背景免疫球蛋白通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。每个重链和轻链多肽含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，其包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链和轻链多肽包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带fcγ受体(fcγr)的细胞(例如吞噬细胞)或ii)携带新生fc受体(fcrn)(也称为brambell受体)的细胞的结合。它还介导与某些因子的结合，包括经典补体系统的因子，如组分(c1q)。人的先天免疫包括补体途径。该途径通过c1q(c1补体因子的识别亚基)与免疫靶标的结合而被激活。完整的c1q分子是包含三个单体结构单元(其表示为c1qa，c1qb和c1qc)中的每一个的六个拷贝的异聚体分子。每个单体单元包含n末端区域(3至9个残基)，胶原样结构域(跨越约81个残基)和球状结构域(球状头；跨越约135个残基)(sellar，gc，等人，biochem.j.274(1991)481-490)。c1q具有识别单元的功能，并且可以结合igg1的ch2结构域以及igm的ch3或ch4结构域(ghebrehiwet，b.等人，j.exp.med.160(1984)1375-1389)。在wo2010/048313中，报道了用于纯化含fc融合蛋白的重组fcrn及其变体。magistrelli，g.等人报道了在哺乳动物细胞中稳健的重组fcrn产生，使得能够进行定向固定用于igg结合研究(j.immunol.meth.371(2012)20-29)。在wo2013/120929中报道了新生fc受体(fcrn)和β-2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合体通常作为亲和层析配体的用途，并且例如通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率用于测定抗体的体内半寿期。使用具有固定化人igg的亲和层析法纯化人c1q(参见例如assimeh，s.n等人，j.immunol.113(1974)225-234；kolb，w.p等人，j.immunol.122(1979)2103-2111)。bally，i.，等人报道了全长人c1q的产生，其涉及hek293-f哺乳动物细胞的稳定转染和亲和标签与c链的c末端的融合(proc.natl.acad.sci.usa110(2013)8650-8655)。据报道，从生物化学和结构分析判断，所得重组(r)c1q分子与血清c1q相似，并且应显示出一束花的特征形状。通过表面等离振子共振分析其相互作用性质表明rc1q保留了血清c1q与c1s-c1r-c1r-c1s四聚体结合的能力，以识别生理c1q配体如igg。亲和标签用于纯化重组c1q。svehag，s.-e和b，d报道了通过亲和层析和用二氨基烷基化合物解吸附来分离c1q结合免疫复合体(actapath.microbiol.scand.sect.c84(1976)45-52)。gibbons，j.j.jr等人报道了固相c1q与聚集的人免疫球蛋白g的温度敏感性结合(biochim.biophys.acta670(1981)146-149)。uwatoko，s和mannik，m报道了通过c1q亲和层析和凝胶过滤从五种sle血浆中分离单体c1q结合igg(j.clin.invest.82(1982)816-824)。ghebrehiwet，b.等人报道了c1q与琼脂糖的偶联以及这种材料用于纯化c1qr的用途(j.exp.med.160(1984)1375-1389)。nethery，a.等人(j.immunol.meth.126(1990)57-60)报道了c1q-sepharose上免疫球蛋白m的一步纯化。uwatoko，s和mannik，m(j.clin.invest.82(1982)816-824)报道了通过c1q亲和层析和凝胶过滤从五种sle血浆中分离单体c1q结合igg。moreau，c.等人(front.immunol.7(2016)article79)报道了单链重组形式的人c1q球状区(c1q-scgr)的产生，其包含c1-a的n-至c-末端方向残基88-223，gly-ser-gly接头，c1qc的残基87至217，gly-ser-ala接头和c1qb的残基90至226(第2页和图1)。选择用来产生c1q-scgr的5'-3'a-c-b顺序也对应于染色体1p上的三个c1q基因的顺序。pfueller，b.等人(arth.rheum.44(2001)1962-1963)公开了使用c1q柱用从猪血浆中分离的c1q通过免疫吸附成功治疗系统性红斑狼疮患者的先导研究的结果。us2015/329606公开了一种用于重组产生c1q蛋白或c1q蛋白变体的方法，其中从表达c1qa亚基或c1qa亚基变体，c1qb亚基或c1qb亚基的变体，c1qc亚基或c1qc亚基的变体的细胞的体外培养物中回收蛋白质，其中至少一个亚基或亚基变体在n-末端或c-末端也具有至少6个残基的氨基酸序列，其中至少40％是谷氨酸和/或天冬氨酸残基。moreau，c.等人公开了补体蛋白c1q的识别结构域的单链形式的结构和功能表征(front.immunol.7(2016))。yadav，s.等人公开了马来丝虫免疫调节蛋白肌钙网蛋白和人clq之间的蛋白质-蛋白质相互作用的计算机和体外研究(plosone9(2014)e106413)。us2005/208586公开了衍生自c1q(第一补体成分分子c1的亚基)的多肽或非多肽。技术实现要素：本文报道的一个方面是包含补体c1q亚组分亚基a至c的片段的融合多肽作为亲和层析配体的用途。已经发现，利用本文报道的融合多肽，现在可以分离、分隔和表征关于其密切相关的抗体种类(即在单个或有限数量的氨基酸残基上不同，或在糖基化模式上不同)的体内特性，其影响分析物和融合多肽之间的相互作用，即fc-区与c1q的相互作用。因此，利用本文报道的方法，可以分离一种亲本抗体的不同变体并确定这些变体之间的特定比例，这利用目前已知的方法是不可能的，因为它们仅提供修饰的总和而不是个别种类(即，对于亲本和变体1和变体2以及变体1/2的混合物，质谱法提供包含变体1的分子的总数，即包含单个变异的变体(1)以及还包含第二变异的变体(1/2))。已经发现，对于给定条件，野生型igg1抗体在本文提供的实施例中概述的条件下具有约25至28分钟的保留时间。与具有亲本未修饰的fc-区的抗体相比，具有降低的c1q结合的具有经修饰的fc-区的抗体具有较短的保留时间，而具有增强的c1q结合的具有经修饰的fc-区的抗体具有更长的保留时间。本文报道的一个方面是根据式i的融合多肽tag-x1-c1qa-x2-c1qb-x3-c1qc-x4(式i)其中，x1表示第一肽接头，x2表示第二肽接头，x3表示第三肽接头，x4表示第四肽接头，x1，x2，x3，x4彼此独立地存在或不存在，tag是氨基酸序列标签，tag可以存在或不存在，c1qa是seqidno：01的片段，c1qb是seqidno：03的片段，c1qc是seqidno：05的片段，和-表示肽键。在一个实施方案中，存在x1，x2和x3，并且不存在x4。在一个实施方案中，存在x2，x3和x4，并且不存在x1。在一个实施方案中，x1具有seqidno：10的氨基酸序列，x2具有seqidno：11或12的氨基酸序列，x3具有seqidno：13或14的氨基酸序列，并且x4不存在。在一个实施方案中，x1不存在，x2具有seqidno：13或14的氨基酸序列，x3具有seqidno：11或12的氨基酸序列，并且x4具有seqidno：10的氨基酸序列。在一个实施方案中，c1qa具有seqidno：07的氨基酸序列，c1qb具有seqidno：08的氨基酸序列，并且c1qc具有seqidno：09的氨基酸序列。在一个实施方案中，tag存在并具有seqidno：15的氨基酸序列。在一个实施方案中，x3存在并具有氨基酸序列ggggs(seqidno：23)。在一个实施方案中，式i在n-或c-末端方向上从右到左表示融合多肽元件的序列(n-末端-clqc-c1qb-c1qa-c-末端)。本文报道的一个方面是多聚体非共价复合体，其包含2至6个本文报道的融合多肽。在一个实施方案中，在非共价复合体的至少一种融合多肽中存在tag，并且在非共价复合体的至少一种融合多肽中不存在tag。本文报道的一个方面是如本文报道的融合多肽或如本文报道的多聚体复合体在亲和层析中作为亲和层析配体的用途。在一个实施方案中，融合多肽或复合体固定在固相上。在一个实施方案中，融合多肽或多聚体复合体是生物素化的，并且固相用链霉抗生物素蛋白衍生化。在一个实施方案中，亲和层析用于分离包含至少fc-区的抗体或融合多肽。在一个实施方案中，亲和层析是分析亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是使用收集级分或不收集级分。在一个实施方案中，固相是层析材料。在一个实施方案中，层析材料是琼脂糖(交联琼脂糖)。在一个实施方案中，该用途是通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率来确定抗体的体内半寿期。在一个实施方案中，该用途是用于从亲本抗体或亲本融合多肽的包含至少fc-区的c1q结合部分的经修饰抗体或修饰融合多肽的文库中筛选出与亲本抗体或亲本融合多肽相比，具有改变的c1q结合亲和力的那些经修饰抗体或修饰的融合多肽。在一个实施方案中，该用途是用于鉴定抗体或融合多肽，其包含至少fc-区的c1q结合部分，该部分显示出与c1q的结合改变。在一个实施方案中，抗体是融合多肽的单特异性抗体或抗体片段，或融合多肽的双特异性抗体或抗体片段，或融合多肽的三特异性抗体或抗体片段，或融合多肽的四特异性抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该用途是在具有盐梯度的亲和层析中。在一个实施方案中，该用途是通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率来确定抗体的体内半寿期。在一个实施方案中，该用途是用于分离包含至少fc-区的抗体或融合多肽。在一个实施方案中，该用途是用于确定抗体的糖基化。在一个实施方案中，该用途是用于鉴定抗体或融合多肽，所述抗体或融合多肽包含至少fc-区的c1q结合部分，所述部分显示出与c1q的结合改变。本文报道的一个方面是用于选择具有预定体内半寿期的抗体的方法，其中进行层析并选择相对于野生型igg1在给定保留时间窗内具有保留时间的抗体。附图简述图1igg1亚类(3)的抗体和igg3亚类(2)的抗体和igg4亚类(1)的抗体的示例性层析图的叠加。虚线表示离子强度梯度的过程。图2去糖基化形式(1)，g(0)形式(2)和g(2)形式(3)的igg1亚类抗体的示例性层析图的叠加图。虚线表示离子强度梯度的过程。图3去半乳糖基化形式(1)，完全唾液酸化形式(2)和完全半乳糖基化形式(3)的igg1亚类抗体的示例性层析图的叠加图。虚线表示离子强度梯度的过程。图4野生型糖基化形式(1)，在man3-glcnac-nana/ngna上完全唾液酸化的形式(2)和在man6-glcnac-nana/ngna上完全唾液酸化的形式(3)的igg1亚类抗体的示例性层析图的叠加。虚线表示离子强度梯度的过程。图5igg1亚类(1)，briakinumab(2)和ustekinumab(3)的抗体的示例性层析图的叠加。虚线表示离子强度梯度的过程。图6固定化的c1q与fab复合抗体结合的spr传感图。图7空白柱(虚线)，即仅包含基质但不包含配体的柱和c1q柱(实线)(即包含与空白柱相同的基质但此时根据本发明的c1q融合多肽作为亲和配体与其缀合的柱)上的igg1亚类的抗体的示例性层析图的叠加。图8igg1类(a)和igg4类(b)的抗体的柱负载(μg/ml相/3mg融合多肽；x轴)和检测到的峰面积(maus；y轴)的关系。图9igg1亚类抗体的示例性层析图的叠加，使用25μg负载(1)，50μg负载(2)，75μg负载(3)，125μg负载(4)，250μg负载(5)，375μg负载(6)，500μg负载(7)，750μg负载(8)，1000μg负载(9)和1500μg负载(10)。图10igg1类抗体的柱负载(μg/ml相/3mg融合多肽；x轴)与检测峰面积(maus；y轴)的关系，每ml固相每3mg根据本发明的融合多肽高达1500μg负载。