具有扩展宿主范围的噬菌体变体、其制备方法及其在将核酸转导至感兴趣的宿主中的用途与流程

发明领域

本公开内容涉及用于扩展和调节递送媒介物的宿主范围的平台。更具体地，本发明提供了用于制备和分离噬菌体变体的方法和试剂盒，所述噬菌体变体作为将核酸分子转导至感兴趣的靶宿主细胞中的递送媒介物使用。本发明还提供了本文公开的递送媒介物和方法的工业、治疗和诊断应用。

背景技术：

以下列出被认为与目前公开的主题相关的作为背景的参考文献：

[1]citorik，r.j.，mimee，m.＆lu，t.k.sequence-specificantimicrobialsusingefficientlydeliveredrna-guidednueleases.natbioteehnol(2014).

[2]bikard，d.etal.exploitingcrispr-casnucleasestoproducesequence-specificantimicrobials.natbiotechnol32，1146-1150(2014).

[3]yosef，i.，manor，m.，kiro，r.＆qimron，u.temperateandlyticbacteriophagesprogrammedtosensitizeandkillantibiotic-resistantbacteria.procnatlacadsciusa112，7267-7272(2015).

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[5]yosef，i.，kiro，r.，molshanski-mor，s.，edgar，r.＆qimron，u.differentapproachesforusingbacteriophagesagainstantibiotic-resistantbacteria.bacteriophage4，e28491(2014).

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本文对上述参考文献的承认不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与目前公开的主题的可专利性相关。

发明背景

病原体的抗生素抗性是对人类健康的越来越大的威胁。细菌病毒，也称为噬菌体(bacteriophages)或噬菌体(phages)，作为克服这种威胁的经典方法和新型方法中的工具正在重新出现(1至3)。

细菌病毒，也称为噬菌体(bacteriophages)或噬菌体(phages)，作为在克服这种威胁的传统方法和新型方法中使用的工具正在重新出现(2、3)。最近已显示温和噬菌体和转导噬菌体有效地将dna转移到细菌中，用于针对抗生素抗性细菌的治疗性或预防性治疗。这些新型技术证明了通过噬菌体注射操作的dna(dna转导)有时可能优于直接的细菌杀灭(例如，通过裂解性噬菌体)。重要的是，dna转导可以选择性地靶向抗性病原体并为“期望的”细菌提供有效对抗“不期望的”细菌的工具。来自lu和marraffini的组的两项独立研究最近表明，转移专门定制的crispr-cas系统的噬菌体可以用于在体内和离体二者编辑微生物组(1、2)。本发明人先前已经表明，噬菌体可用于转移显性敏感基因或crispr-cas元件，以便使细菌对抗生素敏感，并因此改变经处理的表面上的微生物群体(3至6)。

这些新型噬菌体相关技术依赖于噬菌体将dna转导至所需细菌宿主菌株中的能力。然而，噬菌体通常仅与窄范围的宿主相互作用。通过将噬菌体的宿主范围扩展到远缘宿主(distanthost)来克服该限制可以促进上述技术的使用。通过改变特定噬菌体的识别结构域来扩展特定噬菌体的范围可能优于使用识别不同宿主的噬菌体的混合剂(cocktail)，因为对单个噬菌体的调控和控制更可行。

在上个世纪，已经努力扩展噬菌体的宿主范围。各种研究已经表明，噬菌体宿主范围可通过用许多噬菌体感染期望的宿主并因此选择它们的突变使它们能够在期望的宿主中繁殖的那些突变体噬菌体来扩展(参见，例如7、8、9)。

最近，lu及同事已经示出了t7组的噬菌体可以被编程以识别期望的宿主。由于t7噬菌体的尾/尾丝蛋白决定不同宿主的识别(10)，lu及同事假设交换来自不同来源的尾/尾丝将使噬菌体能够识别不同的宿主。为此，他们基于不同pcr片段的gibson组装，通过独特的合成生物学平台构建了不同的噬菌体基因组(11)。已经与来自不同噬菌体的那些基因组交换尾/尾丝基因的组装的基因组在酵母细胞中复制(10、12)。然后将得到的噬菌体基因组转化到大肠杆菌(escherichiacoli)中，该大肠杆菌产生感染性杂交颗粒，这些颗粒被测试它们感染不同宿主的能力。然而，扩展宿主范围的所有上述技术都依赖于噬菌体在期望的宿主中繁殖的能力而不是那些转导dna的能力。噬菌体繁殖依赖于多个步骤：吸附、dna注入、dna复制、对宿主中对其繁殖必需的因子的依赖、克服宿主防御机制和宿主细胞的裂解。由于需要各种关键步骤，即使t7噬菌体的dna被转导至宿主中，它也不能在许多宿主中繁殖。与噬菌体繁殖不同，通过噬菌体的dna转导仅需要吸附、克服防御机制和dna注入能力。这解释为什么更多宿主在不支持噬菌体繁殖的情况下可易于进行dna转导。然而，鉴定这样的宿主是复杂的，因为首先应建立噬菌体宿主范围与转导dna的能力之间的联系。使噬菌体能够将dna转导至新宿主中的平台将显著扩展其宿主范围，并且为高级遗传操作和分析铺平道路。

因此，本领域需要建立用于扩展递送媒介物诸如噬菌体的宿主范围的平台，用于将感兴趣的核酸分子转导至限制性宿主。

发明概述

根据第一方面，本发明涉及用于制备、鉴定和/或分离与感兴趣的靶细胞相容的宿主识别元件的方法。在更具体的实施方案中，方法包括步骤：

第一步骤(a)涉及提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个(apluralityof)核酸分子。应注意，这些核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。在下一步骤(b)中，使包含所述多个核酸分子的第一宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物接触。应注意，宿主细胞与缺陷媒介物在允许包装和/或繁殖所述递送媒介物的条件下接触。通过回收在第一宿主细胞中繁殖的所得递送媒介物变体进一步完成该步骤。

下一步骤(c)涉及使第二宿主细胞与步骤(b)中回收的递送媒介物变体接触。在下一步骤(d)中，选择步骤(c)中获得的包含所述可选择元件的宿主细胞。下一步骤(e)涉及从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和表征至少一种宿主识别元件或编码该宿主识别元件的任何核酸序列，以获得编码相容的宿主识别元件的核酸序列。

另一方面，本公开内容提供了制备核酸递送媒介物的方法。在更具体的实施方案中，方法包括：在第一步骤(a)中，提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个核酸分子。应注意，这些核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。下一步骤(b)涉及在允许包装和/或繁殖递送媒介物的条件下，使包含所述多个核酸分子的第一宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物接触。该步骤之后为回收在这些第一宿主细胞中繁殖的所得递送媒介物变体。接下来在步骤(c)中，使第二宿主细胞与步骤(b)中回收的递送媒介物变体接触。然后在步骤(d)中选择这些第二宿主细胞中的在步骤(c)中获得或产生的包含可选择元件的细胞。下一步骤(e)涉及从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和/或表征至少一种宿主识别元件或编码该宿主识别元件的任何核酸序列，以获得编码与第二宿主细胞相容的宿主识别元件的核酸序列。最后，在步骤(f)中，将编码步骤(e)中获得的相容宿主识别元件的核酸序列中的至少一个引入第三宿主细胞中，并且使这些第三宿主细胞与携带编码至少一种所述宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物接触，从而获得包含能够将感兴趣的核酸分子递送至感兴趣的靶细胞的所述相容宿主识别元件的递送媒介物变体。

本发明的另一方面涉及将感兴趣的核酸分子转导至感兴趣的靶宿主细胞中的方法，所述方法包括：

在第一步骤(a)中，提供感兴趣的核酸分子，所述感兴趣的核酸分子任选地可操作地连接到至少一种包装信号。下一步骤(b)涉及提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的核酸序列。应注意，在某些实施方案中，识别元件应与所述感兴趣的靶细胞相容。下一步骤(c)涉及用(a)的核酸分子和(b)的核酸序列转化第一宿主细胞，以获得包含感兴趣的核酸分子和编码相容宿主识别元件的核酸序列的宿主细胞。接下来在步骤(d)中，使步骤(c)中获得的转化的宿主细胞与携带编码至少一种所述宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物接触。该步骤之后为(e)，从(d)的感染宿主细胞中回收包含在其中包装感兴趣的核酸分子的递送媒介物。应注意，递送媒介物包括相容宿主识别元件。在某些实施方案中，宿主识别元件可以反式(intrans)提供给本发明用作递送媒介物的噬菌体。下一步骤(f)涉及使含有所述感兴趣的靶细胞的受试者、组织、器官、表面、物质和物品中的至少一种中的所述感兴趣的靶细胞与有效量的在步骤(e)中获得的所述递送媒介物中的至少一种接触，从而将所述感兴趣的核酸分子转导至感兴趣的靶宿主细胞中。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含：(a)编码至少一种宿主识别元件或其任何蛋白或片段的多种核酸分子。核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。(b)携带编码所述宿主识别元件中的至少一种或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的至少一种递送媒介物(噬菌体)；以及任选地，(c)用于选择携带所述可选择元件的细胞的至少一种化合物。

在又一方面，本发明提供了通过将至少一种感兴趣的核酸序列转导至包含在所述细胞群体内的靶细胞中来操作至少一个细胞群体的方法。在一些具体实施方案中，该方法可包括使可能存在于也含有靶细胞的受试者、组织、器官、表面、物质和物品中的至少一种中的细胞群体与有效量的至少一种递送媒介物或包含该递送媒介物的任何试剂盒、系统或组合物接触的步骤。在一些具体实施方案中，这样的递送媒介物可以包含：(a)与靶细胞相容的至少一种宿主识别元件，或其任何变体、突变体、蛋白或片段；以及(b)感兴趣的核酸分子中的至少一种。

在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含至少一种修饰的噬菌体或修饰的噬菌体的任何混合剂或混合物。更具体地，这样的噬菌体可以包含：(a)至少一种修饰的宿主识别元件；以及任选的(b)至少一种感兴趣的核酸分子。

在又一方面，本发明提供了用于治疗、预防、改善、抑制或延迟受试者中由致病细胞引起或与致病细胞相关的病理性紊乱的发作的方法。在一些实施方案中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种递送媒介物或包含该递送媒介物的任何试剂盒、系统或组合物的步骤。更具体地，通过本发明的方法施用的递送媒介物可以包含：(a)与所述致病细胞相容的至少一种宿主识别原件，或其任何变体、突变体、蛋白或片段；和(b)至少一种感兴趣的核酸分子。

本发明的这些和其他方面将随着描述的进行变得明显。

附图简述

为了更好地理解本文公开的主题并且为了例示主题如何在实践中进行，现在将参考附图仅通过非限制性实例的方式描述实施方案。现在详细地参考具体附图，要强调的是，所示的细节为以实例的方式并且出于说明性论述本发明的实施方案的目的。在这方面，通过附图进行的描述对于本领域技术人员来说使得可如何实施本发明的实施方案为明显的。

在图中：

图1a至图1f：用于选择具有将dna转导至各种宿主的扩展能力的t7噬菌体的方法的示意图

图1a：缺乏编码对宿主受体特异性的基因(基因11、基因12、基因17)的t7噬菌体在可包装质粒上在编码这些基因的随机突变文库的大肠杆菌宿主上繁殖。

图1b：所得噬菌体裂解物含有许多噬菌体变体，该噬菌体变体包装编码其突变尾基因的质粒。

图1c：这些噬菌体与不一定支持噬菌体生长的宿主菌株混合。具有识别该宿主的相容的尾蛋白的噬菌体将注入质粒。

图1d：由于质粒编码的抗生素标记，在含有抗生素的板上选择获得质粒的宿主。提取质粒，将其转化到大肠杆菌宿主中，并且重复该过程数次，以选择感染新宿主的优化尾基因产物。对质粒进行测序并鉴定优化的突变。

图1e：然后将编码突变的尾部的基因与具有包装信号的期望的质粒一起使用，以制备与新宿主受体相容的噬菌体。

图1f：这些噬菌体将期望的可包装质粒转导至期望的宿主菌株中。

图2.增强t7杂交颗粒的转导效率

来自含有wt-gp17质粒的未诱变的大肠杆菌bw25113宿主的裂解物用于感染大肠杆菌δwaacδtrxa。

图3a至图3b.鉴定能够将dna转导至新型宿主的杂交t7颗粒

图3a.程序的示意图

i.缺乏其尾基因的t7噬菌体在大肠杆菌宿主中产生，所述大肠杆菌宿主在可包装质粒中编码各种来源的尾部。ii.所得颗粒-裂解物含有具有新型尾基因的杂交t7颗粒(以及包装t7基因组的杂交颗粒-未示出)。iii.将这些颗粒与不一定支持t7噬菌体繁殖的宿主菌株一起孵育。具有识别该宿主的相容的尾蛋白的颗粒注入质粒。iv.在含有抗生素的板上选择获得质粒的宿主。然后确定转导的效率。

图3b.不同杂交颗粒对不同宿主的dna转导

条形图代表由指定的杂交颗粒(与衍生自噬菌体t7、t3、ypsp-g、13a、ypp-r、vi06、gh-1、φsg-jl2、k11、φeap-1、e-2、kp32、kp34、kpv289、φkmv的尾部杂交的t7核心衣壳)进入指定的宿主中的每毫升转导的菌落数(tfu/ml)的平均值±sd。对于每组宿主，实验独立重复至少三次。bw25113δtrx，大肠杆菌δtrxa；sso4727，宋内志贺氏菌(shigellasonnei)4727；sen4510，肠道沙门氏菌亚利桑那血清型菌株sarc5；kpn4718，肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumoniae)肺炎亚种atcc10031；kpn4800ii，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc9997；ecl4723，阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)阴沟亚种atcc13047(图3b)；sen4001，肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株lt2；k390，克雷伯杆菌属390；eae4739，产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)atcc51697；sen4513，肠道沙门氏菌肠炎血清型(salmonellaentericaserovarenteritidis)pt4；kpn4719，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc13882；eco4507，大肠杆菌atcc25922(图3b-1)。

图4a至图4c.增强杂交t7颗粒将dna转导至新宿主的能力

图4a.gotrap的示意图

i.缺乏其尾基因的t7噬菌体用于感染在可包装质粒中编码随机突变尾部的大肠杆菌宿主。ii.所得噬菌体裂解物含有许多颗粒的变体，这些颗粒已经包装了编码其突变尾基因的质粒。iii.将这些颗粒与不一定支持噬菌体繁殖的宿主菌株一起孵育。具有以更高的效率识别该宿主的相容的尾蛋白的颗粒将比亲本或其他突变尾部更好地注入质粒。iv.由于质粒编码的抗生素标记，在含抗生素的板上选择已获得质粒的宿主。提取质粒，将其转化到大肠杆菌宿主中，并进行突变；将该过程重复几次以选择感染新宿主的优化尾的基因产物。v.对质粒进行测序并鉴定出改进转导的突变。

图4b.使用gotrap提高不同杂交颗粒的转导效率。

在具有编码指定尾部(蓝色字体)的质粒的野生型大肠杆菌中产生的颗粒裂解物使用ems突变。裂解物用于转导指定的宿主(粗体字)。将转导物铺在含抗生素的琼脂板上并计数。提取来自这些转导物的质粒、将其突变并转化到新鲜的野生型大肠杆菌中。使用这些宿主来产生用于转导指定的宿主的新的颗粒裂解物。在未处理的裂解物(第0次循环)和经历指定循环数(第1次循环、第2次循环和第3次循环)的裂解物中计数转导细菌的数量。条形图代表在三个独立实验中，归一化到相同杂交颗粒对参考菌株(对于大肠杆菌δtrxaδwaac和对于sso4727，大肠杆菌δtrxa；对于kpn4800ii，sso4727)的转导效率的转导细菌的平均数±标准偏差。

图4c.验证获得的突变对dna转导的影响

含有编码亲本尾基因(wt)或指定的突变基因的质粒的大肠杆菌用于制备杂交颗粒。条形图代表在三个独立实验中，归一化到杂交颗粒对以上参考菌株的转导效率的转导细菌的平均数±标准偏差。

图5a至图5b.产生用于将质粒转导至特定宿主中的杂交颗粒

图5a.该程序的示意图

用于产生杂交颗粒的大肠杆菌细胞含有两种质粒，一种编码尾蛋白(不具有包装信号)，且另一种编码t7包装信号。产生的杂交颗粒裂解物用于将dna转导至指定的宿主中。然后将宿主接种在补充有抗生素的lb琼脂板上，具有包装信号的质粒赋予对该抗生素的抗性。

图5b.亲本(wt)或改进的突变尾部支持的转导效率之间的比较

条形图代表在三个独立实验中，归一化至相同杂交颗粒对参考菌株(对于大肠杆菌δtrxaδwaac和对于sso4727，大肠杆菌δtrxa；对于kpn4800ii，sso4727)的转导效率的转导细菌的平均数±标准偏差。

图6.将特异性质粒转导入特定宿主中的杂交颗粒的产生

含有编码指定尾蛋白(赋予链霉素抗性)的质粒和编码t7包装信号(赋予卡那霉素抗性)的质粒的大肠杆菌细胞用于产生杂交颗粒。这些杂交颗粒用于将dna转导至指定的宿主中。然后将宿主接种在补充有卡那霉素(灰色条)或链霉素(黑色条)的lb琼脂板上。条形图代表两个独立实验中转导细菌的平均数±标准偏差。

图7a至图7b.使用gotrap提高杂交颗粒的转导效率。

图7a.ems诱变用于在野生型大肠杆菌中生产颗粒裂解物，野生型大肠杆菌含有编码t7(gp11-12)和ypsp-g(gp17)尾部的质粒。将杂交裂解物用于转导鼠伤寒沙门氏菌atcc14028。将转导物接种在含抗生素的琼脂板上并进行计数。来自这些转导物的质粒被提取、突变、并转化进新鲜的野生型大肠杆菌中。这些宿主用于产生新的颗粒裂解物，所述新的颗粒裂解物用于再次转导鼠伤寒沙门氏菌atcc14028以完成循环。在未处理的裂解物(第0次循环)和经历指定循环数的裂解物中计数转导细菌的数量。条形图代表在三个独立实验中，归一化至相同杂交颗粒对参考菌株sen4510的转导效率的转导细菌的平均数±sd。

图7b.验证(关于ypsp-ggp17的atg起始密码子)-9位和-10位突变对dna转导的影响。含有亲本质粒(wt)或具有指定突变的质粒的大肠杆菌用于制备杂交颗粒。条形图代表在三个独立实验中，归一化至杂交颗粒对以上参考菌株的转导效率的转导细菌的平均数±sd。

图8a至图8b.通过本发明的方法生产与dna转导颗粒相比的现有技术裂解性杂交噬菌体

图8a.如现有技术(10)中描述的杂交裂解性噬菌体的产生

步骤包括整个噬菌体基因组的gibson组装、克隆到酵母人工染色体(yac)中、转化到酵母中、提取组装的基因组、将基因组转化到支持杂交噬菌体产生的大肠杆菌宿主中。然后通过氯仿释放噬菌体并用于感染支持宿主，以得到杂交裂解性噬菌体。

图8b.通过本发明产生杂交转导颗粒

步骤包括合成仅具有尾基因的质粒、转化到支持噬菌体生长的大肠杆菌宿主中。用缺陷噬菌体感染该宿主，缺陷噬菌体的尾部在宿主中反式提供，产生转导感兴趣的dna的杂交噬菌体颗粒。

发明详述

使用基于噬菌体的应用的主要限制为它们的宿主范围窄。用于扩展宿主范围的方法已经主要集中在支持其繁殖的宿主中的裂解性噬菌体，而不是用于扩展将dna转导至噬菌体限制性宿主中的能力的方法。

更具体地说，转导颗粒也相对于噬菌体显示出几个关键技术优势。与噬菌体的产生不同，包装的噬菌体基因组的完整性对于产生转导颗粒不是必需的。事实上，唯一的要求是噬菌体颗粒的所有组分应该在生产宿主(producinghost)中编码(顺式或反式)。一些反式组分的表达极大地简化了杂交颗粒的生成，因为这些组分可以在使用常规分子生物学技术构建而不是现有技术中用于生成交换的噬菌体基因组的费力且昂贵的合成生物学技术构建的质粒中表达(10)。本发明的平台相对于现有技术方法的优点在图8中清楚地说明。用于产生转导颗粒的噬菌体基因组缺乏自我繁殖能力(因为不存在以反式表达的关键基因)。因此，转导颗粒的产生更安全且更可控，并且因此可以需要监管机构更宽松的批准程序。因此，使用转导颗粒在几个技术方面比使用感染性噬菌体具有优势。

为了分离将dna转导至不支持其繁殖的宿主的噬菌体，本发明人首先确定具有宿主识别元件的杂交衣壳的转导能力，所述宿主识别元件具体为来源于不同致病宿主上的不同噬菌体的尾/尾丝(为简单起见，尾/尾丝在下文中称为“尾”)。本发明人还大大提高了这些杂交颗粒中的一些的初始介质转导效率(mediumtransductionefficiency)。为此，发明人开发了gotrap(转导颗粒的一般优化(generaloptimizationoftransducingparticles))，一种将表型(即dna的转导)与允许这种转导的期望的基因型(即尾编码基因中的突变)相联系的平台。重要的是，gotrap允许选择具有与期望的宿主相容的尾的噬菌体。本发明人进一步示出了编码包装信号的期望的dna可以被转导至致病菌株中，因此证明了使用本发明的程序化转导颗粒可以特异性地转导dna。

更具体地，本公开内容建立了将dna转导能力与尾和新宿主的相容性相联系的平台。如下文证明的，该平台允许选择具有与不天然支持噬菌体生长的宿主相容的尾的噬菌体。鉴于适当的选择方案，该平台可以用于选择将期望核酸分子或序列注入到远缘细菌和，不受任何理论约束，甚至注入到真核生物中的噬菌体。

因此，根据第一方面，本发明提供了用于鉴定和/或分离和/或优化与感兴趣的靶细胞相容的宿主识别元件的方法。在更具体的实施方案中，该方法包括以下步骤：第一步骤(a)涉及提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个核酸分子。应注意，这些核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。在下一步骤(b)中，使包含所述多个核酸分子的第一宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物接触。应注意，宿主细胞与缺陷媒介物在允许所述递送媒介物的繁殖和/或包装的条件下接触。该步骤通过回收在第一宿主细胞中繁殖或包装的所得递送媒介物变体进一步完成。下一步骤(c)涉及使第二宿主细胞与步骤(b)中回收的递送媒介物变体接触。在下一步骤(d)中，选择步骤(c)中获得的包含所述可选择元件的宿主细胞。下一步骤(e)涉及从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和表征至少一种宿主识别元件或编码这样的至少一种宿主识别元件的任何核酸序列，以获得宿主识别元件或编码该宿主识别元件的任何核酸序列，在一些实施方案中，所述宿主识别原件可与第二宿主细胞相容和/或与感兴趣的靶宿主细胞相容。

在某些实施方案中，步骤(b)至步骤(e)中的至少一个，例如步骤(b)至步骤(d)，或步骤的任何其他组合可以再重复一次或更多次，如本文之前所指出的。

如上所述，本公开内容提供了用于鉴定、优化、改进和/或分离与感兴趣的靶细胞相容的宿主识别元件或其任何蛋白的方法。术语“鉴定”指与感兴趣的靶细胞相容的宿主识别元件的确定、分类、发现、优化和/或选择中的至少一个。在编码至少一种宿主识别元件的核酸序列的上下文中，术语“分离”和“表征”指将编码至少一种宿主识别元件的核酸序列与其天然环境分离并确定其核酸序列，从而对其进行表征。

因此，“分离的”不一定反映核酸序列已经纯化的程度。但是，将理解，已经纯化到某种程度的这样的分子是“分离的”。核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、递送媒介物上或为部分纯化或基本纯的形式。当核酸从天然环境中通常与之缔合的其他细胞组分中纯化出来时，核酸是“分离的”或“变得基本纯的”。为了分离核酸，可以使用诸如以下的标准技术：碱/sds处理、cscl显带(csclbanding)、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术。

如下文中将结合本发明的其他方面所阐述的，通过本发明的方法鉴定、提供、制备、优化和/或表征的宿主识别元件在一些实施方案中使用来制备可与至少一种感兴趣的靶宿主细胞相容的递送媒介物，并且因此可适合于将至少一种感兴趣的核酸分子转导至这样的靶细胞。

如上所述，宿主细胞和核酸递送媒介物之间的物理相互作用决定宿主细胞和递送媒介物之间的识别，并且决定递送媒介物进入(或感染)宿主细胞的能力。因此，在本公开内容的上下文中，术语“相容的”指特定的宿主识别元件，当包含在递送媒介物中时，所述特定的宿主识别元件能够在携带其的递送媒介物和感兴趣的具体靶宿主细胞之间进行识别。如本文所用的，“识别”还包括递送媒介物结合、附着、吸收、侵入感兴趣的靶宿主细胞中，本文中感兴趣的靶宿主细胞由“第二宿主细胞”呈现。换言之，包含相容宿主识别元件的递送载体将能够进入并由此转导具体的宿主细胞。

在一些具体实施方案中，本文描述的方法还包括诱变步骤(a)中提供的多个核酸分子，例如，通过置于至少一种诱变剂，从而获得编码至少一种突变的宿主识别元件的多个核酸分子。

还如实施例1、实施例2以及具体地在图3b中示出的，在一些实施方案中，本发明的方法可包括几轮选择和富集，并因此该方法还包括至少再重复步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)中的至少一个或者可选择地，步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)一次的选项。在一些实施方案中，该方法可包括至少再重复步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)一次。如图4b中示出的，重复这些步骤提高了包含通过本发明方法制备的宿主识别元件的媒介物的转导效率。这些递送媒介物及其制备方法在下文中结合本发明的其他方面详细描述。应理解，这些步骤可以再重复至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次、21次、22次、23次、24次、25次、26次、27次、28次、29次、30次、31次、32次、33次、34次、35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次、45次、46次、47次、48次、49次、50次、51次、52次、53次、54次、55次、56次、57次、58次、59次、60次、61次、62次、63次、64次、65次、66次、67次、68次、69次、70次、71次、72次、73次、74次、75次、76次、77次、78次、79次、80次、81次、82次、83次、84次、85次、86次、87次、88次、89次、90次、91次、92次、93次、94次、95次、96次、97次、98次、99次、100次、200次、300次、400次、500次、600次、700次、800次、900次、1000次或更多次。应理解，在本发明方法涉及将步骤(a)中提供的编码至少一种宿主识别元件的多个核酸分子暴露于至少一种诱变剂，或者可选择地通过如下文描述的任何其他手段诱变所述核酸序列的情况中，该步骤也可重复至少一次或更多次。应理解，核酸序列暴露于诱变剂可在细胞(第一宿主细胞或第三宿主细胞)中或在细胞外进行。

如本领域已知的，宿主细胞和核酸递送媒介物之间的物理相互作用决定宿主细胞和递送媒介物之间的识别，并且决定递送媒介物进入(或感染)宿主细胞的能力。

例如，噬菌体的存活取决于它们在噬菌体进入期间感染其细菌宿主的能力。在噬菌体和细菌宿主中，噬菌体的宿主识别元件和细菌受体的共同进化决定了细菌宿主范围、噬菌体进入机制和其他感染参数。

为了分离将dna转移到天然限制性(即不允许特定类型的递送媒介物)并且其中递送媒介物不能繁殖的宿主(或感兴趣的靶细胞)中的核酸递送媒介物(例如，噬菌体)，必须开发一种将表型(即宿主识别)与允许这种识别的期望的基因型相联系的方法。

为此，当前描述的方法尤其包括使用携带编码至少一种宿主识别元件或其任何片段的缺陷核酸序列的递送媒介物，以及包含编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体或片段的多个核酸分子的第一宿主细胞。如上所述，这些核酸分子还包含有助于将所述核酸分子包装在媒介物(具有缺陷宿主识别元件)中的至少一种包装信号和编码允许对其进行选择和鉴定的可选择元件的至少一种核酸序列。

如上所述，在本发明的方法的步骤(b)中，“第一宿主细胞”包含多个识别元件并在本文中用作“生产细胞(producingcell)”，与携带编码缺陷识别元件的缺陷核酸序列的递送媒介物接触。在上文中，术语“缺陷”指编码如本文定义的宿主识别元件中的至少一种的递送媒介物的天然核酸序列为缺陷的、突变的(在基因的编码区或非编码区中)、受损的、部分的或不完整的，或者可选择地，编码至少一种缺陷宿主识别元件的核酸从递送媒介物基因组中完全缺失(从而这样的媒介物缺少编码宿主识别元件的核酸序列)。因此，不能支持识别期望的宿主细胞或任何宿主细胞的缺陷核酸序列编码缺陷的、受损的、突变的、部分的或不完整的(或甚至缺失的)宿主识别元件。应注意，本发明在其一些实施方案中包括任何媒介物，特别是本发明公开的可以仅包含包装编码宿主识别元件的核酸序列(作为多个核酸序列提供)所需的元件的任何递送媒介物。例如，除了包装这些核酸序列的能力之外，没有任何其他性质或活性的递送媒介物。然而，应注意，在一些可选择的实施方案或另外的实施方案中，非缺陷递送媒介物(例如，在编码宿主识别元件的核酸序列中无缺陷)或甚至野生型递送媒介物的使用也可以适用于本发明。

用上述递送媒介物接触包含编码至少一种宿主识别元件(或其任何变体、突变体、蛋白或片段)的多个核酸分子以及另外的包装元件的第一宿主细胞引起将由宿主细胞携带的宿主识别元件包装到所得递送媒介物中。该过程有助于获得递送媒介物变体的群体，每个变体包含至少一种宿主识别元件(或其任何变体、蛋白或突变体)，从而获得新的表型/基因型。这些元件中的至少一些可以与感染扩展范围的靶宿主细胞/与扩展范围的靶宿主细胞相互作用相容。如上所述，进一步选择这些变体中携带可以与感兴趣的靶宿主相容的宿主细胞识别元件的递送媒介物。如下文将阐述的，“第三宿主细胞”，在本文中也称为“生产细胞”，可以进一步包括人工细胞、囊泡或模拟细胞或其任何部分或细胞器的任何系统。

更具体地，如本文定义的和本发明的方法的步骤(b)中获得的术语“递送媒介物变体”指一群或多种递送媒介物物类，每一种包含独特的基因型/表型。递送媒介物变体可以通过其核酸序列的含量和/或其蛋白的氨基酸序列彼此不同。递送媒介物变体可以携带编码宿主识别元件的核酸序列，该宿主识别元件可以是同源的或异源的、杂交的、天然的、突变的或其任何组合。具体地，这些变体可以携带与感兴趣的靶宿主细胞相容的期望的宿主识别元件。

如本文所用，在本公开内容的上下文中，术语“核酸递送媒介物”以其最广泛的含义使用。如本文所用的“媒介物”或“递送媒介物”包括载体诸如噬菌体、质粒、噬粒(phagemid)、病毒、可整合dna片段和能够将核酸分子转移到期望的靶宿主细胞中的其他媒介物，并且在一些其他实施方案中，引起所述转导的核酸分子在靶细胞中的表达。

载体通常为自我复制的dna或rna构建体，其含有期望的核酸序列和在合适的宿主细胞中被识别并影响期望的基因的翻译的可操作地连接的遗传控制元件。通常，遗传控制元件可以包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统。这样的系统通常包括转录启动子、提高rna表达水平的转录增强子。载体通常含有允许载体独立于宿主细胞进行复制的复制起点。

因此，术语控制和调控元件包括启动子、终止子和其他表达控制元件。这样的调控元件在goeddel中描述；[goeddel等人,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185,academicpress,sandiego,calif.(1990)]。例如，当可操作地连接到表达控制序列时，控制dna序列表达的多种表达控制序列中的任何一种可以在这些载体中使用，以使用本发明的方法表达编码任何期望的蛋白的dna序列。

载体或递送媒介物可另外包含适当的限制性位点、抗生素抗性或用于选择含载体细胞的其他标记。质粒为最常用的载体的形式，但是发挥同等功能并且为本领域已知的或变成本领域已知的其他形式的载体也适用于在本文中使用。参见例如pouwels等人,cloningvectors:alaboratorymanual(1985年和补编),elsevier,n.y.；和rodriquez等人.(编辑)vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,buttersworth,boston,mass(1988)，这些通过引用并入本文。将理解，递送媒介物的这种定义与本发明的任何其他方面中描述的任何步骤或组合物相关。

在一些实施方案中，在根据本公开内容的任何方法中使用的递送媒介物可以是至少一种噬菌体。因此，在一些实施方案中，噬菌体可用作递送媒介物以制备和鉴定本发明的宿主识别元件。在另一些实施方案中，本发明还可以使用噬菌体来制备通过本发明的方法获得的包含宿主识别元件的递送媒介物。这样的递送媒介物与期望的感兴趣的靶细胞和/或本文所用的第二宿主细胞相容。在一些实施方案中，第二宿主细胞可与感兴趣的靶宿主细胞相同或相似。

术语“噬菌体”指在原核生物诸如细菌中感染、复制和组装的病毒。应注意，术语“噬菌体(bacteriophage)”与术语“噬菌体(phage)”同义。噬菌体由包封dna或rna基因组的蛋白组成，所述dna或rna基因组可以仅编码几个或数百个基因，从而产生具有相对简单或复杂结构的病毒体。根据国际病毒分类委员会(internationalcommitteeontaxonomyofviruses)(ictv)鉴于形态学和核酸的类型(dna或rna，单链或双链，线性或环状)对噬菌体进行分类。到目前为止，已经识别到感染细菌和/或古菌域(archaea)(以前被归类为古细菌的原核域(domain))的约19个噬菌体科。许多噬菌体对特定属或物种或细胞株是特异性的。应理解，任何合适的噬菌体可通过本公开内容的方法、试剂盒和组合物用作递送媒介物。

在一些非限制性实施方案中，当前公开的主题的噬菌体属于有尾噬菌体目(caudovirales)(例如，属于短尾噬菌体科(podoviridae)、肌尾噬菌体科(myoviridae)或长尾噬菌体科(siphoviridae))或属于线状病毒目(ligamenvirales)(例如，属于脂毛噬菌体科(lipothrixviridae)或古噬菌体科(rudivirus))。来自其他科的噬菌体也包括在本公开内容中，例如ampullaviridae、bicaudaviridae和clavaviridae，仅举几个例子。

在其他实施方案中，根据本公开内容的噬菌体为(但不限于)噬菌体科短尾噬菌体科、肌尾噬菌体科或长尾噬菌体科、脂毛噬菌体科或古噬菌体科中的一个。

在某些具体实施方案中，根据本公开内容的噬菌体为t7样病毒或t4样病毒中的至少一种。

在其他具体实施方案中，被本发明的方法用作递送媒介物的噬菌体以及下文所述的本公开内容的修饰的噬菌体、试剂盒和组合物可以是t7样病毒，特别是肠杆菌(enterobacteria)噬菌体t7。噬菌体t7是具有裂解性生命周期的dna病毒。

