本发明涉及在体外分化诱导多能性干细胞的方法。更具体而言,本发明涉及在体外将多能性干细胞分化诱导为与信息呈递细胞有相同的表现型及功能的细胞的方法,其包括将多能性干细胞或该多能性干细胞被浓缩的细胞级分与来源于信息呈递细胞的损伤细胞和/或死细胞(含它们的一部分)共培养。
背景技术:
近年,推进从多能性干细胞分化诱导的研究,期待分化诱导的各种细胞向再生医疗、药物开发研究、药物安全性试验等的各种各样的用途的应用。
在再生医疗中,通过向对象疾病移植从本身或异体采集的多能性干细胞或储存的多能性干细胞、或者从这些多能性干细胞分化诱导的细胞,尝试治疗疾病。另外,在药物开发研究中,在解析或筛选中利用从来源于健康者的多能性干细胞或从患者得到的疾病特异性的多能性干细胞分化诱导的作为目的的细胞,期待开发对于该疾病的新药。再者,在药物安全性试验中,期待在开发中或被开发的医药的毒性的筛选中使用分化诱导的细胞。
为了可在医疗的现场或产业上利用以这样的用途作为目的的细胞,有从多能性干细胞、多能性干细胞大量、稳定、并且容易地得到分化诱导的细胞的必要。报告了从多能性干细胞分化诱导作为目的的各种细胞的尝试,但已知在分化诱导过程中向多能性干细胞导入特定的基因的方法(专利文献1等)、在添加各种细胞因子的培养基中分化多能性干细胞的方法(专利文献2)。但是,这样的分化诱导法的诱导顺序烦琐,另外为了诱导细胞而经长期间(例如,数周),从而无法认为是容易的方法,再者成本也非常地高。
一方面,也提议不使用细胞因子而分化诱导心肌细胞的方法(非专利文献1)。在此提议中,无饲养层培养后,单离为单细胞,其后,以高密度接种,进行接附培养。但是,有如果不是能在无饲养层培养中驯化的细胞就难以分化这样的问题。
另外,作为成为分化诱导的前提的多能性干细胞之一,作为典型例举以由作为本发明人的一人的出泽氏发现的存在于间充质细胞级分的ssea-3(阶段特异性胚胎抗原-3,stage-specificembryonicantigen-3)作为表面抗原表达的muse(多系分化应激耐受,multilineage-differentiatingstressenduringcells)(专利文献3;非专利文献2)。muse细胞与其他作为多能性干细胞已知的人工多能性干细胞(ips细胞)、胚胎干细胞(es细胞)、神经干/前体细胞(nspc)、脐带血干细胞(ucbc)不同,细胞的筹备容易,如ips细胞一样不以用于其筹备的基因导入作为必要,无肿瘤形成能。
muse细胞在再生医疗中的贡献至今知之甚多,可在心肌梗塞、脑肿瘤、脑梗塞、肾障碍等的治疗中发现(专利文献4等)。例如,在心肌梗塞的治疗中确证,通过将muse细胞从静脉注入,muse细胞到达梗塞部位,分化为心肌细胞而达成心肌梗塞的治疗。一方面,还缓慢地得知向静脉施用的muse细胞向疾病部位游走的机制,例如,提示与被认为从疾病部位释放的sip1等的趋化因子(损伤信号)相关(专利文献5)。但是,未解明muse细胞分化为构成疾病部位的组织的细胞的详细的机制。
对于muse细胞而言,使用此细胞的疾病的治疗可被认为是如从损伤部位发损伤信号的心肌梗塞等的急性疾病中的情况一样的发生细胞损伤和伴随其的炎症反应被损伤的细胞或其一部分尚处于当场残留的状态、即在发生“场的论理”之间,使由muse细胞的施用、游走、及分化这样的一系列的流程治疗成为可能的战略。但是,在损伤信号的释放低的“场的论理”已经消失的慢性疾病或经血管的到达困难的组织或器官、或者稀少细胞的再生中,不是仅由如上所述的muse细胞的血管内施用达成的情况多。从而,如果可在体外,从muse细胞等的多能性干细胞大量、稳定、容易并且低成本地分化诱导,得到期望的细胞,向再生医疗、药物开发研究、药物安全性试验等的各种各样的用途的进一步的应用就变得可能。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开2013-252081号公报
专利文献2:特开2004-298087号公报
专利文献3:国际公开第2011/007900号
专利文献4:国际公开第2014/027684号
专利文献5:国际公开第2014/133170号
【非专利文献】
非专利文献1:yangl,etal.,nature,vol.453,p.524-528(2008)
非专利文献2:wakao,s,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,vol.108,p.9875-9880(2011)
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
以往已知的将多能性干细胞分化为各种细胞的方法有经多阶段分化诱导的必要,短期间内调制均一并且大量的期望的细胞是困难的。另外,在从导入外来的基因的ips细胞分化的细胞中肿瘤化的可能性也无法否定。从而,本发明旨在提供容易并且有效调制均一且高功能的各种分化细胞的方法。
【用于解决课题的手段】
本发明人发现,在体外,muse细胞有吞食性,及通过吞食损伤细胞或死细胞(含它们的一部分)而分化为这些细胞,从而完成本发明。
即,本发明如下所述。
[1]在体外将多能性干细胞分化诱导为与信息呈递细胞有相同的表现型及功能的细胞的方法,其包括将多能性干细胞或该多能性干细胞被浓缩的细胞级分与来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养。
[2]上述[1]所述的方法,其特征在于,多能性干细胞吞食来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分。
[3]上述[1]或[2]所述的方法,其中上述多能性干细胞是从生物体的间充质组织或培养的间充质细胞分离的ssea-3阳性细胞。
[4]上述[1]~[3]之任一项所述的方法,其中上述多能性干细胞是cd105阳性。
[5]上述[1]~[4]之任一项所述的方法,其中上述多能性干细胞是cd117阴性及cd146阴性。
[6]上述[1]~[5]之任一项所述的方法,其中上述多能性干细胞是cd117阴性、cd146阴性、ng2阴性、cd34阴性、vwf阴性、及cd271阴性。
[7]上述[1]~[6]之任一项所述的方法,其中上述多能性干细胞是cd34阴性、cd117阴性、cd146阴性、cd271阴性、ng2阴性、vwf阴性、sox10阴性、snai1阴性、slug阴性、tyrp1阴性、及dct阴性。
[8]上述[1]~[7]之任一项所述的方法,其中上述多能性干细胞是有以下的性质的全部的多能性干细胞:
(i)端粒末端转移酶活性低或无;
(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力;
(iii)不显示肿瘤性增殖;及
(iv)具有自我更新能力。
[9]上述[1]~[8]之任一项所述的方法,其中多能性干细胞的数和来源于信息呈递细胞的损伤细胞或死细胞的数的比是1:10,000~10,000:1。
[10]上述[1]~[9]之任一项所述的方法,其中来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分是由选自凋亡诱导剂、代谢拮抗药、烷基化剂、蒽环类药物、抗生物质、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、抗癌剂、热、低温、酸、碱、超声波、及涡旋等的药剂的添加得到。
[11]上述[1]~[10]之任一项所述的方法,其中信息呈递细胞是来源于外胚层的细胞。
[12]上述[11]所述的方法,其中来源于外胚层的细胞选自神经细胞、神经胶质细胞、色素细胞、皮肤细胞、内耳细胞、网膜细胞、角膜细胞、及毛根细胞。
[13]上述[1]~[10]之任一项所述的方法,其中信息呈递细胞是来源于中胚层的细胞。
[14]上述[13]所述的方法,其中来源于中胚层的细胞选自心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、软骨细胞、生殖系细胞、及造血系细胞。
[15]上述[1]~[10]之任一项所述的方法,其中信息呈递细胞是来源于内胚层的细胞。
[16]上述[15]所述的方法,其中来源于内胚层的细胞选自胰腺β细胞、肝细胞、胆管细胞、呼吸系统上皮细胞、消化管上皮细胞、血管内皮细胞、肾构成细胞、膀胱上皮细胞、及胰腺外分泌细胞。
[17]上述[1]~[10]之任一项所述的方法,其中信息呈递细胞是稀少细胞。
[18]上述[17]所述的方法,其中上述稀少细胞选自运动神经元、多巴胺神经、中间神经元、谷氨酰胺操作性神经元、脑垂体细胞、甲状腺细胞、肾上腺皮质、肾上腺髓质、颈动脉的压力传感器细胞、心脏刺激传递系统、脉络丛上皮细胞、胰腺-α细胞、胰腺-δ细胞、及肺克拉拉细胞。
[19]用于在体外确认细胞制剂中所含有的细胞是生存的多能性干细胞的方法,其包括:
(a)将细胞制剂中的细胞和损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养;及
(b)在该细胞制剂中的细胞分化为与来源于损伤细胞、死细胞和/或其一部分的外胚层系细胞、中胚层系细胞和/或内胚层系细胞有相同的表现型及功能的细胞时,判断为多能性干细胞在该细胞制剂中生存。
[20]在体外从多能性干细胞制造与信息呈递细胞有相同的表现型及功能的细胞的方法,其包括将多能性干细胞或该多能性干细胞被浓缩的细胞级分与来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养。
【发明的效果】
根据本发明,通过将多能性干细胞与来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养,能从多能性干细胞容易地分化而得到损伤细胞或死细胞所起源的信息呈递细胞。由此得到的分化细胞向再生医疗、药物开发研究、药物安全性试验等的各种各样的用途的应用是可能的。
【附图的简单的说明】
【图1】显示对于使用正常小鼠心肌细胞的分化诱导而进行验证的结果。图1a及b各自是检测从正常小鼠心肌细胞得到muse细胞的培养上清或将外泌体添加到培养系统中时的各种标志物的mrna表达的结果。图1c是探讨使muse细胞直接接触正常小鼠心肌细胞时的mrna表达的结果。图1d是由直接接触的培养3天后及7天后,将gata-4的表达的有无由免疫染色进行探讨,在荧光显微镜下观察的结果。
【图2】显示对于使用损伤小鼠心肌细胞的分化诱导而进行验证的结果。是检测从损伤小鼠心肌细胞得到muse细胞的培养上清或将外泌体添加到培养系统中时的各种标志物的mrna表达的结果(各自,图2a及2b)。
【图3】显示验证muse细胞的吞食性的结果。为了验证吞食能力而使用pkh26pcl(红色)。
【图4】显示对于损伤心肌细胞的muse细胞的吞食性。与引起凋亡的gfp小鼠心肌细胞共培养的muse细胞向muse细胞内(红色)摄入坏的心肌细胞的一部分(绿色)。
【图5】显示向心肌细胞的分化诱导。与图3同样地,显示对于各种心肌标志物的表达而在荧光显微镜下观察与引起凋亡的gfp小鼠心肌细胞共培养的muse细胞分化诱导为心肌细胞的样式的结果。
【图6】显示通过由膜联蛋白v的吞食抑制的分化诱导抑制的结果。
【图7】是显示向骨骼肌细胞的分化诱导的结果。图7a是显示muse细胞(绿色)表达作为骨骼肌细胞的标志物的生肌素(红色)的利用荧光显微镜的图像。图7b显示以myod作为指标,muse细胞分化为骨骼肌细胞。
【图8】是显示向神经前体细胞的分化诱导的结果。显示以neuro2a作为指标,muse细胞分化为神经细胞。
【图9】是显示向β细胞的分化诱导的结果。显示以前体细胞标志物(nkx2.2和neurod1)及成熟β细胞标志物(islet1)作为指标,muse细胞分化为β细胞。
【图10】是显示向肝细胞的分化诱导的结果。显示以afp作为指标,muse细胞分化为肝细胞。
【具体实施方式】
本发明涉及在体外分化诱导多能性干细胞的方法,其为通过将多能性干细胞与损伤细胞或死细胞共培养,得到与成为损伤细胞或死细胞的起源的细胞有相同的表现型及功能的细胞的方法。接下来对本发明进行说明。
本发明涉及在体外将多能性干细胞分化诱导为信息呈递细胞的方法,其包括将多能性干细胞或该多能性干细胞被浓缩的细胞级分与来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养。根据本发明,多能性干细胞通过吞食共培养中的损伤细胞、死细胞和/或其一部分,可分化为与损伤细胞等所来源的本原的信息呈递细胞有相同的表现型及功能的细胞。对于多能性干细胞、特别是muse细胞的吞食性而至今已知muse细胞吞食铁素体(磁性体)(特开2016-028614),但未知muse细胞作为信息识别细胞,通过吞食作为信息呈递细胞的损伤细胞等而分化。如上所述,本发明基于首次发现muse细胞通过吞食损伤细胞等而可分化为成为损伤细胞等的起源的本原的信息呈递细胞。利用这样的多能性干细胞的吞食性的在体外的分化诱导化通过将多能性干细胞与损伤细胞等简单共培养而达成,得到损伤细胞等的方法及共培养的方法可基于本领域技术人员通常进行的方法而容易地进行,不限定。