图11igg1类抗体的柱负载(μg/ml相/xmg融合多肽；x轴；菱形＝1mg/ml，方形＝3mg/ml，三角形＝6mg/ml)和检测到的峰面积(maus；y-轴)的关系，每ml固相，每3mg根据本发明的融合多肽高达1500μg负载。图12与igg1类抗体的加载(x轴；μg)相关的洗脱峰面积(y轴；maus)，取决于在具有本文报道的融合蛋白作为亲和配体的亲和柱上的加样溶液的浓度(左栏：0.5μg/ml；右栏5mg/ml)，每ml固定的柱材料有3mg融合蛋白。图13利用具有500mm氯化钠的从0％20mmhepes缓冲液ph7.4到20％，30％，40％或50％20mmhepes缓冲液ph7.4的不同的线性梯度洗脱igg1类抗体(50μg载量/ml柱材料)的示例性层析图的叠加。图14利用具有500mm氯化钠的从0％20mmhepes缓冲液ph7.4到40％20mmhepes缓冲液的相同的线性梯度在8.3，7.4，6.3和5.5的ph值下洗脱igg1类抗体(25μg载量/ml柱材料)的示例性层析图的叠加。图15利用具有500mm氯化钠(虚线)或500mm氯化钾(实线)的从0％20mmhepes缓冲液ph7.4到40％20mmhepes缓冲液ph7.4的相同的线性梯度洗脱igg1类抗体(25μg载量/ml柱材料)的示例性层析图的叠加。图16在根据本发明的c1q亲和层析柱上具有fab片段的层析图。图17在根据本发明的c1q亲和层析柱上具有牛血清白蛋白的层析图。图18使用固定在磁珠上的根据本发明的融合蛋白通过酶促切割全长抗体获得的抗体fab片段和fc-区的分离。图19用不同突变的fc-区洗脱igg1类抗体的示例性层析图的叠加：v1＝去除c-末端赖氨酸；v3＝e345r，e430g，s440y；v4＝e345k，k326w；v5＝k326w，e333s。本发明的具体实施方式的详细说明本发明至少部分基于以下发现：以顺序a-b-c包含补体c1q亚组分亚基的单链重组c1q具有改善的性质。例如，它可以用作亲和层析配体，用于分析和分离抗体和包含fc-区的多肽。如本领域技术人员已知的，能够使用重组dna技术生产核酸和/或多肽的多种衍生物。例如，这些衍生物可以通过取代、改变、交换、缺失或插入在一个或若干个位置进行修饰。修饰或衍生化可以例如借由定点诱变进行。这些修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如sambrook，j.等人，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，newyork，usa(1999)；hames，bd和higgins，sj，nucleicacidhybridization-apracticalapproach，irlpress，oxford，england(1985))。重组技术的使用使得本领域技术人员能够用异源核酸转化各种宿主细胞。尽管不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但属于不同物种的细胞可能具有不同的所谓密码子使用。因此，相同的多肽(关于氨基酸序列)可以由不同的核酸编码。而且，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。重组技术的使用使得能够用异源核酸转化各种宿主细胞。尽管不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但属于不同物种的细胞可能具有不同的所谓密码子使用。因此，相同的多肽(关于氨基酸序列)可以由不同的核酸编码。而且，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。在本发明的范围内，可以用本领域已知的基本上任何种类的转染方法获得转染的细胞。例如，可以借由电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中。或者，可以使用脂质转染试剂，例如fugene6(rochediagnosticsgmbh，germany)，x-tremegene(rochediagnosticsgmbh，germany)和lipofectamine(invitrogencorp.，usa)。还或者，可以通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴随病毒的适当病毒载体系统将核酸引入细胞中(singer，o.，proc.natl.acad.sci.usa101(2004)5313-5314)。i.定义可用于实施本发明的方法和技术是本领域技术人员已知的，并且描述于例如在thielens，n.m.等人，j.immunol.151(1993)6583-6592；ausubel，f.m.编，currentprotocolsinmolecularbiology，第i至iii卷(1997)和sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny(1989)。如本领域技术人员已知的，能够使用重组dna技术生产核酸和/或多肽的多种衍生物。例如，这些衍生物可以通过取代、改变、交换、缺失或插入在一个或多个位置进行修饰。修饰或衍生化可以例如通过定点诱变进行。这些修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如sambrook，j.等人，molecularcloning：alaboratorymanual(1999)coldspringharborlaboratorypress，newyork，usa)。重组技术的使用使得本领域技术人员能够用一种或多种异源核酸转化各种宿主细胞。尽管不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件，但属于不同物种的细胞可能具有不同的所谓密码子使用。因此，相同的多肽(关于氨基酸序列)可以由不同的核酸编码。而且，由于遗传密码的简并性，不同的核酸可以编码相同的多肽。如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据kabat,etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中描述的kabat编号系统编号并且在此称为“根据kabat编号”。具体地，kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，natlonalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991)的kabat编号系统(参见第647-660页)用于kappa和lambda同种型的轻链恒定区cl，以及kabateu索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(ch1，铰链，ch2和ch3，在本案中其在本文中通过参考“根据kabateu索引编号”进一步阐明)。必须指出的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及其本领域技术人员已知的等同物，等等。同样，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应指出的是，术语“包含”，“包括”和“具有”可互换使用。术语“约”表示其后的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示其后的数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示其后的数值的+/-5％的范围。“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。分子x对其配偶体y的亲和力通常可由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。术语“改变”表示亲本抗体或融合多肽中的一个或多个氨基酸残基的取代、添加或缺失，所述亲本抗体或融合多肽包含至少fc-区的fcrn结合部分以获得修饰的抗体或融合多肽。术语“氨基酸取代”表示用另一种不同的氨基酸残基(取代氨基酸残基)取代至少一个现有的氨基酸残基。取代氨基酸残基可以是“天然存在的氨基酸残基”并选自由以下组成的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：a)，精氨酸(arg，r)，天冬酰胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，谷氨酰胺(gln，q)，谷氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，组氨酸(his，h)，异亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro，p)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)和缬氨酸(val，v)。术语“氨基酸插入”表示在氨基酸序列中的预定位置掺入至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，插入将是一个或两个氨基酸残基的插入。插入的氨基酸残基可以是任何天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。术语“氨基酸缺失”表示在氨基酸序列中的预定位置除去至少一个氨基酸残基。术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出fcrn-结合属性。术语“缓冲物质”表示当在溶液中时可以调节溶液ph值变化(例如，由于添加或释放酸性或碱性物质)的物质。c1q(补体c1q亚组分)由3个不同基因(c1qa，c1qb和c1qc)编码的三条多肽链(a，b和c)组装而成。每条链包含n-末端胶原样序列和c-末端球状gc1q模块，其中二硫键桥连接a链和b链的n末端和两条c链。每个a-b二聚体与c链结合，产生由两个二硫键连接的异源三聚体胶原蛋白样茎(由球状结构域延伸)组成的碱性亚基。3个亚基的缔合产生具有六束花的典型形状的全长蛋白质，通过强烈的非共价相互作用将茎保持在其n-末端半部分中，然后发散以形成六个单独的茎，每个终止于球状头部(参见frachet，p.，等人，“autoimmunity-pathogenesis，clinicalaspectsandtherapyofspecificautoimmunediseases”，由k.chatzidionysiou编辑，intech开源出版，2015，doi：10.5772/60519)。术语“c1q结合”表示c1q与结合其抗原的抗体的结合。在本文报道的方法和测定中，抗体与其抗原的结合在体内和体外没有限制。在一个实施方案中，clq结合在以下方法中测定：i)在4℃下用pbs中的抗体以0.007至25.0mg/ml的浓度包被多孔板(例如96孔elisa板)过夜，ii)洗涤平板，iii)用0.5×pbs/0.025％吐温20/0.1％明胶封闭剩余的反应性表面残基，iv)在37℃下用a)3％合并的人血清，b)兔抗人c1q，和c)与hrp缀合的猪抗兔igg抗体，温育多孔板1小时，包括在中间洗涤，v)用1mg/ml2,2'-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸温育约30分钟，vi)加入100μl的2％草酸，和vii)在酶标仪中测量405nm处的吸光度。抗体的c1q结合在本文中表示多价相互作用，导致高亲和力结合。术语“ch2结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大约从eu位置231延伸至eu位置340(根据kabat的eu编号系统)。在一个实施方案中，ch2结构域具有seqidno：16的氨基酸序列：apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqestyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskak。术语“ch3结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大约从eu位置341延伸至eu位置446。在一个实施方案中，ch3结构域具有seqidno：17的氨基酸序列：gqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg。术语抗体的“类型”表示其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类型的抗体：iga，igd，ige，igg和igm，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。当在本文中使用时，术语“包含”明确地包括术语“由......组成”。术语“补体激活”表示经典补体途径的起始。该起始是由补体成分c1q与抗体-抗原复合体的结合引起的。clq是经典补体级联中的第一种蛋白质。它参与一系列导致形成活性c3转化酶的反应，其将补体成分c3切割成c3b和c3a。c3b与膜c5结合，产生所谓的c5b，其触发补体激活的晚期事件(将c5b，c6，c7，c8和c9装配成膜攻击复合体(mac))。最后，补体级联导致细胞壁中孔的形成，引起细胞裂解(又名补体依赖性细胞毒性，cdc)。术语“补体依赖性细胞毒性(cdc)”是指在补体存在下本文报道的抗体诱导的细胞裂解。在一个实施方案中，通过在补体存在下用本文报道的抗体处理表达cd19的人内皮细胞来测量cdc。在一个实施方案中，细胞用钙荧光素标记。如果抗体以30μg/ml的浓度诱导20％或更多的靶细胞裂解，则发现cdc。可以在elisa中测量与补体因子c1q的结合。在这种测定中，原则上用浓度范围的抗体包被elisa板，向其中加入纯化的人c1q或人血清。通过针对c1q的抗体，接着通过过氧化物酶标记的缀合物检测c1q结合。结合检测(最大结合bmax)测量为过氧化物酶底物(2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐(6)])在405nm处的光密度(od405)。术语“衍生自”表示相应的氨基酸序列包含相同的氨基酸序列，或含有氨基酸序列变化，或者是缩写的变体或亲本氨基酸序列的融合变体。“效应子功能”是指可归因于抗体fc-区的那些生物活性，其随抗体类型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调；和b细胞激活。fc受体结合依赖性效应子功能可以通过抗体的fc-区与fc受体(fcr)的相互作用来介导，fc受体是造血细胞上的特化细胞表面受体。fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已经显示通过免疫复合体的吞噬作用介导抗体包被的病原体的去除，以及经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)溶解红细胞和包被有相应抗体的各种其他细胞靶标(例如肿瘤细胞)。(参见例如vandewinkel，jg和anderson，cl，j.leukoc.biol.49(1991)511-524)。fcr由它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：igg抗体的fc受体被称为fcγr。fc受体结合例如描述于ravetch，j.v.和kinet，j.p.,annu.rev.immunol.9(1991)457-492；capel，p.j等人，immunomethods4(1994)25-34；dehaas，m.等人，j.lab.clin.med.126(1995)330-341；和gessner，j.e.等人，ann.hematol.76(1998)231-248。igg抗体(fcγr)的fc-区受体的交联引发多种效应功能，包括吞噬作用，抗体依赖性细胞毒性和炎症介质的释放，以及免疫复合体清除和抗体产生的调节。在人类中，已经表征了三类fcγr，它们是：-fcγri(cd64)以高亲和力结合单体igg，并在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。fc-区igg中的至少一个氨基酸残基e233-g236，p238，d265，n297，a327和p329(根据kabat的eu索引编号)的修饰降低了与fcγri的结合。位置233-236的igg2残基被取代到igg1和igg4中，与fcγri的结合减少了103倍，并消除了人单核细胞对抗体致敏的红细胞的反应(armor，k.l.等人，eur.j.immunol.29(1999)2613-2624)。-fcγrii(cd32)以中等至低亲和力结合复合的igg并广泛表达。该受体可分为两种亚型，fcγriia和fcγriib。在参与杀伤的许多细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)上发现fcγriia，并且它似乎能够激活杀伤过程。fcγriib似乎在抑制过程中起作用，并且在b细胞、巨噬细胞和肥大细胞和嗜酸性粒细胞上发现。在b细胞上，它似乎起到抑制进一步免疫球蛋白产生和同种型转换为例如ige类的作用。在巨噬细胞上，fcγriib通过fcγriia介导抑制吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，b型可能有助于通过ige与其独立受体的结合来抑制这些细胞的激活。例如，对于包含在氨基酸残基e233-g236，p238，d265，n297，a327，p329，d270，q295，a327，r292和k414(根据kabat的eu索引编号)的至少之一处具有突变的iggfc-区的抗体，发现对fcγriia的结合降低。-fcγriii(cd16)以中等至低亲和力结合igg，并以两种类型存在。fcγriiia在nk细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和一些单核细胞以及t细胞上被发现并介导adcc。fcγriiib在嗜中性粒细胞上高表达。例如，对于包含至少在氨基酸残基e233-g236，p238，d265，n297，a327，p329，d270，q295，a327，s239，e269，e293，y296，v303，a327，k338和d376(根据kabat的eu指数编号)之一处具有突变的iggfc-区的抗体，发现与fcγriiia的结合降低。人igg1上fc受体的结合位点的作图、上述突变位点和用于测量与fcγri和fcγriia的结合的方法描述于shields，r.l.等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604。本文的术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区域，其含有至少一部分恒定区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个实施方案中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。然而，fc区的c-末端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。术语“人源fc-区”表示人源免疫球蛋白重链的c末端区域，其含有铰链区，ch2结构域和ch3结构域的至少一部分。在一个实施方案中，人igg重链fc-区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。在一个实施方案中，fc-区具有seqidno：22的氨基酸序列。然而，fc-区的c端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。本文报道的方法中使用的抗体包含fc-区，在一个实施方案中是源自人源的fc-区。在一个实施方案中，fc-区包含人恒定区的所有部分。抗体的fc-区直接参与补体激活、c1q结合、c3激活和fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与c1q的结合是由fc-区中确定的结合位点引起的。这种结合位点在现有技术中是已知的并且描述于例如lukas，t.j.，等人，j.immunol.127(1981)2555-2560；brunhouse，r和cebra，j.j.，mol.immunol.16(1979)907-917；burton，d.r等人，nature288(1980)338-344；thommesen，j.e.等人，mol.immunol.37(2000)995-1004；idusogie，e.e等人，j.immunol.164(2000)4178-4184；hezareh，m.等人，j.virol.75(2001)12161-12168；morgan，a.等人，immunology86(1995)319-324；以及ep0307434。这种结合位点例如是l234，l235，d270，n297，e318，k320，k322，p331和p329(根据kabat的eu索引编号)。亚类igg1，igg2和igg3的抗体通常显示补体激活、c1q结合和c3激活，而igg4不激活补体系统、不结合c1q并且不激活c3。“抗体的fc-区”是本领域技术人员熟知的术语，并且基于抗体的木瓜蛋白酶切割来定义。在一个实施方案中，fc-区是人fc-区。在一个实施方案中，fc-区是人igg4亚类，其包含突变s228p和/或l235e(根据kabat的eu索引编号)。在一个实施方案中，fc-区是人igg1亚类，其包含突变l234a和l235a(根据kabat的eu索引编号)。术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的fc-区的重链的抗体。术语“铰链区”表示连接ch1结构域和ch2结构域的抗体重链多肽的一部分，例如，根据kabat的eu编号系统，从大约位置216到大约位置230。铰链区通常是由具有相同氨基酸序列的两个多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分为三个结构域：上部，中部和下部铰链结构域(roux等人，j.immunol.161(1998)4083)。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代可能与亲代细胞的核酸含量不完全相同，而可能含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。“人源化”抗体是指嵌合抗体，其包含来自非人高变区(hvr)的氨基酸残基和来自人构架区(fr)的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有hvr(例如cdr)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部的fr都对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。如本文所用，术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域的每个区域，其包含序列中高变的氨基酸残基区段(“互补决定区”或“cdr”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个hvr；vh中的三个(h1，h2，h3)和vl中的三个(l1，l2，l3)。hvr包括(a)在氨基酸残基26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)和96-101(h3)处发生的高变环(chothia，c.和lesk，a.m.，j.mol.biol.196(1987)901-917)；(b)在氨基酸残基24-34(l1)，50-56(l2)，89-97(l3)，31-35b(h1)，50-65(h2)和95-102(h3)处发生的cdr(kabat，e.a.等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，natlonalinstitutesofhealth，bethesda，md(1991)，nihpublication91-3242.)