更具体地，根据本公开内容的噬菌体可以是大肠杆菌(escherichiacoli)噬菌体t7(有尾噬菌体目(有尾噬菌体)的短尾噬菌体科的成员，如上文详细描述的)。t7由二十面体衣壳组成，在一个顶点处具有20-nm短尾。衣壳由壳蛋白基因产物(gp)10形成并包封40kb的dna。由gp14、gp15和gp16组成的圆柱形结构存在于衣壳内，附着于由连接器(即gp8的圆形十二聚体)形成的特殊顶点(8、10)。蛋白gp11和蛋白gp12形成尾部；gp13、gp6.7和gp7.3也已被证明为病毒体的一部分并且为感染所必需的，尽管它们的位置尚未被确定。尾部的主要部分由gp12组成，gp12为存在其6个拷贝的大蛋白；小gp11蛋白也位于尾部。六根纤维附着于尾部，每根纤维含有三个拷贝的gp17蛋白。

被本公开内容的方法、试剂盒和组合物用作递送媒介物的噬菌体可以包括短尾噬菌体科的其他组成员，例如但不限于t3噬菌体、φ29、p22、p-spp7、n4、ε15、k1e、k1-5和p37。

在一些具体实施方案中，被本公开内容的方法、试剂盒和组合物用作递送媒介物的噬菌体可以包括但不限于肠杆菌(enterobacteria)噬菌体t7、肠杆菌噬菌体13a、耶尔森氏菌(yersinia)噬菌体ypsp-g、肠杆菌噬菌体t3、耶尔森氏菌噬菌体ypp-r、沙门氏菌(salmonella)噬菌体phisg-jl2、沙门氏菌噬菌体vi06、假单胞菌(pseudomonas)噬菌体gh-1、克雷伯杆菌(klebsiella)噬菌体k11、肠杆菌噬菌体phieap-1、肠杆菌噬菌体e-2、克雷伯杆菌噬菌体kp32、克雷伯杆菌噬菌体kp34、克雷伯杆菌噬菌体vb_kpnp_kpv289和假单胞菌噬菌体phikmv。

以另一实例的方式，噬菌体包括但不限于能够感染细菌的那些噬菌体，所述细菌包括但不限于变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacterioidetes)中的任何一个。

以其他实例的方式，噬菌体包括但不限于能够感染属于以下属的细菌的那些噬菌体：大肠杆菌、假单胞菌属、链球菌属(streptococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、沙门氏菌属、志贺氏菌属(shigella)、梭菌属(clostidium)、肠球菌属(enterococcus)、克雷伯杆菌属、不动杆菌属(acinetobacter)和肠杆菌属。

特别感兴趣的是特异性靶向任何“eskape”病原体的噬菌体。如本文所用，这些病原体包括但不限于屎肠球菌(enterococcusfaecium)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumoniae)、鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumanii)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和肠杆菌属。

仅举几例，这些噬菌体可以包括但不限于对金黄色葡萄球菌特异的噬菌体，具体地vb_sau.myd1、vb_saumy1140、vb_saum142、sb-1、vb_saum232、vb_saus175、vb_saum50、vb_sau51/18、vb_sau.m.1、vb_sau.m.2、vb_sau.s.3、vb_sau.m.4、vb_sau.s.5、vb_sau.s.6、vb_sau.m.7、vb_sau.s.8、vb_sau.s.9、vb_sau.m.10、vb_sau.m.11中的至少一种。在另一些实施方案中，对肺炎克雷伯杆菌特异的噬菌体也可以适用于本发明。在更具体的实施方案中，这些噬菌体可以包括vb_klp1、vb_klp2、vb_klp.m.1、vb_klp.m.2、vb_klp.p.3、vb_klp.m.4、vb_klp.m.5、vb_klp.m.6、vb_klp.7、vb_klp.m.8、vb_klp.m.9、vb_klp.m.10、vb_klp.p.11、vb_klp.p.12、vb_klp.13、vb_klp.p.14、vb_klp.15、vb_klp.m.16。此外，在某些实施方案中，对铜绿假单胞菌特异的噬菌体可以用作本发明的递送媒介物，或者作为异源宿主识别元件的来源。这样的噬菌体的非限制性实例包括但不限于vb_psa.shis1、vb_psampat5、vb_psappat14、vb_psampat13、vb_psamst-1、vb_psaст27、vb_psaст44k、vb_psaст44m、vb_psa16、vb_psaps-1、vb_psa8-40、vb_psa35k、vb_psa44、vb_psa1、vb_psa9、vb_psa6-131m、vb_psaст37、vb_psaст45s、vb_psaст45m、vb_psaст16mu、vb_psaст41、vb_psaст44mu、vb_psaст43、vb_psaст11k、vb_psa1638、vb_psaps-2、vb_psa35ct、vb_psa35m、vb_psas.ch.l、vb_psar1、vb_psasan、vb_psal24、vb_psaf8、vb_psabt-4、vb_psabt-2(8)、vb_psabt-1(10)、vb_psabt-4-16、vb_psabt-5、vb_psaf-2、vb_psab-cf、vb_psaph7/32、vb_psaph7/63、vb_psaph5/32、vb_psaph8/16、vb_psaph11/1、vb_psa、vb_psa3、vb_psa4、vb_psa5、vb_psa6、vb_psa7、vb_psa.p.15、vb_psa.17、vb_psa.m.18、vb_psa.28、vb_psa.m.2、vb_psa.m3、vb_psa.23、vb_psa.p.8、vb_psa.m.pst7、vb_psa.m.c5、vb_psa.md1038。在其他实施方案中，对鲍曼不动杆菌特异的噬菌体可以适用于本发明。这样的裂解性噬菌体或温和噬菌体可以包括vb_abab37、vb_abag865、vb_abag866、vb_abau7、vb_abau8、vb_acb1、vb_acb2中的任一种。在另一些实施方案中，对肠杆菌特异的噬菌体可用于本发明的试剂盒和方法，具体地，vb_eb1、vb_eb2、vb_eb3、vb_eb4噬菌体中的任何一种。在另一些实施方案中，可以使用对粪肠球菌特异的噬菌体。几个非限制性实例包括vb_ec1、vb_ec2、vb_enf.s.4、vb_enf.s.5噬菌体中的任何一种。

在另一些实施方案中，特异性感染炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)的噬菌体，例如vb_bak1、vb_bak2、vb_bak6、vb_bak7、vb_bak9、vb_bak10、vb_bak11、vb_bak12、vb_baga4、vb_baga5、vb_baga6也可以适用于本发明。此外，对流产布鲁杆菌(brucellaabortus)特异的噬菌体，例如tb、vb_brapiv、vb_brapv、vb_brapvi、vb_brapvii、vb_brapviii、vb_brapix、vb_brapx、vb_brapxii、vb_brap12(b)、vb_brapba、vb_brap544、vb_brap141я、vb_brap141m、vb_brap19я、vb_brap19m、vb_brap9，对犬布鲁杆菌(brucellacanis)特异的噬菌体，具体地vb_brcp1066，对产气荚膜梭菌a.b.c.d.e(clostridiumperfigenesa.b.c.d.e)特异的噬菌体，例如vb_cppi、vb_cpii、vb_cpiii、vb_cpiv，对普通脱硫弧菌(desulfovibriovulgaris)特异的噬菌体，具体地vb_dvrch1/m1、vb_dvh/p15、vb_dvh/m15，对粪肠球菌(enterococcusfaecalis)特异的那些噬菌体，具体地vb_ec1、vb_ec2、vb_enf.s.4、vb_enf.s.5，对大肠杆菌特异的噬菌体，具体地vb_eschc.pod9、vb_eschc.pod4、vb_eschc.shis7、vb_eschc.shis14、vb_eschc.shis5、vb_eschc.my2、phi-1、phi-2、phi3、phi4、phi5、t2、t4、t5、ddii、ddvi、ddvii、vb_eschc.shis7/20、vb_eschc.shis1161、vb_eschc.shis8963、vb_eschc4、vb_eschc11/24、vb_eschc.shis18、vb_shis3/14、vb_saua、vb_shisg、vb_eschc.shisw、vb_shisge25、vb_eschc.shis8962、vb_eschc90/25、vb_eschc5/25、vb_eschc12/25、vb_eschch、t3、t6、t7、vb_eschc4、vb_eschc121、vb_eschcbak2、vb_eschcl7-2、vb_eschcl7-3、vb_eschcl7-7、vb_eschcl7-8、vb_eschcl7-9、vb_eschcl7-10、vb_eschcф8、vb_eschc.shis20、vb_eschc.shis25、vb_eschc.shis27、vb_eschc.shismy、vb_eschc11、vb_eschc12、vb_eschc13、vb_eschc17、vb_eschc18、vb_eschc19、vb_eschc20、vb_eschc21、vb_eschc22、vb_eschc23、vb_eschc24、vb_eschc25、vb_eschc26、vb_eschc27、vb_eschc28、vb_eschc29、vb_eschc30、vb_eschc31、vb_eschc32、vb_eschc34、vb_eschc35、vb_eschc37、vb_eschc38、vb_eschc39、vb_eschc44、vb_eschc45、vb_eschc46、vb_e.coli.m.1、vb_e.coli.m.2、vb_e.coli.p.3、vb_e.coli.p.4、vb_e.coli.p.5、vb_e.coli.p.6、vb_e.coli.p.7、vb_e.coli.p.8，对副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphi)特异的噬菌体，具体地vb_spbdiag1、vb_spbdiag2、vb_spbdiag3、vb_spbdiag3b、vb_spbdiagjersey、vb_spbdiagbeecles、vb_spbdiagtaunton、vb_spbdiagb.a.o.r、vb_spbdiagdundee、vb_spbdiagworksop、vb_spbdiage、vb_spbdiagd、vb_spbdiagf、vb_spbdiagh，对salmonellatyphiabdominalis特异的vb_stadiaga、vb_stadiagb1、vb_stadiagb2、vb_stadiagc1、vb_stadiagc2、vb_stadiagc3、vb_stadiagc4、vb_stadiagc5、vb_stadiagc6、vb_stadiagc7、vb_stadiagd1、vb_stadiagd2、vb_stadiagd4、vb_stadiagd5、vb_stadiagd6、vb_stadiagd7、vb_stadiagd8、vb_stadiage1、vb_stadiage2、vb_stadiage5、vb_stadiage10、vb_stadiagf1、vb_stadiagf2、vb_stadiagf5、vb_stadiagg、vb_stadiagh、vb_stadiagj1、vb_stadiagj2、vb_stadiagk、vb_stadiagl1、vb_stadiagl2、vb_stadiagm1、vb_stadiagm2、vb_stadiagn、vb_stadiago、vb_stadiagt、vb_stadiagvi1、vb_stadiag27、vb_stadiag28、vb_stadiag38、vb_stadiag39、vb_stadiag40、vb_stadiag42、vb_stadiag46，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，具体地vb_stm.my11、vb_stm.my28、vb_stm.shis13、vb_stm.my760、vb_stm.shis1、ira、vb_stm16、vb_stm17、vb_stm18、vb_stm19、vb_stm20、vb_stm21、vb_stm29、vb_stm512、vb_stmdiagi、vb_stmdiagii、vb_stmdiagiii、vb_stmdiagiv、vb_stmdiagv、vb_stmdiagvi、vb_stmdiagvii、vb_stmdiagviii、vb_stmdiagix、vb_stmdiagx、vb_stmdiagxi、vb_stmdiagxii、vb_stmdiagxiii、vb_stmdiagxiv、vb_stmdiagxv、vb_stmdiagxvi、vb_stmdiagxvii、vb_stmdiagxviii、vb_stmdiagxix、vb_stmdiagxx、vb_stmdiagxxi、vb_stmdiag1、vb_stmdiag2、vb_stmdiag3、vb_stmdiag4、vb_stmdiag5、vb_stmdiag6、vb_stmdiag7、vb_stmdiag8、vb_stmdiag9、vb_stmdiag10、vb_stmdiag11、vb_stmdiag12、vb_stmdiag13、vb_stmdiag14、vb_stmdiag15、vb_stmdiag16、vb_stmdiag17、vb_stmdiag18、vb_stmdiag19、vb_stmdiag20、vb_stmdiag21、vb_stmdiag22、vb_stmdiag23、vb_stmdiag24、vb_stmdiag25、vb_stmdiag26、vb_stmdiag27、vb_stmdiag28、vb_stmdiag29、vb_stmdiag30、vb_stmdiag31、vb_stmdiag32、vb_stmdiag33、vb_stmdiag34、vb_stmdiag35、vb_stmdiag36、vb_stmdiag37、vb_stmdiag38、vb_stmdiag39、vb_stmdiag40、vb_stmdiag41、vb_stmdiag42、vb_stmdiag43、vb_stmdiag44、vb_stmdiag45、vb_stmdiag46、vb_stmdiag47、vb_stmdiag48、vb_stmdiag49、vb_stmdiag50、vb_stmdiag51、vb_stmdiag52、vb_stmdiag53、vb_stmdiag54、vb_stmdiag55、vb_stmdiag56、vb_stmdiag57、vb_stmdiag58、vb_stmdiag59、vb_stmdiag60、vb_stmdiag61、vb_stmdiag62、vb_stmdiag63、vb_stmdiag64、vb_stmdiag65、vb_stm.p.1、vb_stm.p.2、vb_stm.p.3、vb_stm.p.4，宋内志贺氏菌，具体地vb_shs.pod3、vb_eschc.shis7/20、vb_eschc.shis1161、vb_eschc.shis8963、vb_eschc.shis8962、vb_shisge25、vb_eschc.shisw、vb_shisg、vb_shis3/14、vb_eschc.shis18、vb_shis1188、vb_shis1188г、vb_shis1188y、vb_shis1188x、vb_shis5514、vb_shisl7-2、vb_shisl7-4、vb_shisl7-5、vb_shisl7-11、vb_shisk3、vb_shistuia、vb_shisox2、vb_shisscl、vb_shisbakc2、vb_shis4/1188、vb_shis8962、vb_shis8963、vb_shisxiv、vb_shis116、vb_shis106/8、vb_shis20、vb_shis90/25、vb_shis87/25、vb_shis16/25、vb_shs7、vb_shs38、vb_shs92、vb_shs1391、vb_shs.p.1、vb_shs.p.2、vb_shs.p.3。

应理解，在一些实施方案中，本发明包括本文列出和公开的任何噬菌体作为递送媒介物用于通过本发明的方法制备宿主识别元件的用途，也适用于制备包含所述宿主识别元件的任何递送媒介物，如本发明的任何方面所定义的。在另一些实施方案中，适用于本发明的方法和修饰的噬菌体的识别元件，如下文将结合尾蛋白和纤维蛋白描述的，可衍生自本文列出的任何噬菌体或本发明公开的任何噬菌体、其任何组合、突变体、变体或直向同源物。

本发明提供了用于鉴定、优化和制备宿主识别元件的方法。在本发明的一些其他方面，这些宿主识别元件可用于制备与感兴趣的靶宿主细胞相容的改进的递送媒介物。

如本文所用，术语“宿主识别元件”也称为“宿主决定簇蛋白”，包括与媒介物-宿主识别相关的任何媒介物组分，即介导递送媒介物和宿主之间的相互作用的元件。特别地，术语宿主识别元件指位于噬菌体尾端的任何噬菌体组分。更进一步地，“宿主识别元件”在本文中可以其最广泛的含义来解释，并且因此，在一些实施方案中，可以包括参与、促进、改进或实现宿主识别、附着于宿主、侵入、注入核酸分子(或任何其他转导材料)、以及甚至所注入的材料在宿主内的稳定性(例如，对宿主限制酶的抗性等)中的至少一种的递送媒介物的任何元件，或者参与本文描述的任何过程的任何阶段的任何元件，或其任何组合。因此，本发明提供了用于任何宿主识别元件的或参与宿主识别、附着、侵入、注入和所注入的材料(例如，核酸分子)的稳定性中的至少一项的任何元件的制备、分离、鉴定、改进和优化中的任一项的有效方法。

如上所述，本发明的方法可以包括诱变编码宿主识别元件的多个核酸序列。术语“修饰”或“突变”或“诱变”指编码至少一种宿主识别元件的天然核酸序列被改变、修改或突变。本领域已知的用于突变核酸序列的任何程序可用于获得突变的核酸序列，特别是下面例举的方法，例如甲磺酸乙酯(ems)、使用增变质粒(mutatorplasmid)诸如mp6或任何其他诱变剂或使用与dna合成或修复相关的低保真蛋白。如本文所用的术语“诱变剂”指在给定的生物系统例如宿主细胞中诱导突变或将突变率增加至高于该系统中天然存在的突变水平的水平的剂。一些示例性诱变剂包括但不限于碱基类似物、脱氨剂(例如亚硝酸)、插入剂(intercalatingagent)(例如溴化乙锭)、烷化剂(例如乙基亚硝基脲)、转座子、溴、叠氮化物盐、补骨脂素、苯、3-氯-4-(二氯甲基)-5-羟基-2(5h)-呋喃酮(mx)(cas第77439-76-0号)、o,o-二甲基-s-(邻苯二甲酰亚氨基甲基)二硫代磷酸酯(phos-met)(cas第732-11-6号)、甲醛(cas第50-00-0号)、2-(2-呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺(af-2)(cas第3688-53-7号)、乙二醛(cas第107-22-2号)、6-巯基嘌呤(cas第50-44-2号)、n-(三氯甲硫基)-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺(captan)(cas号第133-06-2号)、2-氨基嘌呤(cas第452-06-2号)、甲磺酸甲酯(mms)(cas第66-27-3号)、4-硝基喹啉1-氧化物(4-nqo)(cas第56-57-5号)、n4-氨基胞苷(cas第57294-74-3号)、叠氮化钠(cas第26628-22-8号)、n-乙基-n-亚硝基脲(enu)(cas第759-73-9号)、n-甲基-n-亚硝基脲(mnu)(cas第820-60-0号)、5-氮杂胞苷(cas第320-67-2号)、过氧化氢异丙苯(chp)(cas第80-15-9号)、甲磺酸乙酯(ems)(cas第62-50-0号)、n-乙基-n-硝基-n-亚硝基胍(enng)(cas第4245-77-6号)、n-甲基-n-硝基-n-亚硝基胍(mnng)(cas第70-25-7号)、5-重氮尿嘧啶(cas第2435-76-9号)和叔丁基过氧化氢(bhp)(cas第75-91-2号)。可以使用另外的诱变剂，并且本发明在这方面不受限制，例如本发明的多个核酸序列可以经受电离辐射或紫外线辐射。此外，在一些实施方案中，编码宿主识别元件或其任何蛋白的核酸序列可以使用增变质粒诸如mp6突变。更具体地，mp6质粒(badranah1和liudr,natcommun.20156:8425)是大肠杆菌中有效的、可诱导的、广谱的、基于载体的诱变系统，其相对于基础水平将突变增加322,000倍。增变菌株，诸如xl1-red也可以适用于本文。这些系统能够在体内对染色体、附加体和病毒进行广谱诱变，适用于细菌和噬菌体介导的实验室进化平台，并因此适用于通过发明的方法诱变步骤(a)中提供的多个核酸序列。

还应注意，诱变剂或诱变剂的任何组合应以在给定核酸群体中诱导期望的突变率的浓度或暴露水平使用。

由本发明的方法的步骤(a)中的多个核酸序列提供并通过本文描述的方法制备的宿主识别元件可自发突变，或者通过使用如上文公开的至少一种诱变剂突变。在一些实施方案中，所得的诱变的核酸序列编码可以包含至少一个突变的宿主识别元件。本文所用的术语“突变”指一个(点突变体)或更多个核苷酸的交换。应理解，本文所用的突变包括点突变、无义突变、错义突变、不改变氨基酸产物的沉默突变、缺失、插入、截短或重排。在某些实施方案中，这样的突变可以引起所得氨基酸残基与一个或更多个氨基酸残基的交换。应理解，该术语包括编码序列上的突变以及非编码序列例如调控序列(例如，为核糖体结合位点的shine-dalgarno(sd)序列，如表7公开的克隆#1、克隆#2和克隆#3的突变体中所例示的)上的突变等。

因此，突变可引起至少一个氨基酸取代、缺失或插入或其组合。因此，应理解，所得蛋白可以是缺陷的或以其他方式非功能性蛋白或部分功能性蛋白。在另一些其他可选择的实施方案中，突变可引起所得多肽，在这种情况中，宿主识别元件的功能的修饰，并且因此可以修饰和/或扩展、增加和增强其宿主特异性，或者对不同宿主具体地感兴趣的宿主细胞的相容性。

氨基酸“取代”是用具有相似或不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸替换一种氨基酸的结果，即保守氨基酸替换。氨基酸取代可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

例如，可以进行取代，其中脂族氨基酸(g、a、i、l或v)被该组的另一个成员取代，或者诸如一个极性残基取代另一个极性残基的取代，诸如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺。以下八组中的每一组都含有彼此为保守取代的其他示例性氨基酸：

1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；

2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；

3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；

4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；

5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；

6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；

7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；以及

8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)。

保守核酸取代为引起如上文定义的保守氨基酸取代的核酸取代。

“插入”或“缺失”指向本文定义的宿主识别元件的氨基酸序列添加或从本文定义的宿主识别元件的氨基酸序列消除氨基酸残基。插入例如在约1个至10个氨基酸的范围内，具体地1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。更具体地，插入或缺失约1个、2个或3个氨基酸。氨基酸添加通常不超过100个，更具体地不超过80个，更具体地不超过50个，最具体地不超过20个氨基酸，这些氨基酸被添加和/或插入到本公开内容的宿主识别元件中。

“修饰”为由将在下文中详述的本发明的方法制备的递送媒介物携带的本发明的宿主识别元件的天然核酸或氨基酸序列的任何变化，例如如上文所述。

因此，在一些实施方案中，本文描述的方法的步骤(a)中提供的多个核酸分子被诱变，例如在转化到第一宿主细胞中之前或之后被置于诱变剂。

如上文详细描述的，本发明的方法可以包括将步骤(a)中提供的多个核酸分子置于诱变剂，从而获得编码至少一种突变的宿主识别元件的多个核酸分子。在某些实施方案中，所得宿主识别元件中的每一个可以包含宿主识别元件内包含的至少一种纤维或尾蛋白中的至少一种突变或修饰。使用通过本发明的方法制备的宿主识别元件，例如gotrap，使用将核酸序列暴露于诱变剂的步骤制备的递送媒介物的具体和非限制性实例在图4c、图5b和图7中公开。更具体地，本发明的宿主识别元件可以包含至少一种突变的t7gp17蛋白，具体地在540位携带突变(具体地，用天冬酰胺(n或asn)取代天冬氨酸(d或asp))的突变的t7基因17，如包含由seqidno.123表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的d540n突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.124表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，宿主识别元件可以包含在540位携带突变(具体地，用酪氨酸(y或tyr)取代天冬氨酸(d或asp))的突变的t7基因17，如可包含由seqidno.162表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的d540y突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.163表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在一些其他实施方案中，宿主识别元件可以包含在541位携带突变(具体地，用精氨酸(r或arg)取代丝氨酸(s或ser))的突变的t7基因17，如可包含由seqidno.164表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的s541r突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可由seqidno.165表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，宿主识别元件可以包含在479位携带突变(具体地，用丝氨酸(s或ser)取代甘氨酸(g或gly))的突变的t7基因17，如可包含由seqidno.125表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的g479s突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可由seqidno.126表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。此外，宿主识别元件可以包含衍生自噬菌体t7的突变尾丝gp12，具体地在733位携带突变(具体地，用天冬氨酸(d或asp)取代甘氨酸(g或gly))的t7gp12，如可包含由seqidno.127表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的g733d突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.128表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，宿主识别元件可以包含在106位携带突变(具体地，用谷氨酰胺(q或gln)取代精氨酸(r或arg))的突变的t7基因11，如可包含由seqidno.129表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的r106q突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.130表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，宿主识别元件可包含在40位携带突变(具体地，用苏氨酸(t或thr)取代丙氨酸(a或ala))的突变的t7基因11，如可包含由seqidno.131表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的a40t突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.132表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，宿主识别元件可以包含在487位携带突变(具体地，用天冬酰胺(n或asn)取代天冬氨酸(d或asp))的突变的t7基因12，如可包含由seqidno.133表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的d487n突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.134表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在其他实施方案中，宿主识别元件可以包含在694位携带突变(具体地，用脯氨酸(p或pro)取代丝氨酸(s或ser))的突变的t7基因12，如可包含由seqidno.158表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物的s694p突变体所示的。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.159表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。更进一步地，宿主识别元件可以包含在694位携带突变(具体地，用脯氨酸(p或pro)取代丝氨酸(s或ser))并且在733位携带另外的突变(具体地，用天冬氨酸(asp或d)替换甘氨酸(g或gly)的突变)的突变的t7基因12，如突变体s694p-g733d所示，该突变体可包含由seqidno.160表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可由seqidno.161表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，宿主识别元件可包含在580位携带突变的突变的t7基因12。然而，该突变为引起在同一位置的赖氨酸残基(k580k)的沉默突变。在一些实施方案中，该t7基因12k580k可以由seqidno.135表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在一些其他实施方案中，本发明的宿主识别元件可以包含在694位和487位携带突变(具体地s694p突变、d487n突变)的突变的t7基因12。这样的突变体可以包含由seqidno.209表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可以由seqidno.210表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。在又一些其他实施方案中，本发明的宿主识别元件可以包含在694位、487位和580位携带突变(具体地s694p突变、d487n突变和k580k突变)的突变的t7基因12。这样的突变体可以包含由seqidno.209表示的氨基酸序列或其任何变体或衍生物。在又一些其他实施方案中，所述氨基酸序列可由seqidno.211表示的核酸或其任何变体或衍生物编码。此外，在一些实施方案中，本发明的突变体可以在非编码区中携带突变。更具体地，在一些实施方案中，编码本发明的宿主识别元件的核酸序列可以包含衍生自ypsp-g噬菌体的gp17编码序列或其任何变体或突变体，例如在gp17的起始atg密码子的上游-9bp处携带g(鸟嘌呤)到a(腺嘌呤)突变的gp17基因。在又一些其他具体实施方案中，gp17基因可以包含由seqidno.136表示的核酸序列。在又一些其他实施方案中，本发明的宿主识别元件可以包含衍生自ypsp-g噬菌体的gp17基因，例如，在gp17的起始atg密码子上游-10bp处携带a(腺嘌呤)到g(鸟嘌呤)突变的gp17基因。在又一些具体实施方案中，所述gp17基因可包含由seqidno.137表示的核酸序列。如将结合本发明的递送媒介物，具体地本发明的修饰的噬菌体更详细地阐述的，其宿主识别元件可以包含不同噬菌体的不同蛋白(例如，gp11、gp12、gp17)，这些蛋白可以是天然的或者可以包含本文公开的突变中的至少一种或其任何组合。

在本文描述的方法、试剂盒和组合物的一些实施方案中，宿主识别元件可以包含至少一种蛋白、至少两种蛋白、至少三种蛋白或更多种蛋白，具体地，与宿主受体相互作用的结构噬菌体蛋白。在一些具体实施方案中，这样的结构噬菌体蛋白可以为驻留在噬菌体尾部区域的蛋白。如本领域已知的，在噬菌体中，尾部为存在于大多数噬菌体中的蛋白复合体，并且参与宿主识别和基因组递送。尾部结构共有两个主要特征：尾部具有形成用于dna弹射的通道的中央管状结构，尾部被在宿主识别的初始步骤中必不可少的纤维或刺突(spike)包围。例如，t7噬菌体的尾部由gp11(衔接子)的十二聚体(即12个拷贝)和gp12(喷嘴(nozzle))的六聚体(即6个拷贝)组装而成，gp17的六个三聚体附着在其上。t7的六条尾丝附着在衔接子和喷嘴之间的边缘上，从而与两种蛋白接触。衔接子环负责将预先形成的尾部通过与由gp8的12个亚基组成的入口相互作用附着到原头(prohead)(8)。位于噬菌体的尾端的噬菌体组分可归类为“尾蛋白”或“尾管蛋白”(例如参照gp11和gp12)和尾丝(例如参照gp17)。如上文所述，本发明的宿主识别元件可以包含这些蛋白中的至少一种，这些蛋白衍生自本发明公开的任何噬菌体，可以包含突变的任何组合，具体地由本发明公开的任何突变的组合。

位于噬菌体尾端的噬菌体组分可以归类为尾蛋白(例如参照gp11和gp12)和尾丝(例如参照gp17)。在具体实施方案中，根据本公开内容的宿主识别元件可以包含至少一种尾丝或至少一种尾蛋白。

在一些实施方案中，驻留在所述噬菌体的尾部区域中的至少一种蛋白可以为尾蛋白和纤维蛋白中的至少一种。

在具体实施方案中，本文描述的宿主识别元件可以包含gp11、gp12和gp17中的至少一种，或其任何组合。在一些具体和非限制性实施方案中，这些蛋白可以是但不限于t7gp17、gp11或gp12，如本文描述的其任何突变体或如下文所述的任何天然的或突变的异源变体，或其任何组合。

驻留在感染如本文所定义的靶细胞的任何天然存在的噬菌体的尾部区域中的任何蛋白以及其任何组合都包括在本公开内容中，具体地，作为本发明的宿主识别元件的一部分。特别地，本公开内容涉及驻留在t7样噬菌体的尾部区域中的蛋白(例如本文定义的“尾蛋白”或“尾管蛋白”)。

各种噬菌体的纤维蛋白(t7gp17异源蛋白)的氨基酸序列的具体非限制性实例由seqidno：1至seqidno：9和seqidno：49、seqidno：55、seqidno：61、seqidno：67、seqidno：73和seqidno：79表示。应理解，通过本文所用的本发明的方法分离和鉴定的宿主识别元件在下文所公开的任何方法中可以指任何gp17蛋白或任何同源物、直向同源物或其任何修饰或变体。这样的gp17的具体和非限制性实例由表2提供(本文中在实验程序部分中公开，各个编码核酸序列在所附序列表中列出)。

换言之，在一些实施方案中，根据本公开内容的宿主识别元件可以包含纤维蛋白gp17，该纤维蛋白gp17包含具有选自以下的登录号的氨基酸序列：np_042005.1(由seqidno：1表示)、yp_002003979.1(由seqidno：2表示)、afk13534.1(由seqidno：3表示)、np_523342.1(由seqidno：4表示)、afk13438.1(由seqidno：5表示)、yp_001949790.1(由seqidno：6表示)、yp_004306691.1(由seqidno：7表示)、np_813781.1(由seqidno：8表示)、yp_002003830.1(由seqidno：55表示)、yp_009196379.1(由seqidno：49表示)、yp_009226215.1(由seqidno：9表示)、yp_003347555.1(由seqidno：61表示)、yp_003347643.1(由seqidno：67表示)、yp_009215498.1(由seqidno：73表示)、np_877477.1(由seqidno：79表示)，或其任何修饰或片段。

编码gp17样蛋白的上述氨基酸序列的相应核酸序列由以下表示：seqidno：25(肠杆菌噬菌体t7)、seqidno：26(肠杆菌噬菌体13a)、seqidno：27(耶尔森氏菌噬菌体ypsp-g)、seqidno：28(肠杆菌噬菌体t3)、seqidno：29(耶尔森氏菌噬菌体ypp-r)、seqidno：30(沙门氏菌噬菌体phisg-jl2)、seqidno：31(沙门氏菌噬菌体vi06)、seqidno：32(假单胞菌噬菌体gh-1)、seqidno：33(克雷伯杆菌噬菌体k11)、seqidno：50(肠杆菌噬菌体phieap-1)、seqidno：56(肠杆菌噬菌体e-2)、seqidno：62(克雷伯杆菌噬菌体kp32)、seqidno：68(克雷伯杆菌噬菌体kp34)、seqidno：74(克雷伯杆菌噬菌体vb_kpnp_kpv289)和seqidno：80(假单胞菌噬菌体phikmv)。在具体实施方案中，本文定义的纤维蛋白可以为gp17。

在某些实施方案中，本公开内容的宿主识别元件可以包含t7基因产物17(gp17)。由seqidno：1表示并由seqidno：25表示的核酸序列编码的t7gp17形成六条尾丝，每一条由gp17的同型三聚体组成。认为gp17尾丝负责与大肠杆菌lps的第一次特异性附着。蛋白三聚体形成由氨基末端尾部附着结构域、细长轴和由几个结节组成的羧基末端结构域组成的扭结纤维(10)。

因此应理解，本发明的宿主识别元件可以包含如本文之前描述的突变的gp17，或者可选择地，天然存在的或突变的异源gp17蛋白，例如，表2中公开的每种gp17蛋白。这些特异性宿主识别元件可以任选地与通过本发明制备的递送媒介物反式地提供，如将在本发明的第二方面中详细描述的。

在一些实施方案中，包含在本文定义的本发明的宿主识别元件内的尾蛋白可以是gp11和gp12中的至少一种。

各种噬菌体的尾蛋白(t7gp11和gp12异源蛋白)的氨基酸序列的具体非限制性实例在实验过程之后在本文的表2中由seqidno：10至seqidno：19和seqidno：45、seqidno：47、seqidno：51、seqidno：53、seqidno：57、seqidno：59、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：69、seqidno：71、seqidno：75和seqidno：77表示(各自的编码核酸序列在所附序列表中列出并由表2指示)。

换言之，本公开内容的宿主识别元件可以包含尾蛋白gp11，其具有选自以下的登录号所指的氨基酸序列：np_041999.1(由seqidno：10表示)、yp_004306685.1(由seqidno：11表示)、yp_001949784.1(由seqidno：12表示)、np_813775.1(由seqidno：13表示)和yp_002003824.1(由seqidno：14表示)、yp_009196373.1(由seqidno：45表示)、yp_009226221.1(由seqidno：51表示)、yp_003347549.1(由seqidno：57表示)、yp_003347638.1(由seqidno：63表示)、yp_009215492.1(由seqidno：69表示)和np_877472.1(由seqidno：75表示)，或其任何修饰、突变、变体或片段。

在某些实施方案中，编码gp11样蛋白的上述氨基酸序列的相应核酸序列由seqidno：34(肠杆菌噬菌体t7)、seqidno：35(沙门氏菌噬菌体vi06)、seqidno：36(沙门氏菌噬菌体phisg-jl2)、seqidno：37(假单胞菌噬菌体gh-1)、seqidno：38(克雷伯杆菌噬菌体k11)、seqidno：46(肠杆菌噬菌体phieap-1)、seqidno：52(肠杆菌噬菌体e-2)、seqidno：58(克雷伯杆菌噬菌体kp32)、seqidno：64(克雷伯杆菌噬菌体kp34)、seqidno：70(克雷伯杆菌噬菌体vb_kpnp_kpv289)和seqidno：76(假单胞菌噬菌体phikmv)表示。