在一实施方式中,本发明可为在体外分化诱导多能性干细胞的方法,其包括:
(a)培养信息呈递细胞的工序;
(b)在上述培养系统中损伤或杀灭信息呈递细胞的工序;及
(c)将多能性干细胞添加到工序(b)的培养系统中,培养的工序。
另外,在别的实施方式中,本发明也可为在体外分化诱导多能性干细胞,其包括:
(a’)培养多能性干细胞的工序;及
(b’)损伤或杀灭信息呈递细胞而得到损伤细胞、死细胞和/或其一部分的工序;及
(c’)向工序(a)的培养系统添加工序(b)中得到的损伤细胞、死细胞和/或其一部分,培养的工序。
(1)多能性干细胞
在本发明的分化诱导法中使用的多能性干细胞,典型而言是作为本发明人的一人的出泽氏在人活体内发现其存在,命名为“muse(多系分化应激耐受,multilineage-differentiatingstressenduring)细胞”的细胞。muse细胞可从骨髓液、脂肪组织(ogura,f.,etal.,stemcellsdev.,nov20,2013(epub)(publishedonjan17,2014))或真皮结缔组织等的皮肤组织得到,还散在于各器官的结缔组织。另外,此细胞是有多能性干细胞和间充质干细胞这两方的性质的细胞,例如,被鉴定为作为各自的细胞表面标志物的“ssea-3(阶段特异性胚胎抗原-3,stage-specificembryonicantigen-3)”和“cd105”的双阳性。从而,muse细胞或含muse细胞的细胞集团,例如,可以这些抗原标志物作为指标而从生物体组织分离。另外,muse细胞是应激抗性的,可从间充质组织或培养的间充质细胞由各种应激刺激浓缩。在本发明的分化诱导法中,也可使用由应激刺激浓缩muse细胞的细胞级分。muse细胞的分离法、鉴定法、及特征等的详细内容在国际公开第wo2011/007900号中公开。另外,如由wakao等(2011、上述)报告得知,从骨髓、皮肤等培养间充质细胞,以其作为muse细胞的母集团使用时,ssea-3阳性细胞的全部是cd105阳性细胞。从而,根据本发明,当从生物体的间充质组织或培养间充质干细胞分离muse细胞时,可单以ssea-3作为抗原标志物纯化muse细胞而使用。再者,在本说明书中,以可在本发明的分化诱导法中使用的ssea-3作为抗原标志物,有时将从生物体的间充质组织或培养间充质组织分离的多能性干细胞(muse细胞)或含muse细胞的细胞集团简记作“ssea-3阳性细胞”。另外,在本说明书中,“非muse细胞”是指生物体的间充质组织或培养间充质组织中所含的细胞,指“ssea-3阳性细胞”以外的细胞。
简言之,muse细胞或含muse细胞的细胞集团可单独使用对于作为细胞表面标志物的ssea-3的抗体,或使用对于ssea-3及cd105的各自的抗体两方,从生物体组织(例如,间充质组织)分离。其中,“生物体”是指哺乳动物的生物体。在本发明中,在生物体中,不含发生阶段在受精卵或囊胚期之前的胚,但含胎儿或含囊胚的囊胚期往后的发生阶段的胚。在哺乳动物中,不限定,可举出人、猴等的灵长类、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等的啮齿类、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。在本发明的分化诱导法中使用的muse细胞在从生物体的组织使用直接标志物分离的点,明确地区别为胚胎干细胞(es细胞)或ips细胞。另外,“间充质组织”是指骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、腱、齿髓、脐带、脐带血等的组织及存在于各种器官的组织。例如,muse细胞可从骨髓或皮肤、脂肪组织得到。例如,优选采集生物体的间充质组织,从此组织分离muse细胞而利用。另外,也可使用上述分离手段而从成纤维细胞或骨髓间充质干细胞等的培养的间充质细胞分离muse细胞。在本发明的分化诱导法中,使用的muse细胞对于受者而言可为本身,也可为或者异体。
如上所述,muse细胞或含muse细胞的细胞集团,例如,可以ssea-3阳性、及ssea-3和cd105的双阳性作为指标而从生物体组织分离,已知在人成人皮肤中含各种类型的干细胞及前体细胞。但是,muse细胞与这些细胞不相同。在这样的干细胞及前体细胞中,可举出皮肤来源前体细胞(skp)、神经嵴干细胞(ncsc)、成黑色素细胞(mb)、血管周围细胞(pc)、内皮前体细胞(ep)、脂肪来源干细胞(adsc)。可以这些细胞中固有的标志物的“非表达”作为指标,对muse细胞进行分离。更具体而言,muse细胞可将选自cd34(ep及adsc的标志物)、cd117(c-kit)(mb的标志物)、cd146(pc及adsc的标志物)、cd271(ngfr)(ncsc的标志物)、ng2(pc的标志物)、vwf因子(冯·威利布兰德因子)(ep的标志物)、sox10(ncsc的标志物)、snai1(skp的标志物)、slug(skp的标志物)、tyrp1(mb的标志物)、及dct(mb的标志物)的11个标志物之中至少1个、例如,2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标志物的非表达分离为指标。例如,不限定,可将cd117及cd146的非表达分离为指标,再者,可将cd117、cd146、ng2、cd34、vwf及cd271的非表达分离为指标,再者,可将上述的11个标志物的非表达分离为指标。
另外,在本发明的分化诱导法中使用的有上述特征的muse细胞也可有选自以下的至少1个性质:
(i)端粒末端转移酶活性低或无;
(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力;
(iii)不显示肿瘤性增殖;及
(iv)具有自我更新能力。
在本发明的一方面,在本发明的分化诱导法中使用的muse细胞有全部上述性质。其中,对于上述(i),“端粒末端转移酶活性低或无”是指例如,在使用trapezexl端粒酶检测试剂盒(millipore公司)检测端粒末端转移酶活性时,低或无法检测。端粒末端转移酶活性“低”是指例如,与作为体细胞的人成纤维细胞有同程度的端粒末端转移酶活性,或者与hela细胞比有1/5以下,优选1/10以下的端粒末端转移酶活性。对于上述(ii),muse细胞有在体外及体内分化为三胚层(内胚层系、中胚层系、及外胚层系)的能力,例如,通过在体外诱导培养,可分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。另外,有在体内向精巢移植时也显示分化为三胚层的能力的情况。再者,通过由静脉注射向生物体移植而向受损伤的器官(心脏、皮肤、脊髓、肝、肌肉等)游走及植活,有分化为对应于组织的细胞的能力。对于上述(iii),muse细胞有在悬浮培养中以增殖速度约1.3天增殖,在悬浮培养中从1细胞增殖,制作胚样体样细胞块,在14天左右增殖停止这样的性质,对这些胚样体样细胞块进行接附培养,则再开始细胞增殖,从细胞块增殖的细胞扩大。再向精巢移植时,有在至少半年间不癌化这样的性质。另外,对于上述(iv),muse细胞有自我更新(本身复制)能力。其中,“自我更新”是指可确认到从通过从1个muse细胞以悬浮培养进行培养而得到的胚样体样细胞块中所含的细胞向3胚层性的细胞的分化的同时,通过再以1细胞悬浮培养中具有胚样体样细胞块的细胞,使之后的世代的胚样体样细胞块形成,可确认到从其再向3胚层性的分化和以悬浮培养的胚样体样细胞块。自我更新只要重复1次或多次的循环即可。
另外,在本发明的分化诱导法中使用的含muse细胞的细胞级分也可为由包括给生物体的间充质组织或培养的间充质细胞外部应激刺激,回收应激抗性的细胞的方法得到的、有以下的性质的至少1个、优选全部的、ssea-3阳性及cd105阳性的多能性干细胞被浓缩的细胞级分。
(i)ssea-3阳性;
(ii)cd105阳性;
(iii)端粒末端转移酶活性低或无;
(iv)具有分化为三胚层的能力;
(v)不显示肿瘤性增殖;及
(vi)具有自我更新能力。
上述外部应激也可为蛋白酶处理、以低氧浓度的培养、在低磷酸条件下的培养、以低血清浓度的培养、在低营养条件下的培养、在向热休克的暴露下的培养、在低温的培养、冷冻处理、在有害物质存在下的培养、在活性氧存在下的培养、在机械刺激下的培养、在振荡处理下的培养、在压力处理下的培养或物理冲击之任一者或多个的组合。例如,由上述蛋白酶的处理时间优选为了给细胞外部应激而进行合计0.5~36小时。另外,蛋白酶浓度只要是在剥接附在培养容器的细胞之时,将细胞块分散为单细胞之时,或者从组织回收单细胞之时使用的浓度即可。蛋白酶优选为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或n末端苏氨酸蛋白酶。再者,上述蛋白酶优选为胰蛋白酶、胶原酶或分散酶。
(2)信息呈递细胞
在本发明的体外分化诱导法中使用的“信息呈递细胞”是指与处于从多能性干细胞最终分化的状态的细胞有相同的表现型及功能特性,分化诱导之前的细胞,是指成为损伤细胞或死细胞的起源的细胞。在本发明中使用的信息呈递细胞只要可从多能性干细胞得到期望的分化细胞,其起源也可为任何。例如,细胞的起源对应于其目的,可以各种各样的哺乳动物作为起源,不限定,来源于人、黑猩猩、此外的灵长类、家畜动物、例如狗、猫、畜产动物、例如牛、猪、马、绵羊、山羊、实验用动物、例如兔、大鼠、小鼠、豚鼠等。
(3)损伤细胞及死细胞
根据本发明,为了将多能性干细胞分化为期望的细胞而使用的损伤细胞或死细胞可以上述的信息呈递细胞作为起源。在本说明书中使用之时,用语“损伤细胞”是指例如,由于由人为应激或环境的应激受损伤,即使由一般适宜的培养条件培养时,增殖也困难,但其细胞所具有的代谢活性与活细胞比较降低,但与死细胞比较则有显著地活性的状态的细胞。在本说明书中使用之时,用语“死细胞”是指即使由适宜的培养条件培养时增殖也不可能,不显示代谢活性的状态的细胞。“死细胞”也可为坏死导致的死细胞或凋亡导致的细胞死亡之任一者。再者,根据本发明,多能性干细胞的吞食性不限于上述的损伤细胞或死细胞,也可表示它们的一部分(例如,细胞质、细胞膜、核、线粒体、高尔基体、小泡体、细胞质中所含的细胞骨架、酶、蛋白、rna、dna)或细胞的破碎物。
从信息呈递细胞得到损伤细胞、死细胞和/或其一部分的方法不限定,可基于通常使用的方法而进行。在制作损伤细胞时,例如,可使用现有技术领域已知的抑制细胞的增殖的药剂。作为这样的药剂,不限定,举显著地降低在s期的细胞的百分率的,典型而言,含阻断细胞分裂周期的进行的药剂、例如,诱发g1停止及m期停止的药剂等。作为可为了制作损伤细胞而使用的试剂的具体例,可举出代谢拮抗药/抗癌剂(例如,硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他汀、克拉屈滨、5-氟尿嘧啶(5fu)、氟尿苷(fudr)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)、甲氨蝶呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶、培美曲塞、卡培他滨、吉西他滨、阿糖胞苷);烷基化剂(例如,环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、噻替派/苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、白消安、二溴甘露糖醇、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、沙铂、四硝酸三铂、丙卡巴肼、六甲蜜胺、达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺);蒽环类药物(例如,柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、戊柔比星);抗生物质(例如,更生霉素、博来霉素、普卡霉素、安曲霉素、链脲霉素、短杆菌肽d、丝裂霉素类(例如,丝裂霉素c)、多卡米星类(例如,cc-1065)、加利刹霉素类);有丝分裂抑制剂(类美登素类、澳瑞他汀类、多拉司他汀类、念珠藻环肽类、长春花生物碱(例如,长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨)、紫杉烷类(例如,紫杉醇、多西他赛)、及秋水仙碱类;拓扑异构酶抑制剂(例如,伊立替康、托泊替康、安吖啶、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌);以及蛋白酶体抑制剂(例如,肽基硼酸)。再者,在这些试剂的使用中,试剂的浓度或使用方法、再者,培养条件等如通常进行,只要是本领域技术人员,就可适宜确定。例如,使用上述的试剂时,作为适宜于得到损伤细胞的浓度,能对应于使用的试剂的种类而变更,优选1~100μm。