；(c)在氨基酸残基27c-36(l1)，46-55(l2)，89-96(l3)，30-35b(h1)，47-58(h2)和93-101(h3)处发生的抗原接触(maccallum等人，j.mol.biol.262：732-745(1996))；和(d)(a)，(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(l2)，47-56(l2)，48-56(l2)，49-56(l2)，26-35(h1)，26-35b(h1)，49-65(h2)，93-102(h3)和94-102(h3)。除非另有说明，否则可变结构域中的hvr残基和其他残基(例如fr残基)在本文中根据kabat等(上文)编号。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如奶牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，例如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠、仓鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。术语“单克隆抗体”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，包含在群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如含有天然发生的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中出现的，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不被理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文所述。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从n-末端到c-末端，每条重链具有可变区(vh)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(ch1，ch2和ch3)。类似地，从n-末端到c-末端，每条轻链具有可变区(vl)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，然后是恒定轻(cl)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配为两种类型中的一种，称为κ(κ)和λ(λ)。术语“非天然存在的氨基酸残基”表示除了如上所列的天然存在的氨基酸残基之外的氨基酸残基，其可以与多肽链中的相邻氨基酸残基共价结合。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸，鸟氨酸，正缬氨酸，高丝氨酸。进一步的实例列于ellman等人，meth.enzym.202(1991)301-336。用于合成非天然存在的氨基酸残基的示例性方法报道于，例如，noren等人，science244(1989)182和ellman等人，同上。有关参考多肽序列的“百分数(％)氨基酸序列同一性"定义为经比对序列和引入空位(如果需要)以获得最大百分数序列同一性，和不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中氨基酸残基的相同的氨基酸残基的百分数。可以以不同方式实现为了百分数氨基酸序列同一性的目的的比对，所述方式在本领域技术内，例如，使用公众可获得的计算机软件，比如blast，blast-2,align或megalign(dnastar)软件。本领域熟练技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括获得跨被比较序列的全长的最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序align-2产生％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc.授权，并且已将原代码与用户文献资料提交美国版权局，washingtond.c.，20559，其中其在美国版权登记号txu510087下登记。align-2程序可从genentech，inc.,southsanfrancisco,california由公众获得，或可以从源代码编辑。应该将align-2程序编辑用于在unix操作系统(包括数字的unixv4.0d)上使用。所有序列比较参数由align-2程序设定并且不改变。在将align-2用于氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定氨基酸序列a相对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列b(其可以备选地叙述为相对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列b具有或包含某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)的％氨基酸序列同一性：100乘以分数x/y其中x是通过序列比对程序align-2在该程序中a和b的比对得分为相同匹配的氨基酸残基的数量，并且其中y是b中氨基酸残基的总数量。将理解当氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不相等时，a相对b的％氨基酸序列同一性将不等于b相对a的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，否则如在紧接的上一段中使用align-2计算机程序获得本文使用所有％氨基酸序列同一性值。术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式使得其中所含活性成分的生物活性有效，并且不含对制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。如本文所用，“治疗”(及其语法变体，例如“治疗(动词)”或“治疗(动名词)”)是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学疗程期间进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，症状的缓解，疾病的任何直接或间接病理后果的减少，预防转移，降低疾病进展的速度，改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原的结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为vh和vl)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(fr)和三个高变区(hvr)(参见，例如，kindt，t.j.等人，kubyimmunology，第6版，w.h.freemanandco.，ny(2007)，第91页)。单个vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的vh或vl结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补vl或vh结构域的文库(参见，例如，portolano，s.等人，j.immunol.150(1993)880-887；clackson，t.等人，nature352(1991)624-628)。术语“变体”，“修饰的抗体”和“修饰的融合多肽”表示具有与亲本分子的氨基酸序列不同的氨基酸序列的分子。通常，此类分子具有一个或多个改变、插入或缺失。在一个实施方案中，修饰的抗体或修饰的融合多肽包含氨基酸序列，其包含至少一部分非天然存在的fc-区。此类分子与亲本抗体或亲本融合多肽具有小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，变体抗体或变体融合多肽具有与亲本抗体或亲本融合多肽的氨基酸序列具有约75％至小于100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，尤其是约80％至小于100％，尤其是约85％至小于100％，尤其是约90％至小于100％，尤其是约95％至小于100％。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽和变体抗体或变体融合多肽相差一个(单个)、两个或三个氨基酸残基。ii.组合物和方法通常，旨在用作治疗剂的非人抗体是人源化的，以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中hvr(例如cdr)(或其部分)衍生自非人抗体，并且fr(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选还包含至少一部分或全长人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些fr残基被来自非人抗体(例如衍生hvr残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。抗体含有对某些fc受体，例如fcγ受体或fcrn，以及对补体系统，即对c1q的两个结合位点。每个重链fc-区中有一个结合位点。fc-区与c1q的结合介导补体依赖性细胞毒性(cdc)，其中c1q与丝氨酸蛋白酶c1r和c1s形成复合体以形成c1复合体。c1q的三维结构类似于包含六个球状头的一束郁金香，其包含抗体结合区(参见例如perkins等人，biochem.j.228(1985)13-26；poon等人，j.mol.biol.168(1983)563-577；reid等人，biochem.soc.trans.11(1983)1-12；weiss等人，j.mol.biol.189(1986)573-581)。更详细地，c1q包含18个亚基，各有6个a亚基，6个b亚基和6个c亚基。a-，b-和c-亚基的每个三聚体形成fc-区结合位点。因此，完全组装的c1q能够结合六个fc-区。不同的igg亚类对c1q具有不同的亲和力，例如igg1和igg3显示出强的c1q结合，而igg2和igg4与补体的结合不良。因此，igg1和igg3表现出强cdc，igg2表现出弱cdc，igg4表现出无cdc。在fc-区与c1q残基的结合中，涉及铰链区以及ch2结构域。与igg2/igg4相比，这些区域在igg1/igg3中具有不同的氨基酸序列。例如，残基233-236(根据kabat的eu索引编号)的交换对cdc影响很大(参见例如armor，kl，eur.j.immunol.29(1999)2613-2624；和shields等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604)。进一步诱变研究已经鉴定了人igg上的c1q结合位点包含氨基酸残基d270，k322，k326，p329，和p331，以及e333(idusogie等人，j.immunol.164(2000)4178-4184；idusogie等人，j.immunol.166(2001)2571-2575)。抗体fc-区还在氨基酸残基n297处具有保守的n-连接糖基化位点。这种糖基化是有效的c1q-fc-区域相互作用所必需的。在n297碳水化合物组成的修饰或其消除影响结合(参见例如umana等人，nat.biotechnol.17(1999)176-180；davies等人，biotechnol.bioeng.74(2001)288-294；mimura等人，j.biol.chem.276(2001)45539-45547；radaev等人，j.biol.chem.276(2001)16478-16483；shields等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604；shields等人，j.biol.chem.277(2002)26733-26740；simmons等人，j.immunol.meth.263(2002)133-147)。