更进一步地，实施方案涉及本公开内容的宿主识别元件，所述宿主识别元件可以包含具有选自以下的登录号所指的氨基酸序列或其任何修饰或片段的尾蛋白gp12：np_042000.1(由seqidno：15表示)、yp_004306686.1(由seqidno：16表示)、yp_001949785.1(由seqidno：17表示)、yp_002003825.1(由seqidno：18表示)和np_813776.1(由seqidno：19表示)、yp_009196374.1(由seqidno：47表示)、yp_009226220.1(由seqidno：53表示)、yp_003347550.1(由seqidno：59表示)、yp_003347639.1(由seqidno：65表示)、yp_009215493.1(由seqidno：71表示)和np_877473.1(由seqidno：77表示)。

在一些实施方案中，编码gp12样蛋白的上述氨基酸序列的相应核酸序列由seqidno：39(肠杆菌噬菌体t7)、seqidno：40(沙门氏菌噬菌体vi06)、seqidno：41(沙门氏菌噬菌体phisg-jl2)、seqidno：42(克雷伯杆菌噬菌体k11)、seqidno：43(假单胞菌噬菌体gh-1)、seqidno：48(肠杆菌噬菌体phieap-1)、seqidno：54(肠杆菌噬菌体e-2)、seqidno：60(克雷伯杆菌噬菌体kp32)、seqidno：66(克雷伯杆菌噬菌体kp34)、seqidno：72(克雷伯杆菌噬菌体vb_kpnp_kpv289)和seqidno：78(假单胞菌噬菌体phikmv)表示。

在本公开内容的其他具体实施方案中，宿主识别元件可以包含t7基因产物11(t7gp11，具有由seqidno：10表示并由seqidno：34表示的核酸序列编码的氨基酸序列)和/或t7基因产物12(gp12，具有seqidno：15表示并由seqidno：39表示的核酸序列编码的氨基酸序列)。

如上所述，如本文所定义的尾蛋白和纤维蛋白可以是相同的噬菌体(或任何其他递送媒介物)的，具体地突变的或以其他方式修饰的蛋白。可选择地，包含在识别元件内的这些尾蛋白或纤维蛋白可衍生自本文所定义的至少一种噬菌体，并且因此可以被认为是与包含所使用的宿主识别元件的噬菌体异源的蛋白。这些噬菌体将在下文中结合本发明的其他方面更详细地描述。这样的异源蛋白可以是突变的，或可以以其天然野生型形式存在。

应理解，尾蛋白和纤维蛋白可以衍生自本发明公开的任何噬菌体，具体地，衍生自本文中指示为递送媒介物的任何噬菌体及其任何组合。

还应理解，本发明的宿主识别元件可以包含任何突变体，特别是本发明公开的任何突变体或本文公开的任何突变体的组合。因此，本发明的宿主识别元件可以包含本文公开的任何蛋白，特别是任何噬菌体的gp11、gp12、gp17中的任一种，特别是本文公开的gp11、gp12、gp17中的任一种或其任何同源物。术语“同源物”用于定义与本发明定义的氨基酸序列保持最小同源性的氨基酸序列(多肽)，例如具体地，与任何识别元件的氨基酸序列或gp11、gp12、gp17中的任一种或本文公开的如上结构定义的突变体中的任一种具有至少约50％，更具体地至少约75％，甚至更具体地至少约85％，最具体地至少约95％的整体序列同源性。

如上所述，本公开内容提供了编码至少一种宿主识别元件或其任何蛋白(例如，gp11、gp12、gp17或其任何组合中的至少一种)，或其任何突变体、变体或片段的多个核酸分子，如上所述。这些核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。本文定义的术语“多个”指至少一个、至少两个、三个或更多个核酸分子，具体地，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10或更多个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100或更多个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、750个、800个、850个、900个、950个、1000或更多个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000或更多个、10,000个、20,000个、30,000个、40,000个、50,000个、60,000个、70,000个、80,000个、90,000个、100,000个或更多个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个或更多个核酸分子。步骤(a)中提供的核酸分子可以作为线性或环状的质粒dna提供。在其他实施方案中，所述分子可以作为质粒文库、噬粒文库或任何组合文库提供。

如前文所述，本发明提供的核酸分子包含至少一种宿主识别元件、包装信号和至少一种可选择元件或指示元件，所述可选择元件或指示元件能够鉴定和/或选择包含和/或表达编码所述元件的核酸分子的细胞。因此，这样的可选择元件可以是任何可检测部分、检测剂或指示剂，或者可选择地可以是选择标记或元件。选择元件(在本文中也称为“可选择元件”)可以是提供优势例如生长优势或者存活或任何其他参数中的任何优势的基因(或多个基因)。非限制性实例涉及使用抗生素抗性基因作为可选择标记。这些基因提供对任何抗微生物剂的抗性或者换言之，抑制、减少、压制(suppress)或减弱细胞，特别是细菌对任何抗微生物剂的易感性。

如本文所用的术语“抗微生物剂”指具有抗微生物活性(杀菌或抑菌)，即抑制生长和/或杀死细菌，例如革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的能力的任何实体。抗微生物剂可以是与不存在抗微生物剂相比，引起抑制细菌生长或细菌的活力降低至少约10％、20％、30％或至少约40％、或至少约50％或至少约60％或至少约70％，或者大于70％，例如，75％、80％、85％、90％、95％、100％，或者30％至70％或更大的之间的任何整数的任何剂。换句话说，抗微生物剂为与不存在抗微生物剂时相比，将微生物细胞诸如细菌的群体减少至少约30％或至少约40％，或至少约50％或至少约60％，或至少约70％或大于70％，或30％至70％之间的任何整数的任何剂。在一个实施方案中，抗微生物剂是特异性靶向细菌细胞的剂。在另一个实施方案中，抗微生物剂修饰(即抑制或活化或增加)在细菌细胞中特异性表达的途径。抗微生物剂可以包括任何化学品、肽(即抗微生物肽)、肽模拟物、实体或部分，或其杂交物的类似物，包括但不限于合成的和天然存在的非蛋白实体。

在一些实施方案中，抗微生物剂为具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯类、细霉素(leptomycin)及其相关的天然产物或类似物。抗微生物剂可以是已知具有期望的活性和/或性质的任何实体，或者可以选自各种化合物的文库。

因此，在一些实施方案中，作为多个核酸分子提供的核酸分子包含至少一种如上文讨论的宿主识别元件、至少一种包装信号和至少一种抗生素抗性基因。

本文所用的短语“抗生素抗性基因”指赋予对抗生素的抗性的基因，例如通过编码破坏所述抗生素化合物的酶、通过编码阻止抗生素化合物进入微生物的表面蛋白、通过主动将其输出，或者通过成为抗生素的靶的突变形式从而阻止其抗生素功能。

根据本发明可用作选择元件的抗生素抗性基因包括但不限于磷霉素(fosfomycin)抗性基因fosb、四环素抗性基因tetm、卡那霉素(kanamycin)核苷酸转移酶aadd、双功能氨基糖苷钝化酶基因aaca-aphd、氯霉素乙酰转移酶cat、莫匹罗星(mupirocin)抗性基因iles2、万古霉素(vancomycin)抗性基因vanx、vanr、vanh、vrae、vrad、甲氧西林(methicillin)抗性因子fema、fmta、mecl、链霉素腺苷酰转移酶spcl、spc2、antl、ant2、壮观霉素腺苷酸转移酶spd、ant9、aada2、亚碲酸盐(tellurite)抗性基因teha、tehb、kila、潮霉素磷酸转移酶抗性基因hpt、新霉素磷酸转移酶ii抗性基因nptii、营养缺陷型可选择标记基因ura3、met15/17、lys2、his3、leu2、trp1和met15、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因aprt、胸苷激酶基因tk1、博来霉素(zeocin)抗性基因shble和任何其他抗性基因。

在如本文所述的可选择元件为抗生素抗性基因的一些实施方案中，选择步骤(d)可包括使所述宿主细胞特别是“第二宿主细胞”在所述抗生素可选择标记的存在下生长。

应理解，术语选择性元件还包括在选择性条件下提供另一种生长优势的基因(或多种基因)，例如lac基因。在这种情况中，选择步骤(d)包括使所述宿主细胞在相应的条件(例如乳糖、x-gal等)下生长，或者在真核宿主细胞的情况中在胸苷激酶的条件下生长。

更进一步地，将理解本发明还包括在本文中用作指示剂的可以被可视化或以其他方式测量的任何其他可选择元件或标记，以区分和使得能够鉴定和/或选择含有或携带可选择元件以及与其附着的相容的宿主识别元件的细胞，所述相容的宿主识别元件能够将核酸分子转导至期望的宿主细胞。

如本文描述的术语“选择”指分离宿主细胞(具体地，“第二宿主细胞”)的过程，所述宿主细胞包含通过递送媒介物(例如噬菌体)变体注射或转导包含可选择元件的核酸序列而获得的可选择元件。包含可选择元件的宿主细胞的选择可以在对应于递送媒介物携带的可选择元件的任何选择条件下进行，例如通过使用含有选择被携带抗生素抗性基因的噬菌体感染的宿主细胞的抗生素的培养基。在为指示剂的可选择元件的情况中，第二宿主细胞可通过适合于细胞分选的任何手段来选择，或者通过引起细胞分离或富集包含可选择元件的细胞的任何手段来选择。

如上所述，本发明提供的核酸序列包含包装信号。本文定义的术语“包装信号”指例如病毒或噬菌体基因组中的核苷酸序列，所述核苷酸序列在感染周期期间指导病毒或噬菌体基因组包装成预成形的衣壳(包膜)。

在一些具体实施方案中，包装信号可以是t7包装信号，具体地，t7161-207、t738981-39364和t739718-39937，如以下seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22所表示的或其任何组合。组合的又一个非限制性实例由seqidno：23表示。上述包装信号为对t7特别相容的包装信号的非限制性实例。因此，当t7用作本发明的递送媒介物时，可以使用这些包装信号，如将结合本发明的其他方面特别是涉及包含本发明的宿主识别元件的递送媒介物描述的。然而，将理解本发明公开的任何噬菌体可以用作递送媒介物(例如，m13、p1、葡萄球菌噬菌体等)，并且因此，与所使用的任何噬菌体相容的任何包装信号均可适用并包含在本发明中。

如上所述，编码至少一种宿主识别元件的核酸分子或其任何变体或突变体也可以编码所述宿主识别元件的任何蛋白或任何片段。

更具体地，核酸序列可以编码上文公开的尾蛋白和纤维蛋白中的至少一种或其任何组合。例如，gp11、gp12和gp17中的至少一个；至少一个gp11、至少一个gp12和至少一个gp17；至少一个gp11和至少一个gp12；至少一个gp11和至少一个gp17；至少一个gp12和至少一个gp17，或其任何突变体、变体、片段或组合，特别是本发明公开的任何变体或突变体。

如本文所用的“片段”包括特定区域的氨基酸或dna序列的一部分。肽序列的片段比该特定区域短至少一个氨基酸，并且dna序列的片段比该特定区域短至少一个碱基对。还应理解，本文所用的“变体”和“突变体”指宿主识别元件或其任何蛋白，所述宿主识别元件或其任何蛋白携带与使用诱变剂相关的如上文指明的至少一种突变或取代。然而应注意，如本文所用，术语突变体还包括可以在不存在诱变剂的情况下发生(并且可在富集步骤期间分离)的自发突变。

更进一步地，本发明的方法包括以下步骤：在允许携带编码所述宿主识别元件中的至少一种或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物繁殖的条件下，使包含本文定义的多个核酸分子的第一宿主细胞与所述递送媒介物接触，以及回收在所述第一宿主细胞中繁殖的所得递送媒介物变体。

如本文所用，术语“接触”指使得递送媒介物，例如，本发明的噬菌体与宿主细胞直接或间接接触的定位。因此，本发明考虑将本发明使用的递送媒介物应用于期望的表面和/或直接应用于细菌细胞二者。这样的接触引起宿主细胞被递送媒介物特别是本发明使用的噬菌体感染。

本文定义的术语“繁殖”指从其“亲本”产生新的个体生物体(即递送媒介物，例如噬菌体)的过程。允许本文所用的递送媒介物繁殖的条件尤其指在本领域已知适于通过递送媒介物(例如噬菌体)感染宿主细胞的条件诸如温度(例如，取决于噬菌体和宿主，温度在4℃至100℃之间的范围；具体地，对于t7，这样的温度可以在10℃至42℃之间的范围，更具体地，37℃)、孵育时间(取决于使用的噬菌体和宿主，可以在10分钟至48小时之间的范围；具体地，对于t7，可以适用10分钟至120分钟的孵育时间)以及培养基下，将允许递送媒介物的第一宿主细胞与至少一种递送媒介物孵育或接触，如以下实施例所示的。

繁殖噬菌体的回收(或收集)可以通过本领域已知的任何方法进行，例如，使用氯仿和离心，如下所示例的。应理解，当人工或体外系统被用作“第一宿主细胞”时，包装的所得变体(例如，体外包装)随后被回收。

本公开内容的方法还涉及在选择性条件下或者在能够检测可选择元件的条件下，使第二宿主细胞与通过本文描述的方法获得的潜在相容的递送媒介物变体接触，从而分离包含能够将感兴趣的核酸分子递送至感兴趣的靶细胞的至少一种相容的宿主识别元件的递送媒介物变体。术语“相容的”指递送媒介物(例如噬菌体)携带能够识别并由此感染由本发明提供的第二宿主细胞所代表的靶宿主细胞的宿主识别元件。这样的噬菌体还能够将感兴趣的核酸分子转导至靶细胞。

如上所述，本公开内容涉及从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和表征宿主识别元件或编码至少一种宿主识别元件的核酸序列，所述宿主识别元件或编码至少一种宿主识别元件的核酸序列能够感染第二宿主细胞并使这些细胞获得选择性元件。由此获得编码相容的宿主识别元件的核酸序列。更具体地，本文所用的术语“表征”包括涉及分离、纯化、图谱分析(mapping)(例如，使用限制性图谱)和对相容的识别元件进行测序的任何方法。

本发明提供了用于制备、鉴定、表征、改进和优化至少一种宿主识别元件的方法，所述宿主识别元件可以是相容的并因此可以能够识别期望的分子识别并将期望的分子递送到感兴趣的靶宿主细胞中。下文描述的宿主细胞适用于分离宿主识别元件的方面，以及本发明所述的任何方面和方法，例如，用于制备包含本发明的宿主识别元件的递送媒介物的方法。

如上所述，本发明提供了有效制备递送媒介物的方法，所述递送媒介物包含与任何期望的感兴趣的靶宿主细胞相容的本发明的宿主识别元件。在一些实施方案中，为了选择合适的宿主识别元件，“第二宿主细胞”用作期望的靶宿主细胞的模型。因此，在另一些实施方案中，第二宿主细胞可以与感兴趣的靶细胞相同或相似。

在一些实施方案中，根据本公开内容的所述第二宿主细胞和所述感兴趣的靶细胞中的至少一种为原核宿主细胞和真核宿主细胞中的任一种。

如本文所用的“宿主细胞”指本领域已知的任何细胞，所述细胞可以使用本领域已知的程序用裸dna或本文定义的递送媒介物重组转化、转导或转染。“转化”和“转染”指通过核酸介导的基因转移将核酸，例如裸dna或本文定义的递送媒介物引入受体细胞中。

根据本公开内容的宿主细胞，并且特别是感兴趣的靶宿主细胞可以是原核的(缺乏膜结合的细胞核或任何其他膜结合细胞器的单细胞生物，例如细菌，例如真细菌和古细菌)或真核生物(含有细胞核和其他封闭在膜内的细胞器的细胞，包括动物细胞、植物细胞和真菌细胞)。本文所用并且如本领域已知的术语“真核细胞”指在细胞质中具有含有特化细胞器、封闭组织成染色体的遗传物质的膜结合的细胞核、以及通过有丝分裂或减数分裂进行分裂的精细系统的细胞的任何生物体。真核细胞的实例包括但不限于动物细胞、植物细胞、真菌和原生生物。更具体地，动物是动物界(也称为后生动物(metazoa))的多细胞真核生物，并且可以广泛地分为脊椎动物和无脊椎动物。脊椎动物具有脊椎(backbone)或脊柱(spine)(脊柱(vertebralcolumn))，并且包括鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。缺乏脊椎的无脊椎动物包括软体动物(蛤蜊、牡蛎、章鱼、枪乌贼、蜗牛)；节肢动物(千足虫、蜈蚣、昆虫、蜘蛛、蝎子、螃蟹、龙虾、虾)；环节动物(蚯蚓、水蛭)、线虫(丝虫、钩虫)、扁形动物(绦虫、肝吸虫)、刺胞动物(水母、海葵、珊瑚)、栉水母门动物(栉水母)和海绵。因此，本文所用的动物细胞涉及衍生自上文公开的任何动物细胞中的细胞，特别是哺乳动物细胞。

此外，根据本发明的真核宿主细胞可以是植物细胞。植物主要为多细胞的，主要为植物界的光合真核生物。该术语今天通常仅限于绿色植物“进化枝绿色植物亚界(cladeviridiplantae)”，包括开花植物、针叶树和其他裸子植物(gymnosperm)、蕨类植物(fern)、石松类植物(clubmoss)、角苔类植物(hornwort)、苔类植物(liverwort)、苔藓植物(moss)和绿藻，并且不包括红藻和褐藻。植物细胞的特征在于液泡和含有纤维素、半纤维素和果胶的细胞壁。被本发明的方法用作靶细胞的更另外的真核宿主细胞可以是真菌。真菌(fungi)或真菌(fungus)是包括包括微生物诸如酵母和霉菌以及蘑菇的真核生物群中的任何成员。

在另一些实施方案中，本发明使用的宿主细胞可以是原生生物。术语原生生物是留给微生物以及某些大型多细胞真核生物的，诸如海藻(kelp)、红藻和粘菌。可应用于本方面的原核细胞将在下文中描述。

本发明的方法以及在本发明的任何方面中描述的任何方法，在下文中涉及在其不同步骤中使用宿主细胞。应理解，这些宿主细胞，尽管在本文中称为“第一”、“第二”和“第三”宿主细胞，以及感兴趣的靶宿主细胞(第三宿主细胞结合涉及制备包含本发明的宿主识别元件的递送媒介物的其他方面来描述)可以是不同的宿主细胞，或者可选择地是相同的宿主细胞。在一些实施方案中，“第一”宿主细胞或“生产宿主细胞”为携带本发明的方法的步骤(a)提供的多个核酸分子的细胞或由本发明的方法的步骤(a)提供的多个核酸分子转化或转染的细胞。这些细胞用于展示各种宿主识别元件或其任何蛋白或片段，以及用于初始包装不同宿主识别元件以获得携带宿主识别元件的至少一种变体或其任何蛋白的各种递送媒介物，特别是噬菌体的目的。在一些实施方案中，这些第一宿主细胞可以允许本发明使用的递送媒介物。这些变体噬菌体在下一步骤中使用“第二”宿主细胞选择。

在又一些其他实施方案中，如本文所用的“第二”宿主细胞可以是感兴趣的靶宿主细胞或至少是与感兴趣的靶细胞足够相似的细胞。在更具体的实施方案中，本发明的方法针对并且旨在鉴定携带至少一种宿主识别元件的递送媒介物变体，所述宿主识别元件能够识别、感染感兴趣的核酸分子并将感兴趣的核酸分子转导至由“第二”宿主细胞代表的靶细胞。这些细胞在选择步骤中使用。应注意，这些“第二”宿主细胞或感兴趣的宿主细胞可以是真核细胞(如上文讨论的)或原核细胞。在又一些其他实施方案中，本发明的方法使用的“第二”宿主细胞可以与靶细胞相同或相似。宿主细胞的非限制性实例可以是在以下实施例中使用的δtrxaδwaac宿主。在一些具体和非限制性实施方案中，“第二宿主细胞”可以是以下中的任何一种：bw25113δtrx，大肠杆菌δtrxa；sso4727，宋内志贺氏菌4727；sen4510，肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)亚利桑那血清型菌株sarc5；kpn4718，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc10031；kpn4800ii，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc9997；ecl4723，阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)阴沟亚种atcc13047；sen4001，肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株lt2；k390，克雷伯杆菌属390；eae4739，产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)atcc51697；sen4513，肠道沙门氏菌肠炎血清型pt4；kpn4719，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc13882；和eco4507，大肠杆菌atcc25922。本发明使用的这些宿主细胞可以代表是期望的感兴趣的靶宿主细胞的临床分离株。应理解，在一些实施方案中，可以反映感兴趣的靶宿主细胞的“第二宿主细胞”可以包含经表征的或未经表征的细胞的均质群体，或者可选择地，经表征的或未经表征的细胞的异质群体或混合物(包含至少两种不同的类型、菌株、分离株等)。如反映感兴趣的宿主细胞的这些细胞可以是从含有感兴趣的宿主细胞的生物样品或环境样品中分离(从受感染的受试者获得的样品或从含有这些细胞的物质、表面或物品中获得的样品)的已知的和已鉴定的细胞或未知的细胞。

此外，根据某些实施方案，与本发明的其他方面结合使用的“第三”宿主细胞可以被本发明的方法使用，用于包装和创建携带与靶宿主细胞相容的至少一种宿主识别元件的本发明的递送媒介物，特别是修饰的噬菌体。在一些实施方案中，这些“第三”宿主细胞还可以用于包装应由本发明创建的媒介物(例如，修饰的噬菌体)转导到靶宿主细胞中的感兴趣的核酸分子。这些“第三宿主细胞”在本文中也称为“生产细胞”(例如图5a)。

如上所述，“第一”宿主细胞、“第二”宿主细胞和“第三”宿主细胞以及“感兴趣的靶宿主细胞可以是如上文讨论的真核细胞，或者可选择地是原核细胞，特别是细菌细胞。

在另一些其他具体实施方案中，“第二”宿主细胞以及感兴趣的靶宿主细胞可以是原核细胞，特别是细菌细胞。

根据本公开内容的原核细胞包括细菌细胞。在该上下文中，术语“细菌(bacteria)”(单数形式“细菌(bacterium)”)指任何类型的单细胞微生物。本文中术语“细菌”和“微生物”是可互换的。本文中该术语包括根据其基本形状属于一般类别的细菌，即球形(球菌(cocci))、杆状(杆菌(bacilli))、螺旋形(螺旋菌(spirilla))、弧形(弧菌(vibrios))或螺旋桨形(螺旋体(spirochaetes))，以及以单细胞、成对、成链或成簇存在的细菌。

应注意，本文所用的术语“细菌”指以单细胞或以单细胞簇或聚集体存在的任何原核微生物。在更具体的实施方案中，术语“细菌”特别指革兰氏阳性、革兰氏阴性或抗酸性生物体。革兰氏阳性细菌可以认为是保留在区分细菌的革兰氏染色方法中使用的结晶紫染料，并因此在显微镜下表现为紫色的。革兰氏阴性菌不保留结晶紫，使得阳性鉴定为可能。换言之，本文中术语“细菌”应用于在细胞膜外的细胞壁中具有较厚的肽聚糖层的细菌(革兰氏阳性)，以及在夹在细胞质的细胞内膜(innercytoplasmiccellmembrane)和细菌外膜之间具有它们的细胞壁的薄肽聚糖层的细菌(革兰氏阴性)。该术语还适用于一些细菌诸如异常球菌属(deinococcus)，这些细菌由于厚的肽聚糖层的存在而染色为革兰氏阳性，但是还拥有外层细胞膜，并且因此被认为是在单层(monoderm)细菌(革兰氏阳性)和双层(diderm)细菌(革兰氏阴性)之间过渡的中间体。抗酸性生物体如分枝杆菌属(mycobacterium)在其细胞壁内含有大量的被称为分枝菌酸的脂质物质，所述分枝菌酸耐受被常规方法诸如革兰氏染料染色。

特别感兴趣的感兴趣的靶宿主细胞(也可以用作“第二”宿主细胞)，可以是涉及医院内感染的任何细菌或这样的细菌的任何混合物。术语“医院内感染”指医院获得性感染，即医院环境诸如表面和/或医务人员对其发展有利并且由患者在住院期间获得的感染。医院内感染为由抗抗生素的生物体潜在地导致的感染。医院内感染对发病率和死亡率具有影响并造成明显的经济负担。鉴于升高水平的抗生素抗性和住院患者的疾病的增加的严重程度，该问题需要急迫的解决方案。

常见的医院内生物体包括艰难梭菌(clostridiumdifficile)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌(staphylococci)、万古霉素抗性肠球菌(enterococci)、抗性肠杆菌科(enterobacteriaceae)、铜绿假单胞菌、不动杆菌属和嗜麦芽糖寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)。

医院内感染病原体可细分为革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌)、革兰氏阳性球菌(粪肠球菌和屎肠球菌)、革兰氏阴性棒状生物体(肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌(klebsiellaoxytoca)、大肠杆菌、proteusaeruginosa、沙雷氏菌属属种(serratiaspp.))、革兰氏阴性杆菌(产气肠杆菌、阴沟肠杆菌)、好氧革兰氏阴性球杆菌(鲍曼不动杆菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌)和革兰氏阴性好氧杆菌(嗜麦芽糖寡养单胞菌，以前称为嗜麦芽假单胞菌(pseudomonasmaltophilia))。除了许多其他以外，铜绿假单胞菌为一种极其重要的医院内革兰氏阴性需氧杆病原体。在特定的和非限制性实施方案中，这样的感兴趣的靶细胞可以是抗生素抗性靶细胞，或包含所述细胞的任何混合物或群体。特别感兴趣的是鉴定与任何“eskape”病原体相容的宿主识别元件。如本文所示，这些病原体包括但不限于屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌。

因此，在本发明的一些实施方案中，涉及靶宿主细胞，所述靶宿主细胞可以是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)、艰难梭菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌物种(特别是eskape细菌)中的至少一种的任何菌株的细菌。

在更具体的实施方案中，细菌可以是铜绿假单胞菌、化脓性链球菌、艰难梭菌和金黄色葡萄球菌中的任何一种。

在其他实施方案中，本发明所指的细菌可以包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)、假结核耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌(vibriocholerae)、宋内志贺氏菌、百日咳杆菌(bordetellapertussis)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、炭疽芽孢杆菌、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)和单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogens)。

在其他具体实施方案中，感兴趣的靶细胞可以是任何大肠杆菌菌株，特别是o157:h7大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌(eaec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠致病性大肠杆菌(epec)、肠毒性大肠杆菌(etec)和弥散附着性大肠杆菌(daec)中的任何一种。

在其他实施方案中，根据本公开内容的原核细胞可以是大肠杆菌、假单胞菌属属种特别是铜绿假单胞菌、葡萄球菌属属种特别是金黄色葡萄球菌、链球菌属属种特别是化脓性链球菌、沙门氏菌属属种、志贺氏菌属属种、梭菌属属种特别是艰难梭菌、肠球菌属属种特别是屎肠球菌、克雷伯杆菌属属种特别是肺炎克雷伯杆菌、不动杆菌属属种特别是鲍曼不动杆菌、耶尔森氏菌属属种特别是鼠疫耶尔森氏菌和肠杆菌属物种中的至少一种的细菌细胞，或其任何突变体、变体分离株或其任何组合。在又一些其他实施方案中，细菌诸如空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)或其任何分离株或变体也可以在本文中用作根据本发明的“第二细胞”和/或感兴趣的靶细胞。

在一些其他实施方案中，本文所用的第二宿主细胞可以是限制性宿主，并且感染所述细胞的噬菌体变体(即所用的递送媒介物)不(天然地)能够在所述限制性宿主中繁殖。应理解，在某些实施方案中，如通过本发明使用的“第二宿主细胞”所代表的，(与第二宿主细胞相同或足够相似的)靶宿主细胞也可以是限制性宿主。换言之，在具体实施方案中，如本文描述的靶细胞是限制性宿主细胞。在另一些实施方案中，在所述方法步骤(c)中使用的第二宿主细胞可以是与感兴趣的靶细胞相同的细胞，或其任何混合物或群体或是与所述感兴趣的靶细胞具有足够相似性的细胞。

应理解，在一些实施方案中，“第一”宿主细胞可以是与感兴趣的靶细胞不同的宿主细胞。在一些实施方案中，第一宿主细胞为细菌细胞。以类似的方式，“第三”宿主细胞可与感兴趣的宿主细胞不同，并从而与“第二”细胞不同，尽管它们可以是细菌细胞。在其他实施方案中，“第一”宿主细胞和“第三”宿主细胞可以是相似或相同的细菌细胞。然而，如前文所述的，当指由本发明的方法、组合物、修饰的噬菌体和试剂盒中的任一项使用的任何宿主细胞时，术语“宿主细胞”还包括使用模拟细胞、囊泡、细胞器甚至体外包装系统的人工细胞或系统。

还应理解，本发明还包括通过本发明的方法制备或产生的任何宿主识别元件。在另一些其他具体的实施方案中，本发明还包括本发明公开的任何宿主识别元件或本文公开的任何杂交体或突变体。本发明还包括本文提供的宿主识别元件中所包含的任何蛋白，特别是本发明公开的突变的gp11、gp12和gp17突变蛋白中的任一种。

通过另一个方面，本发明涉及用于制备核酸递送媒介物的方法。具体地，具有扩展的宿主范围的递送媒介物。在更具体的实施方案中，该方法可以包括在第一步骤(a)中提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个核酸分子。应注意，这些核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。下一步骤(b)涉及使包含所述多个核酸分子的第一宿主细胞与携带编码至少一种缺陷识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的至少一种递送媒介物在允许所述递送媒介物繁殖和/或包装的条件下接触。该步骤之后是回收在这些第一宿主细胞中繁殖和/或包装的所得递送媒介物变体。接下来在步骤(c)中，使第二宿主细胞与步骤(b)中回收的递送媒介物变体接触。然后在步骤(d)中选择这些第二宿主细胞用于由步骤(c)获得或得到的包含可选择元件的细胞。下一步骤(e)涉及从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和/或表征至少一种宿主识别元件或编码宿主识别元件的任何核酸序列，以获得编码与第二宿主细胞相容的至少一种宿主识别元件的核酸序列。最后，在步骤(f)中，将编码步骤(e)中获得的相容的宿主识别元件的核酸序列引入第三宿主细胞中。应注意，将核酸序列引入细胞中可以通过本领域已知的任何方法进行，如下文将详细描述的(例如，转染、转导和转化)。然后使这些宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的至少一种递送媒介物接触。就此而言，之前定义和公开的任何递送媒介物也适用于本文。这在一些实施方案中在允许包装和/或繁殖所述递送媒介物的条件下进行，所述递送媒介物现在包含步骤(e)中获得的相容的宿主识别元件。因此，该步骤引起获得包含所述相容的宿主识别元件中的至少一种的递送媒介物变体，所述递送媒介物变体在一些实施方案中，由第三宿主细胞反式提供。通过本发明的方法获得的该递送媒介物变体可能能够将感兴趣的核酸分子递送至感兴趣的靶细胞。

如上文详细描述的，本公开内容尤其涉及使包含本文描述的多个核酸分子的第一宿主细胞与递送媒介物接触，以及用编码通过本公开内容的方法获得的相容的宿主识别元件的核酸序列转化第三宿主细胞。在一些实施方案中，第一宿主细胞和第三宿主细胞可以是如下文描述的细菌细胞，具体如发明人所例示。在一些其他实施方案中，宿主细胞可以是相同物种或菌株的细菌细胞。第一宿主细胞和第三宿主细胞在本文中也称为“生产细胞”(例如，图3a、图5a)。

应理解，在一些实施方案中，第三宿主细胞可以包含编码至少一种宿主识别元件(相同或不同)的至少一种核酸序列。因此，本发明在其一些实施方案中还包括在该步骤中获得的包含至少一种或更多种相同或不同的宿主识别元件的递送媒介物。具体地，至少1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种或更多种，更具体地，1种至10种，甚至更具体地，可以相同或至少部分地彼此不同的六种不同的宿主识别元件。在包含至少两种不同宿主识别元件的情况中，通过本发明方法制备的递送媒介物可与至少一种或更多种感兴趣的宿主细胞相容。在这种情况中，这种媒介物的宿主范围因此可以被扩展。

应注意，在一些实施方案中，“第一宿主细胞”和“第三宿主细胞”中的至少一个在本文中也可以称为“生产细胞”。在一些实施方案中，这些细胞支持递送媒介物的繁殖，并且因此用于包装和/或制备和回收递送媒介物。在又一些其他实施方案中，本发明的方法用于制备与期望的靶宿主相容的递送媒介物。在一些具体的实施方案中，被本发明的方法用作期望的靶宿主细胞的模型的“第二宿主细胞/”可以与期望的感兴趣的靶宿主细胞相同或足够相似。因此，本发明的方法旨在制备与期望的感兴趣的靶宿主特异性相容的递送媒介物。

然而，应理解，当提及“细胞”(例如，第一生产细胞、第二生产细胞、第三生产细胞和感兴趣的宿主细胞)时，本发明还包括本发明例示和公开的任何真核细胞或原核细胞的附加物，在一些具体实施方案中，模拟或模仿细胞、人工细胞、囊泡等的其他系统。

还应理解，在步骤(b)中，当提及使递送媒介物与包含编码宿主识别元件的多个核酸序列的细胞接触的步骤时，本发明还包括体外包装系统。因此，在一些实施方案中，在允许在其中包装多个核酸序列的条件下使多个核酸序列与这样的递送媒介物接触或暴露于这样的递送媒介物是可能的。更具体地，体外包装也可在水-油乳液中充当“细胞”的水滴中发生。这种被称为icv(体外区室化)的方法被开发用于蛋白的体外进化[(tawfik,d.s.&griffiths,a.d.man-madecell-likecompartmentsformolecularevolution.nat.biotechnol.16,652–656(1998)]，但也可以用作用于噬菌体包装的平台。因此，在一些实施方案中，这些系统也可以是适用于本发明的人工系统的非限制性实例。

因此，在一些具体实施方案中，应注意，本发明的方法可以特别适用于扩展或调节所述递送媒介物的宿主范围。

如本文所用，在宿主范围的上下文中术语“扩展”或“调节”意指影响、改变(varying)、增强、调整或改变(changing)特定核酸递送媒介物识别感兴趣的核酸并将感兴趣的核酸转导至不被认为是其天然宿主的特定宿主细胞的能力。

更具体地，在一些具体实施方案中，如本发明所公开的，在将核酸递送媒介物的宿主识别元件或其任何蛋白或片段替换后，核酸递送媒介物可以通过至少一种宿主识别原件、其蛋白或其任何组合识别不是其天然宿主的宿主。具体地，从其他天然存在的递送媒介物(例如，异源宿主识别元件或其蛋白)或者可选择地通过用突变的或以其他方式改变的宿主识别元件替换而获得的任何宿主识别元件由本发明的gotrap平台执行。应理解，本发明还包括上述的任何组合，特别是，可以在其编码区或非编码区中携带至少一个突变或至少两个突变的组合的杂交媒介物的用途。