在别的实施方式中,作为用于制作损伤细胞的手段,如以上列举的试剂的使用之外,也可为对信息呈递细胞实施uv照射和/或x线处理而进行的方法。uv照射及x线处理可适宜选择在现有技术领域中已知的条件而进行。再者,uv照射及x线处理也可与上述的试剂联用而进行。
在可为了制作死细胞而使用的试剂中,可包含可为了制作上述的损伤细胞而使用的试剂,例如,提高这些使用浓度,或者由长期使用达成其目的。另外,在实施uv照射或x线处理时,例如,也可通过加长照射等的时间而使uv或x线的强度增大。
在别的一实施方式中,作为用于制作损伤细胞或死细胞的手段,不限定,可举出施热,处于低温状态,酸或碱处理,用超声波或涡旋处理,冷冻融解,低氧处理,低营养处理,活性氧处理等的方法。关于这些手段的使用而言,只要是本领域技术人员,就可适宜选择条件而使用。
在本发明的方法中,也可含用于确认是否可制作由上述方法得到的损伤细胞及死细胞的手段。作为确认手段,不限定,可举出显微镜下的观察、测定细胞损伤的市售的试剂盒的使用、从细胞分泌的内容物的生理学或免疫学的测定等。在死细胞之中,在细胞起因于凋亡的死细胞中,可基于细胞表面的弯曲、核染色质的凝缩、染色体dna的片段化等的独特的形态异常的观察而判断。再者,在死细胞的定量测定中,可利用将死细胞用锥虫蓝染色的方法、或由四唑鎓的比色分析(mtt测定)。
(4)共培养条件
本发明涉及通过将多能性干细胞和损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养而在体外分化诱导多能性干细胞的方法。在本说明书中使用之时,“共培养”是指在相同环境下培养2种以上的细胞(或者一部分),是指向相同的培养容器或培养皿内各自放入指定数多能性干细胞和损伤细胞等而进行培养。作为共培养的实施方式,可举出(i)向培养中的多能性干细胞添加损伤细胞等而共培养的系统、(ii)从信息呈递细胞制作损伤细胞等后,添加多能性干细胞而共培养的系统、(iii)在培养容器内将多能性干细胞和损伤细胞等指定混在而共培养的系统等。
多能性干细胞的数和来源于信息呈递细胞的损伤细胞或死细胞的数的比是1:10,000~10,000:1,例如,1:10,000、1:7,000、1:5,000、1:3,000、1:2,000、1:1,000、1:700、1:500、1:300、1:200、1:100、1:70、1:50、1:30、1:20、1:10、1:7、1:5、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、5:1、7:1、10:1、20:1、30:1、50:1、70:1、100:1、200:1、300:1、500:1、700:1、1,000:1、2,000:1、3,000:1、5,000:1、7,000:1、10,000:1。用于培养细胞的培养液只要是适合于实际培养的细胞的培养基即可,一般而言,可使用dmem、rpmi-1640、ham’sf12等。另外,也可以0.1~10%的浓度添加通常使用的抗生物质、牛胎儿血清、基因导入细胞选择用抗生剂等。
培养温度等的培养条件设为根据通常的细胞培养条件,例如,可为36~38℃、优选为37℃,再者,4~6%co2、优选为5%co2气氛下。另外,共培养的时间依赖于诱导、最终得到的细胞种而大致是2~10天左右。
(5)分化诱导
在本发明中使用之时,“分化诱导”是指由某些手段,从多能性干细胞引导至构成特定的器官、器官或组织的细胞或其前体细胞,也包括分化为含内胚层细胞、中胚层细胞及外胚层细胞等的多种细胞的细胞群。根据本发明,从多能性干细胞向特定的细胞的分化诱导通过将多能性干细胞与损伤细胞等简单共培养而达成,以不以损伤细胞等以外的试剂或uv照射等作为必要作为特征。提示这样的分化诱导是起因于对于多能性干细胞的损伤细胞等的吞食性,不因从损伤或杀灭前的对应的信息呈递细胞分泌的某些液性因子或外泌体、或者与信息呈递细胞的细胞间的直接的接触(参照实施例1)。
分化诱导的细胞的确认可由现有技术领域中进行的方法进行,典型而言,可通过研究在细胞中指定的分化标志物的基因表达或蛋白质表达的有无来进行。作为这样的方法,可举出rt-pcr法、northern印迹法、流式细胞术、蛋白印迹法、elisa法等。例如,多能性干细胞是否分化为心肌细胞可使用rt-pcr法而在mrna水平确认在分化诱导的细胞中见到作为心肌细胞的分化标志物的nkx2.5(nk-2转录因子相关的,座位5)、gata-4、肌钙蛋白-t、anp(心房性钠利尿肽)的基因表达(实施例3等)。
(6)用途
可利用多能性干细胞通过吞食损伤细胞、死细胞和/或其一部分而分化为来源于这些细胞这样的性质而应用于含有多能性干细胞的细胞制剂的品质管理。本发明提供用于确认在体外细胞制剂中所含有的细胞是生存的多能性干细胞的方法,其包括:
(a)将细胞制剂中的细胞和损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养;及
(b)在该细胞制剂中的细胞分化为与来源于损伤细胞、死细胞和/或其一部分的外胚层系细胞、中胚层系细胞和/或内胚层系细胞有相同的表现型及功能的细胞时,判断为多能性干细胞在该细胞制剂中生存。
其中,确认多能性细胞(例如,muse细胞)是否分化为三胚层系细胞(外胚层系细胞、中胚层系细胞、及内胚层系细胞)的方法,如上所述,能研究各种细胞标志物的表达的有无。
根据本发明,可提供在体外从多能性干细胞制造与信息呈递细胞有相同的表现型及功能的细胞的方法,其包括将多能性干细胞或该多能性干细胞被浓缩的细胞级分与来源于信息呈递细胞的损伤细胞、死细胞和/或其一部分共培养。
由以下的实施例进一步具体地说明本发明,但本发明不受这些实施例的任何限定。
【实施例】
【实施例1:muse细胞的分化诱导机制的解析】
muse细胞因从生物在体内损伤部位发出的损伤信号(例如,s1p)而向损伤部位游走,植活后,根据“场的论理”而分化诱导,但对于muse细胞分化的机制却不详细知晓。在本实施例中,在体外验证muse细胞的分化诱导以何机制进行。解明muse细胞如何接受“场的论理”的信息,即,被认为与分化诱导相关的要因是什么样的成为向“场的论理”消失的慢性疾病或经血管的到达困难的组织或器官、或者稀少细胞的再生的应用的基础。
作为被认为muse细胞接受的“场的论理”的信息,推定从信息呈递细胞分泌的液性因子或外泌体、或者不经由这样的因子等而与信息呈递细胞的直接的接触、或者muse细胞吞食受损伤的信息呈递细胞等。从而,使用正常小鼠心肌细胞及损伤小鼠心肌细胞而在上述之中,对于由液性因子、外泌体、及直接的接触分化诱导muse细胞的可能性而进行探讨。
(1)使用正常小鼠心肌细胞的分化诱导
将由从自日本slc(株)购入的c57bl/6-tg(cag-egfp)产生的生后第1天的小鼠心脏建立的正常小鼠心肌细胞培养约10天后,回收细胞的培养上清,以其作为用于探讨由液性因子的分化诱导的可能性的材料。接下来,通过回收用无血清培养基培养3天的上述心肌细胞的培养上清,将该培养上清与exoquickexosomeprecipitationsolution(systembiosciences)混合后,进行离心分离而得到从心肌细胞分泌的外泌体(参照douglas,d.,etal.,molecularbiology,728(4),235~246(2011))。以hsp70作为指标而由蛋白印迹确认得到了外泌体。
接下来,人muse细胞由国际公开第wo2011/007900号中记载的方法得到。将muse细胞以成为1×104细胞/孔的方式接种到板(nuncmultidish6nunclonδsi,thermo,#140675)上,培养24小时。接下来,添加在上述中得到的来源于正常小鼠心肌细胞的培养上清或外泌体,持续培养。添加后培养3天后,1周后,2周后,及3周后,回收培养的muse细胞,研究muse细胞是否分化为与信息呈递细胞相同的心肌细胞。具体而言,从回收的muse细胞提取总rna,对于作为心肌分化标志物的nkx2.5(nk-2转录因子相关的,座位5)、gata-4、肌钙蛋白-t、及anp(心房性钠利尿肽)而由rt-pcr确认这些人特异性的mrna表达的有无。以nkx2.5及gata-4作为在心肌前体细胞中表达的初期的分化标志物,以anp作为未分化型心肌细胞标志物,以肌钙蛋白-t作为成熟心肌分化标志物选择。作为rt-pcr的阳性对象使用人胎儿心脏、及作为阴性对象以小鼠心肌细胞作为试样使用。如图1所示,muse细胞在使用从正常小鼠心肌细胞得到的液性因子(培养上清)(图1a)及外泌体(图1b)之任一者时也不表达心肌细胞标志物,不分化诱导为心肌细胞。
再者,在rt-pcr中作为检测对象在各种标志物中使用的引物基于nkx2.5(nm004387;seqidno:1)、gata-4(nm002052;seqidno:4)、肌钙蛋白-t(nm000364;seqidno:7)、及anp(nm006172;seqidno:10)的核苷酸序列而设计及合成。具体而言,如下所示。
(1)nkx2.5
正向引物:5’-caggaccagactctggagctg-3’(seqidno:2)(对应于seqidno:1的821-841nt)
反向引物:5’-cgccgaagttcacgaagttgt-3’(seqidno:3)(对应于seqidno:1的1118-1098nt)
(2)gata-4
正向引物:5’-agcagctccgtgtcccagacgtt-3’(seqidno:5)(对应于seqidno:4的1683-1705nt)
反向引物:5’-ccaactcacaggagagatgcagtgtg-3’(seqidno:6)(对应于seqidno:4的2139-2114nt)
(3)肌钙蛋白-t
正向引物:5’-ctcaaagacaggatcgagag-3’(seqidno:8)(对应于seqidno:7的489-508nt)
反向引物:5’-gatcttcattcaggtggtca-3’(seqidno:9)(对应于seqidno:7的795-771nt)
(4)anp
正向引物:5’-tccagctcctaggtcagacc-3’(seqidno:11)(对应于seqidno:10的149-168nt)
反向引物:5’-tctgggctccaatcctgtcc-3’(seqidno:12)(对应于seqidno:10的523-504nt)
接下来,探讨muse细胞是否可通过与正常小鼠心肌细胞直接接触而被分化诱导。首先,对于正常小鼠心肌细胞而言,以表达绿色荧光蛋白质(gfp)的方式进行基因导入。接下来,将gfp标记的心肌细胞以3×104细胞/孔接种到板(nuncmultidish6nunclonδsi,thermo,#140675)而进行培养。其后,以1×104细胞/孔添加预先将核用dapi标记的人muse细胞,持续培养。从培养开始起3天后,1周后,2周后,及3周后,与上述同样地,将心肌分化标志物的人特异性的mrna表达的有无由rt-pcr进行探讨(图1c)。与上述的培养上清及外泌体的结果同样地,观察不到心肌细胞标志物的表达。另外,培养3天后及7天后,将gata-4的表达的有无由免疫染色进行探讨,在荧光显微镜下观察的结果示于图1d。在核被蓝色标记的muse细胞中,确认不到gata-4的表达。从上述的结果得知,muse细胞不由与正常小鼠心肌细胞的细胞接触而分化诱导。
(2)使用损伤小鼠心肌细胞的分化诱导
探讨在使用损伤小鼠心肌细胞时,muse细胞是否可分化。损伤小鼠心肌细胞的制作使用诱导凋亡的依托泊苷进行。简言之,以3×104细胞/孔接种gfp标记的小鼠心肌细胞,在培养2天后添加50μm的依托泊苷(sigma,#e1383)。培养1天后,回收凋亡诱导小鼠心肌细胞的培养上清,培养以1×104细胞/孔接种的人muse细胞。与正常小鼠心肌细胞的情况同样地,在从培养开始起3天后,1周后,2周后,及3周后将心肌分化标志物的人特异性的mrna表达的有无由rt-pcr进行探讨(图2a)。但是,由于任何的标志物都无法确认到,确证仅用损伤细胞的培养上清中所含的因子,则不发生muse细胞向心肌细胞的分化。