对于补体激活，需要多于单一抗体fc-区，因为单体igg对c1q的亲和力非常弱(亲和力约10-4m)(参见例如sledge等人，j.biol.chem.248(1973))2818-2813；hughes-jones等人，mol.immunol.16(1979)697-701)。多价c1q的结合可以通过免疫球蛋白分子的基于抗原的结合而增加，并因此补体激活(亲和力约10-8m)(参见例如burton等人，mol.immunol.22(1990)161-206)。已知方法的组合可以获得与c1q亲和层析相当的分析结果，但代价是增加了复杂性和努力。igg-c1q相互作用的spr分析提供了定性结果，表明样品的预期或异常结合特性，但既没有给出异常结合的原因的提示也没有给出具有异常结合的抗体量的定量估计。质谱法也仅提供igg分子的干扰完整性的定性信息。相反，c1q亲和层析允许在适当的生理条件下用离子强度梯度分析样品，如果需要微调样品中发现的不同峰的分离，可以调节离子强度梯度。不同的峰可以通过它们在曲线下的相应面积来定量，并且对应于每个峰的洗脱液可进行二次分析，例如用于功能测定、重新层析或质谱分析。另外，为了提供治疗方案以治疗今天已知的疾病的多样性以及将来将揭示的那些，存在着对定制的抗体以及含有fc-区的多肽的需要。为了定制抗体或含有fc部分的融合多肽的c1q结合特征，修饰参与fc-区介导的效应子功能的残基，并且必须测试所得的修饰抗体和融合多肽。如果不满足所需特征，则再次执行相同的过程。在一个实施方案中，fc-区是全长抗体重链的部分，其介导与c1q的结合。该级分可包含一个或两个与重链恒定区(特别是铰链和ch2结构域)中的不同相互作用残基相关的区段。因此，提供一种方法是有利的，该方法基于简单的层析方法预测修饰抗体的特征性质的变化，并且不需要体内研究来分析修饰抗体中特征的变化。已经发现，使用本文报道的融合多肽作为层析配体，现在可以分离、隔离和表征其密切相关的抗体种类的体内特性，即在单个或有限数量的氨基酸残基中不同，这会影响与c1q的相互作用。因此，利用本文报道的方法，可以分离一种亲本抗体的不同变体并确定这些变体之间的特定比例，这对于目前已知的方法是不可能的，因为这些仅提供修饰的总和而不是单个种类(即，对于亲本和变体1和变体2以及变体1/2质谱的混合物，提供包含变体1的分子的总数，即包含单个变异(1)的变体以及还包含第二变异(1/2)的变体)。已经发现，对于给定条件，野生型igg1抗体在本文提供的实施例中概述的条件下具有约25至28分钟的保留时间。具有降低的c1q结合的、具有修饰的fc-区的抗体具有较短的保留时间，而具有增强的c1q结合的、具有修饰的fc-区的抗体具有比具有亲本未修饰的fc-区的抗体更长的保留时间。本文报道的一个方面是根据式i的融合多肽tag-x1-c1qa-x2-c1qb-x3-c1qc-x4(式i)其中，x1表示第一肽接头，x2表示第二肽接头，x3表示第三肽接头，x4表示第四肽接头，x1，x2，x3，x4彼此独立地存在或不存在，tag是氨基酸序列标签，tag可以存在或不存在，c1qa是seqidno：01的片段，c1qb是seqidno：03的片段，c1qc是seqidno：05的片段，和-表示肽键。c1q链a(c1qa，补体c1q亚组分亚基a)具有seqidno：01的氨基酸序列(uniprotkb-p02745(c1qa_human))。c1q链b(c1qb，补体c1q亚组分亚基b)具有seqidno：03的氨基酸序列(uniprotkb-p02746(c1qb_human))。c1q链c(c1qc，补体c1q亚组分亚基c)具有seqidno：05的氨基酸序列(uniprotkb-p02747(c1qc_human))。c1q由18条多肽链组成：6条a链，6条b链和6条c链。a-，b-和c-链以人类基因组中染色体1上的a-c-b顺序排列。与此相反，亚基在本文报道的融合多肽中以a-b-c的顺序排列。每个补体c1q亚组分亚基包含胶原蛋白样结构域和c1q结构域。在亚基a和b的胶原样结构域的残基4之间(seqidno：01和03的残基4)，形成二硫键。在两个c亚基的胶原样结构域的残基4之间(seqidno：05的残基4)，也形成二硫键。如本文报道的融合多肽中，不再包含上述半胱氨酸残基的三个亚基的片段融合，也不再形成天然存在的二硫键。本文报道的一个方面是根据式i的固定化融合多肽tag-x1-c1qa-x2-c1qb-x3-c1qc-x4(式i)其中，x1表示第一肽接头，x2表示第二肽接头，x3表示第三肽接头，x4表示第四肽接头，x1，x2，x3，x4彼此独立地存在或不存在，tag是氨基酸序列标签，tag可以存在或不存在，c1qa是seqidno：01的片段，c1qb是seqidno：03的片段，c1qc是seqidno：05的片段，和-表示肽键作为亲和层析配体的用途。本文报道的一个方面是根据式i的固定化融合多肽tag-x1-c1qa-x2-c1qb-x3-c1qc-x4(式i)其中，x1表示第一肽接头，x2表示第二肽接头，x3表示第三肽接头，x4表示第四肽接头，x1，x2，x3，x4彼此独立地存在或不存在，tag是氨基酸序列标签，tag可以存在或不存在，c1qa是seqidno：01的片段，c1qb是seqidno：03的片段，c1qc是seqidno：05的片段，和-表示肽键作为亲和层析配体用于分离抗体糖形的用途。抗体糖形的总和表示为“糖谱”或“糖基化谱”。这些术语是指糖基化多肽的聚糖的性质。这些性质是糖基化位点，或糖基化位点占据，或多肽的聚糖和/或非糖部分的特性，结构，组成或数量，或特定糖形的特性和数量。如本文所用，“聚糖”是糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但通常含有至少三个糖，并且可以是直链或支链的。聚糖可包括天然糖残基(例如，葡萄糖，n-乙酰基葡糖胺，n-乙酰神经氨酸，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，己糖，阿拉伯糖，核糖，木糖等)和/或修饰的糖(例如，2'-氟代核糖，2'-脱氧核糖，磷酸甘露糖，6'-磺基n-乙酰基葡糖胺等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还包括糖缀合物的聚糖组分(例如糖蛋白，糖脂，蛋白聚糖等)。该术语还包括游离聚糖，包括已经从糖缀合物切割或以其他方式释放的聚糖。如本文所用，术语“糖蛋白制剂”是指一组单独的糖蛋白分子，每个分子包含具有特定氨基酸序列的多肽(该氨基酸序列包括至少一个糖基化位点)和至少一个共价连接到至少一个糖基化位点的聚糖。糖蛋白制剂中特定糖蛋白的各个分子通常具有相同的氨基酸序列，但在至少一个糖基化位点的占据和/或与至少一个糖基化位点连接的聚糖的特性方面可以不同。也就是说，糖蛋白制剂可以仅含有特定糖蛋白的单一糖形，但更通常含有多种糖形。相同糖蛋白的不同制剂可以在存在的糖形的特性(例如，一种制剂中存在的糖形可以不存在于另一种制剂中)和/或不同糖形的相对量方面不同。术语“糖形”在本文中用于指特定形式的糖蛋白。也就是说，当糖蛋白包括可能与不同聚糖或聚糖组连接的特定多肽时，则糖蛋白的每种不同形式(即，当多肽与特定聚糖或聚糖组连接时)被称为“糖形”。因此，术语“糖形”表示一种多肽，其具有与其附接的多糖的特定类型和分布。例如，如果它们包含具有相同数量、种类和单糖序列的聚糖，即具有相同的“糖基化谱”，则两个多肽将具有相同的糖形。还报道了亲和层析柱，其包含基质和基质结合的层析官能团，其中基质结合的层析官能团包含根据式i的融合多肽tag-x1-c1qa-x2-c1qb-x3-c1qc-x4(式i)其中，x1表示第一肽接头，x2表示第二肽接头，x3表示第三肽接头，x4表示第四肽接头，x1，x2，x3，x4彼此独立地存在或不存在，tag是氨基酸序列标签，标签可以存在或不存在，c1qa是seqidno：01的片段，c1qb是seqidno：03的片段，c1qc是seqidno：05的片段，和-表示肽键。使用这样的柱，可以特异性地保留抗体，特别是全长四链抗体，其可以与柱上的c1q相互作用。fab片段和非抗体蛋白质不与柱结合(参见图16和17)。本文报道的一个方面是使用本文报道的亲和层析柱通过测定抗体和参照抗体的保留时间的比率来确定抗体的相对c1q结合。在一个实施方案中，参照抗体是全长人igg1抗体。本文报道的一个方面是如本文报道的亲和层析柱用于分离包含至少fc-区的c1q结合片段的抗体或融合多肽的用途。本文还报道了用于分离抗体或融合多肽的方法，所述抗体或融合多肽包含至少fc-区的c1q结合片段。在一个实施方案中，分离选自纯化、产生和分析。本文报道的一个方面是使用如本文报道的亲和层析柱用于从igg2或igg4亚类的抗体中分离igg1或igg3亚类的抗体。本文报道的一个方面是使用如本文报道的亲和层析柱用于从igg3和/或igg2和/或igg4亚类的抗体中分离igg1亚类的抗体。通常，本文报道的方法的起始点是亲本抗体或亲本融合多肽，其特征在于与c1q结合。本文报道的一个方面是如本文报道的亲和层析柱用于从亲本抗体或亲本融合多肽的包含至少fc-区的c1q结合部分的经修饰抗体或修饰融合多肽的文库中筛选出与亲本抗体或亲本融合多肽相比，具有改变的c1q结合亲和力的那些经修饰抗体或修饰的融合多肽。本文报道了从亲本抗体或亲本融合多肽的包含至少fc-区的c1q结合部分的经修饰抗体或修饰融合多肽的文库中筛选出与亲本抗体或亲本融合多肽相比，具有改变的c1q结合亲和力的那些经修饰抗体或修饰的融合多肽，该方法包括以下步骤：(a)将文库的个体成员和亲本抗体或亲本融合多肽应用于本文报道的c1q亲和层析柱；(b)以离子强度梯度回收文库的个体成员并确定个体保留时间；和(c)选择与亲本抗体或亲本融合多肽相比具有对c1q改变的结合亲和力的那些抗体或融合多肽。本文报道了从多肽混合物纯化包含至少fc-区的c1q结合部分的抗体或融合多肽的方法，该方法包括将该混合物应用于如本文报道的c1q亲和柱并用离子强度梯度洗脱包含至少fc-区的c1q结合部分的抗体或融合多肽，从而纯化抗体或融合多肽。在一个实施方案中，fc-区的c1q结合部分是人fc-区，或小鼠fc-区，或食蟹猴fc-区，或兔fc-区，或仓鼠fc-区。本文报道的一个方面是如本文报道的亲和层析柱用于鉴定表现出与c1q的结合改变的包含至少fc-区的c1q结合部分(例如，免疫球蛋白例如igg1的恒定结构域)的抗体或融合多肽的用途。本文提供了鉴定表现出与c1q的结合改变的抗体或融合多肽的方法，所述抗体或融合多肽包含至少fc-区的c1q结合部分(例如免疫球蛋白例如igg1的恒定结构域)。当与亲本抗体或融合多肽相比或与参照抗体或参照融合蛋白相比时，这种修饰的抗体或融合多肽显示出与c1q的结合增加或减少，并且因此分别具有增加或减少的cdc引发特性。与对c1q具有降低的亲和力的那些相比，预测具有对c1q的增加的亲和力的fc-区变体(即，与亲本抗体或参照抗体相比在c1q亲和层析柱上的保留时间增加)具有更高的cdc引发特性。对c1q具有增加的亲和力的fc-区变体可应用于治疗哺乳动物，尤其是人的方法，其中需要施用的抗体或融合多肽的cdc。对c1q具有降低的亲和力的fc-区变体可用于治疗哺乳动物，尤其是人的方法，其中需要降低施用的抗体或融合多肽的cdc，例如体内诊断成像。在一个实施方案中，如本文报道的抗体或融合多肽包含至少一个结合位点(例如至少一个抗原结合位点，或至少一个受体结合位点，或至少一个配体结合位点)。在一个实施方案中，本文报道的抗体或融合多肽包含至少两个结合位点(例如至少两个抗原结合位点，或至少两个受体结合位点，或至少两个配体结合位点，或至少一个抗原结合位点和至少一个受体结合位点，或至少一个抗原结合位点和至少一个配体结合位点，或至少一个受体结合位点和至少一个配体结合位点)。在一个实施方案中，本文报道的抗体或融合多肽包含三个结合位点(例如至少三个抗原结合位点，或至少三个受体结合位点，或至少三个配体结合位点，或之前的至少三个结合位点的任何混合物)。在一个实施方案中，如本文报道的抗体或融合多肽包含四个结合位点。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，fc-区的至少一部分是人源fc-区的至少一部分。在本文报道的所有方面的一个实施方案中，c1q选自人c1q，食蟹猴c1q，小鼠c1q，大鼠c1q，绵羊c1q，狗c1q和兔c1q。在一个实施方案中，fc-区的至少一部分包含人源ch2结构域(seqidno：16，根据kabat编号)的至少氨基酸残基282-340。在一个实施方案中，fc-区的至少一部分包含完整的ch2结构域(根据kabat的eu编号，约为人源抗体重链多肽fc-区的氨基酸残基231-340)。