更具体地，这样的替换可以是通过本发明的递送媒介物(在一些实施方案中携带缺陷识别元件)包装宿主识别元件的结果，这继而可以能够识别并且促进识别不是其天然宿主的宿主细胞。如上所述，替换宿主识别元件可以是源自特异于不同宿主的不同递送媒介物的异源元件，或者可选择地，突变的或以其他方式改变以识别其他宿主的改变的同源识别元件或两者的任何组合。在一些具体实施方案中，通过宿主识别元件或至少一些识别元件的这样的替换，核酸递送媒介物可以识别不是其天然宿主的宿主。在其他实施方案中，这样的非天然宿主可以是限制性宿主或非许可性宿主。

如本文所用，术语“限制性”或“非许可性”指不许可(permit)或不允许(allow)特定核酸递送媒介物感染或侵入和/或其繁殖的宿主。限制性宿主细胞是禁止某些核酸递送媒介物侵入到其中的细胞。

在某些实施方案中，用于鉴定和/或分离与感兴趣的靶细胞相容的宿主识别元件的方法是其中所述第二宿主细胞可以与所述感兴趣的靶细胞相同或相似。

对于选择步骤(d)中的“第二宿主细胞”，可以使用靶宿主细胞(例如，任何临床菌株，例如，sso4727，宋内志贺氏菌4727；sen4510，肠道沙门氏菌亚利桑那血清型菌株sarc5；kpn4718，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc10031；kpn4800ii，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc9997；ecl4723，阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047；sen4001，肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株lt2；肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型(atcc14028)；k390，克雷伯杆菌属390；eae4739，产气肠杆菌atcc51697；sen4513，肠道沙门氏菌肠炎血清型pt4；kpn4719，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc13882；eco4507，大肠杆菌atcc25922中的一种)，其任何组合或本发明公开的任何细菌细胞。可选择地，可以使用表现出与所述期望的靶宿主细胞相似性的宿主细胞模型(例如不支持噬菌体生长且缺乏噬菌体受体的宿主菌株诸如δtrxaδwaac)。更进一步地，在某些实施方案中，本发明包括可以从临床生物样品获得的经表征的细胞或未经表征的任何细胞作为“第二宿主细胞”的用途。

如上所述，本发明涉及用于扩展或调节核酸递送媒介物的宿主范围的方法。调节根据本公开内容的核酸递送媒介物的宿主范围尤其能够通过调节、替换或改变核酸递送媒介物特别是噬菌体中的至少一种宿主识别元件，以改变、扩展或调节宿主-媒介物识别模式来进行。本发明还包括用相同或不同的宿主识别元件替换至少一个宿主识别元件，从而提供包含相同或不同的至少两种或更多种识别元件并因此可识别另外的靶宿主的媒介物。

如本领域已知的，为了启动感染或转导，噬菌体需要吸附到宿主表面，侵入细胞壁并将遗传物质注入到宿主中。用于在噬菌体基因组注入之前启动与细菌宿主的连接的机构被称为尾部，并且专用于特定宿主识别的吸附机构于尾端。噬菌体和宿主之间的相互作用发生在噬菌体尾蛋白和细菌受体之间，细菌受体为蛋白或脂多糖(lps)。这些相互作用决定噬菌体的宿主特异性和宿主范围。

为了扩展或改变递送媒介物诸如噬菌体的宿主范围，本发明提供了一种方法，该方法基于用与感兴趣的宿主相容并且因此允许识别感兴趣的宿主的宿主识别元件替换给定噬菌体的至少一种宿主识别元件或其任何蛋白或部分。因此，本公开内容提供了编码至少一种宿主识别元件或其任何蛋白、片段部分或其任何变体或突变体的多个核酸分子。如上所述，这些核酸分子还包含能包装在噬菌体中的至少一种包装信号。这些核酸分子还包含编码能够选择适当的相容的宿主识别元件的可选择元件的至少一种核酸序列。

在一些非限制性实施方案中，通过用从其他天然存在的递送媒介物获得的宿主识别元件替换递送媒介物特别是噬菌体中的至少一种宿主识别元件后，核酸递送媒介物可以变得与非天然许可性宿主细胞(限制性宿主或非许可性宿主)“相容”或可识别该非天然许可性宿主细胞(限制性宿主或非许可性宿主)。即用可以是天然的或修饰的异源元件替换至少一个宿主识别元件。

至于用至少一种异源宿主识别元件(使得能够识别期望的宿主)替换噬菌体的宿主识别元件或其任何蛋白、部分或片段，应理解，这些宿主识别元件可以是衍生自任何噬菌体的元件。更具体地，这些宿主识别元件可以衍生自本文之前公开的任何噬菌体。在又一些更具体的实施方案中，这些识别元件可以以其天然形式(在异源元件的情况中)使用，或者可选择地以改变的形式，例如，突变或截短的(在异源元件或同源元件的情况中)使用，或其任何组合。因此，在一些其他非限制性实施方案中，核酸递送媒介物可以在修饰或突变其至少一种宿主识别元件后与非天然许可性宿主相容或可以识别非天然许可性宿主，如下文详述。本发明的方法可以适用于制备前文定义的任何递送媒介物。

在其他实施方案中，通过本发明的方法制备的递送媒介物可以是至少一种噬菌体。如上所述，噬菌体可以来自，例如短尾噬菌体科、肌尾噬菌体科或长尾噬菌体科、脂毛噬菌体科或古噬菌体科。

在另一些实施方案中，用作媒介物的噬菌体和/或通过本发明的方法制备的修饰的噬菌体可以是t7样病毒和t4样病毒中的至少一种。

应注意，本发明公开的任何噬菌体也可以适用于该方面。

在某些实施方案中，第二宿主细胞和感兴趣的靶细胞中的至少一种可以是原核宿主细胞和真核宿主细胞中的任何一种。

在更具体实施方案中，这样的原核细胞可以是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、艰难梭菌、屎肠球菌、志贺氏菌属属种(例如宋内志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)和痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae))、沙门氏菌属属种(例如，肠道沙门氏菌和邦戈沙门氏菌(salmonellabongori))、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、鼠疫耶尔森氏菌和肠杆菌属物种中的任一种的细菌细胞或其任何突变体、变体或任何组合或混合物，或样品中存在的经表征的细胞或未经表征的细胞的任何混合物。

在一些实施方案中，第一宿主细胞和第三宿主细胞可以是细菌细胞。在一些其他实施方案中，所述细胞可以是相同菌株的细菌细胞。

在一些实施方案中，本发明的方法使用的第二宿主细胞可以是限制性宿主。这样，感染所述宿主的噬菌体变体不能在所述限制性宿主中繁殖。

在更进一步的实施方案中，本发明提供的宿主识别元件或其任何蛋白或片段可以是异源元件(天然的或改变的)，或者可选择地被改变或突变的同源元件。因此，应理解，本发明的方法，特别是在本文中被称为gotrap平台的情况中，还可以包括使步骤(a)中提供的多个核酸分子经受诱变剂的步骤，从而获得编码至少一种突变的宿主识别元件的多个核酸分子。应注意，在某些实施例中，本发明的方法的所述版本中的任何步骤可以再重复至少一次，并且具体地至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次、20次、30次、40次、50次、60次、70次、80次、90次、100次或更多次。在某些实施方案中，所述宿主识别元件中的每一个包含至少一个突变或修饰。

更进一步地，在某些实施方案中，如本文所用的用于制备本发明的递送媒介物的宿主识别元件可以包含驻留在噬菌体尾部区域中的至少一种蛋白。更具体地，驻留在所述噬菌体的尾部区域中的至少一种蛋白可以是尾蛋白和纤维蛋白中的至少一种。在一些特定实施方案中，宿主识别元件可以包含纤维，特别是gp17。在一些其他实施方案中，尾蛋白可以是gp11和gp12中的至少一种。

然而，应理解，在某些实施方案中，包含在通过本发明的方法制备的递送媒介物内的宿主识别元件可以包含gp11、gp11和gp17或其任何组合。这样的组合的具体的非限制性实例可以包括gp11、gp12和gp17；gp11、gp12和gp17中的一种；gp11和gp12；gp11和gp17；gp12和gp17，所述gp11、gp12和gp17衍生自本文公开的任何噬菌体，和/或包含本发明公开的任何突变及其任何组合。

在一些具体实施方案中，由本发明的方法提供的核酸分子包含除宿主识别元件外的可选择的元件，所述可选择元件可以是抗生素抗性基因。

在一些具体实施方案中，第二宿主细胞可以与感兴趣的靶细胞相同或相似。

在又一些其他实施方案中，第三宿主细胞可以还包含至少一种感兴趣的核酸分子，所述核酸分子任选地可操作地连接到至少一种包装信号。因此，根据这样的实施方案，步骤(f)中获得的递送媒介物可以还包含包装在其中的所述感兴趣的核酸分子。

本发明的另一方面涉及将感兴趣的核酸分子转导入感兴趣的靶宿主细胞的方法，该方法包括：在第一步骤(a)中，提供感兴趣的核酸分子，所述核酸分子任选地可操作地连接到至少一种包装信号。下一步骤(b)涉及提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的核酸序列。应注意，在某些实施方案中，识别元件应与所述感兴趣的靶细胞相容。下一步骤(c)涉及将(a)的核酸分子和(b)的核酸序列引入生产宿主细胞中，以获得包含感兴趣的核酸分子和编码与感兴趣的宿主相容的相容的宿主识别元件的核酸序列的宿主细胞。接下来在步骤(d)中，使步骤(c)中获得的宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物接触。该步骤之后为(e)，从(d)的感染的宿主细胞中回收包含包装在其中的感兴趣的核酸分子的递送媒介物。应注意，回收的递送媒介物包含与感兴趣的靶细胞相容的相容的宿主识别元件。在某些实施方案中，宿主识别元件可以反式地提供给本发明用作递送媒介物的噬菌体。

下一步骤(f)涉及使含有感兴趣的靶细胞的受试者、组织、器官、表面、物质和物品中的至少一种的所述感兴趣的靶细胞与有效量的在步骤(e)中获得的所述递送媒介物中的至少一种接触，从而将所述感兴趣的核酸分子转导至感兴趣的靶宿主细胞中。

在一些实施方案中，如本文在步骤(c)中所用的“生产宿主细胞”可以等同于上文结合本发明其他方面描述的“期望的宿主细胞”。如本文的步骤(c)中所用的术语“引入到宿主细胞中”指将外源dna掺入到这些细胞中。将外源dna引入到宿主细胞中的非限制性方法包括转化、磷酸钙介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染和脂质体介导的转染、电穿孔和病毒载体转导。任何本领域公认的外源dna递送方法可以用于将感兴趣的核酸分子和/或编码通过本发明的方法分离的宿主识别元件的核酸序列引入到宿主细胞中。另外的非限制性实例，以下外源dna递送方法可以用于引入感兴趣的核酸分子：直接注射、氨基酸介导的基因递送、基因枪基因递送和热休克。

如上所述，本发明的方法旨在使用本发明的改进的递送媒介物将至少一种感兴趣的核酸序列转导至期望的宿主细胞中。

术语“多核苷酸”或“核酸序列”或“核酸分子”在本文中指核酸的聚合物，诸如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。如本文所用，“核酸”(亦或核酸分子或核苷酸)指任何单链或双链的dna或rna多核苷酸、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(pcr)生成的片段以及通过连接、切割、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任一种生成的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸的单体组成(诸如dna和rna)，或者由天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映异构体形式)或修饰的核苷酸组成，或其任何组合。本文中该术语还包括cdna，即通过逆转录酶(rna依赖性dna聚合酶)的作用从rna模板产生的互补或拷贝dna。

如本文定义的术语“感兴趣的核酸分子”指期望将其插入到感兴趣的靶宿主细胞，特别是非许可性宿主中的任何核酸序列。应注意，感兴趣的核酸序列可以是调控序列或编码蛋白产物或任何产物的序列，将该序列转导至宿主细胞中可以操作细胞或包含感兴趣的靶细胞的任何细胞群体的性质、数量、量、百分比、生存力、稳定性、分布、位置或任何其他参数。

在某些实施方案中，感兴趣的核酸序列可以包含crispr-cas系统，如将在下文中公开的，或者可选择地，可以编码期望的物质，例如具有任何治疗、诊断或工业实用性的物质。举例说明本发明提供的平台的一些应用的几个非限制性实施方案还说明了可以通过本发明的媒介物和方法递送的有用的“感兴趣的核酸序列”的几个非限制性实施方案，在下文中公开。

尽管本发明具体涉及特别适用于递送核酸分子的媒介物，但应理解，本发明还包括本发明的递送媒介物用于将任何分子，包括蛋白、多肽和小分子(或可由本发明的媒介物包装的任何其他物质)递送至感兴趣的靶细胞的用途。

在一些具体实施方案中，本发明的方法包括使含有靶细菌细胞的表面、物质或物品，特别是固体或液体表面、物品或任何物质中的靶细胞与递送媒介物，特别是本发明的修饰的噬菌体接触的步骤。

如所用的，本文中术语“接触”指使得本发明的噬菌体与细菌细胞直接或间接接触的定位。因此，本发明考虑将本发明的噬菌体应用于期望的表面和/或直接应用于细菌细胞两者。使表面与本发明公开的噬菌体或其任何试剂盒和组合物接触可以使用本领域已知的任何方法实现，包括喷涂(spraying)、涂抹(spreading)、润湿(wetting)、浸泡(immersing)、浸渍(dipping)、涂漆(painting)、超声波焊接(ultrasonicwelding)、焊接(welding)、粘合(bonding)或粘附(adhering)。适用于本发明的该方面的各种表面(生物表面或非生物表面)将在下文中结合通过本发明的方法和媒介物操作细胞群体的方面描述。

更进一步地，本发明的方法还包括使感兴趣的靶细胞与有效量的本发明的噬菌体、试剂盒和组合物接触，同样在细胞处于受试者，特别是哺乳动物受试者中的情况下。因此，在一些实施方案中，本发明的方法还可以包括向有相应需要的受试者施用有效量的本发明的噬菌体、试剂盒和组合物的步骤。各种适用的施用模式将结合本发明的其他方面在下文详细描述，并且所有这些模式也适用于此方面。

应注意，在某些实施方案中，步骤(b)中提供的编码至少一种相容的宿主识别元件的核酸序列可通过包括以下步骤的方法获得：在第一步骤(a)中，提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个核酸分子。应注意，这些核酸分子还可以包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。在下一步骤(b)中，使包含所述多个核酸分子的第一宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的递送媒介物在允许所述递送媒介物繁殖的条件下接触，并回收在所述第一宿主细胞中繁殖的所得递送媒介物变体。下一步骤(c)涉及使第二宿主细胞与步骤(b)中获得/回收的递送媒介物变体接触。在步骤(d)中，选择步骤(c)中获得的包含所述可选择元件的宿主细胞的集落；以及在步骤(e)中，从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和表征编码宿主识别元件的核酸序列，以获得编码与所述感兴趣的靶细胞相容的相容的宿主识别元件的核酸序列。

在一些另外的实施方案中，相容的宿主识别元件可以通过在本文公开的任何实施方案中定义的方法提供。

在一些实施方案中，如选项(a)中所示，通过本发明的方法转导的感兴趣的核酸序列可以基于crispr系统。更具体地，这样的核酸序列可以包含至少一种敏化组分，该敏化组分靶向感兴趣的靶宿主细胞例如细菌中的不期望的基因或致病基因，并且同时为转导的感兴趣的靶宿主细胞提供选择性优势。更具体地，这样的组分可以包含至少一个cas基因和至少一个成簇的、规则间隔的短回文重复序列(crispr)阵列。应注意，crispr的至少一个间隔区靶向包含在细菌的致病基因或不期望的基因内的前间区(proto-spacer)，以便特异性灭活所述致病基因或不期望的基因，并且所述crispr的至少一个间隔区靶向包含在选择性组分中的前间区，以便特异性灭活所述选择性组分。

在选项(b)中说明的某些可选择的或另外的实施方案中，感兴趣的核酸序列可以在本文中用于产生包含本发明的修饰的噬菌体媒介物的选择性组分，所述修饰的噬菌体媒介物包含含有至少一个前间区，特别是由本文(例如选项(a)中)描述的敏化组分靶向的至少一个前间区的至少一种核酸序列。因此，在一些实施方案中，本发明的方法可以应用于制备选择性元件。

因此应理解，本发明还提供试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的至少一种选择性组分和至少一种敏化组分的任何组合。

在另一些实施方案中，本发明的方法可以用于操作包含所述感兴趣的靶宿主细胞的细胞群体。

应理解，本发明还包括通过本发明的任何方法制备的任何递送媒介物。在一些具体实施方案中，本发明包括本发明公开的任何递送媒介物。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个核酸分子。核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列，(b)携带编码至少一种缺陷识别元件或其任何蛋白或片段的缺陷核酸序列的至少一种递送媒介物(噬菌体)；和任选地，(c)用于选择携带所述可选择元件的细胞的至少一种化合物。

在一些具体实施方案中，本发明的试剂盒使用的递送媒介物可以是至少一种噬菌体。

在一些实施方案中，噬菌体可以是t7样病毒和t4样病毒中的至少一种。

在又一些其他实施方案中，本发明的试剂盒使用的多个核酸分子可以编码至少一种突变的宿主识别元件。在某些实施方案中，所述宿主识别元件中的每一个或其任何蛋白可以包含至少一种突变或修饰。

在一些其他实施方案中，本发明的试剂盒的宿主识别元件可以包含驻留在所述噬菌体尾部区域的至少一种蛋白。

在一些实施方案中，驻留在噬菌体的尾部区域的至少一种蛋白可以是尾蛋白和纤维蛋白中的至少一种。在更具体实施方案中，纤维蛋白可以是gp17。在又一些其他实施方案中，尾蛋白可以是gp11和gp12中的至少一种。在其他实施方案中，本发明的识别元件可以包含本文公开的任何纤维蛋白和尾蛋白的任何组合。应理解，在某些实施方案中，本文公开的衍生自本文公开的任何噬菌体的任何尾蛋白和纤维蛋白也适用于本发明的试剂盒。

在又其他实施方案中，本发明的试剂盒使用的可选择元件可以是抗生素抗性基因。应理解，结合本发明的方法由本发明公开的任何抗生素抗性基因或任何可选择元件也适用于此方面。将理解，本发明还包括用于本发明的试剂盒的任何组分的容器或任何其他包装工具。这样的试剂盒还可以包含用于制备本发明的递送媒介物所需的任何说明书、工具、试剂、材料、酶、缓冲剂、培养基或任何可选择元件。

进一步的实施方案提供了如上描述的本发明的试剂盒在扩展或调节核酸递送媒介物的宿主范围的方法中的用途。在更具体的实施方案中，本发明的试剂盒可以用于本发明的任何方法，具体地，如上文指定的任何实施方案中所公开的。

本发明公开了新型修饰的噬菌体的设计，特别是将dna转导入新型期望的宿主的t7杂交颗粒。重要的是，这种方法不需要在这些宿主中繁殖噬菌体。因此，与现有技术方法不同，它也可用于将宿主的谱扩展到不支持噬菌体繁殖的宿主。这些宿主占宿主库(repertoire)(例如，表6中公开的那些)的相当大的比例。迄今为止，对噬菌体繁殖能力的依赖限制了对新型噬菌体-宿主相互作用的检测。例如，lu的小组最近的一项研究成功地组装了具有来自不同噬菌体的尾部的杂交t7噬菌体衣壳(10)。该研究设法将这些杂交颗粒的宿主范围扩展到除大肠杆菌之外的几种宿主菌株(克雷伯杆菌的一个菌株和耶尔森氏菌的两个菌株)。值得注意的是，本发明扩展了克雷伯杆菌、沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌和肠杆菌的几个物种的宿主的谱，这些细菌不能通过lu的方法鉴定，因为它们都不支持t7繁殖(表6)。本发明还证明了通过杂交颗粒将dna转导至lu的研究中鉴定的相同克雷伯杆菌菌株中(图3b，k390)。本发明人还通过开发gotrap优化了转导至新宿主中的效率，gotrap是选择优化的dna转导杂交颗粒的平台。最后，我们证明了杂交颗粒可被编程以特异性地将dna转移到期望的宿主中。

杂交颗粒相对于也可以递送dna的天然温和噬菌体而言具有几个关键优势。首先，定制这样的模块化噬菌体颗粒比为每种宿主分离和表征天然温和噬菌体更有效。第二，杂交颗粒仅递送期望的质粒dna，而不转导能够复制的噬菌体dna。这与通过温和噬菌体进行的dna递送不同，在温和噬菌体进行的dna递送中，具有潜在不期望的副作用的噬菌体基因也被递送到靶中。第三，使用单一类型的模块化杂交颗粒克服与使用几种不同噬菌体的混合剂相关的许多挑战，诸如易于生产、调控和生物监测。

本发明证明了通过改变尾部与宿主受体的相容性优化dna转导。然而，其他因素诸如宿主中的限制酶也可能成为dna转导的障碍。这些障碍也可以通过gotrap克服，因为它选择增强其dna转导效率的突变体，而不管其潜在机制如何。由于转导的dna与其赋予的表型之间的联系，即增加的转导效率，能够选择克服这些障碍的突变体。因此，如果限制识别位点阻断dna的有效转移，则在该位点获得突变的质粒将更好地转导并变得富集。此外，该方法可以用于通过用编码质粒的尾部基因取代编码限制酶抑制剂的基因(例如t7噬菌体的基因0.3)来分离改进的限制酶的抑制剂。这种联系使人们能够富集最佳转导dna，编码其产物允许有效转导的最佳基因。因此，gotrap是可以潜在地解决dna转导效率的许多方面的广泛的技术，。

因此，在又其他方面，本发明提供了修饰的噬菌体，在本文中也称为“本发明的媒介物”。更具体地，本发明的修饰的噬菌体或递送媒介物可以包含：(a)至少一种修饰的宿主识别元件；和任选地(b)至少一种感兴趣的核酸分子。应注意，在某些实施方案中，修饰的宿主识别元件可以与感兴趣的靶细胞相容。在某些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以能够将感兴趣的核酸分子转导至感兴趣的靶细胞。

更进一步地，在某些实施方案中，感兴趣的靶宿主细胞可以是限制性宿主。更具体地，在这些实施方案中，本发明的噬菌体可能不能在这样的限制性宿主中繁殖。

更进一步地，感兴趣的靶细胞可以是原核宿主细胞和真核宿主细胞中的任何一种，或其任何混合物或组合物。

在某些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体靶向的原核细胞可以是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、沙门氏菌属种、志贺氏菌属种、艰难梭菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、鼠疫耶尔森氏菌和肠杆菌属物种中的至少一种的细菌细胞，或其任何突变体、变体分离株或任何组合物或混合物。

应注意，在某些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可适于将感兴趣的核酸序列递送或转导至任何期望的宿主细胞中。特别地，本发明公开的任何宿主细胞与本文之前和之后公开的任何方法、试剂盒和组合物有关。更具体地，在一些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以包含“宿主识别元件”，所述“宿主识别元件”可以与至少一种感兴趣的宿主细胞或与几种感兴趣的宿主细胞或感兴趣的细胞的任何混合物相容。因此，修饰的噬菌体可以包含与至少一种宿主细胞或多种宿主细胞相容的宿主识别元件或其蛋白或片段的任何组合。通过组合与不同宿主相容的不同元件，本发明的方法还扩展了本发明的递送媒介物的宿主范围。

在某些实施方案中，本发明使用的修饰的噬菌体可以是t7样病毒和t4样病毒中的至少一种。在更具体实施方案中，噬菌体为t7样病毒，更具体地，至少一种肠杆菌噬菌体t7。

在一些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体的宿主识别元件可以包含驻留在所述噬菌体尾部区域的至少一种蛋白。在一些实施方案中，这样的蛋白可以是尾蛋白和纤维蛋白中的至少一种。

在更具体实施方案中，纤维蛋白可以是gp17。在一些其他实施方案中，尾蛋白可以是gp11和gp12中的至少一种，或其任何组合，具体地，衍生自本发明公开的任何噬菌体。

在一些具体的实施方案中，本发明的修饰的噬菌体的宿主识别元件可以是突变的宿主识别元件(同源的或异源的)。

在其他实施方案中，本发明的噬菌体具有扩展或修饰的宿主范围(对一种感兴趣的靶宿主细胞或多种宿主细胞特异)，并且可通过本发明的方法，特别是通过上文公开的任何实施方案描述的方法制备。在另一些其他具体实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以是本发明公开的任何噬菌体或通过本发明的任何方法制备的任何修饰的噬菌体。

如通过实施例证明的和上文所示，本发明提供了杂交转导颗粒，其在本文中也称为本发明的修饰的噬菌体。如上所述，这些杂交颗粒可由本发明公开的任何噬菌体组成或基于本发明公开的任何噬菌体，所述噬菌体包含衍生自本发明公开的任何异源或同源噬菌体的任何宿主识别元件或其任何蛋白。图3b说明这样的杂交颗粒的一些非限制性实例，其也被证明有效转导不同的宿主细胞。图3b中呈现的杂交颗粒在下文中描述。本发明的某些实施方案提供了包含本发明的任何宿主识别元件的多种修饰的噬菌体。为简单起见，宿主识别元件在本文中称为“尾部”。因此，在一些具体的实施方案中，本发明提供可以是t7杂交体的修饰的噬菌体，所述t7杂交体包含至少部分衍生自噬菌体t7，特别是天然或突变的gp17、gp11和gp12蛋白中的任一种或其任何组合的尾部。在一些具体实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以是包含t7gp11蛋白的t7噬菌体。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含t7gp11蛋白，所述t7gp11蛋白包含由seqidno.10表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含宿主识别元件作为尾部，该宿主识别元件包含t7gp12，特别是包含由seqidno.15表示的氨基酸序列的t7gp12或其任何变体和突变体。本发明提供的另一种可选择的t7颗粒可以包含t7gp17蛋白，特别是包含由seqidno.1表示的氨基酸序列的gp17或其任何变体和突变体。在更进一步的实施方案中，这样的特异性t7杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至以下种的至少一种中：bw25113δtrx(大肠杆菌δtrxa)宿主细胞；sso4727(宋内志贺氏菌4727)宿主细胞；sen4510(肠道沙门氏菌亚利桑那血清型菌株sarc5)宿主细胞；kpn4718(肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc10031)宿主细胞；kpn4800ii(肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc9997)宿主细胞；和ecl4723(阴沟肠杆菌阴沟亚种13047)宿主细胞。

在其他具体实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体t3的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体的实施方案中，t7杂交体可以包含t3gp17蛋白。在另一些其他具体实施方案中，这样的t3gp17可以包含由seqidno.4表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7至t3杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；kpn4800ii宿主细胞；和ecl4723宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体ypsp-g的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含ypsp-ggp17蛋白。在另一些其他具体实施方案中，这样的ypsp-ggp17可以包含由seqidno.3表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。在另一些其他实施方案中，这样的特异性t7-ypsp-g杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；kpn4800ii宿主细胞；和ecl4723宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体13a的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含13agp17蛋白。在另一些其他具体实施方案中，这样的13agp17可以包含由seqidno.2表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。在另一些实施方案中，这样的特异性t7-13a杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；kpn4800ii宿主细胞；和ecl4723宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体ypp-r的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含ypp-rgp17蛋白。在另一些其他具体实施方案中，这样的ypp-rgp17可以包含由seqidno.5表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7-ypp-r杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；kpn4800ii宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体vi06的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含vi06gp11蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含vi06gp11蛋白或其任何变体和突变体，该vi06gp11蛋白包含由seqidno.11表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含含有vi06gp12的尾部，特别是包含由seqidno.16表示的氨基酸序列的vi06gp12或其任何变体和突变体。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含至少部分衍生自vi06的尾部，vi06gp17，特别是包含由seqidno.7表示的氨基酸序列的vi06gp17或其任何变体和突变体。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7-vi06杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；kpn4800ii宿主细胞；sen4001(肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清型菌株lt2)宿主细胞；eco4507(大肠杆菌atcc25922)宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体gh-1的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含gh-1gp11蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含gh-1gp11蛋白或其任何变体和突变体，该gh-1gp11蛋白包含由seqidno.13表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含gh-1gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.19表示的氨基酸序列的gh-1gp12。可选择地，这样的杂交噬菌体可以包含至少部分衍生自gh-1的尾部，gh-1gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.8表示的氨基酸序列的gh-1gp17。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7-gh-1杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；kpn4800ii宿主细胞；和ecl4723宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体φsg-jl2的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含φsg-jl2gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含φsg-jl2gp11蛋白或其任何变体和突变体，该φsg-jl2gp11蛋白包含由seqidno.12表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含φsg-jl2gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.17表示的氨基酸序列的φsg-jl2gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含φsg-jl2gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.6表示的氨基酸序列的φsg-jl2gp17。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7-φsg-jl2杂交颗粒可有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞；kpn4718宿主细胞；ecl4723宿主细胞；sen4001宿主细胞；sen4513(肠道沙门氏菌肠炎血清型pt4)；kpn4719(肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc13882)宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体k11的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含k11gp11蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含k11gp11蛋白或其任何变体和突变体，该k11gp11蛋白包含由seqidno.14表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含k11gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.18表示的氨基酸序列的k11gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含k11gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.9表示的氨基酸序列的k11gp17。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7-k11杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；k390(克雷伯杆菌属390)；宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体φeap-1的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含φeap-1gp11蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含φeap-1gp11蛋白或其任何变体和突变体，该φeap-1gp11蛋白包含由seqidno.45表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含φeap-1gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.47表示的氨基酸序列的φeap-1gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含φeap-1gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.49表示的氨基酸序列的φeap-1gp17。在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7-φeap-1杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；eae4739(产气肠杆菌atcc51697)宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体e-2的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含e-2gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含e-2gp11蛋白或其任何变体和突变体，该e-2gp11蛋白包含由seqidno.51表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含e-2gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.53表示的氨基酸序列的e-2gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含e-2gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.55表示的氨基酸序列的e-2gp17。在更进一步的一些实施方案中，这样的特异性t7-e-2杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体kp32的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含kp32gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含kp32gp11蛋白或其任何变体和突变体，该kp32gp11蛋白包含由seqidno.57表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含kp32gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.59表示的氨基酸序列的kp32gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含kp32gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.61表示的氨基酸序列的kp32gp17。在另一些实施方案中，这样的特异性t7-kp32杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体kp34的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含kp34gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含kp34gp11蛋白或其任何变体和突变体，该kp34gp11蛋白包含由seqidno.63表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含kp34gp12或其任何变体和突变体，特别为包含由seqidno.65表示的氨基酸序列的kp34gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含kp34gp17或其任何变体和突变体，特别为包含由seqidno.67表示的氨基酸序列的kp34gp17。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体kpv289的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含kpv289gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含kpv289gp11蛋白或其任何变体和突变体，该kpv289gp11蛋白包含由seqidno.69表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含kpv289gp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.71表示的氨基酸序列的kpv289gp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含kpv289gp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.73表示的氨基酸序列的kpv289gp17。在另一些实施方案中，这样的特异性t7-kpv289杂交颗粒可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至bw25113δtrx宿主细胞；sso4727宿主细胞；sen4510宿主细胞中的至少一种中。

在某些实施方案中，本发明提供了可以是包含至少部分衍生自噬菌体φkmv的尾部的t7杂交体的修饰的噬菌体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含φkmvgp11蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含φkmvgp11蛋白或其任何变体和突变体，该φkmvgp11蛋白包含由seqidno.75表示的氨基酸序列。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含φkmvgp12或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.77表示的氨基酸序列的φkmvgp12。可选择地或另外地，这样的杂交噬菌体可以包含φkmvgp17或其任何变体和突变体，特别是包含由seqidno.79表示的氨基酸序列的φkmvgp17。

在某些实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，gotrap技术在其一些实施方案中涉及使本发明的方法的步骤(a)中提供的多个核酸分子经受至少一种诱变剂(例如，ems或mp6质粒)。因此该技术涉及向杂交颗粒引入扩大其宿主范围的突变。本发明的这样的突变的修饰的噬菌体的一些非限制性实例可以包括为t7杂交体的噬菌体。在一些实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含至少部分衍生自噬菌体t7的尾部。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含具有d540n突变的t7gp17蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有d540n突变蛋白的t7gp17蛋白或其任何变体和突变体，该d540n突变蛋白包含由seqidno.123表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp17可以由seqidno.124表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。在另一些实施方案中，具有d540n突变杂交颗粒的这样的特异性t7gp17蛋白可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至至少一个bw25113δtrx宿主细胞中。

在其他具体实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体可以是包含衍生自噬菌体t7的尾部的t7杂交体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含具有g479s突变的t7gp17蛋白。在更具体的实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有g479s突变蛋白的t7gp17蛋白或其任何变体和突变体，该g479s突变蛋白包含由seqidno.125表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp17可由seqidno.126表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。在又一些其他实施方案中，具有g479s突变杂交颗粒的这样的特异性t7gp17蛋白可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至至少一个sso4727，宋内志贺氏菌4727宿主细胞中。

在又一些其他实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体可以是包含至少部分衍生自噬菌体t7的尾部的t7杂交体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含t7和具有g733d突变的噬菌体t7的纤维蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有g733d突变蛋白的t7gp12蛋白或其任何变体和突变体，该g733d突变蛋白包含由seqidno.127表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp12可以由seqidno.128表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。在另一些实施方案中，具有g733d突变杂交颗粒的这样的特异性t7gp12蛋白可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至至少一个kpn4800ii，肺炎克雷伯杆菌肺炎亚种atcc9997宿主细胞中。

在其他具体实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体可以是包含至少部分衍生自噬菌体t7的尾部的t7杂交体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含具有r106q突变的t7gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有r106q突变蛋白的t7gp11蛋白或其任何变体和突变体，该r106q突变蛋白包含由seqidno.129表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp11可以由seqidno.130表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。在其他一些实施方案中，t7杂交体可以包含具有a40t突变的t7gp11蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有a40t突变蛋白的t7gp11蛋白或其任何变体和突变体，该a40t突变蛋白包含由seqidno.131表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp11可以由seqidno.132表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。在其他具体实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体可以是包含具有d487n突变的t7gp12蛋白的t7杂交体。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有d487n突变蛋白的t7gp12蛋白或其任何变体和突变体，该d487n突变蛋白包含由seqidno.133表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp12可以由seqidno.134表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。在又一些其他实施方案中，t7杂交体可以包含具有s694p突变的t7gp12蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有s694p突变蛋白的t7gp12蛋白或其任何变体和突变体，该s694p突变蛋白包含由seqidno.158表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，这样的突变的t7gp12可由seqidno.159表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码。适用本文的另外的t7gp12，例如s694p-g733d可以包含由seqidno.160表示、由seqidno.161编码的氨基酸序列。