再者,使用从损伤小鼠心肌细胞分泌的外泌体而进行探讨。接种与上述同浓度的muse细胞,添加外泌体。从添加起3天后,1周后,2周后,及3周后,与上述同样地,将心肌分化标志物的人特异性的mrna表达的有无由rt-pcr进行探讨(图2b)。与使用培养上清的结果同样地,muse细胞不由外泌体的添加而分化诱导为心肌细胞。
【实施例2:muse细胞的吞食性的验证】
已报告muse细胞吞食铁素体,对于是否还可吞食损伤细胞、死细胞、或者其一部分则未被探讨。从而,使用pkh26pcl珠而再验证对于muse细胞的吞食性。
pkh26pcl(乙醇中,1×10-3m贮存;sigma,#pkh26pcl)是可对巨噬细胞、嗜中性粒细胞、微神经胶质等的有吞食能力的细胞选择性地进行标记的染料,在现有技术领域中广泛使用。首先,培养被grp(绿色)及dapi(蓝色)双染色的muse细胞,添加pkh26pcl(红色)。其后,进行24小时培养。如图3所示,可确认到pkh26被摄入到muse细胞的细胞质,再确认到muse细胞有吞食性。约74.1±4.6%的muse细胞摄入pkh26pcl,确认muse细胞有吞食能力。
【实施例3:由muse细胞和损伤细胞的共培养的分化诱导】
验证muse细胞通过吞食损伤细胞而直接接受“场的论理”的信息而分化的可能性。
(1)向中胚层细胞(心肌细胞)的分化诱导
使用作为拓扑异构酶抑制剂的依托泊苷而调制损伤心肌细胞。作为成为宿主的心肌细胞,使用在实施例1中调制的gfp标记的来源于小鼠的心肌细胞。将gpr小鼠心肌细胞以3×104细胞/孔的细胞密度接种到板上,在培养1天的培养系统中,将50μm的依托泊苷添加到各孔中。其后,再培养1天。接下来,以1×104细胞/孔添加标记的人muse细胞,进行共培养。开始共培养后3天后,在荧光显微镜下验证由muse细胞的损伤心肌细胞的吞食能力。如图4所示,由于与引起凋亡的gfp小鼠心肌细胞共培养的muse细胞向muse细胞内(红色)摄入坏的心肌细胞的一部分(绿色),确认到muse细胞的吞食能力。
接下来,在同培养系统中开始共培养后3天后,1周后,2周后,及3周后各自固定细胞,探讨muse细胞是否分化诱导为心肌细胞。通过对于作为心肌细胞的分化标志物的gata-4(心肌前体细胞标志物)、anp(未分化型心肌细胞标志物)、及肌钙蛋白-i(心肌细胞的成熟分化标志物)进行免疫染色而确认分化诱导。结果示于图5。与引起凋亡的心肌细胞共培养的muse细胞在第3天和第7天表达gata-4(各自图5a和5b)。再者,muse细胞在第2周表达anp,在第3周表达肌钙蛋白-i(各自图5c和5d)。这样,由于什么分化标志物都表达,确认到muse细胞通过与损伤心肌细胞的共培养而分化为作为中胚层系细胞的心肌细胞。
再者,为了验证如上所示的向心肌细胞的分化诱导因由muse细胞的损伤心肌细胞的吞食,探讨通过向培养系统添加膜联蛋白v,抑制细胞的吞食能力而是否抑制分化诱导。在与上述的共培养相同的培养系统中,添加依托泊苷(50μm)后1天后,添加1μg/ml的膜联蛋白v,培养8小时。其后,向此系统添加muse细胞(1×104细胞/孔),继续培养。在添加膜联蛋白v后3天后,1周后,2周后,及3周后从muse细胞提取总rna,将各标志物的基因表达的有无由rt-pcr进行确认(图6)。
nkx2.5及gata4是在分化过程的初期,在更幼稚的心肌细胞中表达的分化标志物,在3天后和1周后不添加膜联蛋白v的试样中,muse细胞分化为心肌,但在添加膜联蛋白v的试样中,观察不到这些分化标志物的表达。在更后期见到表达的anp和肌钙蛋白t(tnt)也同样地,由膜联蛋白v而在muse细胞中观察不到分化标志物的表达。这样,当抑制muse细胞的吞食时,向心肌细胞的分化被抑制,从而表明muse细胞通过吞食死细胞或要死的细胞(损伤细胞)而取得“场的论理”的信息,由此分化诱导。
(2)向中胚层系细胞(骨骼肌细胞)的分化
使用小鼠c2c12(来源于横纹肌肉瘤的细胞株)(atcc,#crl-1772)而探讨muse细胞向中胚层系细胞的分化诱导。将依托泊苷处理的c2c12细胞和gfp标记的muse细胞共培养,尝试分化诱导。具体而言,用5×104细胞/孔的细胞浓度接种c2c12细胞,用依托泊苷处理后,接种同细胞浓度的muse细胞,进行共培养。开始共培养后14天后,将生肌素(骨骼肌细胞的分化标志物)的表达的有无由免疫染色进行探讨。在荧光显微镜下观察的结果及myod表达的rp-pcr的结果各自示于图7a及b。可确认muse细胞(绿色)表达生肌素(红色),多核,再者myod的mrna表达(从共培养开始起1周后),从而表明通过与诱导损伤的c2c12的共培养而分化为作为中胚层系细胞的骨骼肌细胞。
再者,在rt-pcr中作为检测对象在各种标志物中使用的引物基于myod(nm002478;seqidno:13)的核苷酸序列而设计及合成。具体而言,如下所示。
正向引物:5’-gagcaatccaaaccagcggttg-3’(seqidno:14)(对应于seqidno:13的631-652nt)
反向引物:5’-tagtaggcgccttcgtagcag-3’(seqidno:15)(对应于seqidno:13的912-892nt)
(3)向外胚层系细胞(神经细胞)的分化
使用诱导损伤的神经细胞(neuro2a,atcc,#ccl-131)而对于muse细胞向外胚层系细胞的分化诱导而进行探讨。与上述同样地用依托泊苷处理制作诱导损伤的神经,与muse细胞共培养。从共培养的开始起3天后和1周后,从muse细胞提取总rna,对于分化诱导而进行验证。更具体而言,将被知为神经细胞标志物的neun的mrna表达由rt-pcr进行研究。在小鼠胚(培养15天)及人msc-muse细胞(l26)中无neun的表达。一方面,在与诱导损伤的neuro2a的共培养的系统中,在共培养开始后1周在muse细胞中确认到neun的表达。由此表明,muse细胞通过与损伤神经细胞的共培养而分化为作为外胚层系细胞的神经细胞。
(4)向内胚层系细胞(β细胞)的分化
使用诱导损伤的小鼠β细胞(nit-1)(atcc,#crl-2055)而探讨muse细胞向内胚层系细胞的分化诱导。与上述同样地用依托泊苷处理制作诱导损伤的β细胞,与muse细胞共培养。从共培养的开始起3天后和1~3周后,从muse细胞提取总rna,对于分化诱导而进行验证。更具体而言,将被知为β细胞的前体细胞标志物的nkx2.2和neurod1、以及被知为成熟β细胞标志物的islet1的mrna表达由rt-pcr进行研究。如图9所示,从各种标志物的经时的表达的变化确认到muse细胞随着共培养的时间经过而从前体细胞向成熟β细胞分化。表明muse细胞通过与损伤β细胞的共培养而分化为作为内胚层系细胞的β细胞。
再者,在rt-pcr中作为检测对象在各种标志物中使用的引物基于nkx2.2(nm002509;seqidno:16)、neurod1(nm002500;seqidno:19)、islet1(nm002202;seqidno:22)的核苷酸序列而设计及合成。具体而言,如下所示。
(1)nkx2.2
正向引物:5’-gacataaattttggggtct-3’(seqidno:17)(对应于seqidno:16的25-43nt)
反向引物:5’-ggttctggaaccagatctt-3’(seqidno:18)(对应于seqidno:16的584-566nt)
(2)neurod1
正向引物:5’-gcacaatttgagcaattcat-3’(seqidno:20)(对应于seqidno:19的1998-2017nt)
反向引物:5’-caagcttgtgcaagtaatgtg-3’(seqidno:21)(对应于seqidno:19的2144-2124nt)
(3)islet1
正向引物:5’-ggctgttcaccaactgta-3’(seqidno:23)(对应于seqidno:22的490-507nt)
反向引物:5’-actcgatgtgatacaccttg-3’(seqidno:24)(对应于seqidno:22的858-839nt)
(5)向内胚层系细胞(肝细胞)的分化
使用诱导损伤的肝细胞(小鼠肝癌细胞株:hepa1-6)(atcc,#crl-1830)而探讨muse细胞向内胚层系细胞的分化诱导。与上述同样地用依托泊苷处理制作诱导损伤的肝细胞,与muse细胞共培养。从共培养的开始起3天后和1~2周后,从muse细胞提取总rna,对于分化诱导而进行验证。更具体而言,将在肝细胞的发生初期见到的α-胎蛋白(afp)的mrna表达由rp-pcr进行研究。如图10所示,在共培养开始后1周观察到afp的表达,表明muse细胞通过与损伤肝细胞的共培养而分化为作为内胚层系细胞的肝细胞。
再者,在rt-pcr中作为检测对象在各种标志物中使用的引物基于afp(nm001134;seqidno:25)的核苷酸序列而设计及合成。具体而言,如下所示。
正向引物:5’-ccgaactttccaagccataactg-3’(seqidno:26)(对应于seqidno:25的740-762nt)
反向引物:5’-cacttctccaataactcctggtatc-3’(seqidno:27)(对应于seqidno:25的1195-1171nt)
【产业上的利用可能性】
本发明的体外分化诱导多能性干细胞的方法可从多能性干细胞、特别是muse细胞,使用共同的系统,分化诱导为内胚层细胞、中胚层细胞、及外胚层细胞。再者,可向“场的论理”已经消失的慢性疾病或经血管的到达困难的组织或器官、或者稀少细胞的再生应用。本发明的分化诱导法可从muse细胞等的多能性干细胞大量、稳定、容易并且低成本地诱导分化细胞,这样诱导的细胞与导入外来基因而分化诱导的细胞不同,无肿瘤化的可能性而可更安全地利用。
在本说明书中引用的全部刊物及专利文献通过参照整体在本说明书中援用。再者,以例示作为目的,在本说明书中说明本发明的特定的实施方式,本领域技术人员容易地理解有不从本发明的精神及范围脱离而进行各种改变的情况。
序列表
<110>lifescienceinstitute,inc.
<120>在体外分化诱导多能性干细胞的方法
<130>p170368wo
<150>jp2016-153259
<151>2016-08-03
<160>27
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1669
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>1
gctcctgtcatcgaggcccctggcccaatggcaggctgagtccccctcctctggcctggt60
cccgcctctcctgccccttgtgctcagcgctacctgctgcccggacacatccagagctgg120
ccgacgggtgcgcgggcgggcggcggcaccatgcagggaagctgccaggggccgtgggca180
gcgccgctttctgccgcccacctggcgctgtgagactggcgctgccaccatgttccccag240
ccctgctctcacgcccacgcccttctcagtcaaagacatcctaaacctggaacagcagca300
gcgcagcctggctgccgccggagagctctctgcccgcctggaggcgaccctggcgccctc360
ctcctgcatgctggccgccttcaagccagaggcctacgctgggcccgaggcggctgcgcc420
gggcctcccagagctgcgcgcagagctgggccgcgcgccttcaccggccaagtgtgcgtc480
tgcctttcccgccgcccccgccttctatccacgtgcctacagcgaccccgacccagccaa540
ggaccctagagccgaaaagaaagagctgtgcgcgctgcagaaggcggtggagctggagaa600
gacagaggcggacaacgcggagcggccccgggcgcgacggcggaggaagccgcgcgtgct660
cttctcgcaggcgcaggtctatgagctggagcggcgcttcaagcagcagcggtacctgtc720
ggcccccgaacgcgaccagctggccagcgtgctgaaactcacgtccacgcaggtcaagat780
ctggttccagaaccggcgctacaagtgcaagcggcagcggcaggaccagactctggagct840
ggtggggctgcccccgccgccgccgccgcctgcccgcaggatcgcggtgccagtgctggt900