在一个实施方案中，fc-区的至少一部分包含至少一个ch2结构域和至少一个铰链区(根据eu编号，人源抗体重链多肽fc-区的约氨基酸残基216-230)或ch3结构域(根据eu编号，人源抗体重链多肽fc-区的约氨基酸残基341-446；seqidno：17)。在一个实施方案中，fc-区的至少一部分包含人源抗体重链的ch2和ch3结构域。在一个实施方案中，fc-区的至少一部分包含人源抗体重链fc-区的铰链，ch2结构域和ch3结构域。人源fc-区或人源部分fc-区的c1q结合部分可以衍生自不同的同种型，例如igg1(seqidno：18)或igg3(seqidno：20)。在一个实施方案中，人同种型是igg1。亲本抗体的fc-区或包含在亲本融合多肽中的fc-区可以衍生自不同的免疫球蛋白分子和/或不同的免疫球蛋白同种型。例如，亲本抗体或亲本融合多肽可包含衍生自igg1同种型免疫球蛋白的ch2结构域和衍生自igg3同种型免疫球蛋白的铰链区。还例如，亲本抗体或亲本融合多肽可以包含部分源自igg1免疫球蛋白亚型的铰链区，并且部分源自igg3免疫球蛋白亚型，只要它们是人源的。例如，亲本抗体或亲本融合多肽可包含嵌合铰链区，其部分源自igg1免疫球蛋白同种型，部分源自igg4免疫球蛋白同种型。亲本抗体或亲本融合多肽包含至少一个fc-区或其一个c1q结合部分。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本多肽另外包含至少一个结合结构域(在一个实施方案中，选自抗原结合结构域，受体结合结构域或配体结合结构域)。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽包含至少一个结合结构域和至少一个fc-区或其一个c1q结合部分。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽包含两个结合结构域和两个fc-区或其两个c1q结合部分。在一个实施方案中，如本文报道的亲本抗体或亲本融合多肽包含至少一个结合结构域以及至少一个fc-区或其c1q结合部分，所述至少一个结合结构域特异性结合介导生物学效应(在一个实施方案中是能够结合细胞表面受体的配体或能够结合配体的细胞表面受体)并介导阴性信号或阳性信号传递给细胞的靶。在一个实施方案中，亲本抗体或亲本融合多肽包含至少一个对靶向减少或消除的抗原(在一个实施方案中为细胞表面抗原或可溶性抗原)特异的结合结构域和至少一个fc-区或其一个c1q结合部分。通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的抗原，包含此类抗原的细胞或细胞提取物，或编码这种抗原的dna)和任选的佐剂，可以在哺乳动物中产生特异性结合靶标的抗体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，融合多肽包含与c1q结合部分有效连接的抗体片段(例如scfv分子、微抗体、四价微抗体或双抗体)。在一个实施方案中，c1q结合部分是完整的抗体重链fc-区。在一个实施方案中，亲本抗体是双特异性抗体或亲本融合多肽包含双特异性抗体或双特异性抗体片段。在一个实施方案中，亲本抗体是嵌合抗体。在一个实施方案中，亲本融合多肽包含至少fc-区的c1q结合部分。在一个实施方案中，亲本融合多肽包含一个或多个结合结构域，其又各自包含一个结合位点。亲本融合多肽可以是双特异性的(具有特异性结合第一靶标的一个结合位点和特异性结合第二个靶标的第二结合位点)或多价的(具有特异性结合相同靶标的两个结合位点)。通常，结合结构域与fc-区的至少c1q结合部分的c末端或n末端融合。“固相”表示非流体物质，并且包括由诸如聚合物、金属(顺磁性，铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷的材料制成的颗粒(包括微粒和珠子)；凝胶物质如二氧化硅、氧化铝和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；实心条；和比色皿、管或其他光谱仪样品容器。测定的固相组分与惰性固体表面的区别在于“固相支持体”在其表面上含有至少一个部分，其旨在与分子化学相互作用。固相可以是固定组分，例如芯片、管、条、比色皿或微量滴定板，或者可以是非固定组分，例如珠子和微粒。微粒也可用作均相测定形式的固相支持体。可以使用允许蛋白质和其他物质的非共价或共价连接的各种微粒。这种颗粒包括聚合物颗粒，如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒，如金纳米颗粒和金胶体；和陶瓷颗粒，如二氧化硅、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如martin，c.r，等人，analyticalchemistry-news&features，may1(1998)322a-327a，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，固相支持体是琼脂糖。在一个实施方案中，固相是磁珠。在一个实施方案中，本文报道的融合多肽与固相的缀合通过n-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基、抗体的氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团，和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基团化学结合来进行。在一个实施方案中，本文报道的融合多肽经由特异性结合对与固相缀合。在一个实施方案中，融合多肽与生物素缀合，并经由固相支持体固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白进行到固相支持体上的固定。在一个实施方案中，固相是磁珠。在一个实施方案中，特异性结合对(第一组分/第二组分)选自链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素，抗体/抗原(参见，例如，hermanson，g.t.等人，bioconjugatetechniques，academicpress(1996))，凝集素/多糖，类固醇/类固醇结合蛋白，激素/激素受体，酶/底物，igg/蛋白a和/或g等。如本文报道的用途和方法中报道的结合c1q亲和柱的抗体的回收是通过线性梯度洗脱。在一个实施方案中，线性梯度是离子强度梯度或电导率梯度。原则上，任何缓冲物质可用于本文报道的方法中。根据下表，使用线性盐梯度(离子强度/电导率)的洗脱液a(20mmhepes缓冲液，ph7.4)和洗脱液b(20mmhepes缓冲液，补充500mmnacl，ph7.4)，用c1q亲和层析柱(长度：50mm；直径：5mm；床体积：1ml；1mg融合蛋白/ml固相)测定以下示例性数据。表使用如上所述的洗脱方法用本文报道的c1q亲和层析柱获得的不同igg亚类的抗体的保留时间显示在下表中(也参见图1)。表从图8可以看出igg1或igg4类抗体的柱负载与检测到的峰面积之间的线性关系。在图9中，显示了在具有不同负载的相同c1q柱上获得的层析图的叠加图。可以观察到线性，直到1000μg/1ml柱材料，具有每毫升柱材料缀合/固定的3mg如本文报道的融合蛋白(参见图10)。在每ml柱材料/固相固定的1mg/ml和6mg/ml融合蛋白之间可以观察到这种线性(参见图11)。因此，在一个实施方案中，具有本文报道的融合多肽的亲和层析法具有高达1000μg/1-6mg融合多肽/1ml固相的负载能力。已发现该柱的性能与负载溶液的浓度无关。从图12可以看出，与负载溶液的浓度无关，获得相同的峰面积。即，样品浓度不影响所获得的信号。在一个实施方案中，通过线性离子强度或电导率梯度洗脱与c1q亲和层析柱结合的物质，其中在施用包含待分析/分离/纯化的物质的溶液后，用第一溶液平衡和洗涤柱，并通过施加所述第一溶液和具有增加的离子强度或导电性的第二溶液的线性变化的混合物来洗脱物质。根据梯度的斜率，可以调整不同的保留时间(参见图13)。在一个实施方案中，第一溶液和第二溶液是缓冲溶液(即第一溶液和第二溶液包含缓冲物质)。在一个实施方案中，使用药学上可接受的缓冲物质，例如，磷酸或其盐，乙酸或其盐，柠檬酸或其盐，吗啉，2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)或其盐，组氨酸或其盐，甘氨酸或其盐，三(羟甲基)氨基甲烷(tris)或其盐，(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)或其盐。在一个实施方案中，缓冲物质选自吗啉，2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)或其盐，三(羟甲基)氨基甲烷(tris)或其盐，(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)或其盐。在一个实施方案中，缓冲物质具有从10mm至500mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从10mm至300mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从10mm至250mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从10mm至200mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从10mm至150mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从10mm至100mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从15mm至50mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有约20mm的浓度。在一个实施方案中，缓冲物质具有从100mm至150mm的浓度。在一个实施方案中，第一溶液中的缓冲物质和第二溶液中的缓冲物质是相同的缓冲物质。在一个实施方案中，第一溶液中的缓冲物质和第二溶液中的缓冲物质是不同的缓冲物质。在一个实施方案中，第一溶液中的缓冲物质和第二溶液中的缓冲物质具有相同的浓度。缓冲盐的抗衡离子对保留时间的影响很小(参见图15)。在一个实施方案中，第一和/或第二溶液包含额外的盐。在一个实施方案中，额外的盐选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。在一个实施方案中，包含50mm至1000mm的额外盐的缓冲溶液。在一个实施方案中，溶液包含50mm至750mm的额外的盐。在一个实施方案中，溶液包含50mm至500mm的额外的盐。在一个实施方案中，溶液包含50mm至750mm的额外的盐。在一个实施方案中，缓冲溶液包含约50mm至约300mm的额外的盐。在一个实施方案中，第一和/或第二溶液包含氯化钠。在一个实施方案中，第一和/或第二溶液包含约50mm至约750mm氯化钠。在一个实施方案中，第一溶液和第二溶液包含氯化钠。在一个实施方案中，第一溶液包含约0mm至约15mm的氯化钠，第二溶液包含约100mm至约1000mm的氯化钠，优选约100mm至约500mm的氯化钠。一种示例性优选的第一溶液包含20mmhepes，调节至ph7.4。一种示例性优选的第二溶液包含20mmhepes和500mmnacl，调节至ph7.4。由于c1q结合是ph依赖性的，第一和第二溶液的ph影响洗脱曲线，即保留时间和峰形(参见图14)。具有本文报道的融合多肽的亲和层析材料作为与基质结合的亲和层析配体可用于分析/分离抗体的各个糖形。例如，在下表中，给出了去糖基化形式，如g(0)型和g(2)型的igg1亚类的相同抗egfr抗体的保留时间差异。相应的层析图如图2所示。表例如，在下表中，给出了去糖基化形式、完全唾液酸化形式和完全半乳糖基化形式的igg1亚类的相同抗cd20抗体的保留时间差异。相应的层析图如图3所示。表例如，在下表中，给出了cho产生形式，在man3-glcnac-nana/ngna上完全唾液酸化以及在man6-glcnac-nana/ngna上完全唾液酸化的相同igg1抗体的保留时间差异。相应的层析图如图4所示。