在其他具体实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体可以是包含至少部分衍生自ypsp-g噬菌体的尾部的t7杂交体。在一些具体实施方案中，t7杂交体可以包含在基因的非编码区域中具有突变的ypsp-ggp17蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含在位于gp17的起始密码子atg上游-9处的g到a点突变的ypsp-ggp17核酸序列。在一些实施方案中，这样的突变的噬菌体包含由seqidno.136表示的核酸序列或其任何变体和突变体。在另一些其他具体实施方案中，修饰的噬菌体可以包含在位于gp17的起始密码子atg上游-10处的a到g点突变的ypsp-ggp17核酸序列。在一些实施方案中，这样的突变的噬菌体包含由seqidno.137表示的核酸序列或其任何变体和突变体。

在又一些其他实施方案中，这样的特异性t7突变的杂交颗粒，特别是在非编码区中具有所指示的点突变的t7gp11r106q、t7gp11a40t、t7gp12d487n、ypsp-ggp17中的任一个可以有效地将期望的感兴趣的核酸序列转导至鼠伤寒沙门氏菌宿主细胞中。

在其他具体实施方案中，本发明通过gotrap技术提供了修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体可以是包含至少部分衍生自噬菌体t7杂交体的尾部的t7杂交体。这样的噬菌体可以包含具有沉默k580k突变的t7gp12蛋白。在更具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含具有由seqidno.135表示的核酸序列或其任何变体或突变体编码的k580k突变的t7gp12蛋白。本发明提供的其他噬菌体变体可以包含含有s694p和d487n突变两者的t7gp12蛋白，这样的gp12可以包含由seqidno.209表示、由seqidno.210表示的核酸序列编码的氨基酸序列。更进一步的实施方案中，在本发明提供的噬菌体变体可以包含含有s694p、d487n和k580k突变的t7gp12蛋白，这样的gp12可以包含由seqidno.209表示、由seqidno.211表示的核酸序列编码的氨基酸序列。

在又一些其他实施方案中，本发明提供的t7噬菌体可以包含通过将多个核酸序列(在本发明的方法的步骤(a)中提供)暴露于诱变质粒mp6而获得的突变的宿主识别元件。在一些具体实施方案中，这样的突变的噬菌体可以包含含有d540y突变的t7gp17蛋白。在一些实施方案中，这样的t7gp17d540y突变体可以包含由seqidno.162表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。在又一些其他实施方案中，这样的t7gp17d540y突变体可以由seqidno.163表示的核酸序列编码。

在一些其他实施方案中，本发明提供的t7噬菌体可以包含在分离循环期间自发获得的突变的宿主识别元件。在一些具体实施方案中，这样的突变噬菌体可以包含含有s541r突变的t7gp17蛋白。在一些实施方案中，这样的t7gp17s541r突变体可以包含由seqidno.164表示的氨基酸序列或其任何变体和突变体。在又一些其他实施方案中，这样的t7gp17s541r突变体可以由seqidno.165表示的核酸序列编码。

如上所述，用作递送媒介物的本发明的修饰的噬菌体可以包含作为宿主识别元件的上文公开的任何来源的任何纤维蛋白或尾蛋白或其任何组合。在某些实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含本文中具体公开的以下任何突变，以及至少两种更多种的组合，具体地1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种的组合：t7gp17d540n、t7gp17g479s、t7gp12g733d、t7gp11r106q、t7gp11a40t、t7gp12d487n、t7gp12s694p、t7gp12k580k、t7gp17d540y、t7gp17s541r、在位于-9处具有g到a点突变的ypsp-ggp17核酸序列、在gp17的起始密码子atg上游-10处具有a到g点突变的ypsp-ggp17核酸序列，及其任何组合或其与任何其他突变体或变体的任何组合。在一些实施方案中，这些组合扩展所得媒介物的宿主范围。更进一步地，包含携带不同突变的不同噬菌体的纤维蛋白或尾蛋白的组合的识别元件的一些说明性和非限制性实施方案可以包括但不限于t7(gp11-r106q，gp12)ypsp-g(gp17)，所述t7(gp11-r106q，gp12)ypsp-g(gp17)可以由seqidno.166(本文也称为克隆#1)表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.129、15或158和3中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11-a40t、gp12)ypsp-g(gp17)可以由seqidno.167(本文也称为克隆#2)表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.131、15或158和3中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12-d487n、k580k)ypsp-g(gp17)可以由seqidno.168(本文也称为克隆#3)表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、133或213和3[发明人请在此确认seqid133]中的任何一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12)ypsp-g(gp17)和在gp17的起始atg上游9bp的g＝>a可以由seqidno.169(本文也称为mut1)表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和3中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12)ypsp-g(gp17)和在gp17的起始atg上游10bp的a＝>g可以由seqidno.170(本文也称为mut2)表示的核酸序列编码。在另一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和3中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12和gp17^g479s)可以由seqidno.189表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和125中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12、gp17)在t7gp12s694p中含有点突变的发明人wt-t7可以由seqidno.171表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和1中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12、gp17-d540n)可以由seqidno.172表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和123中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12、gp17-d540y)可以由seqidno.173表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和162中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12、gp17-s541r)可以由seqidno.174表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和164中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12)13a(gp17)由seqidno.175表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和2中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12)t3(gp17)可以由seqidno.176表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和4中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12)ypp-r(gp17)可以由seqidno.177表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和5中的任何一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11、gp12)ypsp-g(gp17)可以由seqidno.178表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、15或158和3中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；vi06(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.179表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.11、16和7中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；gh-1(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.180表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.13、19和8中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；phisg-jl2(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.181表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.12、17和6中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；k11(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.182表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.14、18和9中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；phieap-1(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.183表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.45、47和49中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；e-2(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.184表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.51、53和55中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；kp32(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.185表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.57、59和61中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；kp34(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.186表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.63、65和67中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；kpv289(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.187表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.69、71和73中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；phikmv(gp11、gp12、gp17)可以由seqidno.188表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.75、77和79中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；t7(gp11)13a(g733d，gp17)可以由seqidno.190表示的核酸序列编码。在又一些其他实施方案中，这些核酸可以编码包含由seqidno.10、127或160和2中任一个表示的氨基酸序列的任何蛋白；或其任何变体或衍生物。应理解，本发明提供的特定噬菌体在本文中仅表示为说明性的非限制性实施方案，其可以进一步与本文公开的任何突变体或可通过本发明的方法获得的任何另外的突变体组合。在一些实施方案中，这些组合可以扩展特定噬菌体的宿主范围，例如，通过组合与宿主细胞a相容的突变和与宿主细胞b相容的突变，包含两种突变的噬菌体可以与宿主细胞a和宿主细胞b相容。还应理解，本发明包括通过本发明的任何方法制备的任何修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体在一些实施方案中包含通过本发明的任何方法获得的任何宿主识别元件或其任何组合。

应理解，本发明的修饰的噬菌体在本文中也可称为“修饰的颗粒”、“转导颗粒”、“编程的转导颗粒”、“转导媒介物”、“本发明的媒介物”、“噬菌体或噬菌体颗粒”、“递送媒介物”等，并且都与通过本发明的方法制备的媒介物有关。

如上文说明的，本发明的修饰的噬菌体用于将感兴趣的核酸序列转导至期望的宿主细胞中。

在一些具体实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以包含感兴趣的核酸序列，并因此可将这样的核酸序列转导入靶细胞中。在一些具体实施方案中，这样的感兴趣的核酸序列可以包含至少一种敏化组分。更具体地，这样的组分可以包含至少一个cas基因和至少一个成簇的、规则间隔的短回文重复序列(crispr)阵列。应注意，crispr的至少一个间隔区靶向包含在靶宿主细胞特别是细菌的致病基因或不期望的基因内的前间区，以便特异性灭活所述致病基因或不期望的基因，并且所述crispr的至少一个间隔区靶向包含在选择性组分内的前间区，以便特异性灭活所述选择性组分。

更具体地，由于通过本发明的方法制备的递送媒介物内包含的宿主识别元件的高度特异性，本发明的这些修饰的噬菌体可以用作将感兴趣的核酸序列特异性递送到特定的期望的靶宿主细胞或几种感兴趣的宿主细胞中的有力工具。在一些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以在操作或编辑不同细胞群体，例如细菌细胞群体的组成和含量的方法中使用，所述方法通过靶向消除特定细胞亚群，和/或用期望的亚群替换特定细胞亚群，或者可选择地通过使用本发明的递送媒介物通过用感兴趣的核酸序列转导的特定细胞亚群来诱导特定物质的表达(例如，代谢途径的调节、特定肽或蛋白的表达)。在一些具体实施方案中，本发明的媒介物可用于特异性消除携带抗生素抗性基因的细菌细胞，并用对抗生素敏感的亚群或细胞替换携带抗生素抗性基因的细菌细胞。在其他实施方案中，本发明的媒介物可以靶向参与生物膜形成的细菌基因。在又一些其他实施方案中，本发明的媒介物可以用于用无味的细胞特异性替换产生有气味物质的细菌细胞。在一些特定实施方案中，设计用于靶向消除和破坏靶细胞中的核酸序列(例如抗生素抗性基因或编码毒性产物、致病产物或不期望的产物的任何基因)的特定crispr-cas系统可以用作“感兴趣的核酸”并包装在本发明的递送媒介物(例如，本发明描述的任何修饰的噬菌体)内。在该技术中，crispr-cas系统用于破坏赋予例如抗生素抗性的特定dna，并伴随赋予抗生素敏感细菌选择性优势。选择性优势使得能够通过选择不携带由本发明的递送媒介物转导的crispr-cas系统的未处理细菌来有效地用抗生素敏感细菌替换群体。更具体地，在一些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以是有用的，并因此包含在包含两种组分的试剂盒或系统中。第一组分(i)为包含含有至少一个前间区的核酸序列的选择性组分。因此，包含在这样的修饰的噬菌体中的“感兴趣的核酸序列”可以包含所述至少一个签间区。在又一些其他实施方案中，第二组分(ii)包含至少一种敏化组分，该敏化组分包含至少一个cas基因和至少一个成簇的、规则间隔的短回文重复序列(crispr)阵列。应注意，crispr的至少一个间隔区靶向包含在靶宿主细胞特别是细菌的致病基因或不期望的基因(细菌致病基因或不期望的基因)内的前间区，以便特异性灭活靶宿主细胞中的致病基因或不期望的基因。此外，在其他实施方案中，本发明的crispr的至少一个间隔区靶向包含在(i)的选择性组分内的前间区，以便特异性灭活选择性组分。在更具体的实施方案中，本发明的crispr阵列的至少一个间隔区可以与靶宿主细胞，特别是细菌的至少一种致病基因或不期望的基因(或所述基因的一部分)中包含的核酸序列，在本文中也称为“前间区”充分互补，以便靶向和灭活所述细菌中的至少一种致病基因或不期望的基因。应理解，这些组分中的每一种(例如，敏化组分或选择性组分)可以作为“感兴趣的核酸序列”包含在本发明的递送媒介物内，并因此可以由本发明的媒介物递送并转导至特定的靶宿主细胞。

因此，在一些实施方案中，本发明的噬菌体可以包含以下中的任何一种作为感兴趣的核酸序列：(a)至少一种敏化组分，该敏化组分包含至少一种cas基因和至少一种crispr阵列。在一些实施方案中，所述crispr的至少一个间隔区靶向包含在感兴趣的靶细胞的致病基因或不期望的基因内的前间区，以便特异性灭活所述致病基因或不期望的基因，并且所述crispr的至少一个间隔区靶向包含在选择性组分内的前间区，以便特异性灭活所述选择性组分。包含这些序列的修饰的噬菌体可以用作敏化组分。

在又一些其他实施方案中，本发明的噬菌体可以包含(b)包含至少一种前间区的至少一种核酸序列作为感兴趣的核酸序列。这样的前间区可以包含在编码毒素的基因内。这些噬菌体可以在本文中用作选择性组分。

如本文所用，“选择性组分”指本发明的系统的元件或组分，所述元件或组分能够、促进、引起并作用于选择(selecting)、选择(choosing)、选择(electing)或富集特定细菌细胞群体，特别是携带本发明的cas-crispr系统的细胞群体，更特别是携带本发明的敏化组分的细菌细胞群体。选择组分为期望的群体提供选择性优势，例如通过施加仅仅使得所选择的期望的群体(在具体的实施方案中，携带本发明的敏化组分的任何群体或细胞)能够存活并且仅仅允许所选择的期望的群体存活的条件。

如本文所用，“敏化组分”指本发明的系统的元件，该元件能够增加携带所述元件或组分的生物体对某种物质，例如抗生素物质的增加的敏感性或易感性和/或降低的抗性。在又一些其他实施方案中，敏化组分可以消除转导细菌产生不期望的产物(例如，毒素、参与生物膜形成的蛋白或有气味的物质)的能力。在更具体实施方案中，本发明的敏化组分通过特异性靶向、灭活和/或破坏致病细菌基因或编码不期望产物的基因(例如编码抗生素抗性性的基因或编码毒性化合物的基因)、或编码参与气味形成的产物的基因能够使细胞敏化并使其逆转为抗性较低、更易感的细胞或不产生不期望的产物的细胞。在某些实施方案中，“靶向”应被理解为使元件或对象或者元件或对象的组成为靶，以选择(elect)或选择(choose)它或它们进行作用，其中所选择的(elected)或所选择的(chosen)一个或更多个对象或一个或更多个元件将被攻击、摄取(taken)、分解、灭活或破坏。

此外，本发明的crispr阵列的至少一个间隔区可以与在本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或其系统的选择性组分内作为感兴趣的核酸序列包含的核酸序列(或前间区)充分互补，以便靶向和失活选择性组分，其中“失活”指延迟、降低、抑制、消除、减弱或停止选择性组分的活性。应注意，这样的灭活使得包含所述敏化元件的细菌对本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或系统的选择性组分不敏感且具有抗性。应理解，本文所用的充分互补性反映约10％至100％之间的任何互补性，更具体地，约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的互补性。

在某些实施方案中，“互补性”指两个结构之间的关系，每个结构遵循锁钥原理。在自然界中，互补性为dna复制和转录的基本原理，因为它是两个dna或rna序列之间共有的属性，使得当它们彼此反平行对齐时，序列中每个位置处的核苷酸碱基将为互补的(例如，a和t或u、c和g)。

更进一步地，在某些实施方案中，本发明的敏化元件可以包含本发明的遗传修饰的噬菌体，所述遗传修饰的噬菌体包含作为感兴趣的核酸序列的至少一个crispr间隔区，所述至少一个crispr间隔区靶向包含在所述选择性组分内的至少一种核酸序列(在一些实施方案中，其可以是包含前间区或裂解性噬菌体的必需基因的编码毒素的噬菌体)以及至少一个crispr间隔区，所述至少一个crisper间隔区靶向包含在所述至少一种致病基因或不期望的基因内的核酸序列。以这种方式，本发明的敏化组分可以靶向和/或灭活用作选择性组分的裂解性噬菌体和感兴趣的致病基因或不期望的基因两者。

应注意，在某些实施方案中，本发明的修饰的噬菌体也可以用作选择性组分。在一些具体实施方案中，这样的修饰的噬菌体可以包含至少一个前间区作为感兴趣的核酸序列。具体地，至少一个前间区被本发明的敏化组分靶向。在一些实施方案中，这样的前间区可以是编码毒素的基因的一部分。根据这样的实施方案，未被本发明的敏化组分转导的细胞将被毒素(或裂解性噬菌体)杀死。包含本发明的敏化组分的转导细胞将通过由敏化颗粒提供的crispr保护免受这些毒素的伤害。在一些实施方案中，本发明的系统中作为选择性组分和/或敏化组分使用的修饰的噬菌体可以是选择性感染致病细菌类型、或可以在混合细菌群体中具有致病成员和非致病成员的细菌类型、或者可以感染混合细菌群体中不同类型的细菌的杂交颗粒。

在其他具体实施方案中，本发明的修饰的噬菌体可以包含靶向致病基因或不期望的基因的crispr系统作为感兴趣的核酸序列。这样的噬菌体被用作敏化组分。在又一些其他实施方案中，由本发明的crispr系统靶向的细菌的靶致病基因或不期望的基因或由其转录的任何rna可以是细菌内源基因。应注意，本文所用的“内源基因”指源自特定生物体(在当前情况中为细菌)的dna并因此可以是其染色体dna的一部分。

根据其他实施方案，细菌的靶致病基因或不期望的基因可以是染色体外的(epichromosomal)。在一些特定和非限制性实施方案中，这样的非内源基因可以通过水平转移获得。本文所用的“染色体外基因(epichromosomalgene)”涉及可以作为染色体外dna独立地复制，或在某些实施方案中可以整合到宿主染色体中的遗传物质单元，特别是细菌中的dna，例如质粒。

在一些具体实施方案中，细菌的至少一种靶致病基因或不期望的基因可以是编码毒力因子或毒素的基因，从而致使所述细菌具有毒性。本文所用的术语“毒性”指可以引起细菌疾病或感染的细菌。在一些实施方案中，毒性细菌为在不具有受损的免疫系统的人类受试者或任何其他生物体(包括但不限于哺乳动物、啮齿动物、鸟类、鱼类、爬行动物、昆虫或植物)中引起细菌疾病或感染的那些细菌。通常，毒性细菌会产生被称为“毒力因子”的某些蛋白。毒性细菌可以区别于那些正常定植于一个或更多个健康宿主的组织中的细菌，因此在普通治疗环境下它们不期望被杀死，因为后者通常不表达毒力因子，或者表达相对于毒性细菌的较低量的毒力因子。如上文讨论的，本公开内容在一些实施方案中包括crispr系统，所述crispr系统包含编码针对编码毒力因子或任何不期望的产物的细菌dna序列的靶向rna。这样的毒力因子包括但不一定限于参与致病粘附、定植、入侵、生物膜形成的细菌蛋白或免疫应答抑制剂或毒素。毒力基因的实例包括但不限于编码毒素(例如志贺毒素和霍乱毒素)、溶血素、菌毛(fimbrial)和非菌毛粘附素、蛋白酶、脂肪酶、内切核酸酶、内毒素和外毒素细胞毒性因子、小菌素(microcin)和大肠杆菌素的基因以及本领域被鉴定的那些毒素的基因。来自编码这些和其他毒力因子的多种细菌类型的细菌基因的序列是本领域已知的。毒力因子可以在细菌染色体上、或在细菌中的质粒上或在两者上编码。在一些实施方案中，毒力因子可以由细菌超抗原基因诸如超抗原肠毒素基因编码，其一个非限制性实例为金黄色葡萄球菌sek基因。金黄色葡萄球菌的另外的毒力因子包括但不限于：溶细胞毒素(cytolitictoxin)诸如α如溶血素、β-溶血素、γ血溶血素、杀白细胞素(leukocidin)、panton-valentine杀白细胞素(pvl)；外毒素诸如中毒性休克综合征毒素-1(tsst-1)；肠毒素，诸如sea、seb、secn、sed、see、seg、seh和sei；以及剥脱性毒素(exfoliativetoxin)，诸如eta和etb。由其他类型的细菌表达的所有这些毒素的同源物在本文中也被构思为毒力基因靶。

更具体地，本文所用的术语“毒素”指由细菌生成的物质，其可以分类为外毒素或内毒素。生成外毒素并主动分泌；内毒素保持为细菌的一部分。通常，内毒素为细菌外膜的一部分，并且它直到细菌被免疫系统杀死才会释放。

根据本发明的一些具体和非限制性实施方案，可由本发明的递送媒介物递送的crispr系统靶向的细菌毒力基因可以选自由以下组成的组：acta(实例以genebank登录号：nc_003210.1给出)、tem(实例以genebank登录号：nc_009980给出)、shv(实例以genebank登录号：nc_009648给出)、oxa-1(实例以genebank登录号：nw_139440给出)、oxa-7(实例以genebank登录号：x75562给出)、pse-4(实例以genebank登录号：j05162给出)、ctx-m(实例以genebank登录号：nc_010870给出)、ant(3")-ia(aada1)(实例以genebank登录号：dq489717给出)、ant(2")-ia(aadb)b(实例以genebank登录号：dq176450给出)、aac(3)-iia(aacc2)(实例以genebank登录号：nc_010886给出)、aac(3)-iv(实例以genebank登录号：dq241380给出)、aph(3')-ia(apha1)(实例以genebank登录号：nc_007682给出)、aph(3')-iia(apha2)(实例以genebank登录号：nc_010170给出)、tet(a)(实例以genebank登录号：nc_005327中给出)、tet(b)(实例以genebank登录号：fj411076给出)、tet(c)(实例以genebank登录号：nc_010558给出)、tet(d)(实例以genebank登录号：nc_010558给出)、tet(e)(实例以genebank登录号：m34933给出)、tet(y)(实例以genebank登录号：ab089608给出)、cati(实例以genebank登录号：nc_005773给出)、catiinc_010119、catiii(实例以genebank登录号：x07848给出)、flor(实例以genebank登录号：nc_009140给出)、dhfri(实例以genebank登录号：nc_002525给出)、dhfrv(实例以genebank登录号：nc_010488给出)、dhfrvii(实例以genebank登录号：dq388126给出)、dhfrix(实例以genebank登录号：nc_010410给出)、dhfrxiii(实例以genebank登录号：nc_000962给出)、dhfrxv(实例以genebank登录号：z83311给出)、suii(实例以genebank登录号：nc_000913给出)、suiii(实例以genebank登录号：nc_000913给出)、整合子类13'-cs(实例以genebank登录号：aj867812给出)、vat(实例以genebank登录号：nc_011742给出)、vatc(实例以genebank登录号：af015628给出)、vatd(实例以genebank登录号：af368302给出)、vate(实例以genebank登录号：nc_004566给出)、vga(实例以genebank登录号：af117259给出)、vgb(实例以genebank登录号：af117258给出)和vgbb(实例以genebank登录号：af015628给出)。

如上所述，本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或系统可以特异性地靶向任何致病细菌基因或不期望的细菌基因，例如，提供抗性的任何基因，或者换言之抑制(inhibit)、减少、压制(suppress)或减弱细菌对任何抗微生物剂的易感性的任何基因。

如上所述，本发明的试剂盒、系统和方法的敏化元件可以靶向提供抗生素抗性的任何基因。如本文所用，术语“狼性”并不意指暗示细菌细胞群体对特定抗生素化合物具有100％抗性，而是包括耐受抗生素或其任何衍生物的细菌。更具体地，术语“细菌抗性基因”指赋予约100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％保护免于抗生素化合物的基因，从而逆转其对所述抗生素化合物的易感性及敏感性。

因此，在一些实施方案中，细菌致病基因或不期望的基因可以是提供对上文描述的任何抗细菌化合物的抗性的任何基因。

更进一步地，在其他实施方案中，细菌的至少一种靶致病基因或不期望的基因可以是编码抗生素抗性因子的基因。

本文所用的短语“抗生素抗性基因”指例如通过编码破坏抗生素化合物的酶、通过编码阻止抗生素化合物进入微生物的表面蛋白、通过主动将其输出或通过成为抗生素靶的突变形式而赋予抗生素抗性，从而阻止其抗生素功能的基因。

由各种细菌携带的抗生素抗性基因是本领域已知的，并且如果需要，可以确定任何特定细菌中的抗生素抗性基因的序列。在某些非限制性实施方案中，本公开内容包括含有编码靶向rna的间隔区的crispr系统，所述靶向rna针对包含抗生素抗性基因的细菌dna序列。在一些实施方案中，抗性基因赋予对青霉素类抗生素的窄谱β-内酰胺抗生素的抗性。在其他实施方案中，抗性基因赋予对甲氧西林(例如，甲氧西林或苯唑西林)或氟氯西林(flucloxacillin)或双氯西林(dicloxacillin)或这些抗生素中的一些或全部的抗性。因此，在一些实施方案中，crispr系统适合于选择性地靶向通俗地称为甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)中的抗生素抗性基因，所述甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌实际上指对大多数或全部青霉素类不敏感或具有降低的敏感性的金黄色葡萄球菌菌株。在其他实施方案中，crispr系统适合于靶向万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(vrsa)中的万古霉素抗性。在某些实施方案中，万古霉素抗性金黄色葡萄球菌还可以对利奈唑胺(linezolid)(zyvox^tm)，达托霉素(daptomycin)(cubicin^tm)和奎奴普丁(quinupristin)/达福普汀(dalfopristin)(syercid^tm)中的至少一种具有抗性。

另外的抗生素抗性基因包括但不限于磷霉素抗性基因fosb；四环素抗性基因tetm；卡那霉素核苷酸转移酶aadd；双功能氨基糖苷修饰酶基因aaca-aphd；氯霉素乙酰转移酶cat；莫匹罗星抗性基因iles2；万古霉素抗性基因vanx、vanr、vanh、vrae、vrad；甲氧西林抗性因子fema、fmta、mecl；链霉素腺苷酰转移酶spcl、spc2、antl、ant2；壮观霉素腺苷转移酶spd、ant9、aada2和任何其他抗性基因。

在一些具体实施方案中，致病基因或不期望的基因可以是编码赋予对任何β-内酰胺抗生素化合物抗性的任何基因的基因。在更具体实施方案中，这样的基因可以编码至少一种β-内酰胺酶。如本文所用，术语“β-内酰胺酶”表示能够催化β-内酰胺酶底物，诸如含有β-内酰胺的分子(诸如β-内酰胺抗生素)或其衍生物的裂解的蛋白。

β-内酰胺酶基于其氨基酸序列被分成四个分子类别(a、b、c和d)。a类酶具有约29kda的分子量，并优先水解青霉素。a类酶的实例包括rtem和金黄色葡萄球菌的β-内酰胺酶。b类酶包括比其他类别的β-内酰胺酶具有更宽底物谱的金属酶。c类酶具有约39kda的分子量，并且包括革兰氏阴性细菌的染色体头孢菌素酶，所述染色体头孢菌素酶负责革兰氏阴性细菌对多种传统和新设计的抗生素的抗性。另外，c类酶还包括p99阴沟肠杆菌(p99enterobactercloacae)的内酰胺酶，该内酰胺酶负责使得该肠杆菌物种成为美国医院中最广泛传播的菌剂(bacterialagent)之一。d类酶为表现出独特的底物谱的丝氨酸水解酶。如上所述，在更具体的实施方案中，本发明的试剂盒和系统可以针对可赋予对任何β内酰胺抗生素的抗性的任何基因。如本文使用的术语“β-内酰胺”或“β内酰胺抗生素”指在其分子结构中含有β-内酰胺环的任何抗生素剂。β-内酰胺抗生素为包括不同类别的一大组抗生素，诸如天然的和半合成青霉素、克拉维酸(clavulanicacid)、碳青霉烯类、青霉素衍生物(青霉烷类(penams))、头孢菌素类(头孢烯类)、头霉素类(cephamycin)和单酰胺菌素类(monobactam)，即在其分子结构中含有β-内酰胺环的任何抗生素剂。它们为最广泛使用的一组抗生素。虽然不是真正的抗生素，但β-内酰胺酶抑制剂通常包括在该组中。β-内酰胺类抗生素是d-丙氨酰-d-丙氨酸的类似物，为新生肽聚糖层的前体nam/nag-肽亚基上的末端氨基酸残基。β-内酰胺抗生素和d-丙氨酰-d-丙氨酸之间的结构相似性防止新生肽聚糖层的最终交联(转肽作用)，破坏细胞壁合成。在正常情况下，肽聚糖前体标志细菌细胞壁的重组，并且结果为触发自溶性细胞壁水解酶的活化。交联被β-内酰胺抑制引起肽聚糖前体的积累，触发存在的肽聚糖被自溶性水解酶消化，而不产生新的肽聚糖。结果，β-内酰胺抗生素的杀细菌作用被进一步增强。通常，β-内酰胺根据其核心环结构被分类和分组，其中每组可以被分为不同类别。术语“青霉烷”用于描述青霉素抗生素成员的核心骨架。即含有噻唑烷环的β-内酰胺。青霉素含有与五元环稠合的β-内酰胺环，其中五元环中的原子之一为硫并且环为完全饱和的。青霉素可以包括窄谱青霉素，诸如苄星青霉素(benzathinepenicillin)、苄青霉素(青霉素g)、苯氧甲基青霉素(phenoxymethylpenicillin)(青霉素v)、普鲁卡因青霉素和苯唑西林。窄谱青霉素酶抗性青霉素包括甲氧西林、双氯西林和氟氯西林。窄谱β-内酰胺酶抗性青霉素可包括替莫西林(temocillin)。中谱(moderatespectrum)青霉素包括例如阿莫西林和氨苄青霉素。广谱青霉素包括复合阿莫西林-克拉维酸(co-amoxiclav)(阿莫西林+克拉维酸)。最后，青霉素组还包括超广谱(extendedspectrum)青霉素，例如阿洛西林(azlocillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)和哌拉西林(piperacillin)。该类别的其他成员包括匹氨苄青霉素(pivampicillin)、海他西林(hetacillin)、巴氨西林(bacampicillin)、美坦西林(metampicillin)、酞氨青霉素(talampicillin)、依匹西林(epicillin)、羧苄青霉素、卡印西林(carindacillin)、替卡西林、阿洛西林、哌拉西林、美洛西林、甲亚胺青霉素(mecillinam)、氮卓脒青霉素双酯(pivmecillinam)、磺苄西林(sulbenicillin)、氯甲西林(clometocillin)、普鲁卡因苄青霉素(procainebenzylpenicillin)、叠氮西林(azidocillin)、醋甲西林(penamecillin)、苯丙西林(propicillin)、青霉素b(pheneticillin)、氯唑西林和乙氧萘青霉素(nafcillin)。含有吡咯烷环的β-内酰胺被命名为碳青霉烷类。碳青霉烷是为饱和的碳青霉烯的β-内酰胺化合物。它们主要作为至碳青霉烯类抗生素的途中的生物合成的中间体存在。碳青霉烯类抗生素具有使其对β-内酰胺酶高度耐受的结构，并且因此被认为是最广谱的β-内酰胺抗生素。碳青霉烯类抗生素在结构上与青霉素十分相似，但在结构的1位中的硫原子已被碳原子取代，并因此该组的名称为碳青霉烯。碳青霉烯类抗生素最初由卡特利链霉菌(streptomycescattleya)的天然来源的产物噻烯霉素(thienamycin)开发而来。碳青霉烯类组包括：比阿培南(biapenem)、多利培南(doripenem)、厄他培南(ertapenem)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、帕尼培南(panipenem)和pz-601。含有2,3-二氢噻唑环的β-内酰胺被命名为青霉烯类。青霉烯类在结构上类似于碳青霉烯类。然而，在青霉烯具有硫的地方，碳青霉烯类具有另一个碳。没有天然存在的青霉烯；所有青霉烯都是合成的。青霉烯的实例为法罗培南(faropenem)。含有3,6-二氢-2h-1,3-噻嗪环的β-内酰胺被称为头孢烯类。头孢烯类为β-内酰胺类抗生素的亚组并且包括头孢菌素和头霉素。头孢菌素类为广谱的半合成抗生素，其共有7-氨基头孢烷酸的核。也被认为为中谱的第一代头孢菌素类包括头孢氨苄(cephalexin)、先锋霉素i(cephalothin)和头孢唑啉(cefazolin)。被认为具有抗嗜血杆菌属(haemophilus)活性的具有中谱的第二代头孢菌素类可以包括头孢克洛(cefaclor)、头孢呋辛(cefuroxime)和头孢孟多(cefamandole)。表现出具有抗厌氧菌活性的中谱的第二代头霉素类包括头孢替坦(cefotetan)和头孢西丁(cefoxitin)。被认为具有广谱活性的第三代头孢菌素类包括头孢噻肟(cefotaxime)和头孢泊肟(cefpodoxime)。

最后，被认为具有增强的抵抗革兰氏阳性细菌的活性和β-内酰胺酶稳定性的广谱的第四代头孢菌素类包括头孢吡肟(cefepime)和头孢匹罗(cefpirome)。头孢菌素类还可以包括：头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢克肟(cefixime)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢氨苄(cephalexin)、先锋霉素i、头孢呋辛、头孢孟多、头孢吡肟和头孢匹罗。

头霉素与头孢菌素非常相似，并且有时被归类为头孢菌素。与头孢菌素类似，头霉素基于头孢烯核。头霉素类最初由链霉菌生产，但也生产合成的头霉素类。头霉素在7-α位具有甲氧基基团并且包括：头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑(cefmetazole)和氟氧头孢(flomoxef)。

含有1,2,3,4-四氢吡啶环的β-内酰胺被命名为碳头孢烯类(carbacephems)。碳头孢烯类为基于头孢菌素(头孢烯)的结构而合成地制备的抗生素。碳头孢烯类与头孢烯类相似，但是具有替代硫的碳。碳头孢烯类的实例为氯碳头孢(loracarbef)。

单酰胺菌素类为其中β-内酰胺环为单独的且不稠合到另一个环(与具有两个环的大多数其他β-内酰胺相反)的β-内酰胺化合物。它们只针对革兰氏阴性细菌起作用。单酰胺菌素类的其他实例为替吉莫南(tigemonam)、诺卡菌素a(nocardicina)和烟草野火毒素(tabtoxin)。

含有3,6-二氢-2h-1,3-噁嗪环的β-内酰胺被命名为氧头孢烯类(oxacephems)或克拉维烷类(clavams)。氧头孢烯类为与头孢烯类相似的分子，但具有替换硫的氧。因此，它们也被称为氧青霉烷类。氧青霉烷类的实例为克拉维酸。它们为合成地制备的化合物并且在自然界中尚未被发现。氧头孢烯类的其他实例包括拉氧头孢(moxalactam)和氟氧头孢。

另一组β-内酰胺抗生素为β-内酰胺酶抑制剂，例如克拉维酸。虽然它们表现出可忽略的抗微生物活性，但它们含有β内酰胺环。它们唯一的目的是通过结合β-内酰胺酶来防止β-内酰胺抗生素被灭活，并且因此它们与β-内酰胺抗生素共施用。临床使用的β-内酰胺酶抑制剂包括克拉维酸及其钾盐(通常与阿莫西林或替卡西林组合)、舒巴坦(sulbactam)和他唑巴坦(tazobactam)。

因此应理解，本发明的系统通过由本发明的修饰的噬菌体递送的crispr-cas靶向和破坏抗生素抗性基因，致使细菌群体对上文指出的任何抗生素化合物敏感。因此应理解，这样的敏化作用增加了细菌对所述化合物的敏感性，从而增强所述化合物的有效性，可以引起减少所需的量。本发明还构思了用本发明的系统和本文公开的任何抗生素化合物的组合治疗。在又一些其他实施方案中，除了包含敏化组分的递送媒介物之外，本发明的试剂盒或系统还可以包含选择性组分和至少一种抗生素化合物。在更具体实施方案中，这样的化合物可以是本发明公开的任何抗生素化合物。

在更具体的实施方案中，抗生素抗性因子或基因，即本发明的试剂盒的靶致病基因或不期望的基因可以是超广谱β-内酰胺酶抗性因子(esbl因子)、碳青霉烯酶、ctx-m-15、β-内酰胺酶、新德里金属-β-内酰胺酶(ndm)-1,2,5,6、肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯酶(kpc)-1,2,3,4,5、oxa-48碳青霉烯酶、维罗纳整合子-编码的金属-β-内酰胺酶(vim)、imp金属-β-内酰胺酶中的任何一种。