gcgcgatggcaagccatgcctaggggactcggcgccctacgcgcctgcctacggcgtggg960
cctcaatccctacggttataacgcctaccccgcctatccgggttacggcggcgcggcctg1020
cagccctggctacagctgcactgccgcttaccccgccgggccttccccagcgcagccggc1080
cactgccgccgccaacaacaacttcgtgaacttcggcgtcggggacttgaatgcggttca1140
gagccccgggattccgcagagcaactcgggagtgtccacgctgcatggtatccgagcctg1200
gtagggaagggacccgcgtggcgcgaccctgaccgatcccacctcaacagctccctgact1260
ctcggggggagaaggggctcccaacatgaccctgagtcccctggattttgcattcactcc1320
tgcggagacctaggaactttttctgtcccacgcgcgtttgttcttgcgcacgggagagtt1380
tgtggcggcgattatgcagcgtgcaatgagtgatcctgcagcctggtgtcttagctgtcc1440
ccccaggagtgccctccgagagtccatgggcacccccggttggaactgggactgagctcg1500
ggcacgcagggcctgagatctggccgcccattccgcgagccagggccgggcgcccgggcc1560
tttgctatctcgccgtcgcccgcccacgcacccacccgtatttatgtttttacctattgc1620
tgtaagaaatgacgatccccttcccattaaagagagtgcgttgaccccg1669
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nkx2.5的正向引物
<400>2
caggaccagactctggagctg21
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>用于扩增nkx2.5的反向引物
<400>3
cgccgaagttcacgaagttgt21
<210>4
<211>3419
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>4
ttggaggcggccggcgcaggggccgcgagaggcttcgtcgccgctgcagctccgggggct60
cccaggggagcgtgcgcggaacctccaggcccagcaggaccccggctgcggcgaggagga120
aggagccagcctagcagcttctgcgcctgtggccgcgggtgtcctggaggcctctcggtg180
tgacgagtgggggacccgaaggctcgtgcgccacctccaggcctggacgctgccctccgt240
cttctgcccccaataggtgcgccggaccttcaggccctggggtgaattcagctgctccta300
catcagcttccggaaccaccaaaaattcaaattgggattttccggagtaaacaagagcct360
agagccctttgctcaatgctggatttaatacgtatatatttttaagcgagttggtttttt420
cccctttgatttttgatcttcgcgacagttcctcccacgcatattatcgttgttgccgtc480
gttttctctccccgcgtggctccttgacctgcgagggagagagaggacaccgaagccggg540
agctcgcagggaccatgtatcagagcttggccatggccgccaaccacgggccgccccccg600
gtgcctacgaggcgggcggccccggcgccttcatgcacggcgcgggcgccgcgtcctcgc660
cagtctacgtgcccacaccgcgggtgccctcctccgtgctgggcctgtcctacctccagg720
gcggaggcgcgggctctgcgtccggaggcgcctcgggcggcagctccggtggggccgcgt780
ctggtgcggggcccgggacccagcagggcagcccgggatggagccaggcgggagccgacg840
gagccgcttacaccccgccgccggtgtcgccgcgcttctccttcccggggaccaccgggt900
ccctggcggccgccgccgccgctgccgcggcccgggaagctgcggcctacagcagtggcg960
gcggagcggcgggtgcgggcctggcgggccgcgagcagtacgggcgcgccggcttcgcgg1020
gctcctactccagcccctacccggcttacatggccgacgtgggcgcgtcctgggccgcag1080
ccgccgccgcctccgccggccccttcgacagcccggtcctgcacagcctgcccggccggg1140
ccaacccggccgcccgacaccccaatctcgatatgtttgacgacttctcagaaggcagag1200
agtgtgtcaactgtggggctatgtccaccccgctctggaggcgagatgggacgggtcact1260
atctgtgcaacgcctgcggcctctaccacaagatgaacggcatcaaccggccgctcatca1320
agcctcagcgccggctgtccgcctcccgccgagtgggcctctcctgtgccaactgccaga1380
ccaccaccaccacgctgtggcgccgcaatgcggagggcgagcctgtgtgcaatgcctgcg1440
gcctctacatgaagctccacggggtccccaggcctcttgcaatgcggaaagaggggatcc1500
aaaccagaaaacggaagcccaagaacctgaataaatctaagacaccagcagctccttcag1560
gcagtgagagccttcctcccgccagcggtgcttccagcaactccagcaacgccaccacca1620
gcagcagcgaggagatgcgtcccatcaagacggagcctggcctgtcatctcactacgggc1680
acagcagctccgtgtcccagacgttctcagtcagtgcgatgtctggccatgggccctcca1740
tccaccctgtcctctcggccctgaagctctccccacaaggctatgcgtctcccgtcagcc1800
agtctccacagaccagctccaagcaggactcttggaacagcctggtcttggccgacagtc1860
acggggacataatcactgcgtaatcttccctcttccctcctcaaattcctgcacggacct1920
gggacttggaggatagcaaagaaggaggccctgggctcccaggggccggcctcctctgcc1980
tggtaatgactccagaacaacaactgggaagaaacttgaagtcgacaatctggttagggg2040
aagcgggtgttggattttctcagatgcctttacacgctgatgggactggagggagcccac2100
ccttcagcacgagcacactgcatctctcctgtgagttggagacttctttcccaagatgtc2160
cttgtcccctgcgttccccactgtggcctagaccgtgggttttgcattgtgtttctagca2220
ccgaggatctgagaacaagcggagggccgggccctgggacccctgctccagcccgaatga2280
cggcatctgtttgccatgtacctggatgcgacgggcccctggggacaggcccttgcccca2340
tccatccgcttgaggcatggcaccgccctgcatccctaataccaaatctgactccaaaat2400
tgtggggtgtgacatacaagtgactgaacacttcctggggagctacaggggcacttaacc2460
caccacagcacagcctcatcaaaatgcagctggcaacttctcccccaggtgccttccccc2520
tgctgccggcctttgctccttcacttccaacatctctcaaaataaaaatccctcttcccg2580
ctctgagcgattcagctctgcccgcagcttgtacatgtctctcccctggcaaaacaagag2640
ctgggtagtttagccaaacggcaccccctcgagttcactgcagacccttcgttcaccgtg2700
tcacacatagaggggttctgagtaagaacaaaacgttctgctgctcaagccagtctggca2760
agcactcagcccagcctcgaggtccttctggggagagtgtaagtggacagagtcctggtc2820
agggggcaggagtgtcccaagggctggcccacctgctgtctgtctgctcctcctagccct2880
tggtcagatggcagccagagtccctcaggacctgcagcctcgccccggcagaagtctttt2940
gtccaggaggcaaaaagccagagattctgcaacacgaattcgaagcaaacaaacacaaca3000
caacagaattcctggaaagaagacgactgctaagacacggcaggggggcctggagggagc3060
ctccgactctgagctgctccgggatctgccgcgttctcctctgcacattgctgtttctgc3120
ccctgatgctggagctcaaggagactccttcctctttctcagcagagctgtagctgactg3180
tggcattactacgcctccccacacgcccagacccctcactccaaaatcctactggctgta3240
gcagagaatacctttgaaccaagattctgttttaatcatcatttacattgttttcttcca3300
aaggccccctcgtataccctccctaacccacaaacctgttaacattgtcttaaggtgaaa3360
tggctggaaaatcagtatttaactaataaatttatctgtattcctcttaaaaaaaaaaa3419
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增gata4基因的正向引物
<400>5
agcagctccgtgtcccagacgtt23
<210>6
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增gata4基因的反向引物
<400>6
ccaactcacaggagagatgcagtgtg26
<210>7
<211>1195
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>7
ctccatcctctgcctcacccagtccccgctgagactgagcagacgcctccaggatctgtc60
ggcagctgctgttctgagggagagcagagaccatgtctgacatagaagaggtggtggaag120
agtacgaggaggaggagcaggaagaagcagctgttgaagaagaggaggactggagagagg180
acgaagacgagcaggaggaggcagcggaagaggatgctgaagcagaggctgagaccgagg240
agaccagggcagaagaagatgaagaagaagaggaagcaaaggaggctgaagatggcccaa300
tggaggagtccaaaccaaagcccaggtcgttcatgcccaacttggtgcctcccaagatcc360