表为了表明用融合多肽作为亲和层析配体也可以分析不同同种型的密切相关的抗体，将抗体对briakinumab(ozespatm)和ustekinumab(stelaratm)用作模型系统。briakinumab和ustekinumab都是完全人单克隆igg1抗体。它们与白细胞介素12(il-12)和白细胞介素23(il-23)的相同人p40亚基结合(gandhi，m，等人，semin.cutan.med.surg.29(2010)48-52)并且它们不与相应的小鼠il-12和il-23交叉反应(luo，j.等人，j.mol.biol.402(2010)797-812；traczewski，p.和rudnicka，l.，biodrugs.26(2012)9-20)。briakinumab和ustekinumab分别是具有vh5和vκ1d种系家族的可变重链和轻链结构域的igg1κ抗体和具有vh3和vλ1种系家族的可变重链和轻链结构域的igg1λ抗体。除了不同的可变结构域之外，briakinumab和ustekinumab在恒定结构域中显示出几种同种异型特异性氨基酸的差异。在下表中，给出了抗igg1参照抗体briakinumab和ustekinumab的保留时间差异。相应的层析图如图5所示。表通常，本文报道的方法和用途中的保留时间取决于离子强度/电导率梯度的陡度和所用的盐浓度。野生型抗体用作参考，并且较弱的结合通过较短的保留时间(＝较早的洗脱)表示，而较强的结合通过较长的保留时间(＝较晚的洗脱)表示。在一个实施方案中，融合多肽是单-生物素化的。包含本文报道的融合多肽作为亲和配体的层析材料可用于隔离/分离抗体片段，因此提供了常规蛋白a亲和层析的备选方案。此外，通过使用本文报道的层析材料，与常规蛋白a亲和层析相比，可以在更多生理条件例如ph值下进行分离。包含本文报道的融合多肽作为配体的层析材料可用于测定/分离/富集包含修饰例如，糖基化的抗体种类。取决于用于富集某些抗体种类的所选梯度(起始/终止离子强度/电导率)，可以使用包含本文报道的融合多肽作为配体的层析材料。包含本文报道的融合多肽的层析材料可用于分离氨基酸修饰。包含本文报道的融合多肽作为配体的层析材料可用于隔离/分离双特异性抗体错配，例如孔-孔二聚体和半抗体。在图7中，空白柱和c1q柱上的igg1(25μg负载)亚类的抗体的示例性层析图的叠加图，空白柱即在仅包含基质/固相但没有与其缀合的亲和配体的柱上，c1q柱即在包含与空白柱相同的基质的柱，但此时根据本发明的c1q融合多肽作为亲和配体与其缀合。可以看出，使用c1q亲和柱可以实现抗体的保留。如图18中所概述的，本文报道的融合蛋白可用于在酶促切割后从fc-区分离抗体fab片段用于进一步分析。1.抗体片段在某些实施方案中，本文报道的方法中使用的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2、fv和scfv片段，以及下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见hudson，p.j，等人，nat.med.9(2003)129-134。关于scfv片段的综述，参见，例如，plueckthun，a.，在：thepharmacologyofmonoclonalantibodies，vol.113，rosenburg和moore(编辑)，springer-verlag，newyork(1994)，第269-315页；也参见wo93/16185；和us5,571,894和us5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半寿期的fab和f(ab')2片段的讨论，参见us5,869,046。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。2.嵌合抗体和人源化抗体在某些实施方案中，如本文报道的方法中使用的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述在，例如，us4,816,567；和morrison,s.l.等人，proc.natl.acad.sci.usa81(1984)6851-6855)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，从小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物诸如猴衍生出的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中所述类或亚类已经从亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对于人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含这样的一个或多个可变结构域:其中hvr例如cdr(或其部分)源自非人抗体并且fr(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地也包含人恒定区的至少一部分。在某些实施方案中，将人源化抗体中的一些fr残基取代为来自非人抗体(例如，从其衍生出hvr残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体和制造它们的方法综述在，例如，aimagro,j.c.和franssοn,j.，front.biosci.13(2008):1619-1633，且进一步描述在，例如，riechmann,i.等人，nature332(1988)323-329；queen.c.等人，proc.natl.acad.sci.usa86(1989)10029-10033；us5,821,337，us7,527,791、us6,982,321和us7,087,409；kashmiri.s.v.等人，methods36(2005)25-34(描述了sdr(a-cdr)移植)；padlan,e.a.,mol.immunol.28(1991)489-498(描述了“表面再建”)；dall’acqua,w.f.等人，methods36(2005)43-60(描述了“fr改组”)；和osbourn,j.等人，methods36(2005)61-68和klimka,a.等人，br.j.cancer,83(2000)252-260(描述了用于fr改组的“指导选择”方法)。可以用于人源化的人构架区包括、但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的构架区(参见，例如，sims,m.j.等人，j.immunol.151(1993)2296-2308)；从轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生出的构架区(参见，例如，carter,p.等人.proc.natl.acad.sci.usa，89(1992)4285-4289；和presta,l.g.等人，j.immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟的(体细胞突变的)构架区或人种系构架区(参见，例如，almagro,j.c.和fransson,j.，front.biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选fr文库来源的构架区(参见，例如，baca,m.等人，j.biol.chem.272(1997),10678-10684和rosok,m.j.等人，j.biol.chem.271(1996)22611-22618)。3.人抗体在某些实施方案中，如本文报道的方法中使用的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术生产人抗体。人抗体通常描述在vandijk,m.a.和vandewinkel,j.g.，curr.opin.pharmacol.5(2001)368-374和lonberg,n.，curr.opin.immunol.20(2008)450-459。可以通过将免疫原施用给转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已经经过修饰以响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这样的动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座或其在染色体外存在或随机整合进动物的染色体中。在这样的转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见lonberg,n.，nat.biotech.23(2005)1117-1125。也参见，例如，描述技术的us6,075,181和us6,150,584；描述技术的us5,770,429；描述技术的us7,041,870；和描述技术的us2007/0061900)。可以进一步修饰来自从这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人恒定区组合。还可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，kozbor,d.j.immunol.，133(1984)3001-3005；brodeur,b.r.等人，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，marceldekker，inc.，newyork，(1987)，第51-63页；和boerner,p.等人，j.immunol.，147(1991)86-95)。在li,j.等人，proc.natl.acad.sci.usa，103(2006)3557-3562中也描述了通过人b-细胞杂交瘤技术产生的人抗体。另外的方法包括例如在以下文献中描述的那些方法：us7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人igm抗体)和ni,j.，xiandaimianyixue，26(2006)265-268(描述了人-人杂交瘤)。在vollmers,h.p.和brandlein,s.，histologyandhistopathology，20(2005)927-937以及vollmers,h.p.和brandlein,s.，methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology，27(2005)185-91中也描述了人杂交瘤技术(三瘤技术)。通过分离选自人-来源的噬菌体展示文库的fv克隆可变结构域序列，也可以产生人抗体。这样的可变结构域序列随后可以与期望的人恒定结构域组合。下文描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。4.文库来源的抗体通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体，可以分离如本文报道的方法中使用的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有期望的结合特征的抗体的多种方法。这类方法综述在，例如，hoogenboom,h.r.等人，methodsinmolecularbiology178(2002)1-37，且进一步描述在，例如，mccafferty,j.等人，nature348(1990)552-554；clackson,t.等人，nature352(1991)624-628；marks,j.d.等人，j.mol.biol.222(1992)581-597；marks,j.d和bradbury,a.，methodsinmolecularbiology248(2003)161-175；sidhu,s.s,等人，j.mol.biol.338(2004)299-310；lee,c.v.等人，j.mol.biol.340(2004):1073-1093；fellouse，proc.natl.acad.sci.usa101(2004)12467-12472；和lee,c.v.等人，j.immunol.methods284(2004)119-132。在某些噬菌体展示法中，vh和vl基因的组库分别通过聚合酶链式反应(pcr)克隆并且在噬菌体文库中随机地重组，其随后可以针对抗原结合噬菌体进行筛选，如在winter,g.