新德里金属-β-内酰胺酶(ndm-1)为致使细菌对所有当前使用的β-内酰胺抗生素耐受的酶。ndm-1抗性谱包括碳青霉烯家族的抗生素，所述碳青霉烯家族的抗生素为治疗抗生素抗性细菌感染的支柱。ndm-1的基因为编码被称为碳青霉烯酶的β-内酰胺酶的大基因家族中的一个成员。产生碳青霉烯酶的细菌众所周知的难以治疗。重要的是，ndm-1的基因可以通过水平基因转移从细菌的一个菌株扩散到另一个菌株，并因此可容易地扩散。在某些具体和非限制性实施方案中，ndm-1蛋白可以是蛋白_idcaz39946.1的肺炎克雷伯杆菌金属-β-内酰胺酶基因blandm-1。在一些具体实施方案中，所述ndm-1蛋白可以包含由seqidno.191表示的核酸序列编码的氨基酸序列。在另一些其他具体实施方案中，本发明的ndm-1蛋白可以包含由seqidno.192表示的氨基酸序列。

更进一步地，本文所用的ctx-m-15为最初在大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌和沙门氏菌属属种中描述的超广谱β-内酰胺酶(esbl)的ctx-m家族(头孢噻肟酶(cefotaximase)(ctx-m酶))的成员，但在其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)以及在包括铜绿假单胞菌的非肠杆菌科物种中快速出现。该家族包括ctx-m-3酶、ctx-m-9酶、ctx-m-14酶和ctx-m-15酶。在一些具体实施方案中，用作本发明的试剂盒的靶的ctx-m-15可以是蛋白_idaal02127.1的大肠杆菌β-内酰胺酶ctx-m-15。在一些具体实施方案中，所述ctx-m-15蛋白可以包含由seqidno：138表示的核酸序列编码的氨基酸序列。在另一些其他具体实施方案中，本发明的ctx-m-15蛋白可以包含由seqidno：139表示的氨基酸序列。

在又一些其他特定和非限制性实施方案中，由本发明的递送媒介物(修饰的噬菌体)递送的本发明的crispr系统，特别是其敏化组分，可以包含靶向ctx-m-15的至少一个前间区的至少一个间隔区。在更具体实施方案中，这样的前间区可以包含由seqidno：140、141和142中任一个表示的核酸序列或其任何组合(本文也分别称为c1、c2和c3)。在又一些其他实施方案中，本发明的crispr系统，特别是其敏化组分，可以包含靶向ndm-1的至少一个前间区的至少一个间隔区，具体地，这样的前间区可以包含如由seqidno：143、144和145中的任一个表示的核酸序列或其任何组合(在本文中也分别称为n1、n2和n3)。

应理解，在本发明的修饰的噬菌体(在本文中也称为递送媒介物)用作选择性组分的情况中，其中包装的“感兴趣的核酸序列”可以包含如上所述的前间区，具体地，seqidno：140、141和142和/或seqidno：143、144和145中的任一个。用于ndm的间隔区的非限制性实例包括由核酸序列seqidno.212和213表示的间隔区。可用于ctx-m的间隔区包括由核酸序列seqidno.214和215表示的间隔区。

在又一些其他实施方案中，产生肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯酶(kpc)的细菌为引起与显著发病率和死亡率相关的感染的一组新出现的高度耐药的革兰氏阴性杆菌。

oxa-48碳青霉烯酶首先在肺炎克雷伯杆菌流行病中描述。此外，oxa-48已经在大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)和雷氏普罗威登斯菌(providenciarettgeri)中被鉴定。该酶能够水解青霉素类和碳青霉烯类，但对广谱头孢菌素类具有不良的活性。产生oxa-48的菌株中的多药耐受性通常由共同产生多种耐药机制特别是超广谱β-内酰胺酶(esbl)和其他抗性决定子导致。因此，这些碳青霉烯酶可以被本发明的递送媒介物所包含的感兴趣的核酸序列靶向。

因此，在一些实施方案中，本发明的敏化元件可以靶向肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯水解β-内酰胺酶kpc-1，如aag13410.1和seqidno.193所表示，并且由seqidno.194(af297554)编码的。更进一步地，这样的靶碳青霉烯酶可以是肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯水解β-内酰胺酶kpc-2，如aak70220.1所表示，并且包含由seqidno.196(ay034847)编码的seqidno.195的氨基酸序列。在又一些其他实施方案中，本发明的敏化元件可以靶向肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯水解β-内酰胺酶kpc-3，如aal05630.1和seqidno.197所表示，并且由seqidno.198(af395881)编码的。

在又一些其他实施方案中，本发明的敏化元件可以靶向肠杆菌属种e624碳青霉烯水解β-内酰胺酶kpc-4，如aau06362.1和seqidno.199所表示，并且由seqidno.200(ay700571)编码的。更进一步地，这样的靶碳青霉烯酶可以是铜绿假单胞菌β-内酰胺酶kpc-5，如aby91240.1所表示，并且包含由seqidno.202(eu400222.2)编码的seqidno.201的氨基酸序列。其他实施方案涉及aap70012.1的肺炎克雷伯杆菌oxa-48，如seqidno.203所表示、由seqidno.204(ay236073.2)编码的。在又另一个实施方案中，wp_049589868.1的肠杆菌科磷酸乙醇胺-脂质a转移酶mcr-1，如seqidno.216所表示、由seqidno.217(ng_050417.1)编码的。更进一步的实施方案可以涉及大肠杆菌磷酸乙醇胺-脂质a转移酶mcr-2，如wp_065419574.1所表示并且包含由seqidno.219(ng_051171.1)编码的seqidno.218。

在一些其他特定和非限制性实施方案中，由本发明的递送媒介物(修饰的噬菌体)递送的本发明的crispr系统，特别是其敏化组分，可以包含至少靶向kpc-1,2,3,4,5或oxa-48的至少一个前间区的至少一个间隔区。在更具体实施方案中，这样的间隔区可以包含由seqidno：205和206(对于kpc-1,2,3,4,5)中任一个表示的核酸序列或其任何组合。在更具体实施方案中，这样的间隔区可以包含由seqidno：207和208(对于oxa-48)中任一个表示的核酸序列或其任何组合。

在又一些其他实施方案中，本发明的递送媒介物可以包含靶向编码不期望的产物的细菌基因的基于crspr-cas系统的至少一种敏化组分作为感兴趣的核酸序列。在一些具体和非限制性实施方案中，这样的不期望的细菌基因可以编码例如脂肪酶，该脂肪酶参与形成具有不愉快气味的产物诸如丁酸或硫醇化合物的途径。在又一些其他可选择的实施方案中，由本发明的媒介物递送的crispr系统可以靶向编码参与生物膜形成的蛋白例如psts蛋白等的基因。如上所述，在本发明提供的系统中用作敏化元件的本发明的修饰的噬菌体包含crispr(成簇的规则间隔的短回文重复序列)阵列，crispr阵列连同cas基因形成crispr系统。如本文所用，crispr阵列也称为spidr(间隔区散在正向重复序列)，构成最近描述的通常对特定细菌物种具有特异性的dna基因座家族。crispr阵列是在大肠杆菌中首次识别的一类独特的散在短序列重复序列(ssr)。在随后的几年中，相似的crispr阵列在结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、地中海富盐菌(haloferaxmediterranei)、詹氏甲烷球菌(methanocaldococcusjannaschii)、海栖热孢菌(thermotogamaritima)和其他细菌以及古细菌中发现。应理解，本发明构思任何已知的crispr系统，特别是和本文公开的任何crispr系统的用途。

如本文所用，短语“crispr阵列多核苷酸”指包含足够的crispr重复以使得其能够下调(例如，消除、靶向)互补基因的dna或rna区段。

根据一个实施方案，在本发明媒介物中作为感兴趣的核酸序列包含的crispr阵列多核苷酸包含其间具有1个间隔区的至少2个重复序列。在又一些其他实施方案中，本发明的敏化组分的crispr阵列可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个，特别是110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个间隔区。还应理解，本发明的敏化组分的间隔区可以是相同或不同的间隔区。在更多实施方案中，这些间隔区可以靶向相同或不同的靶细菌致病基因或不期望的基因。在又一些其他实施方案中，这样的间隔区可以靶向至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个致病细菌基因或不期望的细菌基因。

在示例性实施方案中，crispr阵列多核苷酸包含所有crispr重复序列，从第一crispr重复序列的第一个核苷酸开始并以最后一个(末端)重复序列的最后一个核苷酸结束。

如本文所用，术语“间隔区”指在crispr阵列的多个短直接重复序列(即，crispr重复序列)之间发现的非重复性间隔区序列。在一些实施方案中，crispr间隔区位于两个相同的crispr重复序列之间。

在一些实施方案中，crispr间隔区天然存在于回文的两个相同的短直接重复序列之间。应注意，本发明的间隔区可以位于或存在于两个相同或不相同的重复序列之间，且此外，这些间隔区编码靶向致病细菌基因或不期望的细菌基因内的前间区和/或选择性组分内的前间区的crrna。

如本文所用，术语“cas基因”指通常与编码cas蛋白的侧翼crispr阵列偶联、相关联或靠近，或在编码cas蛋白的侧翼crispr阵列附近的基因。

crispr阵列通常在名为cas1至cas4的四个基因附近发现。这些基因的最常见的布置为cas3-cas4-cas1-cas2。cas3蛋白表现为解旋酶，而cas4类似于核酸外切酶的recb家族并含有半胱氨酸富集基序，暗示dna结合。cas1基因(ncbicogs数据库代码：cog1518)特别值得注意，因为它充当crispr系统的通用标记(与除了pyrococcusabyssii的crispr系统之外的所有crispr系统有关)。cas2仍有待表征。casl-4通常以它们与crispr基因座的紧密接近以及它们在细菌和古细菌物种中的广泛分布为特征。虽然并非所有casl-4基因都与所有crispr基因座相关，但它们都在多种亚型中被发现。

更进一步地，描绘三种主要类型的crispr-cas系统：i型、ii型和iii型。应理解，包装在本发明的修饰的噬菌体内的感兴趣的核酸可以包含衍生自任何类型的crispr-cas系统的crispr系统(例如，编码cas蛋白和间隔区的基因)。

更具体地，i型crispr-cas系统除了含有编码可能形成具有不同组成的级联样复合体的蛋白的基因之外还含有cas3基因，该cas3基因编码具有单独的解旋酶和dnase活性的大蛋白。这些复合体含有已被包含在重复序列相关神秘蛋白(ramp)中的很多蛋白，该重复序列相关神秘蛋白形成cas蛋白的大型超家族，并且含有至少一个rna识别基序(rrm，也称为铁氧还蛋白-折叠结构域)和特征性富含甘氨酸的环。基于广泛的序列和结构比较，ramp超家族包括大型cas5家族和cas6家族。此外，cas7(cog1857)蛋白代表ramp超家族内的另一个独特的大型家族。

i型crispr-cas系统表现为靶向其中靶裂解由cas3的hd核酸酶结构域催化的dna。由于在若干种i型crispr-cas系统中，cas4的recb核酸酶结构域被融合至cas1，cas4反而能够潜在地在间隔区获得中发挥作用。应注意，任何i型crispr-cas系统，特别是i-a、b、c、d、e和f型中的任一种可适用于本发明。

ii型crispr-cas系统包括“hnh”型系统(链球菌样；也称为nmeni亚型，即脑膜炎奈瑟球菌血清群a菌株z2491，或cass4)，其中除了普遍存在的cas1和cas2之外，cas9，一种单独的非常大的蛋白，表现得足以生成crrna并裂解靶dna。cas9含有至少两个核酸酶结构域，靠近氨基末端的ruvc-样核酸酶结构域和在蛋白中部的hnh(或mcra样)核酸酶结构域，但是这些结构域的功能仍待阐明。然而，由于hnh核酸酶结构域在限制性酶中为丰富的，并且拥有内切核酸酶活性，它可能负责靶裂解。

ii型系统通过不同寻常的机制裂解crrna前体(pre-crrna)，所述机制涉及在tracrrna和crrna前体中的重复的一部分之间形成双链体；随后crrna前体加工途径中的第一次裂解在该重复区域中发生。该裂解由管家、双链rna特异性rna酶iii在cas9的存在下催化。更进一步地，ii型系统包括cas9、cas1、cas2、csn2和cas4基因中的至少一种。应理解，任何ii型crispr-cas系统，特别是ii-a或b型中的任一种可适用于本发明。

iii型crispr-cas系统含有聚合酶和ramp模块，其中至少一些ramp似乎参与类似于级联复合体的间隔区-重复序列转录物的加工。iii型系统还可被分成iii-a亚型(也被称为mtube或cass6)和iii-b亚型(也被称为聚合酶-ramp模块)。iii-a亚型系统可以靶向质粒，如已经针对表皮葡萄球菌(s.epidermidis)在体内证明的，并且似乎可信的是，该亚型中编码的聚合酶样蛋白(cog1353)的hd结构域可能参与靶dna的裂解。存在iii-b型crispr-cas系统至少在体外能够靶向rna的有力证据，如针对来自furiosus的iii-b亚型系统显示的。应理解，属于iii型crispr系统的任何cas基因可以用于本发明的目的，例如cas6、cas10、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、cas1和cas2中的任一种。更进一步地，iii-a型和iii-b型系统中的任一种可以用于本发明的试剂盒、组分和方法。特别感兴趣的是，特别是在其中内源性致病基因或不期望的基因被本发明的系统和方法靶向的情况中，iii-b型系统可以是有用的。

在一些特定实施方案中，用作本发明媒介物中感兴趣的核酸序列的crispr-cas系统中的至少一个cas基因可以是i-e型crispr系统的至少一个cas基因。“ie型crispr”系统指k-型大肠杆菌的天然系统。它已被证明抑制噬菌体感染、治愈质粒、防止接合元件转移和杀死细胞。该crispr机制可以用于以诱导型和靶向方式降解特定的细胞内dna，使剩余的dna保持完整。

在又一些其他实施方案中，包含在本发明的修饰的噬菌体媒介物内的至少一种i-e型cas基因可以是cse1、cse2、cas7、cas5、cas6e和cas3基因中的至少一种。在某些实施方案中，除了cse1、cse2、cas7、cas5、cas6e和cas3基因中的至少一种之外，本发明的敏化组分还可以包含cas1和cas2基因中的至少一种。

在一些具体实施方案中，作为本发明的媒介物中的感兴趣的核酸序列包含的敏化组分的cas基因包括cse1基因。在更具体实施方案中，这样的cse1基因编码如由蛋白_idaac75802.1表示的大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655的cse1蛋白。在更具体实施方案中，cse1基因可以包含由seqidno：146表示的核酸序列。在更具体实施方案中，cse1基因编码包含由seqidno：147表示的氨基酸序列的cse1蛋白。在又一些其他实施方案中，本发明的敏化组分包括cse2基因。在更具体的实施方案中，这样的cse2蛋白可以是如由蛋白_idaac75801.1表示的大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655。在其他实施方案中，本发明使用的cse2蛋白可由seqidno：148表示的核酸序列编码。在更具体的实施方案中，cse2蛋白可以包含由seqidno：149表示的氨基酸序列。更进一步地，在某些实施方案中，本发明的敏化组分可以包含cas7。在更具体的实施方案中，所述cas7蛋白可以是idaac75800.1的大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655cas7蛋白。在一些实施方案中，cas7蛋白由seqidno：150表示的核酸序列编码。更进一步的实施方案涉及包含由seqidno：151表示氨基酸序列的cas7蛋白。

更进一步地，本发明的敏化组分可以包含cas5。更具体地，idaac75799.2的大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655cas5蛋白。在一些实施方案中，cas5蛋白由seqidno：152表示的核酸序列编码。在其他实施方案中，cas5蛋白包含由seqidno：153表示的氨基酸序列。

在又一些其他实施方案中，本发明的敏化组分可以包含cas6e。在更具体实施方案中，cas6e蛋白可以是idaac75798.1的大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655cas6e蛋白。在某些实施方案中，本发明使用的cas6e蛋白可以由seqidno：154表示的核酸序列编码。在其他实施方案中，cas6e蛋白可以包含由seqidno：155表示的氨基酸序列。在一些其他实施方案中，本发明的媒介物中的感兴趣的核酸序列还可以包含cas3基因。在更具体实施方案中，cas3基因编码idaac75803.1的大肠杆菌菌株k-12亚株mg1655cas3蛋白。在其他实施方案中，cas3蛋白由seqidno：156表示的核酸序列编码。在其他实施方案中，cas3蛋白可以包含由seqidno：157表示的氨基酸序列。

生成用于dna转导的新型噬菌体颗粒可以在分子生物学中使用，例如，用于建立当前这样的遗传操作系统对其不可用的宿主的转导系统。重要的是，本发明描述的原理可以用于生成用于将dna递送到其他组的细菌宿主中的其他平台。例如，可以潜在地开发感染革兰氏阳性宿主的噬菌体，以使用所提出的技术转导一整组革兰氏阳性细菌。本发明进一步设想使用某些操作的噬菌体衣壳来转导真核生物，诸如酵母和甚至更高级的生物体，创造用于将dna导入期望的动物细胞中的令人兴奋和新型的平台。

用多种优化的t7颗粒转导多种宿主的能力使得能够特异且有效地编辑某些细菌群体。本发明人和其他人已经证明了使用如上文公开的crispr-cas系统(1、2、3)能够编辑微生物群体。在这些策略中，转导颗粒可以转移定制的crispr-cas系统以消除在患者中或在医院表面上发现的病原体中的抗生素抗性决定子，或源自天然菌群诸如皮肤和肠的病原体的抗生素抗性决定子。因此，通过这里描述的平台获得的颗粒可以应用于这些环境中，为抵抗抗生素抗性病原体的减少的武器库提供重要的新武器。

因此，在另一方面，本发明提供了通过将至少一种感兴趣的核酸序列转导入包含在所述细胞群内的靶细胞中来操作细胞群体的方法。在一些具体实施方案中，该方法可以包括使可能存在于也含有靶细胞的受试者、组织、器官、表面、物质和物品中的至少一种中的细胞群体与有效量的至少一种递送媒介物或包含该递送媒介物的任何试剂盒、系统或组合物接触的步骤。在一些具体实施方案中，这样的递送媒介物可以包含：(a)与靶细胞相容的至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体或片段；以及(b)至少一种感兴趣的核酸分子。

在一些具体实施方案中，本发明用于操作细胞群体的递送媒介物可以是通过本发明的任何方法制备的任何媒介物。在一些其他实施方案中，这样的噬菌体可以是本发明描述的任何修饰的噬菌体。

在一些具体实施方案中，本发明的方法可特别适用于操作原核的细胞群体、真核的细胞群体或其任何组合或混合物。应理解，本发明公开的任何原核细胞或真核细胞也适用于此方面。

如上所述，本发明提供了用于特异性靶向特定靶细胞和将感兴趣的核酸序列转导至靶细胞中的有力方法。该方法还允许操作和编辑受试者中或表面物品或物质中含有感兴趣的靶细胞的不同细胞群体。可以操作在受试者中或在表面、物品或物质(生物、人工或环境)中的靶细胞以表达或分泌期望的化合物，它们可以可选择地通过提供选择性优势来替换和改变靶细胞群体的组成和分布。在一些具体实施方案中，本发明的方法可以用于操作、编辑和改变有需要的受试者的微生物组。

如本文所用，术语“微生物组”指样品中共栖(commensal)、共生(symbiotic)或致病微生物的生态群落。可以与本公开内容一起使用的微生物组的实例包括但不限于皮肤微生物组、脐微生物组、阴道微生物组、结膜微生物组、肠(intestinal)微生物组、胃微生物组、肠道(gut)微生物组和口腔微生物组、鼻微生物组、胃肠道微生物组和泌尿生殖道微生物组。

在一些实施方案中，本发明的方法可以应用于操作受试者中的肠道微生物组。术语“肠道微生物组”(在口语中“肠道菌群”)包括生活在动物(在这种情况中为哺乳动物)消化道中的微生物物种的复杂群落。在这种情况下，肠道(gut)与肠(intestinal)以及菌群(flora)与微生物群(microbiota)和微生物群落(microflora)同义。肠道微生物组指肠道微生物群的基因组。尽管哺乳动物宿主很可能在没有肠道菌群的情况下存活，但两者之间的关系不仅仅为共栖(无害的共存)，而是互惠共生(mutualistic)。哺乳动物肠道微生物群落具有各种有用的功能，包括消化未利用的能量底物、刺激细胞生长、抑制有害微生物的生长、训练免疫系统仅对病原体作出应答以及防御一些疾病。然而，在某些条件下，一些物种能够通过产生感染或增加癌症风险而引起疾病。因此，通过靶向肠道微生物组的特定亚群，本发明提供了治疗性定制工具，用于调节由为肠道微生物组的一部分的某些微生物引起的状况。

哺乳动物肠道微生物组的组成主要由细菌组成，大部分为厌氧革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株，并且在较小程度上由真菌、原生动物和古细菌组成。细菌物种的群体在不同个体之间差异很大，但在个体内随时间是相对恒定的，然而，一些改变可能随着生活方式、饮食和年龄的变化而发生。在人类的个体生命期中已经观察到肠道微生物组成的共同进化模式。肠道微生物组成和含量可在长期饮食后改变；它还取决于地理来源。

更具体地，当提及人微生物组或微生物群的组成或含量时，意指关于四种主要细菌门的组成，即厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)和变形菌门(proteobacteria)，或者可选择地关于主要细菌属的组成，即拟杆菌属(bacteroides)、梭菌属(clostridium)、梭杆菌属(fusobacterium)、真杆菌属(eubacterium)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、消化球菌属(peptococcus)、消化链球菌属(peptostreptococcus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)。特别是最主要的拟杆菌属对宿主功能可能是重要的。其他属，诸如埃希氏菌属(escherichia)和乳杆菌属(lactobacillus)，尽管以较少的程度存在，但显示出有助于宿主功能。

此外，与人类肠道微生物组特别相关的是不依赖于年龄、性别、体重或国家区分(nationaldivision)的基于细菌生态系统的肠型分类。有三种人类肠型：1型以高水平的拟杆菌属(革兰氏阴性)为特征；2型具有很少的拟杆菌属，但普雷沃氏菌属(prevotella)(革兰氏阴性)很常见；以及3型具有高水平的瘤胃球菌属(革兰氏阳性)。然而，肠型可以会受到长期饮食的影响，例如，具有高蛋白和脂肪饮食的人主要为1型肠型，并且如果将他们的膳食模式改为高碳水化合物饮食-从长远来看会变成2型肠型。

因此，本发明的方法涉及构成哺乳动物肠道微生物组的细菌物种的整个范围，包括其定性和定量方面。它们还涉及不太普遍存在的微生物组组分，诸如真菌，已知的属包括念珠菌属(candida)、酵母菌属(saccharomyces)、曲霉菌属(aspergillus)和青霉菌属(penicillium)，以及属于古菌域(archaea)(也称为古细菌(archaebacteria))的微生物，以及不能被培养的尚未分类的物种。

现在回到本发明，在某些实施方案中，意指本发明的方法和组合物通过使感兴趣的核酸序列靶向微生物组内的特定宿主细胞和将感兴趣的核酸序列特异性转导至微生物组内的特定宿主细胞中的特征在于它们影响哺乳动物肠道微生物组的组成或含量，并从而提供用于调节取决于其的一系列状况的手段。在这种情况下，术语“状况”表示活生物体特别是哺乳动物的功能和代谢效率方面的“健康状况”。在人类中，它还表示在面对身体、心理或社会挑战时适应和自我管理的能力。

然而，应理解，本发明还涉及兽医科学所涵盖的动物健康，特别是哺乳动物健康状况。

在又一些其他实施方案中，通过本发明的方法和媒介物操作细胞群体可以适用于改变细菌群体，特别是在哺乳动物受试者的肠道微生物组中，以产生某些有益物质，诸如维生素、肽、糖、脂肪等。这些有益物质可以由感兴趣的核酸序列编码，或者可选择地，感兴趣的核酸序列可以编码参与其合成的产物。这些感兴趣的核酸序列通过本发明的媒介物和方法转导至特定的靶细胞中。更具体地，肠道微生物能够产生宽范围的产物，这些产物的生成可以取决于许多因素，包括营养物可用性和管腔环境，特别是ph。微生物产物可以被gi组织吸收，可能到达循环系统和其他组织，并通过尿或呼吸排出。通过大肠细菌发酵纤维和蛋白产生一些最丰富和生理上重要的产物，即短链脂肪酸(scfa)，所述短链脂肪酸充当结肠直肠组织和细菌的关键能量来源，并促进维持组织完整性的细胞机制。scfa可达到循环并影响组织诸如肺的免疫功能和炎症。存在因其对健康的影响而值得一提的许多其他产物。细菌诸如双歧杆菌可以生成维生素(例如，k、b12、生物素、叶酸、硫胺素)。人体中脂质转运和转换(turnover)的重要组分二级胆汁酸的合成是经由细菌介导的，所述细菌包括乳杆菌、双歧杆菌和拟杆菌。具有生物活性的大量脂质由微生物产生，包括可以引起组织炎症的革兰氏阴性细菌的细胞壁的组分脂多糖(lps)。细菌诸如双歧杆菌也可以通过产生乙酸盐(acetate)来帮助预防致病感染。

微生物产生的许多酶影响消化和健康。实际上，人类肠道中的许多微生物多样性可以归因于降解营养物所需的微生物酶能力谱，特别是人类消耗的许多形式的复合多糖。一些细菌，诸如多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotamicron)具有产生碳水化合物分解所需的一系列酶的能力。大肠的细菌肌醇六磷酸酶降解谷物中存在的植酸、释放与其复合的矿物质诸如钙、镁和磷酸盐，使得这些矿物质可被宿主组织(例如骨)获得。降解粘蛋白的酶帮助细菌满足其能量需求并且协助肠道内粘液屏障膜(mucusbarrierlining)的正常转换。因此，通过用本文公开的方法和媒介物操作微生物组，本发明提供了影响受试者中基本物质的产生、浓度和性质的方法。在一些具体和非限制性实施方案中，这样的物质可以是由细菌产生并在本文中公开的任何物质。

在又一些其他实施方案中，利用本发明的方法和媒介物操作例如阴道微生物组中的细胞群体可以用作生育控制的方法。更具体地，在正常和原本健康的女性中存在几种阴道群落(群落状态类型)，每种都具有显著不同的细菌物种组成。这些群落或者由四种常见的乳杆菌属物种(卷曲乳杆菌(l.crispatus)、惰性乳杆菌(l.iners)、格氏乳杆菌(l.gasseri)和詹氏乳杆菌(l.jensenii))中的一种占主导地位，或者不含有大量的乳杆菌而是有各种各样的严格厌氧微生物和兼性厌氧微生物。最近的研究已经发现，20％至30％的无症状健康女性携带缺乏客观数量的乳杆菌但包括与较高的ph(5.3至5.5)相关的多种兼性厌氧细菌或严格厌氧细菌的阴道群落。这些微生物群包括奇异菌属(atopobium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、厌氧球菌属(anaerococcus)、peptoniphilus、普雷沃氏菌属、加德纳氏菌属(gardnerella)、sneathia、eggerthella、动弯杆菌属(mobiluncus)和芬戈尔德菌属(finegoldia)等的成员。

本发明的方法可以是生育控制方案的一部分，更具体地说，充当男性避孕药。因此，在某些实施方案中，使用本发明的媒介物和方法靶向阴道微生物组内的特定细胞并转导感兴趣的核酸序列可以用于生成产生影响卵子或精子的活力或稳定性或精子的运动性的物质的细菌，并因此可以用作可逆的避孕药。因此，在一些实施方案中，本发明可以提供递送媒介物，所述递送媒介物用编码杀精产物或编码参与杀精产物的形成和合成的产物的感兴趣的核酸序列特异性地转导阴道微生物组中的细菌细胞。应理解，本发明的杀精核酸递送媒介物和含有该杀精核酸递送媒介物的避孕组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法递送至雌性哺乳动物的阴道。用于递送组合物的典型形式包括例如乳霜、洗剂、凝胶、药丸、气溶胶、泡沫、阴道间装置诸如海绵、避孕套(包括女性避孕套)、栓剂和薄膜。此外，本发明的杀精组合物可以用作个人护理产品，例如避孕套润滑剂等。

在又一些其他实施方案中，本发明的方法可以用于操作受试者的皮肤微生物组。大多数皮肤细菌落入四个不同的门中：放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。这四种主要的门也构成在内部粘膜表面(胃肠道和口腔)上发现的微生物群。然而，比例变化很大：尽管放线菌门成员在皮肤上更丰富，厚壁菌门和拟杆菌门成员在胃肠道中更丰富。肠道微生物群落和皮肤微生物群落的共同特征似乎为门水平的多样性低，但物种水平的多样性高。因此，如本文所用，术语“皮肤微生物组”包括但不限于丙酸杆菌属(propionibacterium)物种、类芽孢杆菌属(paenibacillus)物种、葡萄球菌属物种及其任何组合。此外，丙酸杆菌属物种包括但不限于痤疮丙酸杆菌(p.acnes)、颗粒丙酸杆菌(p.granulosum)、贪婪丙酸杆菌(p.avidum)及其任何组合。葡萄球菌属包括表皮葡萄球菌。更具体地，皮肤被大量微生物定植，其中大多数为有益的或无害的。然而，疾病诸如寻常痤疮与微生物组的强烈改变有关。特别是，痤疮被认为与人类皮肤微生物组的改变(distortion)有关。这种改变可能由皮肤细菌痤疮丙酸杆菌的特定子集引起。如本文所用，“寻常痤疮”和“痤疮”可互换使用，并且指在青少年中特别普遍的皮肤状况。痤疮经常与皮肤上的炎性损伤和非炎性损伤的形成有关。痤疮被认为与人类皮肤微生物组的改变有关。这种改变可能由皮肤细菌痤疮丙酸杆菌的特定菌株引起。因此，通过操作皮肤微生物组和特异性靶向痤疮丙酸杆菌，本发明提供了用于预防和治疗皮肤紊乱诸如痤疮的方法和组合物。

在当前方面的又一些其他实施方案中，通过本发明的媒介物和方法操作细胞群体也可以具有美容应用。更具体地，产生气味的细菌可以通过本发明的方法替换为无味的细菌或与气味产生者竞争的细菌。

在又一些其他具体实施方案中，由本发明的递送媒介物递送的感兴趣的核酸序列可以包括例如针对编码与气味形成有关的产物的细菌的不期望的基因(例如本文公开的编码脂肪酶的任何基因)的crispr-cas系统。使用这样的系统(特别是作为敏化元件，与选择性元件一起)可以能够用例如产生不能参与气味形成的缺陷型脂肪酶或不产生脂肪酶的细菌替代生成脂肪酶的细菌。

在人类中，体味的形成主要由皮肤腺体分泌和细菌活动引起。在不同类型的皮肤腺体之间，人类体味主要是大汗腺的结果，大汗腺分泌皮肤菌群(即微生物或细菌)将其代谢成有气味的物质所需的大部分化学化合物。

体味受到皮肤菌群，包括棒状杆菌属的成员的作用的影响，棒状杆菌属成员制造被称为脂肪酶的酶，该酶分解汗液中的脂质以产生较小的分子如丁酸。溶血性葡萄球菌(staphylococcushominis)也已知产生有助于产生气味的硫代醇化合物。这些较小的分子产生气味，并赋予体味其特有的香气(aroma)。丙酸(propionicacid)(丙酸(propanoicacid))存在于许多汗液样品中。这种酸为丙酸杆菌分解某些氨基酸的产物，这些丙酸杆菌在青少年和成人皮脂腺的导管中生长旺盛。因为丙酸在化学上类似于具有相似性质包括气味的乙酸，所以某些人可以将体味识别为具有类似醋的气味。作为细菌表皮葡萄球菌(其也存在于几种强烈的奶酪类型中)的作用的结果，异戊酸(3-甲基丁酸)为体味的另一个来源。

因此，在某些实施方案中，本发明还提供了体味抑制剂。本发明的体味抑制剂可制备成各种形式，诸如洗剂、气溶胶喷雾剂、天然喷雾剂、棒、粉末、走珠(roll-on)、乳霜、凝胶、乳液、片材(纸)、身体肥皂(诸如沐浴露和条皂)以及洗发用化妆品(诸如洗发水和冲洗液)。本发明的体味抑制剂可以通过通常已知的制备方法制备成剂型。可以应用本发明的体味抑制剂的身体区域的实例包括但不必限于腋窝、手臂、腿、脚掌、颈部、胸部和臀部。应注意，尽管主要应用于人类受试者，但本发明的气味抑制剂也可应用于产生强烈气味的动物，包括但不限于伴侣动物(宠物)、牲畜、实验动物、工作动物和运动动物。

更具体地，动物气味最经常由细菌和酵母代谢分泌物，尤其为皮肤油引起。皮肤湿润且黑暗的部位，嘴、耳朵、皮肤褶皱和尾部下方具有最高浓度的酵母和细菌和最强烈的气味。酵母和细菌存在于所有动物甚至健康宠物的皮肤上，但是当皮肤健康时，这些生物体的数量保持在最低。

除了通过本发明的递送媒介物和方法操作和编辑微生物组，特别是作为个性化药物的工具的治疗应用之外，细胞群体的特异性和靶向操作还可以显示例如在农业和食品工业中的工业适用性。因此，在一些非限制性实施方案中，本发明的递送媒介物和方法可以用于操作反刍动物的消化系统中的细菌群体以改进食品的消化、提高奶产量和/或肉的质量。

反刍动物的前胃包含极丰富的原核微生物(细菌、古细菌、病毒)和真核微生物(原生动物和真菌)，它们共同分解和发酵宿主动物摄取的饲料。反刍动物完全依赖于它们的微生物群来进行饲料消化并从而依赖于它们的生存力。常驻瘤胃细菌分类群的组成和丰度与宿主的生理参数之间的联系得到证实。例如，已知厚壁菌门与拟杆菌的比率与乳脂产量之间的强相关性。因此，调节瘤胃微生物组可以通过细菌群落设计用于更好的农业产量。

在提高饲料利用率、更好的饲料转化效率和动物的生产性能方面，瘤胃微生物菌株的选择和改进存在相当大的余地。从粪便中大量未消化的饲料的存在以及瘤胃中可以以其他方式被动物用作能源的大量甲烷气体的产生来看，瘤胃微生物生态系统不足以有效消化摄入的饲料。

遗传瘤胃操作可以允许引入或增加期望的活性，诸如纤维素水解和解毒或者减少不期望的活性诸如蛋白水解、脱氨和甲烷生成。为此目的，一种方法将为选择期望基因并是它们在优势瘤胃细菌中表达。使用本发明的修饰的噬菌体，瘤胃中天然存在的微生物可以被遗传修饰以增强其确定功能的能力或增加新功能。将各种基因引入肠道微生物中已经被广泛研究。遗传修饰的微生物能够消化草料中的纤维成分和木质素，或者降解毒素、合成必需氨基酸、减少瘤胃甲烷产生并耐受酸。