ccgatggagagagagtggactttgatgacatccaccggaagcgcatggagaaggacctga420
atgagttgcaggcgctgatcgaggctcactttgagaacaggaagaaagaggaggaggagc480
tcgtttctctcaaagacaggatcgagagacgtcgggcagagcgggccgagcagcagcgca540
tccggaatgagcgggagaaggagcggcagaaccgcctggctgaagagagggctcgacgag600
aggaggaggagaacaggaggaaggctgaggatgaggcccggaagaagaaggctttgtcca660
acatgatgcattttgggggttacatccagaagacagagcggaaaagtgggaagaggcaga720
ctgagcgggaaaagaagaagaagattctggctgagaggaggaaggtgctggccattgacc780
acctgaatgaagatcagctgagggagaaggccaaggagctgtggcagagcatctataact840
tggaggcagagaagttcgacctgcaggagaagttcaagcagcagaaatatgagatcaatg900
ttctccgaaacaggatcaacgataaccagaaagtctccaagacccgcgggaaggctaaag960
tcaccgggcgctggaaatagagcctggcctccttcaccaaagatctgctcctcgctcgca1020
cctgcctccggcctgcactcccccagttcccgggccctcctgggcaccccaggcagctcc1080
tgtttggaaatggggagctggcctaggtgggagccaccactcctgcctgcccccacaccc1140
actccacaccagtaataaaaagccaccacacactgactggcaaaaaaaaaaaaaa1195
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增肌钙蛋白t的正向引物
<400>8
ctcaaagacaggatcgagag20
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增肌钙蛋白t的反向引物
<400>9
gatcttcattcaggtggtca20
<210>10
<211>858
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>10
gagacagggacagacgtaggccaagagaggggaaccagagaggaaccagaggggagagac60
agagcagcaagcagtggattgctccttgacgacgccagcatgagctccttctccaccacc120
accgtgagcttcctccttttactggcattccagctcctaggtcagaccagagctaatccc180
atgtacaatgccgtgtccaacgcagacctgatggatttcaagaatttgctggaccatttg240
gaagaaaagatgcctttagaagatgaggtcgtgcccccacaagtgctcagtgagccgaat300
gaagaagcgggggctgctctcagccccctccctgaggtgcctccctggaccggggaagtc360
agcccagcccagagagatggaggtgccctcgggcggggcccctgggactcctctgatcga420
tctgccctcctaaaaagcaagctgagggcgctgctcactgcccctcggagcctgcggaga480
tccagctgcttcgggggcaggatggacaggattggagcccagagcggactgggctgtaac540
agcttccggtactgaagataacagccagggaggacaagcagggctgggcctagggacaga600
ctgcaagaggctcctgtcccctggggtctctgctgcatttgtgtcatcttgttgccatgg660
agttgtgatcatcccatctaagctgcagcttcctgtcaacacttctcacatcttatgcta720
actgtagataaagtggtttgatggtgacttcctcgcctctcccaccccatgcattaaatt780
ttaaggtagaacctcacctgttactgaaagtggtttgaaagtgaataaacttcagcacca840
tggacagaagacaaaaaa858
<210>11
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增anp的正向引物
<400>11
tccagctcctaggtcagacc20
<210>12
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增anp的反向引物
<400>12
tctgggctccaatcctgtcc20
<210>13
<211>1823
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>13
gagaagctaggggtgaggaagccctggggcgctgccgccgctttccttaaccacaaatca60
ggccggacaggagagggaggggtgggggacagtgggtgggcattcagactgccagcactt120
tgctatctacagccggggctcccgagcggcagaaagttccggccactctctgccgcttgg180
gttgggcgaagccaggaccgtgccgcgccaccgccaggatatggagctactgtcgccacc240
gctccgcgacgtagacctgacggcccccgacggctctctctgctcctttgccacaacgga300
cgacttctatgacgacccgtgtttcgactccccggacctgcgcttcttcgaagacctgga360
cccgcgcctgatgcacgtgggcgcgctcctgaaacccgaagagcactcgcacttccccgc420
ggcggtgcacccggccccgggcgcacgtgaggacgagcatgtgcgcgcgcccagcgggca480
ccaccaggcgggccgctgcctactgtgggcctgcaaggcgtgcaagcgcaagaccaccaa540
cgccgaccgccgcaaggccgccaccatgcgcgagcggcgccgcctgagcaaagtaaatga600
ggcctttgagacactcaagcgctgcacgtcgagcaatccaaaccagcggttgcccaaggt660
ggagatcctgcgcaacgccatccgctatatcgagggcctgcaggctctgctgcgcgacca720
ggacgccgcgccccctggcgccgcagccgccttctatgcgccgggcccgctgcccccggg780
ccgcggcggcgagcactacagcggcgactccgacgcgtccagcccgcgctccaactgctc840
cgacggcatgatggactacagcggccccccgagcggcgcccggcggcggaactgctacga900
aggcgcctactacaacgaggcgcccagcgaacccaggcccgggaagagtgcggcggtgtc960
gagcctagactgcctgtccagcatcgtggagcgcatctccaccgagagccctgcggcgcc1020
cgccctcctgctggcggacgtgccttctgagtcgcctccgcgcaggcaagaggctgccgc1080
ccccagcgagggagagagcagcggcgaccccacccagtcaccggacgccgccccgcagtg1140
ccctgcgggtgcgaaccccaacccgatataccaggtgctctgaggggatggtggccgccc1200
acccgcccgagggatggtgcccctagggtccctcgcgcccaaaagattgaacttaaatgc1260
ccccctcccaacagcgctttaaaagcgacctctcttgaggtaggagaggcgggagaactg1320
aagtttccgcccccgccccacagggcaaggacacagcgcggttttttccacgcagcaccc1380
ttctcggagacccattgcgatggccgctccgtgttcctcggtgggccagagctgaacctt1440
gaggggctaggttcagctttctcgcgccctcccccatgggggtgagaccctcgcagacct1500
aagccctgccccgggatgcaccggttatttgggggggcgtgagacccagtgcactccggt1560
cccaaatgtagcaggtgtaaccgtaacccacccccaacccgtttcccggttcaggaccac1620
tttttgtaatacttttgtaatctattcctgtaaataagagttgctttgccagagcaggag1680
cccctggggctgtatttatctctgaggcatggtgtgtggtgctacagggaatttgtacgt1740
ttataccgcaggcgggcgagccgcgggcgctcgctcaggtgatcaaaataaaggcgctaa1800
tttataaaaaaaaaaaaaaaaaa1823
<210>14
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增myod的正向引物
<400>14
gagcaatccaaaccagcggttg22
<210>15
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增myod的反向引物
<400>15
tagtaggcgccttcgtagcag21
<210>16
<211>2084
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>16
gaccaagtgaagctacaactttgcgacataaattttggggtctcgaaccatgtcgctgac60
caacacaaagacggggttttcggtcaaggacatcttagacctgccggacaccaacgatga120
ggagggctctgtggccgaaggtccggaggaagagaacgaggggcccgagccagccaagag180
ggccgggccgctggggcagggcgccctggacgcggtgcagagcctgcccctgaagaaccc240
cttctacgacagcagcgacaacccgtacacgcgctggctggccagcaccgagggccttca300
gtactccctgcacggtctggctgccggggcgccccctcaggactcaagctccaagtcccc360
ggagccctcggccgacgagtcaccggacaatgacaaggagaccccgggcggcggggggga420
cgccggcaagaagcgaaagcggcgagtgcttttctccaaggcgcagacctacgagctgga480
gcggcgctttcggcagcagcggtacctgtcggcgcccgagcgcgaacacctggccagcct540
catccgcctcacgcccacgcaggtcaagatctggttccagaaccaccgctacaagatgaa600
gcgcgcccgggccgagaaagggcctggatcacagttcctcaagctttgggatacaaacga660
atcacctgggatttggataaaatgcagattcgtgttcagcagccctggcattctgcattt720
ctcatgagctccagggagacgctggtgctgctggggcaggaccacactttgggtggcaag780