本发明考虑的反刍动物包括例如牛(cattle)(例如奶牛(cows))、山羊、绵羊、长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、羚羊、叉角羚和蓝牛羚。

在一些实施方案中，反刍动物微生物组包含以下微生物列表中的至少一种：乳杆菌属、氨基酸球菌属(acidaminococcus)、双歧杆菌属、小杆菌属(dialister)、rf39、奥尔森菌属(olsenella)、(科)普雷沃氏菌科、卡氏菌属(catonella)、密螺旋体属(treponema)、(目)红蝽杆菌目(coriobacteriales)、(科)红蝽杆菌科(coriobacteriaceae)、adlercreutzia、奇异菌属、(目)拟杆菌目、普雷沃菌属(prevotella)、(目)ys2、(目)梭菌目(clostridiales)、梭菌科(familyclostridiales)、真杆菌属、(科)毛螺菌科(lachnospiraceae)、blautia、丁酸弧菌属(butyrivibrio)、梭菌属、粪球菌属(coprococcus)、lachnobacterium、毛螺菌属(lachnospira)、moryella、假丁酸弧菌属(pseudobutyrivibrio)、罗斯氏菌属(roseburia)、shuttleworthia、(科)瘤胃菌科(ruminococcaceae)、颤螺旋菌属(oscillospira)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、月形单胞菌属(selenomonas)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、(目)气单胞菌目(aeromonadales)、f16科、bulleidia、p-75-a5、光岗菌属(mitsuokella)和succiniclasticum。

更进一步地，本文公开的平台提供了用于操作在各种工业应用中使用的细胞群体的工具。更具体地，生物技术工业使用细菌细胞来生产对人类存在有用的生物物质，包括燃料、食品、药物、激素、酶、蛋白和核酸。考虑到细菌内的基因库和遗传能力，生物技术的可能性为无穷无尽的。

关于宿主细菌，本发明适用于生产工业产品中使用的细菌或工业过程中使用的细菌，特别是属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门的细菌。

更具体地，在制药工业中，细菌为临床上有用的抗生素和酶的主要生产者；它们是抵抗曾经可怕的疾病的疫苗来源；它们是增强哺乳动物健康的益生菌。事实上，大多数抗生素由生活在土壤中的细菌产生。放线菌诸如链霉菌属产生四环素、红霉素、链霉素、利福霉素和伊维菌素。芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属产生杆菌肽和多粘菌素。细菌产品用于制造用于免疫传染病的疫苗。针对白喉、百日咳、破伤风、伤寒和霍乱的疫苗由引起相应疾病的细菌的组分制成。

生物技术已经产生人类激素诸如胰岛素、酶诸如链激酶、以及人类蛋白诸如干扰素和肿瘤坏死因子。这些产品用于治疗各种医学状况和疾病，包括糖尿病、心脏病、结核病、aids和sle。肉毒杆菌毒素和bt杀昆虫剂是分别在药物和害虫防治中使用的细菌产品。

细菌的一个生物技术应用涉及在环境中执行特定的代谢任务的生物体的超级菌株的遗传构建。例如，已经遗传上工程化以降解石油产品的细菌在清理溢油和其他生物修复工作中使用。

本发明的具体实施方案涉及使用本发明的递送媒介物促进群体中的有益细菌生长的方法，即产生治疗蛋白、维生素、疫苗、酶、生物燃料和其他溶剂的细菌，例如大肠杆菌属的不同菌株。在其他实施方案中，本发明的方法可以应用于产生生物乳化剂的细菌。具体实施方案涉及不动杆菌属的不同菌株。更进一步的实施方案包括本发明的方法和递送媒介物用于产生生物可降解塑料的细菌的用途。具体实施方案涉及弧菌属的菌株。本发明的其他实施方案涉及在生物修复中重要的细菌的方法。这样的细菌的非限制性实例包括假单胞菌属和寡养单胞菌属的不同菌株。

更具体地说，在食品工业中，细菌是乳制品和许多其他食品的发酵的主要参与者。乳酸菌诸如乳杆菌、乳球菌和链球菌在乳制品诸如奶酪，包括干酪和奶油干酪、发酵奶油、酸奶油、酪乳、酸奶和酸牛乳酒(kefir)的制造中使用。乳酸菌和醋酸菌在腌制(pickling)过程中使用，诸如橄榄、酸黄瓜和酸菜。细菌发酵在加工茶、咖啡、可可、酱油、香肠和我们日常生活中各种各样的食品中使用。

因此，在更具体的实施方案中，本发明应用于大肠杆菌、不动杆菌属、假单胞菌属、弧菌属、乳杆菌属、乳球菌属、柠檬酸杆菌属和寡养单胞菌属中的任何一种的任何菌株的细菌。

其他实施方案将本发明的方法的应用性扩展到乳球菌的不同菌株。乳球菌为一种球形的革兰氏阳性细菌，广泛用于发酵乳制品的工业生产。乳酸乳球菌被彻底研究并投入许多应用。它有几种发酵途径，但最重要的目的是其制造乳制品，诸如奶酪和牛奶的属性。乳酸乳球菌专门产生分泌乳酸的乳酸脱氢酶，用于保存食品和延长食品的保质期。乳制品行业通过操作乳酸乳球菌的环境和细胞行为继续改进其活性和有效性。

更进一步地，通过本发明提供的方法和媒介物操作细菌群体可在其一些实施方案中应用于生物防治。更具体地，假单胞菌属的某些成员(例如荧光假单胞菌和防御假单胞菌(p.protegens))已经应用于谷物种子或直接应用于土壤，作为防止作物病原体生长或建立的一种方式，这种做法通常被称为生物防治。生物防治意味着细菌可能在宿主植物中诱导全身抗性，因此它可以更好地抵抗真正的病原体的攻击；细菌可能胜过其他(致病)土壤微生物，例如通过铁载体(siderophore)提供清除铁方面的竞争优势；细菌可能产生拮抗其他土壤微生物的化合物，诸如吩嗪类抗生素或氰化氢。

在肠道微生物组中操作细胞群体也可以具有例如益生菌应用性。因此，在更进一步的实施方案中，本发明的方法可以应用于乳杆菌属的不同菌株。乳杆菌为一种棒状、革兰氏阳性、发酵性的有机营养细菌。它们通常为直的，尽管它们在某些条件下可以形成螺旋形或球杆状形式。它们通常以成对或成不同长度的链出现。乳杆菌被归类为乳酸菌，并且几乎所有它们的能量来源于在同型乳酸发酵过程中葡萄糖向乳酸的转化。乳杆菌，特别是嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)，被认为具有益生用途。嗜酸乳杆菌通过产生允许敏感但有益的微生物的繁殖的来帮助维持肠的ph水平，所述敏感但有益的微生物是粪便菌群的重要组成部分，并且这样做可以帮助在大量使用抗生素后替换肠道中有用的细菌。嗜酸乳杆菌还具有对抗肠易激综合征、肝性脑病、哮喘、高胆固醇、乳糖不耐症和坏死性小肠结肠炎的用途。嗜酸乳杆菌也被用作牲畜的饲料添加剂，因为它通过产生某些酶来帮助食物的消化。

生物技术的另一个领域涉及通过基因工程改进植物的品质。基因可以通过本发明的递送媒介物引入到植物和遗传工程化的植物细胞中，所述植物细胞在本文中称为期望的宿主细胞，使得它们对某些害虫、除草剂和疾病具有抗性。

如上所述，本发明提供的系统可用于操作表面、物品和物质中存在的细胞的群体。非限制性实例涉及本发明的修饰的噬菌体，所述修饰的噬菌体携带例如上文描述的靶向抗生素抗性基因或任何其他不期望的基因的crispr-cas系统作为期望的核酸序列，并且因此用于用对抗生素治疗敏感的细菌群体替换抗生素抗性细菌的细菌群体。更具体地，这样的递送媒介物可以用于例如处理医院表面和洗手消毒液皂或靶向医务人员的皮肤菌群的其他液体。与选择抗性病原体的抗生素和消毒剂不同，所提出的治疗富集并选择敏感的病原体。具体而言，该策略可以进一步扩展到抗生素抗性是危害生命的情况的免疫受损患者于其中住院的医疗部门。在又一些其他实施方案中，该策略也可以应用于老年人，例如，由于抗生素抗性可能引起并发症的感染艰难梭菌的受试者。

本发明设想使宽范围的表面与本发明的噬菌体接触，包括织物、纤维、泡沫、薄膜、混凝土、砖石、玻璃、金属、塑料、聚合物等。

根据一个具体实施方案，噬菌体与医院、临终关怀院、养老院或其他这样的护理机构中存在的表面接触。

与健康有关的其他表面包括涉及水净化、水储存和水输送的那些物品以及涉及食品加工的那些物品的内表面和外表面。因此，本发明设想在食品或饮料工厂中涂覆固体表面。

与健康有关的表面还可包括涉及提供营养、卫生或疾病预防的那些家庭用品的内表面和外表面。因此，本发明的噬菌体也可以用于对马桶缸、导管、ng管、吸入器等进行消毒。更具体地，细菌在导管的内表面或装置的其他部分上的定植可产生严重的并发症，包括需要移除和/或替换植入装置并且大力治疗继发感染状况。

适于用本发明的试剂盒和系统涂覆、漂洗(rinsing)、冲洗(flushing)或储存的医疗装置通常具有由热塑性或聚合物材料，诸如聚乙烯、涤纶、尼龙、聚酯、聚四氟乙烯、聚氨酯、乳胶、硅氧烷弹性体等构成的表面。具有金属表面的装置也适于用本发明的试剂盒包含该试剂盒的任何溶液或材料漂洗或储存的涂层。特别适于应用本发明的试剂盒的特定装置包括血管内、腹膜、胸膜和泌尿导管、心脏瓣膜、心脏起搏器、血管支架和整形外科假体、眼内假体或阴茎假体。

更进一步地，众所周知，将纯净或非纯净的普通自来水输送到固定装置的小口径管道，诸如牙科单元、内部内窥镜管、导管管道、无菌填充口以及用于无菌制造、食品加工等的管道，在其内表面产生细菌生长和细菌抗性。应理解，本发明的试剂盒和系统也可以应用于防止和减少如本文描述的小口径管道中的细菌抗性。

在其他实施方案中，包含本发明的修饰的噬菌体(例如，携带敏化和/或选择性组分的修饰的噬菌体)的试剂盒和系统可以应用到所治疗的受试者附近。在一些具体实施方案中，试剂盒或系统可以应用于所治疗的受试者附近的任何表面、装置或物体上。表述“所治疗的受试者的附近”涉及围绕所述受试者的周边，根据本发明的试剂盒或系统可应用于其上以防止抗生素抗性基因的水平转移。因此，理解“所述受试者附近”包括在所述受试者的最多达至少约1厘米(cm)、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8m、9m、10cm、20cm、30cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、1米(m)、2m、3m、4m、5m、6m、7m、8m、9m、10m、11m、12m、13m、14m、15m、16m、17m、18m、19m、20m、30m、40m或甚至50m的范围内存在的所有物体。术语“所述受试者的附近”还涉及在将其放置到被治疗的受试者的所述范围内之前，对其应用本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或系统的物体。

根据一些实施方案，本发明的试剂盒或任何组分或任何噬菌体可以每12小时、每日、每周6次、每周5次、每周4次、每周3次、每周2次或甚至每周1次应用至固体表面。

在一些实施方案中，包含本发明媒介物的试剂盒和系统可以用于和应用于食品工业中使用的任何表面或与任何食品(food)或食物或食物产品(foodproduct)接触的任何表面。例如，食品或食物产品包括任何合适的肉或肉制品，其衍生自但不限于猪肉、牛肉、小牛肉、羊肉、羊羔、绵羊、山羊、野牛、麋鹿、鹿、羚羊、马、狗、家禽(例如诸如鸡、火鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、鸵鸟、鹌鹑、鸽子(dove)、鸽子(pigeon)、鸸鹋、雌孔雀)，或任何其他哺乳动物或鸟类(禽类)物种的肉。“牛肉产品”包含牛科亚科的成年哺乳动物的肉，包括牛、水牛、野牛和条纹羚(kudus)。“猪肉产品”含有猪的肉。“家禽产品”含有鸟的肉，诸如鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、鸸鹋、鸽子(dove)、鸽子(pigeon)、鹌鹑、野鸡、孔雀或珍珠鸡。应该注意，“肉”包括整个肌肉或磨碎的肌肉或器官(例如肝脏)。

屠宰动物受到严重卫生问题的挑战，这导致通过交叉污染在产生的肉上产生大量细菌负荷。因此，在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以应用于屠宰场或杂货店中制备和储存肉或任何肉制品的任何表面或物品上，特别是容器、不锈钢盒、牛肉嫩化器、研磨机、刀具、混合器、香肠填充器、塑料盒、地板和和排水管。在屠宰场，这样的表面包括香肠填充器、平台、地板和排水管。在又一些其他具体实施方案中，本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或系统可以应用于食品工业中使用的任何生物或非生物表面，特别是涉及肉制品的制备、运输和储存的任何表面。更具体地，屠宰场中的任何表面，包括猪、牛和其他家畜的尸体也可以用本发明的试剂盒处理，以减少细菌负荷并增加对抗生素的敏感性。更具体地，可将动物的整个尸体浸入或喷洒含有本发明的修饰的噬菌体媒介物或根据本发明的任何试剂盒或系统的溶液或液体。

在又一些其他实施例中，本发明的试剂盒和系统可以应用于用于容纳食品的任何容器和食品处理器具上，包括容纳、包装、覆盖、储存、展示、加工、切割、切碎、刺穿、揉捏、操操作或以其他方式处理食品，使得食品容器或器具的表面与食品接触。

如上所述，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统可以应用于任何用于储存或运输任何食品，特别是肉类的表面。包装可以通过任何常规的肉类包装手段进行，包括用托盘、透明膜(诸如收缩包装或saran)或纸(包括非蜡纸或蜡纸)来容纳肉制品，或者通过任何适合肉制品的方式来包装、装袋、装箱、装罐或装瓶(jarring)。

更具体地，容器和器具为能够容纳食品的任何合适的一次性(即使用一次的)或非一次性(即使用多次的)配置。这些配置包括但不限于剪切包装、片材、纸张、蜡纸、袋子、纸盒、托盘、盘子、碗、有盖和无盖的存储容器、供应餐具、杯子、罐子、广口瓶、瓶子或适用于特定食品的任何其他容器配置。特别适用于食品处理目的的另外的配置包括但不限于手套(gloves)或连指手套(mitts)；用具诸如叉子、勺子、刀具、切片机、加工机、榨汁机、研磨机、削片机、钩子、压榨机、螺丝、开瓶器、切割器、削皮器、钳子、长柄勺、勺子(scoop)、杯子、滑槽或刮刀；以及砧板、捏合板、搅拌碗、干燥架或冷却架或搁板。

在又一些其他实施方案中，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统可以用在海洋食品中使用的任何表面或容器上。具体地，海鲜包括任何海洋或淡水水生生物体，诸如各种鱼类(如金枪鱼、鲑鱼、大比目鱼、鳕鱼、鲨鱼、箭鱼、鲈鱼、鲱鱼、沙丁鱼、鳟鱼、鲤鱼、白鲑和鲈鱼)、软体动物(蛤蜊、扇贝、牡蛎、贻贝、蜗牛、章鱼和鱿鱼)或甲壳类动物(如螃蟹、虾、龙虾和小龙虾)。

蛋类也受到污染，特别是沙门氏菌污染，并且鸡蛋污染可以以多种方式发生。在下蛋之前，鸡蛋可能会被水平感染，构成细菌进入发育中的蛋的运动，而蛋仍然在母鸡的输卵管中。

细菌污染也可以在下蛋过程期间通过垂直感染发生。母鸡为许多细菌的常见携带者(carrier)，其中许多细菌如沙门氏菌存在于消化道中。当这些细菌通过泄殖腔(一种充当生殖、泌尿和肠道末端的结构)沉积时，蛋可以被这些细菌污染。通常，存在于鸡上和鸡内的细菌(致病菌群和正常菌群二者)都与鸡蛋一起沉积，并且在接触后，它们能够在外层(角质层)硬化之前渗透壳。沉积后，鸡蛋也可能与环境细菌接触。这些细菌可能渗透壳，特别是如果污染在下蛋后不久发生，或者可能积聚在壳上，导致最终渗透壳。积聚在壳上的细菌可能在加工过程中渗透壳。更具体地，当鸡蛋经历温度变化时，如在商业鸡蛋的洗涤和消毒期间经常发生的，鸡蛋的内容物收缩，产生负压梯度，其有效地将细菌拉过壳和外膜。因此，在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以喷撒在鸡蛋上。可选择地，鸡蛋可以在含有本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统的粉末中滚动，或者浸入含有本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统的溶液中。

更进一步地，在一些实施方案中，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统可以应用于任何壳体系统、笼子和用于蛋鸡和与蛋鸡接触的任何设备上。

在又一些其他实施方案中，本发明的媒介物或本发明的任何试剂盒或系统可以用作宠物食品中的食品添加剂，以减少抗生素抗性病原体向人体的传播，并在需要时用抗生素有效地治疗它们，本文描述的产品还可以用作在食品中的添加剂中使用或作为食品中的添加剂使用，该食品意图供任何基本驯化或驯服的动物或鸟类，诸如兔子、豚鼠、热带鱼和鸟类消耗。如本文所用的术语“宠物食品”通常指意图用于宠物消耗的任何食品。具体地，如本文所用的“宠物食品添加剂”通常指旨意图添加到(例如掺入和/或应用于)宠物食品的任何产品，例如在该加工期间或在食品消耗之前。

应理解，在一些实施方案中，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统可以应用于任何生物表面或组织上，特别是用于操作这样的表面上的细菌细胞群体。在又一些其他具体实施方案中，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统可以应用在任何粘膜表面上。更具体地，如本文所用，粘膜表面或粘膜(mucosae)(单数粘膜(mucosa))指分泌粘液并排列在胃肠道、呼吸道、生殖道和泌尿生殖道中的粘液上皮，并且也存在于与这些器官相关的外分泌腺中：胰腺、眼睛的结膜和泪腺、唾液腺和哺乳期乳房的乳腺。由于它们的气体交换(肺)、食物吸收(肠道)、感觉活动(眼睛、鼻子、嘴和喉咙)和生殖(子宫、阴道和乳房)的生理功能，粘膜表面必然是身体内部的动态的、薄的、可渗透的屏障。这些特性使得粘膜组织特别容易受到病原体的颠覆(subversion)和破坏(breach)。因此，将本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统应用在粘膜表面上可以操作这样的生物表面中的细胞群体，例如，它可以引起细菌负荷的减少(由于选择性组分)、使剩余的病原体敏感(由于敏化组分)、并且从而可以促进细菌感染和相关状况的抗生素治疗。应注意，本文所用的细菌负荷的减少指约1％至100％中的任一种，特别是约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至约95％、约95％至99％或约99％至99.9％或更多，特别是100％的细菌负荷。

在又一些其他具体实施方案中，将本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统应用于粘膜表面上，例如肺组织(例如，通过使用任何吸入器)，可以特别应用于患有慢性呼吸道感染的患者。例如，铜绿假单胞菌(pa)通常从患有囊性纤维化的个体的呼吸道分离，并且与这些患者的肺功能加速下降相关，并且因此，使用本发明的试剂盒增加这些细菌对抗生素治疗的敏感性可以改进和改善cf患者状况和相关症状。更具体地，如本文所用的，囊性纤维化(也称为cf)指胰腺内的特征性瘢痕形成(纤维化)和囊肿形成。呼吸困难是最严重的症状，并且由被抗生素和其他药物治疗但未被治愈的频繁的肺部感染引起。许多其他症状，包括鼻窦感染、生长不良、腹泻和不育是由cf对身体其他部位的影响造成的。cf由蛋白囊性纤维化跨膜传导调节子(cftr)基因突变引起的，并且被认为是一种常染色体隐性疾病。如上所述，将本发明的试剂盒应用于cf患者的肺组织上可以改进患者的状况。

更进一步地，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统也可以应用于任何慢性肺定植和感染，所述慢性肺定植和感染也可以在支气管扩张(一种支气管树疾病)和慢性阻塞性肺病(一种以气道狭窄和气流异常为特征的疾病)中发生。更进一步地，它还可以应用于住院患者的肺炎，特别是在机械通气患者中。

在又一些其他实施方案中，将本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统应用于泌尿生殖道或生殖道上也可以应用于尿路感染。应理解，本发明的试剂盒也可以应用于与粘膜组织接触的任何表面上，例如垫、卫生棉条等。

更进一步地，作为生物表面，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统可以应用或喷洒在皮肤上，特别是受伤的皮肤上，例如在灼伤的情况中。因此，向受影响皮肤区域的喷涂或任何局部施用或敷用含有本发明试剂盒的软膏、乳霜、悬浮液、糊剂、洗剂、粉末、溶液、油、凝胶或粉末，或含有本发明公开的试剂盒或其任何组分的可喷雾气溶胶或蒸气也包括在本发明中。常规的药学载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。术语“局部应用”或“局部施用”指将软膏、乳霜、润肤剂、药膏(balm)、洗剂、溶液、油膏、膏剂或任何其他药学形式应用于患者皮肤的一部分或全部皮肤，该部分或全部皮肤受到或已经受到细菌感染性疾病的一种或更多种症状或涉及皮肤的任何其他症状的影响，或者显示或已经显示细菌感染性疾病的一种或更多种症状或涉及皮肤的任何其他症状。应理解，本发明的试剂盒可以应用在用于治疗皮肤紊乱的任何基质、织物或绷带上，从而使细菌群体对抗生素治疗敏感。

如上所述，应理解，本发明的媒介物或其任何试剂盒或系统或其任何组件可以应用在可能与粘膜组织接触的任何表面、装置、容器或设备上。在又一些具体实例中，由隐形眼镜(cl)、cl存储盒和护理溶液上的细菌引起的眼部感染可能是cl相关角膜感染的风险因素，并且可以解释cl存储盒中生物体的持久性。不同类型的镜片佩戴方式需要使用隐形眼镜存储盒和护理液用于过夜存储和消毒。然而，隐形眼镜存储盒以及存储溶液可能变得被细菌污染。卫生行为以外的因素，包括微生物抗性可能与隐形眼镜储存盒和护理液的持续微生物污染有关。在储存期间，镜片容易被各种细菌菌株和其他微生物定植，并且即使将镜片储存在含有过氧化氢、氯己定、双胍或季铵化合物的消毒溶液中时，该问题也存在。虽然与隐形眼镜使用相关的最严重的感染可能是微生物角膜炎，但是镜片护理系统的污染可能导致产生可以影响眼睛的毒素。通过提供有效的敏化试剂盒，本发明提供了用于储存隐形眼镜的组合物和方法，并且因此还包括用于抑制、减少或消除角膜感染的方法。上文描述的方法可以包括以下步骤：提供涂覆本发明的试剂盒或其任何组分的镜片储存容器，或者可选择地或另外地，提供包含本发明的试剂盒的护理溶液(储存溶液)，并且将隐形眼镜插入到涂覆本发明的试剂盒的容器中和/或用含有有效量的本发明的试剂盒的溶液漂洗隐形眼镜。

还应当理解，本发明因此提供涂覆、应用或含有本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或系统的隐形眼镜储存盒。在又一些其他实施方案中，本发明提供含有本发明试剂盒的隐形眼镜储存和护理溶液。

更进一步地，本发明还提供了治疗方法，所述治疗方法包括将治疗有效量的本发明的修饰的噬菌体媒介物或其任何试剂盒或系统，任选地与至少一种抗生素化合物，特别是前文所公开的任何抗生素组合，施用于患有传染病的受试者的步骤。还应注意，本发明的试剂盒或其任何组分的应用可以形成对患有传染病或状况的受试者的补充治疗方案。

本发明在另一方面还提供了一种组合物，所述组合物包含有效量的至少一种修饰的噬菌体或修饰的噬菌体的任何混合剂或混合物。

更具体地，这样的噬菌体可以包含：(a)至少一种修饰的宿主识别元件；和任选地

(b)至少一种感兴趣的核酸分子。

在更具体的实施方案中，用于本发明组合物的修饰的噬菌体可以如本发明公开的任何实施方案中所定义。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以配制成喷雾剂、棒、涂剂(paint)、凝胶、乳霜、洗液(wash)、擦拭物(wipe)、泡沫、肥皂、油、溶液、洗剂、软膏、洗手液或糊剂。

术语“有效量”涉及组合物中存在的活性剂特别是本文所述的本发明的核酸递送媒介物的量，当施用这样的组合物时，需要它在待治疗或操作的个体的作用部位处提供期望水平的活性剂以给出预期的生理应答。在患病受试者等的情况中，精确的量将取决于许多因素，例如活性剂、组合物的活性、所用的递送装置、组合物的物理特性、预期的患者使用(即每天施用的剂量数)、患者考虑等，并且可以由本领域技术人员基于本文提供的信息容易地确定。本发明的核酸递送媒介物的“有效量”可以在一次施用中施用，或者通过总计为有效量的多次施用来施用。它可以使用用于确定适当的施用量和施用时间的标准临床程序来确定。理解“有效量”可以是治疗医疗保健专业人员和/或个人的经验和/或个体化(逐案)确定的结果。

本发明的药物组合物可以根据良好的医学实践通过本发明的方法全身施用和给药，例如通过肠胃外，例如胸腺内、进入骨髓和静脉内、腹膜内、皮下、经皮、局部、肌肉内、关节内、结膜下或粘膜，例如，口服、鼻内或眼内施用。

局部施用到需要治疗的区域可以通过例如手术期间的局部输注、局部应用、直接注射到特定器官等来实现。更具体地，前文描述的本发明的任何方法中使用的组合物可适于通过肠胃外、腹膜内、透皮、口服(包括经颊或舌下)、直肠、局部(包括经颊或舌下)、阴道、鼻内和任何其他合适的途径施用。这样的制剂可通过药学领域中已知的任何方法制备，例如通过使活性成分与载体或赋形剂结合。

在又一些其他实施方案中，本发明的组合物可以任选地还包含药学上可接受的载体、赋形剂、添加剂/稀释剂和佐剂中的至少一种。

更具体地，可以方便地以单位剂型存在的根据本发明的用于治疗有相应需要的受试者的药物组合物可以根据制药工业中周知的常规技术制备。这样的技术包括使活性成分与药学载体或赋形剂结合的步骤。通常，制剂通过将活性成分，特别是本发明的核酸递送媒介物与液体载体或细碎固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使产品成形来制备。组合物可以配制成许多可能剂型中的任何一种，诸如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可配制成水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液还可以含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。本发明的药物组合物还包括但不限于乳液和含脂质体的制剂。

此外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。药物组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气溶胶。活性剂在施用后可以是全身性的，或者可以通过使用局部施用、壁内施用(intramuraladministration)或使用用于在植入部位保留活性剂量的植入物来定位。活性剂可以配制成立即活性，或者可配制用于持续释放。

如上所述，本发明提供了用于制备具有工业和治疗应用的递送媒介物的平台。因此，本发明提供了本发明的媒介物用于治疗涉及细菌群体的紊乱的方法和用途。更具体地，通过提供将核酸序列转导至任何感兴趣的靶细胞的修饰的媒介物，本发明提供了用于定制治疗的强大平台，并因此涉及靶向患有由所述细胞引起或与所述细胞相关的病理状况的受试者中的特定细胞或细胞群体的个性化药物。无论先前是否被表征过，细胞可以从受试者分离，并且靶向患者的具体致病细胞的特定递送媒介物可以如本文描述地制备。

因此，在一些其他方面，本发明提供了治疗、预防、改善、抑制或延迟受试者中由致病细胞引起或与致病细胞相关的病理性紊乱发作的方法。在一些实施方案中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的至少一种递送媒介物或包含该递送媒介物的任何试剂盒、系统或组合物的步骤。更具体地，递送媒介物包含：(a)与所述致病细胞相容的至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段；和(b)至少一种感兴趣的核酸分子。

在一些实施方案中，包含在递送媒介物内的至少一种相容的宿主识别元件可以通过本发明的方法获得。具体地，首先(a)，提供编码至少一种宿主识别元件或其任何变体、突变体、蛋白或片段的多个核酸分子。这些核酸分子还包含至少一种包装信号和编码可选择元件的至少一种核酸序列。在步骤(b)中，使包含所述多个核酸分子的第一宿主细胞与携带编码至少一种缺陷宿主识别元件或其任何蛋白或片段的核酸序列的递送媒介物在允许所述递送媒介物繁殖的条件下接触，并且回收在所述第一宿主细胞中繁殖的所得递送媒介物变体。下一步骤(c)涉及使第二宿主细胞与步骤(b)中回收的递送媒介物变体接触。应注意，在一些实施方案中，可以使用从所述受试者的样品获得的致病细胞作为“第二宿主细胞”。接下来在步骤(d)中，选择在步骤(c)中获得的包含所述可选择元件的宿主细胞的集落。在步骤(e)中，从步骤(d)中选择的宿主细胞中分离和/或表征编码宿主识别元件的核酸序列，以获得编码与所述致病细胞相容的宿主识别元件的核酸序列。然后可以制备包含治疗核酸序列被包装在其中的这些特定宿主识别元件的媒介物。这些媒介物专为该受试者定制。应注意，“第二宿主细胞”可以从受试者的任何样品、其任何体液，组织或器官获得。这些细胞也可以从取自受试者周围的表面、物品或物质的环境样品中获得。

在又一些其他实施方案中，本发明的方法使用的噬菌体中包含的感兴趣的核酸序列可以包含以下中的任一种：(a)至少一种敏化组分，该敏化组分包含至少一种cas基因和至少一种crispr阵列，其中所述crispr的至少一个间隔区靶向包含在所述致病细胞的致病基因或不期望的基因内的前间区，以便特异性灭活所述致病基因或不期望的基因，并且所述crispr的至少一个间隔区靶向包含在选择性组分内的前间区，以便特异性灭活所述选择性组分；或(b)包含至少一种前间区的至少一种核酸序列。

根据与感染性状况相关的紊乱的术语“治疗”可以指以下中的一种或更多种：消除、降低或减少与所述感染性状况相关的紊乱的强度或频率。治疗可以在与所述感染相关的紊乱开始发生时进行，或可以连续施用，例如通过每1至14天施用，来预防或减少易于发生所述状况的个体中感染性状况的发生。

术语“预防”指预防或降低生物或医疗事件的发生，特别是与感染性疾病相关的紊乱的发生或再发生的风险，所述与感染性疾病相关的紊乱为研究者、兽医、医师、或其他临床医生力图在组织、系统、动物或人类中防止的，并且术语“预防有效量”旨在指将实现该目标的药物组合物的量。因此，在特定的实施方案中，本发明的方法在预防，即防止与传染病相关的状况中特别有效。因此，被施用所述组合物的受试者较不可能经历与所述感染性状况相关的症状，所述症状也较不可能在在过去已经经历它们的受试者中再发生。

如本文使用的术语“改善”涉及由根据本发明的组合物和方法引起的症状的减少和受试者状况的改善，其中所述改善可通过以下形式表现：与细菌感染相关的病理性过程的抑制、其程度的显著降低、或患病受试者生理状态的改善。

术语“抑制”以及该术语的所有变化形式旨在包括病理症状的进程和恶化或者与所述病理过程的症状或过程相关的病理过程的进程的限制或禁止。

术语“消除”涉及病理症状和可能的病理病因的基本根除或去除，任选地根据以下描述的本发明的方法。

术语“延迟”、“延迟发作”、“减缓”及其所有变化形式旨在包括减慢病理性紊乱或传染病的进程和/或恶化以及减慢其进程、进一步恶化或进展的其症状，以晚于不存在根据本发明的治疗出现。

如本文使用的术语“方法”指用于完成给定任务的方式(manners)、手段(means)、技术和程序，包括但不限于化学、药理、生物、生化和医疗领域的实践者已知或已经从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文使用的，术语“治疗”包括废除、基本抑制、减慢或逆转状况的进程，基本改善状况的临床或审美(aesthetical)症状，或基本防止状况的临床和审美症状的出现。

如本文使用的，“疾病”、“紊乱”、“状况”等，当它们涉及受试者的健康时可互换使用并且具有属于这样的术语的每个或全部的意思。

本发明涉及有相应需要的受试者或患者的治疗。“患者”或“有需要的受试者”意指可被以上提到的病原体感染并且期望本文描述的预防性(preventive)和预防性(prophylactic)试剂盒、系统和方法的任何生物体，包括人类；家养和非家养哺乳动物，诸如犬科和猫科受试者、牛科、类人猿、马科和鼠科受试者；啮齿动物；家养鸟类；水产养殖；鱼和外来观赏鱼。应理解，治疗的受试者还可以是任何爬行动物或动物园动物。更具体地，本发明的试剂盒和方法旨在预防哺乳动物中的病理状况。“哺乳动物受试者”意指需要提议的疗法的任何哺乳动物，包括人类、马科、犬科和猫科受试者，最特别是人类。应注意，特别是在非人类受试者的情况中，本发明的方法可以使用经由注射、饮水、饲喂、喷雾、经口喂食(oralgavage)进行施用和直接施用至有相应需要的受试者的消化道中。

更进一步地，应注意，本发明还提供用于通过将本发明的试剂盒及其任何组分应用到细菌群体来使所述细菌群体对至少一种抗生素化合物敏化或增加所述群体对至少一种抗生素化合物的敏感性的方法。

在又一些其他方面，本发明提供了用于使用本发明的试剂盒及其任何组分来防止或降低细菌或细菌群体对至少一种抗生素化合物的抗性的方法。

本发明还提供了用于通过将本发明的试剂盒或其任何组分应用到包含所述细菌的表面上来治疗致病细菌的爆发的方法。

如上所述，本发明提供了非常特异和有效的媒介物，所述媒介物特异性转导期望的靶细胞。因此，该特异性可以用于诊断应用。更具体地，本发明的媒介物可以仅针对特定病原体，并且特别设计用于将报告基因引入所述靶病原体中。该病原体在生物样品或环境样品中的诊断可以通过检测报告基因，特别是由所述报告子形成的可检测的信号来确定。因此，在又一些其他实施方案中，本发明提供了诊断方法，所述诊断方法包括使生物样品或环境样品与本发明的递送媒介物接触，所述递送媒介物包含针对期望的病原体的宿主识别元件和编码报告基因的核酸序列。检测由报告基因产生的信号表明样品中存在所述病原体。术语“报告基因”涉及编码多肽的基因，该多肽的表达可以在各种已知的测定中检测，并且其中所检测的信号的水平表明存在所述报告。报告基因的非限制性实例为编码和表达荧光素酶、nanoluc荧光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)、分泌碱性磷酸酶(seap)、β-半乳糖苷酶(lacz)、β-葡萄糖苷酸酶(gus)、新霉素磷酸转移酶(neo)和氯霉素乙酰转移酶(cat)的基因。

应理解，为了清楚起见，在独立的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征还可在单个实施方案中组合提供。相反，简略起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的多种特征还可单独提供，或以任何合适的子组合提供，或合适时在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。在多种实施方案的上下文中描述的某些特征并不被认为是那些实施方案的必需特征，除非实施方案在没有这些要素的情况下则不起作用。

如本发明以上描绘的以及如在以下权利要求部分中请求保护的本发明的多种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。

本文使用的所有科学和技术术语具有本领域通常使用的意思，除非另外指明。本文提供的定义是为了便于理解本文频繁使用的某些术语并且不意味着限制本公开内容的范围。

如本文使用的术语“约”指示可偏离所指的值多达1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％、并且在一些情况中高于或低于所指的值多达20％，偏离范围包括整数值，并且如果适用也包括非整数值，构成连续的范围。如本文使用的术语“约”指±10％。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其同源词意指“包括但不限于”。该术语包括术语“由......组成”和“基本上由......组成”。短语“基本上由......组成”意指组合物或方法可包括另外的成分和/或步骤，但条件是另外的成分和/或步骤不实质性地改变请求保护的组合物或方法的基础特性和新特性。贯穿本说明书和实施例和后面的权利要求，除非上下文另外要求，否则术语“包含(comprise)”和变化形式诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为隐含包括陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他的整数或步骤或者整数或步骤的组。

应注意，本发明的各种实施方案可以范围格式存在。应理解，以范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的不灵活限制。相应地，范围的描述应被理解为具有已具体地公开所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如从1到6的范围的描述应被认为已具体地公开诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等的子范围，以及该范围内的单个的数值例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。无论何时本文指示数值范围，其意指包括所指示的范围内的任何引述的数值(分数或整数)。术语“范围在(ranging/rangesbetween)”第一个指示数和第二个指示数“之间”以及“范围为从(ranging/rangesfrom)”第一个指示数“到(to)”第二个指示数在本文可互换使用并且意指包括第一个指示数和第二个指示数及其之间的所有分数和整数。

公开的和描述的将被理解为本发明不限于本文公开的特定实施例、方法步骤和组合物，因为这样的方法步骤和组合物可稍微变化。还将理解，本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求及其等价物限定。

必须要注意，如本说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非内容另外明确规定。

以下实施例为发明人在执行本发明的方面中采用的技术的代表。应理解，尽管这些技术为用于实践本发明的优选实施方案的示例，但根据本公开内容，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神和预期范围的情况下可进行许多修改。

实施例

现在参考以下实施例，所述实施例连同以上说明以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。

总体来说，本文使用的命名法以及在本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组dna技术。这样的技术在文献中被详尽地解释。参见，例如，"molecularcloning:alaboratorymanual"sambrook等人,(1989)；"currentprotocolsinmolecularbiology"卷i-iiiausubel,r.m.编辑(1994)；ausubel等人,"currentprotocolsinmolecularbiology",johnwileyandsons,baltimore,maryland(1989)；perbal,"apracticalguidetomolecularcloning",johnwiley&sons,newyork(1988)；watson等人,"recombinantdna",scientificamericanbooks,newyork；birren等人(编辑)"genomeanalysis:alaboratorymanualseries",卷1-4,coldspringharborlaboratorypress,newyork(1998)；美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号和第5,272,057号中所述的方法；"cellbiology:alaboratoryhandbook",卷i-iii,cellisj.e.编辑(1994)；freshney的"cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique",wiley-liss,n.y.(1994),第三版；"currentprotocolsinimmunology"卷i-iiicoliganj.e.编辑(1994)；stites等人(编辑),"basicandclinicalimmunology"(第8版),appleton&lange,norwalk,ct(1994)；mishell和shiigi(编辑),"selectedmethodsincellularimmunology",w.h.freemanandco.,newyork(1980)；在专利和科学文献中广泛描述可用的免疫测定法，参见，例如，美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号和第5,281,521号；"oligonucleotidesynthesis"gait,m.j.编辑(1984)；“nucleicacidhybridization"hames,b.d.和higginss.j.编辑(1985)；"transcriptionandtranslation"hames,b.d.和higginss.j.编辑(1984)；"animalcellculture"freshney,r.i.编辑(1986)；"immobilizedcellsandenzymes"irlpress,(1986)；"apracticalguidetomolecularcloning"perbal,b.,(1984)和"methodsinenzymology"卷1-317,academicpress；"pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications",academicpress,sandiego,ca(1990)；marshak等人,"strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)；所有这些文献通过引用并入本文，如同在本文完全阐述一样。遍布此文档提供其他一般参考文件。其中的程序被认为是本领域熟知的并且被提供以方便读者。本文包含的所有信息通过引用并入本文。

实验程序

试剂、菌株和质粒

luria-bertani(lb)培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物和5g/lnacl)和琼脂来自acumedia。2yt培养基含有在蒸馏水中的1.6％(w/v)细菌胰蛋白胨(acumedia)、1％(w/v)细菌酵母提取物(acumedia)和0.5％(w/v)nacl(acumedia)。抗生素、溶菌酶、l-阿拉伯糖和麦芽糖来自calbiochem。限制性酶、连接酶、dna修饰酶和高保真dna聚合酶来自新英格兰生物实验室(newenglandbiolabs)。本发明中使用的细菌菌株和噬菌体被列于表1。

表1用于本发明的细菌菌株和噬菌体

质粒构建

使用标准分子生物学技术构建质粒。通过pcr扩增dna区段。标准dna消化和连接根据制造商的说明书进行。表2中列出的本发明中使用的噬菌体尾基因经密码子优化并通过genescript合成。在本研究中使用的质粒列于表3中，用于构建的寡核苷酸在表4中详述，并且用于构建的引物和模板列于表5中。

表2本发明中使用的噬菌体尾蛋白

表3.本发明中使用的质粒

表4用于质粒构建的寡核苷酸5'→3'

表5用于质粒构建的引物和模板

菌株的构建

bw25113δtrxa::kan从keio保藏(15)获得。bw25113δtrxaδwaac通过使用pcp2016切除卡那霉素抗性标记构建。所得菌株(bw25113δtrxa)用作使用来自keio保藏的bw25113δtrxa::kan作为供体菌株的p1转导中的受体菌株。p1转导如yosef等人,2011(18)中描述地进行。

使用甲磺酸乙酯(ems)诱变剂制备质粒文库

将含有t7包装质粒的大肠杆菌bw25113的过夜培养物在含有适当抗生素的5mllb培养基中1:50稀释。将培养物在37℃通气数小时。达到对数中期后，将细胞洗涤两次并重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。然后将ems(sigma-aldrich)以1％加入培养物中，并将细胞在37℃通气1小时。然后将细胞用pbs洗涤三次，然后重悬于补充有适当抗生素的50mllb中，并在37℃通气16小时。过夜培养物用于制备如下文描述的t7噬菌体文库。该程序用于制备本发明的任何包装质粒，例如包装质粒piype19(其核酸序列由seqidno：24表示)，其包含待特异性突变的序列、编码尾丝蛋白gp11、gp12和gp17中至少一种的核酸序列(分别由seqidno：34、39、25表示)、包装信号(例如，seqidno：20、21、22或23)和抗生素抗性基因(如seqidno.44表示)，在含有适当抗生素的2yt培养基中1:50稀释。

制备具有gp11、gp12和gp17缺失的噬菌体t7

具有trxa-flp而不是基因17的t7噬菌体通过之前描述的同源重组构建(17)。简言之，使携带pgemiy398f(编码gp17)和pcaiy396(编码具有与基因17的末端同源的侧接序列的trxa-flp)的bw25113细胞生长过夜。然后在bw25113δtrxa/pgemiy398f中选择编码trxa的噬菌体。flp重组酶用于通过在bw25113/pgemiy398f/pac-frt中连续繁殖噬菌体从t7δ17trxa-flp噬菌体中切除trxa基因。最终如(17)中描述地分离t7δ17噬菌体。

为了构建t7δgp(11-12-17)，使用类似的方法从噬菌体t7δ17中删除基因11-12。简而言之，携带pgem3rcf(编码gp11、gp12和gp17)的bw25113细胞和质粒pcaiy405(编码具有与基因11-12的末端同源的侧接序列的trxa-flp)用于用trxa-flp替换基因11-12。然后在bw25113δtrxa/pgem3rcf中选择编码trxa的噬菌体。flp重组酶用于通过在bw25113/pgem3rcf/pac-frt中连续繁殖噬菌体从t7δgp17δgp(11-12):trxa-frt噬菌体中切除trxa基因。最终如(17)中描述地分离t7δ(11-12-17)噬菌体。

含有转导形成单位(tfu)的裂解物的制备

将含有编码t7包装信号和尾蛋白的质粒的供体菌株大肠杆菌bw25113的过夜培养物在lb中1:5稀释，并在37℃通气另外1小时。细胞通过离心洗涤并用新鲜lb重悬。然后用约5*10⁸pfu的t7δ(11-12-17)以约2的感染复数(moi)感染培养物。将感染的培养物在37℃通气1.5h至2h，直至发生裂解。裂解后，加入氯仿，并将裂解物以最大速度离心2分钟。所得裂解物包含含有噬菌体dna的大约一半颗粒和含有质粒编码基因11、基因12和基因17的一半颗粒。在确定质粒转导的特异性的实验中，如上描述地制备裂解物，除了大肠杆菌bw25113的过夜培养物含有两种质粒：具有t7包装信号的一种质粒和具有缺乏包装信号的尾蛋白的另一种质粒。

tfu测定

用缺乏trxa基因的受体大肠杆菌菌株(bw25113δtrxa或δtrxaδwaac)的单个菌落接种补充有抗生素的无菌lb(16)。将培养物在37℃以250rpm振荡过夜。第二天早上，将新鲜的过夜培养物在补充有抗生素的5mllb中1/50稀释，并在37℃振荡直至达到大约0.5的o.d.。将受体培养物保持在冰上直至使用。

为了对裂解物进行连续稀释，使用96孔板(如果裂解物为高滴度，则应制备高达10^-9的稀释液，否则制备高达10^-7的稀释液)。接下来，将10μl如上文描述地制备的裂解物与10μl受体培养物混合。将该板在剧烈振荡中于37℃放置1h。在恢复期间，将补充有抗生素的lb板在罩(hood)中干燥1h。最后，将10μl所得培养物以点状铺在干燥的板上。使板在37℃生长过夜(o.n.)。对菌落进行计数并确定bw25113δtrxa上的tfu滴度，用于使宿主中的噬菌体繁殖。

转导测定

将处于指数生长期的受体细胞以1:1比例(v/v)与如上文描述地制备的t7tfu裂解物的连续稀释液混合。将培养物在37℃振荡孵育60min。接下来，将培养物铺在含有适当抗生素的lb-琼脂板上，并在37℃孵育过夜。将tfu/ml计数归一化至在指定的参照菌株中获得的10⁸个转导物。

增强杂交t7颗粒将dna转导至新宿主的能力(gotrap)

如上文描述地用总体积为10ml的受体细胞和t7tfu裂解物进行转导测定。从选择性板汇集转导物并提取质粒。将纯化的质粒(100ng)重新转化到bw25113中并接种在补充有50μg/ml卡那霉素的lb板上。过夜孵育(约1*10⁶)后收集转化体，并如上文描述地用ems诱变。t7裂解物从ems处理的细胞制备并用于转导受体细胞。t7裂解物也用于转导参考菌株，用于使受体细胞上的tfu归一化。

实施例1

从野生型包装质粒中选择许可性t7受体结合蛋白

先前显示t7噬菌体的尾蛋白指导t7噬菌体对不同宿主的识别(10)。先前扩展噬菌体宿主范围的尝试依赖于宿主支持噬菌体生长的能力(10)。推测，在独特的选择压力下，这些尾蛋白的定向进化将能够使用它们来将核酸(例如dna)注入到期望的宿主中，而不管噬菌体在这些宿主中繁殖的能力如何。

为此，使用t7噬菌体颗粒包装和转导质粒dna的能力。发生这样的包装，条件是质粒编码合适的包装序列(13)。包装的dna赋予抗生素抗性并因此含有它的细菌可以用适当的抗生素选择。推测在独特的选择压力下，这些尾蛋白的定向进化将能够使用它们来将dna注入到期望的宿主中，而不管噬菌体在这些宿主中繁殖的能力如何。

该特征用于包装编码t7受体结合蛋白的尾基因(即基因gp11、gp12和gp17)。用于包装编码基因gp11、gp12和gp17的质粒的噬菌体缺乏这些尾基因，并且因此dna转导依赖于从质粒表达的受体结合蛋白。进一步推测，只有当包装的dna编码的受体结合蛋白具有使它与宿主受体相容的突变时才能注入包装的dna。受体与野生型尾蛋白不匹配的宿主只有在突变的相容的尾蛋白在转导质粒上编码时才会被转导。因此，该系统将允许选择识别期望的宿主的突变的尾基因。提取转导的质粒并重复该过程应导致使进一步选择具有增强的转导效率的尾蛋白，如例如图1中所示的。

本发明人首次确定该系统确实可以选择编码新宿主的受体结合蛋白的基因。对于缺乏waac受体和trxa的大肠杆菌菌株证明这一点，该菌株用作限制性靶宿主的模型。该宿主不支持t7生长，因为它缺乏t7dna聚合酶必需的亚基trxa。由于缺乏waac(lps生物合成所需的基因)，它也缺乏可识别的t7受体。因此该宿主不支持t7噬菌体生长或dna转导。具有相容的尾蛋白的t7噬菌体可以转导它，尽管t7噬菌体不能在其中繁殖，而野生型t7既不能转导它，也不能在其中繁殖。

首先展示了从未操作的包装质粒的群体中选择质粒。因此，t7噬菌体在含有野生型可包装质粒的bw25113大肠杆菌菌株上繁殖。所得的裂解物(如图1b中图示的)用于转导限制性大肠杆菌δtrxaδwaac，该限制性大肠杆菌δtrxaδwaac充当“临床菌株”(在本文中也称为“靶宿主”或“期望的菌株”)的模型，如图1c所示。使用该裂解物产生的菌落(其中一些可能含有编码相容的受体结合蛋白的质粒)的转导在本文中也称为“宿主识别元件”。合并这些菌落、提取质粒并将质粒转化到bw25113中。这些细胞经历另一个包装周期。使用该裂解物的转导产生至少两倍更多的菌落，并且再进行两次重复循环产生10⁴倍更多的菌落，表明随后由t7噬菌体包装并再次转导的转导的质粒编码携带相容的受体结合蛋白的质粒(图2)。

为了进一步验证该假设，对从不同循环纯化的质粒进行测序。值得注意的是，鉴定基因17中引起对缺乏waac基因的大肠杆菌的受体的识别增强的突变(s541r)。独立实验产生相同的独立突变，证明平台的重复性及其生成与新宿主相容的新尾部的效率。因此，选择方案和随后的富集确实成功地直接进化具有产生期望的表型的突变的颗粒。

实施例2

杂交t7噬菌体有效地将dna转导入新宿主中]

如上文在实施例1中所述和所证明的，由于t7噬菌体可以包装和转导质粒，发明人假设确定不同宿主特异性的不同尾部将允许dna转导至期望的宿主中，而不管噬菌体在这些宿主中成功繁殖的能力如何。同样，用于包装质粒的t7噬菌体缺乏其尾基因(基因11、基因12和基因17)。因此，其成熟为转导颗粒反式地取决于转导质粒产生的尾基因。因此，只有当尾基因产物组装成杂交颗粒时，并且只有当该尾部识别转导宿主的受体时，质粒转导才能发生(图3a)。期望的杂交体允许向靶宿主赋予抗生素抗性的质粒转导。为了进一步建立支持发明人假设的本发明的平台，设计了编码如上表2中详述的15种不同噬菌体的尾基因的质粒以及抗生素抗性标记和t7包装序列(13)。

与上述实施例1中详述的设计类似，在含有不同质粒的大肠杆菌中制备15种不同的杂交颗粒裂解物。如图3b所示，在图中详述的12种不同的靶宿主中测试产生的杂交颗粒裂解物中的每种的转导效率。通过计数获得由转导质粒编码的抗生素抗性标记的菌落形成单位的数量来确定转导效率。

由于缺乏trxa(编码t7dna聚合酶亚基的宿主基因[modrich和richardson,bacteriophaget7deoxyribonucleicacidreplicationinvitro.bacteriophaget7dnapolymerase:ananemzymecomposedofphage-andhost-specificsubunits.jbiolchem250,5515-5522(1975)])而不支持t7噬菌体繁殖的大肠杆菌k-12的衍生物bw25113δtrxa宿主菌株被用作靶宿主。如图3b中示出的，在编码t7尾蛋白的宿主中产生的杂交颗粒有效地将dna转导至bw25113δtrxa宿主菌株中。此外，展示克雷伯杆菌噬菌体k11的杂交颗粒有效地将dna转导至克雷伯杆菌属物种390中，如前文示出的(10)。

测试的其他克雷伯杆菌菌株(如图3所示)表现出至少一种杂交颗粒的dna转导，如图3b示出的。阴沟肠杆菌和产气肠杆菌(详见图3b)也由一些杂交颗粒以低至中等效率转导。同一属的细菌内相容杂交体数量的偏差可以显著变化(例如sen4513对sen4510)。一些宿主只能通过单个杂交颗粒转导，证明测试多个杂交体对于寻找至少一个杂交颗粒和新宿主的相容组合是至关重要的。另一方面，一些宿主被多个杂交颗粒有效转导(例如sso4727被所测试的15个杂交颗粒中的12个转导)，证明对于许多细菌宿主发现相容的杂交颗粒可能是可行的。总之，这些实验清楚地确定本发明平台的可行性，证明该方法可以显著扩展利用噬菌体将dna转导至新宿主中。该目标在需要噬菌体繁殖的现有技术研究中无法解决和证明。因此，如图8的示意图所示，本发明的平台显示出相对于现有技术方法的明显优势。

实施例3

从诱变的野生型包装质粒中选择许可性t7受体结合蛋白

更进一步地，接下来证明从编码尾蛋白的变体的突变的包装质粒的群体中选择相容的质粒(即编码相容的受体结合蛋白的质粒)。发明人假设转导效率可以通过选择由于它们编码的修饰的尾基因而更有效转导的质粒来提高。更具体地，发明人假设在dna转导实验中，编码这样的修饰的尾部的质粒将比编码亲本尾部的质粒更有效地转导，这仅仅是因为展示它们的颗粒比展示亲本尾部的颗粒更好地转导dna。在其中收集转导的质粒并将其用于产生更多的杂交颗粒的几个转导循环后，分离编码具有增强的转导能力的尾蛋白的突变质粒将是可能的(图4a)。该基本原理是发展本文称为“gotrap”的程序的基础。

gotrap程序(转导颗粒的一般优化)被开发为一个平台，将表型(即dna的转导)与允许这样的转导的期望的基因型(即尾部编码基因中的突变)相联系，并且包括在诱变剂存在下在图4a中示意性地证明的程序。

作为gotrap的可行性测试，诱变剂ems用于在编码尾蛋白11、尾蛋白12和尾蛋白17的可包装质粒中生成随机突变，如上文详细描述的。然后，在含有这些质粒的宿主上繁殖缺乏基因11、基因12和基因17的t7噬菌体。然后如实施例1中描述的，将所得裂解物用于转导大肠杆菌δtrxaδwaac(bw25113δtrxaδwaac)。由于缺乏trxa，该宿主不支持t7噬菌体繁殖，并且不编码t7宿主受体脂多糖(lps)，因为它缺乏lps生物合成所需的基因waac(19)。因此，该宿主既不支持t7噬菌体生长也不支持dna转导。因此接下来进行进一步的实验，目的是分离具有能够转导它的改变的相容的尾蛋白的t7颗粒。ems诱变用于在编码t7尾蛋白的可包装质粒中生成随机突变。然后使用含有这些质粒的大肠杆菌宿主产生展示质粒编码的突变尾部的颗粒。然后将所得颗粒用于转导限制性大肠杆菌bw25113δtrxaδwaac。转导物使用抗生素选择并计数(图4b，第0次循环)。合并这些转导物，并提取它们的质粒并转化到用于产生另外的转导颗粒裂解物的新鲜的大肠杆菌宿主中。使用该裂解物转导产生比第一个裂解物产生的超过10⁴倍更多的菌落(图4b，第1次循环)，并且再重复两次循环产生比第一个裂解物约10⁷倍更多的菌落(图4b)。这些结果表明由t7噬菌体重新包装并重新转导的转导质粒编码与限制性宿主的突变的相容的尾部(mutated-compatibletail)。为了验证该假设，对从第3次循环纯化的质粒进行测序。与上述结果类似，鉴定了基因17中的突变，即d540n，其位于已知允许t7噬菌体吸附至大肠杆菌lps突变体的残基旁边的位置(19)。

实际上，如图4c所示，用引入该具体突变的质粒使转导效率相对于亲本质粒增加了约10⁶倍。该结果证实，鉴定的突变负责观察到的表型。四个独立实验产生相同的独立突变，证明gotrap的重复性及其在进化出与新宿主相容的新尾部的效率。当使用增变质粒mp6时，已经揭示在相同位置上将d540取代为酪氨酸残基(d540y)的突变。有趣的是，如实施例1中所证明的，选择方案和随后的富集确实成功地在与使用诱变剂(例如d541r)得到的位置相似的位置直接进化颗粒，得到产生期望的表型的突变。

为了进一步示出gotrap也应用于除大肠杆菌以外的菌株，将以上测定用于提高以中等效率转导宋内志贺氏菌临床分离株(表6不支持t7噬菌体繁殖的菌株)的颗粒的转导效率。为此，将编码t7尾蛋白的突变质粒转导入宋内志贺氏菌(即sso4727)，提取该突变质粒，并然后转化回大肠杆菌宿主中。这些宿主因此被用于产生新的裂解物。新的裂解物用于重新转导宋内志贺氏菌，并将这些循环重复三次。在第一次、第二次和第三次循环后，连续监测到转导颗粒的滴度分别相对于初始效率提高约50倍、120倍和150倍，这可能由于富集具有更高的转导效率的突变质粒(图4b)。该效率在第三次循环稳定，最可能的是其中所有质粒是具有提高的转导效率的突变体。

提取的质粒的dna测序揭示基因17中的突变，致使479位的甘氨酸被丝氨酸取代。为了验证这个突变确实是负责提高的转导效率的唯一突变，将亲本质粒在该位置突变并监测与未突变质粒相比的转导效率。有趣的是，突变质粒相对于亲本质粒将其转导效率提高了约150倍，如图4c中示出的。该结果证实，鉴定的突变负责观察到的表型。

另外，如下文证明的，含有非t7尾部的杂交颗粒也可以通过gotrap测定优化。由t7衣壳和尾部构成但具有衍生自噬菌体13a的尾丝的杂交体被优化以进一步将dna转导至肺炎克雷伯杆菌4800ii中。同样在这种情况中，三次循环足以显著提高杂交颗粒的转导效率，如图4b中证明的。在这种情况中，在基因12中鉴定出致使733位的甘氨酸向天冬氨酸取代的突变。实际上，与对照质粒相比，用以上具体突变构建的突变质粒致使转导效率相对于对照质粒提高，如图4c中示出的。总之，这些结果表明gotrap测定可以显著提高跨多个细菌属的颗粒的dna转导的效率。

表6图1中测试的菌株上噬菌体裂解物的噬菌斑形成

实施例4

将期望的核酸分子转导至感兴趣的受体靶宿主细胞

如上文详细描述的，选择识别期望的宿主的适当的尾部和尾蛋白将允许根据需要递送dna。将这些尾蛋白克隆到不具有包装信号的质粒上。编码包装信号的另外的质粒，即包含例如crispr-cas或其他抗生素敏化元件或任何期望的dna的递送构建体被共转导。用噬菌体感染含有这两种质粒的宿主产生具有将期望的dna注入到期望的宿主中的相容的尾蛋白的杂交噬菌体。

因此，如下文详细描述的，证明了重新编程噬菌体衣壳以使得能够将期望的质粒(不编码尾基因)转导至新宿主中的能力。为此，将两种质粒引入到用于产生颗粒的大肠杆菌宿主中：编码gotrap测定中获得的亲本尾基因或突变尾基因的不可包装质粒，以及携带抗生素标记的可包装质粒，如图5a中示意性示出的。

鉴于上文呈现的结果，据推测，含有在宿主中产生的编码突变尾部的可包装质粒的产生的颗粒将比用亲本尾部产生的颗粒更有效地转导这种质粒(即可包装质粒)。裂解物用于转导大肠杆菌δtrxaδwaac、宋内志贺氏菌4727和肺炎克雷伯杆菌4800ii。然后将菌株接种在补充有转导的质粒赋予对其的抗性的抗生素的平板上，并在第二天计数。

如图5b中示出的，可包装质粒的转导，对应于测量的亲本尾部和突变尾部的转导效率]。

使用在本研究中鉴定的编码相容的尾部的宿主中产生的其他杂交颗粒也观察到编码包装信号(但不编码尾基因)的质粒的转移，如图6中示出的。作为特异性的对照，将转导细胞铺板在含有由尾部编码质粒赋予的抗生素抗性的平板上。不可包装质粒的转导效率比携带包装信号的质粒低至少100倍，表明可包装质粒相对于不可包装的质粒以至少100倍的因子特异性递送(图6)。这些实验示出了，实际上，杂交颗粒衣壳可以被编程以有效且特异性地促进期望的dna质粒转导至新宿主中。

发明人进一步将gotrap方案应用于受体鼠伤寒沙门氏菌atcc14028菌株上。将受体用在bw25113/mgp4187上制备的噬菌体杂交颗粒[t7(gp11-12)ypsp-g(gp17)]转导。在收集转导质粒并将其用于产生更多的杂交颗粒的10次转导循环后，获得比第一次裂解物产生10³倍更多的菌落的裂解物(图7)。这些结果表明，由t7噬菌体重新包装并重新转导的转导质粒编码与限制性宿主的突变相容的尾部。为了验证这一点，在用来自第10次循环的裂解物转导后对几个鼠伤寒沙门氏菌克隆的尾基因进行测序。在基因11、基因12和基因17的上游区域中鉴定出几种突变(表7)。

为了确定基因17上游的突变的影响，使亲本质粒在这些位置突变(mut1和mut2，表7)并监测与亲本质粒相比的转导效率。为此，构建两种质粒，每种质粒在gp17的atg起始密码子上游的-9位或-10位具有点突变。突变质粒相对于亲本质粒将转导效率增加了约50倍(图7b)。该结果清楚地表明，这些突变部分负责观察到的表型。

表7.在来自第10个gotrap循环的质粒中鉴定的突变

*所有克隆和质粒均基于本发明公开的质粒mgp4187。

序列表

<110>技术创新动力基金（以色列）有限合伙公司

<120>具有扩展宿主范围的噬菌体变体、其制备方法及其在将核酸转导至感兴趣的宿主中的用途

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ctaaagtcaaccttcggttgaccttgagggttccctaagggttggggatgacccttgggt180

ttgtctttgggtgttaccttgagtgtctctctgtgtccct220

<210>23

<211>851

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>t7包装信号

<400>23

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gctacgcatatcattgagatgtctgtgggaggagttgatgtgtactctgaggacgatgag120

ggttacggtacgtctttcattgagtggtgatttatgcattaggactgcatagggatgcac180

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gtattagtatcaccttaacttaaggcgggatcgtcaccctcagcagcgaaagacagctgt420

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acctcctaacg851

<210>24

<211>8850

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>用于富集可以将它们的dna注入到大肠杆菌waac中的噬菌体的piype19。

<400>24

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taatgcgccgctacagggcgcgtccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaaggg3900

cgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaagg3960

cgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagt4020

gaattgtaatacgactcactatagggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgc4080

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accgttttgacttaccagttagatggctccaatcgtgattttaatatcccgtttgagtat4200

ctagcccgtaagttcgtagtggtaactcttattggtgtagaccgaaaggtccttacgatt4260

aatacagactatcgctttgctacacgtactactatctctctgacaaaggcttggggtcca4320

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ctatctaaagatggtaacaggaataactggtacattggtagagggtcagataacaacaat5340

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cctacggctgggtggaatagcgacccttggctgagactcagcggtaacttggagggacgc8460

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ctgaacttagggaccggacaatatcgattccctgtggttggtaacgccaagttcaacact8760

gtatacatcttgtcagatgagactacccctctgaacatcattgggtgtggctgggaaggt8820

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<210>25

<211>1662

<212>dna

<213>肠杆菌噬菌体t7（enterobacteriaphaget7）

<220>

<221>misc_feature

<223>尾丝蛋白

<400>25

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gatgagaccaagggtttccgagacgaagccaagcggttcaagaatacggctggtcaatac660

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ctcaagcaggactatgcagtagttaacaaacacttccacgtaggtcaggccgttgtggcc1320

actgatggtaatattcaaggtactaagtggggaggtaaatggctggatgcttacctacgt1380

gacagcttcgttgcgaagtccaaggcgtggactcaggtgtggtctggtagtgctggcggt1440

ggggtaagtgtgactgtttcacaggatctccgcttccgcaatatctggattaagtgtgcc1500

aacaactcttggaacttcttccgtactggccccgatggaatctacttcatagcctctgat1560

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agtcgttcagtacctaatgcaatcatggtggagaacgagtaa1662

<210>26

<211>1677

<212>dna

<213>肠杆菌噬菌体13a（enterobacteriaphage13a）

<220>

<221>misc_feature

<223>gp17

<400>26

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acgaccgacagattggttgactttacggacggctcaatcctccgtgcgtatgaccttaac300

gtagctcagattcaaacgattcacgtagcggaagaggcccgtgacctcactgcggatact360

atcggtgtcaataacgatggtcacttggatgctcgtggtcgtcgaattgtgaacctagcg420

aacgccgtggatgaccgcgatgctgttccgcttggtcaactaaagaccatgaaccagaac480

tcatggcaagcacgtaatgaagccttacagttccgtaatgaggctgagactttcagaaac540

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gatgagaccaagggtttccgagacgaagccgagcagttcaagaatacggctggtcaatac660

gatacatctgctgggaactctgcttccgctgcgcatcaatctgaggtaaacgctgagaac720

tctgccacagcatccgctaactctgctcatttggcagaacagcaagcagaccgtgcggaa780

cgtgaggcagacaagctggggaattttaatggactggctggtgcaattgataaggtagat840

ggaaccaatgtgtactggaagggaaatattcacgctaacgggcgcctttacattaccaca900

aacggttttgactgtggtcagtatcaacagttctttggtggtgacactaatcgttattct960

gtcatggagtggggagatgataacggatggctgatgtatgttcaacgtagagagtggaca1020

acagcgataggcggtaacatccagttagtagtaaacggacagatcatcacccaaggcgga1080

gccatgactggtcagctaaaattgcagaatgggcatgttcttcaattagagtccgcatcc1140

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gggtcagataacaacaatgactgtaccttccactcctatgtacatggtacgaccttaaca1260

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actgatggtaatattcaaggtactaagtggggaggtaagtggcttgatgtttacctaaac1380

gatacttacgttaagaagacaatggcttggactcaagtatgggctgctgatagtggtaag1440

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ttcctttcagccgagggcggttggctaaaattccagatacactctaatggcagggtattt1620

aagaacatatcggatagagatgcgcctccaacagcaatagccgtagaggacgtgtaa1677

<210>27

<211>1677

<212>dna

<213>耶尔森氏菌噬菌体ypsp-g（yersiniaphageypsp-g）

<220>

<221>misc_feature

<223>尾丝

<400>27

atggctaacgtaattaaaaccgttttgacttaccagttagatggctccaatcgtgatttt60

aatatcccgtttgagtatctagcccgtaagttcgtagtagtaacccttattggcgtagac120

cgcaaggtccttacgattaatgcagactaccgttttgctacgcgtactaccatctcactt180

accaaggcttggggtccagcggatggatacactaccatcgagttacgccgagtaacctcc240

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aacgctgtggatgaccgcgacgctgttccgtttggtcaacttaagaccatgaaccagaac480

tcgtggcaggcgcgtaatgaggcactacagttccgtaatgaggctgagactttcagaaat540

caaacggaggtttttaagaatgagtccggtactaacgctacgaacacaaagcagtggcga600

gatgaggctaatgggtcccgagatgaagccgagcagttcaagaatacggctggtcaatac660

gctacatctgctgggaactctgctactgctgcgcatcaatctgaggtaaacgctgagaac720

tccgctacagcagcagcgaactctgcgaatttggcagaacaacacgcagaccgtgcggaa780

cgtgaagcagacaagctggggaattttaatggactggctggtgcaattgacagggtggat840

ggaaccaatgtgtactggaaaggaggtatccatgcgaacggacgcctttaccttacctca900

gatggtttcgactgtggtcagtatcaacagttctttggtggttctgctggtcgttactct960

gtcatggagtggggtgatgagaacggatggctgatgcatgttcaacgtagagagtggaca1020

acagcgataggtgataacatccagctagtagtaaacggacatatcatcgcccaaggtgga1080

gacatgactggtccgctgaaattgcagaatggacatgccctttacttagagtccgcatcc1140

gacaaggcgcaatatattctatctaaagatggtaacagaaacaactggtacattggtaga1200

ggatcagataacaacaatgactgtaccttccactcctatgtgtatggtacgaacttaaca1260

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actgatggtaatattcaaggtactaagtggggaggtaagtggcttgatgcttacctaaac1380

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<213>沙门氏菌噬菌体vi06（salmonellaphagevi06)

<220>

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<223>预测的尾丝蛋白

<400>31

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<213>假单胞菌噬菌体gh-1（pseudomonadphagegh-1）

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<213>克雷伯杆菌噬菌体k11（klebsiellaphagek11）

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<213>肠杆菌噬菌体t7（enterobacteriaphaget7）

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<212>dna

<213>克雷伯杆菌噬菌体k11（klebsiellaphagek11）

<220>

<221>misc_feature

<223>gp11

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<213>沙门氏菌噬菌体vi06（salmonellaphagevi06）

<220>

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<213>沙门氏菌噬菌体phisg-jl2（salmonellaphagephisg-jl2）

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atttaa2406

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<213>克雷伯杆菌噬菌体k11（klebsiellaphagek11）

<220>

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<213>假单胞菌噬菌体gh-1（pseudomonadphagegh-1）

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tacatccgccgttcttccggcatctaa2427

<210>44

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<213>链霉素抗性基因（streptomycinresistancegene）

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<213>肠杆菌噬菌体phieap-1（enterobacterphagephieap-1）

<220>

<221>misc_feature

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<400>45

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<213>克雷伯杆菌噬菌体vb_kpnp_kpv289（klebsiellaphagevb_kpnp_kpv289）

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<213>克雷伯杆菌噬菌体vb_kpnp_kpv289（klebsiellaphagevb_kpnp_kpv289）

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<223>噬菌体尾丝蛋白/t7-样尾管蛋白b

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