ggcttggcaggcaattccaggtgtcaccctagagatggcctgctattgcactgtcagtag840
gtagctgccacagtgacggccgctccagatcaaggggaggaccttttgaaaagggtcctt900
gaatcatttgggaaataaatcaagccatatgagtaaaaagtaatcaaaaaatatgttgaa960
tattggaaccagaggaaatcttagcatcattttgtaatgactccctccacgaattttcca1020
gataaggaaactgacaaagccaggtggcctgtggctgaggagcgagacggtcagcgaggt1080
ctccctgctgcactctcgtgcacttccacagtgaaaccctgctgagagacacaggaaatg1140
ttgaacatagtgtctttaaaattaagactatgactgccctaaacatttacaaagcacaaa1200
ccatgagaaaaaagcctgtaccagaaatcagaagatggcttttgtccatgtgcaaccttg1260
gacaagttaattacttatcgctgctctctgagcccgtttccccactggttaccgaaaaaa1320
tagaaaaggatatgcctgcccttcctaattcacagggcatcgcagggaggtaggtagtta1380
atatgctgaaccacttcaaaacggtggagctgaactcacagcaggaaccctgtcacacct1440
ttccatgacaaggatatcagtggggtgagggaggtggggagaggcatgaggatgggagac1500
aaaggagtggggtggggggcgggggaaggaggaagccagaaggacaggcccaggctaggc1560
tctgaagtcagcaggtgagcgaggtagagaactagcagcaccactgtccatggatatttg1620
cggtgatggaaatgtactgtatccatgttctccaatatggcagccactagccacatgtgg1680
ctatcaagcgctagaaatgtagctagtgtgatcgaggaactgatctttaatttttcttta1740
attgttattaatttccatttaaatagccacatgtggccagtggcttatgtagcaaagatc1800
tagatcatttgtttgaagcagtaaaaagagaaatgtgaatcccctcttcttacctcctat1860
aacatgctaattaacatcactgcaattaaccaccattcacagctcttcagctgctctgtg1920
gaacctcagcccactctgaaatgaacagccgcagtggcaggggttacagaatgggctggg1980
agtggcaatgtagatttatctcttcacacactctatgccctctatcaaaaatgcctcagg2040
ctgtgtaaaattccacaaataataaagagattttaaaaatgtga2084
<210>17
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nkx2.2的正向引物
<400>17
gacataaattttggggtct19
<210>18
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增nkx2.2的反向引物
<400>18
ggttctggaaccagatctt19
<210>19
<211>3002
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>19
ggggaggaggggagaacggggagcgcacagcctggacgcgtgcgcaggcgtcaggcgcat60
agacctgctagcccctcagctagcggccccgcccgcgcttagcatcactaactgggctat120
ataacctgagcgcccgcgcggccacgacacgaggaattcgcccacgcaggaggcgcggcg180
tccggaggccccagggttatgagactatcactgctcaggacctactaacaacaaaggaaa240
tcgaaacatgaccaaatcgtacagcgagagtgggctgatgggcgagcctcagccccaagg300
tcctccaagctggacagacgagtgtctcagttctcaggacgaggagcacgaggcagacaa360
gaaggaggacgacctcgaagccatgaacgcagaggaggactcactgaggaacgggggaga420
ggaggaggacgaagatgaggacctggaagaggaggaagaagaggaagaggaggatgacga480
tcaaaagcccaagagacgcggccccaaaaagaagaagatgactaaggctcgcctggagcg540
ttttaaattgagacgcatgaaggctaacgcccgggagcggaaccgcatgcacggactgaa600
cgcggcgctagacaacctgcgcaaggtggtgccttgctattctaagacgcagaagctgtc660
caaaatcgagactctgcgcttggccaagaactacatctgggctctgtcggagatcctgcg720
ctcaggcaaaagcccagacctggtctccttcgttcagacgctttgcaagggcttatccca780
acccaccaccaacctggttgcgggctgcctgcaactcaatcctcggacttttctgcctga840
gcagaaccaggacatgcccccccacctgccgacggccagcgcttccttccctgtacaccc900
ctactcctaccagtcgcctgggctgcccagtccgccttacggtaccatggacagctccca960
tgtcttccacgttaagcctccgccgcacgcctacagcgcagcgctggagcccttctttga1020
aagccctctgactgattgcaccagcccttcctttgatggacccctcagcccgccgctcag1080
catcaatggcaacttctctttcaaacacgaaccgtccgccgagtttgagaaaaattatgc1140
ctttaccatgcactatcctgcagcgacactggcaggggcccaaagccacggatcaatctt1200
ctcaggcaccgctgcccctcgctgcgagatccccatagacaatattatgtccttcgatag1260
ccattcacatcatgagcgagtcatgagtgcccagctcaatgccatatttcatgattagag1320
gcacgccagtttcaccatttccgggaaacgaacccactgtgcttacagtgactgtcgtgt1380
ttacaaaaggcagccctttgggtactactgctgcaaagtgcaaatactccaagcttcaag1440
tgatatatgtatttattgtcattactgcctttggaagaaacaggggatcaaagttcctgt1500
tcaccttatgtattattttctatagctcttctatttaaaaaataaaaaaatacagtaaag1560
tttaaaaaatacaccacgaatttggtgtggctgtattcagatcgtattaattatctgatc1620
gggataacaaaatcacaagcaataattaggatctatgcaatttttaaactagtaatgggc1680
caattaaaatatatataaatatatatttttcaaccagcattttactacttgttacctttc1740
ccatgctgaattattttgttgtgattttgtacagaatttttaatgactttttataatgtg1800
gatttcctattttaaaaccatgcagcttcatcaatttttatacatatcagaaaagtagaa1860
ttatatctaatttatacaaaataatttaactaatttaaaccagcagaaaagtgcttagaa1920
agttattgtgttgccttagcacttctttcctctccaattgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1980
aaaaaaaaaaaaaaattgcacaatttgagcaattcatttcactttaaagtctttccgtct2040
ccctaaaataaaaaccagaatcataattttcaagagaagaaaaaattaagagatacattc2100
cctatcaaaacatatcaattcaacacattacttgcacaagcttgtatatacatattataa2160
ataaatgccaacatacccttctttaaatcaaaagctgcttgactatcacatacaatttgc2220
actgttactttttagtcttttactcctttgcattccatgattttacagagaatctgaagc2280
tattgatgtttccagaaaatataaatgcatgattttatacatagtcacaaaaatggtggt2340
ttgtcatatattcatgtaataaatctgagcctaaatctaatcaggttgttaatgttggga2400
tttatatctatagtagtcaattagtacagtagcttaaataaattcaaaccatttaattca2460
taattagaacaatagctattgcatgtaaaatgcagtccagaataagtgctgtttgagatg2520
tgatgctggtaccactggaatcgatctgtactgtaattttgtttgtaatcctgtatatta2580
tggtgtaatgcacaatttagaaaacattcatccagttgcaataaaatagtattgaaagtg2640
agagcaattgttgcatttcttcttaaagggattctgtttttatttttggggaaagtagtt2700
gcttttttgctgagttaaaaaatactaaacactatatgtagaataaaagaaaagaaaaaa2760
gtttaccttggcatatgctcttgtctgtttatcttgcacagggagtcaccagttctatgt2820
agataatgaaaagacctaactgatatttcattatttggaatatgggactggacggcagta2880
caaacagtgtgtttttttctttgttttaagtggcttagcctttaggttttttatttccat2940
ttttaaaaatgattgttacatgttttcttctatttctttttttaaaaggtggattttaat3000
aa3002
<210>20
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增neurod1的正向引物
<400>20
gcacaatttgagcaattcat20
<210>21
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增neurod1的反向引物
<400>21
caagcttgtgcaagtaatgtg21
<210>22
<211>2729
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>22
gaaggaagaggaagaggaggagagggaggccagagccagaacagcccggcagcccgagct60
tcgggggagaacggcctgagccccgagcaagttgcctcgggagccctaatcctctcccgc120
tggctcgccgagcggtcagtggcgctcagcggcggcgaggctgaaatatgataatcagaa180
cagctgcgccgcgcgccctgcagccaatgggcgcggcgctcgcctgacgtccccgcgcgc240
tgcgtcagaccaatggcgatggagctgagttggagcagagaagtttgagtaagagataag300
gaagagaggtgcccgagccgcgccgagtctgccgccgccgcagcgcctccgctccgccaa360
ctccgccggcttaaattggactcctagatccgcgagggcgcggcgcagccgagcagcggc420
tctttcagcattggcaaccccaggggccaatatttcccacttagccacagctccagcatc480
ctctctgtgggctgttcaccaactgtacaaccaccatttcactgtggacattactccctc540
ttacagatatgggagacatgggagatccaccaaaaaaaaaacgtctgatttccctatgtg600
ttggttgcggcaatcagattcacgatcagtatattctgagggtttctccggatttggaat660
ggcatgcggcatgtttgaaatgtgcggagtgtaatcagtatttggacgagagctgtacat720
gctttgttagggatgggaaaacctactgtaaaagagattatatcaggttgtacgggatca780
aatgcgccaagtgcagcatcggcttcagcaagaacgacttcgtgatgcgtgcccgctcca840
aggtgtatcacatcgagtgtttccgctgtgtggcctgcagccgccagctcatccctgggg900
acgaatttgcgcttcgggaggacggtctcttctgccgagcagaccacgatgtggtggaga960
gggccagtctaggcgctggcgacccgctcagtcccctgcatccagcgcggccactgcaaa1020
tggcagcggagcccatctccgccaggcagccagccctgcggccccacgtccacaagcagc1080
cggagaagaccacccgcgtgcggactgtgctgaacgagaagcagctgcacaccttgcgga1140
cctgctacgccgcaaacccgcggccagatgcgctcatgaaggagcaactggtagagatga1200
cgggcctcagtccccgtgtgatccgggtctggtttcaaaacaagcggtgcaaggacaaga1260
agcgaagcatcatgatgaagcaactccagcagcagcagcccaatgacaaaactaatatcc1320
aggggatgacaggaactcccatggtggctgccagtccagagagacacgacggtggcttac1380
aggctaacccagtggaagtacaaagttaccagccaccttggaaagtactgagcgacttcg1440
ccttgcagagtgacatagatcagcctgcttttcagcaactggtcaatttttcagaaggag1500
gaccgggctctaattccactggcagtgaagtagcatcaatgtcctctcaacttccagata1560
cacctaacagcatggtagccagtcctattgaggcatgaggaacattcattctgtattttt1620
tttccctgttggagaaagtgggaaattataatgtcgaactctgaaacaaaagtatttaac1680
gacccagtcaatgaaaactgaatcaagaaatgaatgctccatgaaatgcacgaagtctgt1740
tttaatgacaaggtgatatggtagcaacactgtgaagacaatcatgggattttactagaa1800
ttaaacaacaaacaaaacgcaaaacccagtatatgctattcaatgatcttagaagtactg1860
aaaaaaaaagacgtttttaaaacgtagaggatttatattcaaggatctcaaagaaagcat1920
tttcatttcactgcacatctagagaaaaacaaaaatagaaaattttctagtccatcctaa1980
tctgaatggtgctgtttctatattggtcattgccttgccaaacaggagctccagcaaaag2040
cgcaggaagagagactggcctccttggctgaaagagtcctttcaggaaggtggagctgca2100
ttggtttgatatgtttaaagttgactttaacaaggggttaattgaaatcctgggtctctt2160
ggcctgtcctgtagctggtttattttttactttgccccctccccactttttttgagatcc2220
atcctttatcaagaagtctgaagcgactataaaggtttttgaattcagatttaaaaacca2280
acttataaagcattgcaacaaggttacctctattttgccacaagcgtctcgggattgtgt2340
ttgacttgtgtctgtccaagaacttttcccccaaagatgtgtatagttattggttaaaat2400
gactgttttctctctctatggaaataaaaaggaaaaaaaaaaaggaaactttttttgttt2460
gctcttgcattgcaaaaattataaagtaatttattatttattgtcggaagacttgccact2520
tttcatgtcatttgacattttttgtttgctgaagtgaaaaaaaaagataaaggttgtacg2580
gtggtctttgaattatatgtctaattctatgtgttttgtctttttcttaaatattatgtg2640
aaatcaaagcgccatatgtagaattatatcttcaggactatttcactaataaacatttgg2700
catagataaataaataaaaaaaaaaaaaa2729
<210>23
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增islet1的正向引物
<400>23
ggctgttcaccaactgta18
<210>24
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增islet1的反向引物
<400>24
actcgatgtgatacaccttg20
<210>25
<211>2057
<212>dna
<213>智人(homosapiens)
<400>25
atattgtgcttccaccactgccaataacaaaataactagcaaccatgaagtgggtggaat60
caatttttttaattttcctactaaattttactgaatccagaacactgcatagaaatgaat120
atggaatagcttccatattggattcttaccaatgtactgcagagataagtttagctgacc180
tggctaccatattttttgcccagtttgttcaagaagccacttacaaggaagtaagcaaaa240
tggtgaaagatgcattgactgcaattgagaaacccactggagatgaacagtcttcagggt300
gtttagaaaaccagctacctgcctttctggaagaactttgccatgagaaagaaattttgg360
agaagtacggacattcagactgctgcagccaaagtgaagagggaagacataactgttttc420
ttgcacacaaaaagcccactccagcatcgatcccacttttccaagttccagaacctgtca480
caagctgtgaagcatatgaagaagacagggagacattcatgaacaaattcatttatgaga540
tagcaagaaggcatcccttcctgtatgcacctacaattcttctttgggctgctcgctatg600
acaaaataattccatcttgctgcaaagctgaaaatgcagttgaatgcttccaaacaaagg660
cagcaacagttacaaaagaattaagagaaagcagcttgttaaatcaacatgcatgtgcag720
taatgaaaaattttgggacccgaactttccaagccataactgttactaaactgagtcaga780
agtttaccaaagttaattttactgaaatccagaaactagtcctggatgtggcccatgtac840
atgagcactgttgcagaggagatgtgctggattgtctgcaggatggggaaaaaatcatgt900
cctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaaataacagaatgctgcaaactga960
ccacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaaaatgatgaaaaacctgaaggtc1020
tatctccaaatctaaacaggtttttaggagatagagattttaaccaattttcttcagggg1080
aaaaaaatatcttcttggcaagttttgttcatgaatattcaagaagacatcctcagcttg1140
ctgtctcagtaattctaagagttgctaaaggataccaggagttattggagaagtgtttcc1200
agactgaaaaccctcttgaatgccaagataaaggagaagaagaattacagaaatacatcc1260
aggagagccaagcattggcaaagcgaagctgcggcctcttccagaaactaggagaatatt1320
acttacaaaatgcgtttctcgttgcttacacaaagaaagccccccagctgacctcgtcgg1380
agctgatggccatcaccagaaaaatggcagccacagcagccacttgttgccaactcagtg1440
aggacaaactattggcctgtggcgagggagcggctgacattattatcggacacttatgta1500
tcagacatgaaatgactccagtaaaccctggtgttggccagtgctgcacttcttcatatg1560
ccaacaggaggccatgcttcagcagcttggtggtggatgaaacatatgtccctcctgcat1620
tctctgatgacaagttcattttccataaggatctgtgccaagctcagggtgtagcgctgc1680
aaacgatgaagcaagagtttctcattaaccttgtgaagcaaaagccacaaataacagagg1740
aacaacttgaggctgtcattgcagatttctcaggcctgttggagaaatgctgccaaggcc1800
aggaacaggaagtctgctttgctgaagagggacaaaaactgatttcaaaaactcgtgctg1860
ctttgggagtttaaattacttcaggggaagagaagacaaaacgagtctttcattcggtgt1920
gaacttttctctttaattttaactgatttaacactttttgtgaattaatgaaatgataaa1980
gacttttatgtgagatttccttatcacagaaataaaatatctccaaatgtttccttttca2040
aaaaaaaaaaaaaaaaa2057
<210>26
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增afp的正向引物
<400>26
ccgaactttccaagccataactg23
<210>27
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增afp的反向引物
<400>27
cacttctccaataactcctggtatc25