等人，ann.rev.immunol.,12(1994)433-455中所述。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链fv(scfv)片段或作为fab片段。来自免疫过的来源的文库会提供针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。备选地，可以(例如，从人)克隆原初库以在没有任何免疫接种的情况下提供针对广泛类型的非自身抗原以及自身抗原的抗体的单一来源，如griffiths,a.d.等人，emboj，12(1993)725-734所述。最后，通过从干细胞克隆未重排的v-基因区段并使用含有随机序列的pcr引物，也可以合成地产生幼稚文库以编码高度可变的cdr3区并实现体外重排，如hoogenboom,h.r.和winter,g.，j.mo1.bio1.，227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如us5,750,373和us2005/0079574、us2005/0119455、us2005/0266000、us2007/0117126、us2007/0160598、us2007/0237764、us2007/0292936和us2009/0002360。从人抗体文库分离的抗体或抗体片段被认为是本文中的人抗体或人抗体片段。5.多特异性抗体在某些实施方案中，如本文报道的方法中使用的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位到表达抗原的细胞中。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。用于制备多特异性抗体的技术包括、但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见milstein,c.和cuello,a.c.，nature305(1983)537-540)，wo93/08829，和traunecker,a.等人，emboj.10(1991)3655-3659)，和“凸起入孔”工程改造(参见，例如，us5,731,168)。也可以通过以下方式制备多特异性抗体：工程改造静电操纵效应用于制备抗体fc-异源二聚体分子(wo2009/089004a1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见，例如，us4,676,980，和brennan,m.等人，science，229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，kostelny,s.a.等人，j.immunol.，148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段(参见，例如，hoiiinger,p.等人，proc.natl.acad.sci.usa，90(1993)6444-6448)；和使用单链fv(sfv)二聚体(参见，例如，gruber,m.等人，j.immunol.，152(1994)5368-5374)；以及制备三特异性抗体，如在例如tutt,a.等人.j.immunol.147(1991)60-69中所述。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体(octopusantibodies)”(参见，例如，us2006/0025576)。本文中的抗体或片段还包括“双效fab”或“daf”，其包含结合不同抗原的抗原结合位点(参见，例如，us2008/0069820)。本文的抗体或片段还包括wo2009/080251，wo2009/080252，wo2009/080253，wo2009/080254，wo2010/112193，wo2010/115589，wo2010/136172，wo2010/145792和wo2010/145793中描述的多特异性抗体。6.抗体变体在某些实施方案中，设想并分析抗体的氨基酸序列变体。例如，可能合乎需要的是，改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成，可以制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或取代所述氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合以获得最终构建体，前提条件是，所述最终构建体具有期望的特征，例如，抗原结合。a)取代变体、插入变体和缺失变体在某些实施方案中，本文报道的方法中使用了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目标位点包括hvr和fr。在表1中在“示例性取代”的标题下提供了示例性的变化，并且参考氨基酸侧链类别在下面进一步描述。在表1中在“优选取代”的标题下显示了保守取代。可以将氨基酸取代引入目标抗体中并且针对期望的活性(例如，保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的adcc或cdc)来筛选产物。表1氨基酸可以根据共同的侧链特性分组：⑴疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水的：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性的：asp、glu；(4)碱性的:his、lys、arg；(5)影响链取向的残基:gly、pro；(6)芳族的：trp、tyr、phe。非保守取代需要将这些分类之一的成员交换为另一个分类的成员。一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区(hvr)残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体在某些生物学特性上具有修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)，和/或具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。一种示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，所述抗体可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文描述的那些)方便地产生。简而言之，将一个或多个hvr残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示和针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。可以在hvr中做出改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。这类改变可以在hvr“热点”(即，在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见，例如，chowdhury,p.s.,methodsmol.biol.207(2008)179-196)，和/或sdr(a-cdr)中做出，并对得到的变体vh或vl测试结合亲和力。通过构建次级文库并从中重新选择而实现的亲和力成熟已经描述在，例如，hoogenboom,h.r.等人，methodsinmolecularbiology178：1-37(2002)1-37。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易出错的pcr、链改组或寡核苷酸-指导的诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后建立次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及hvr-指导的方案，其中将几个hvr残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以特别地鉴定参与抗原结合的hvr残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别地经常靶向cdr-h3和cdr-l3。在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以出现在一个或多个hvr内部，只要这类改变不实质上降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在hvr中做出不实质上降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文中提供的保守取代)。这类改变可以在hvr“热点”或sdr的外部。在上文提供的变体vh和vl序列的某些实施方案中，每个hvr未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如cunningham,b.c.和welis,j.a.science，244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基诸如arg、asp、his、iys和glu)，并且用中性的或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始取代显示出功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。备选地或额外地，可以使用抗原-抗体复合体的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除这类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。氨基酸序列插入包括长度在从1个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n-端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的n-或c-端与酶(例如针对adept的酶)或增加所述抗体的血清半寿期的多肽的融合体。b)糖基化变体在某些实施方案中，改变本文报道的方法中使用的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而产生或移除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现对抗体添加或缺失糖基化位点。在抗体包含fc区的情况下，可以改变与之连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双天线寡糖，所述寡糖通常借助n-键连接至fc区的ch2结构域的asn297。参见，例如，wright,a.和morrison,s.l.,tibtech15(1997)26-32。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线寡糖结构的“茎部”中的glcnac连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明的抗体中的寡糖以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。在一个实施方案中，使用具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺少与fc区(直接地或间接地)连接的岩藻糖。例如，这类抗体中岩藻糖的量可以是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过maldi-t0f质谱法(例如，如wo2008/077546中所述)所测量的与asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内在asn297处的岩藻糖的平均量。asn297表示位于fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(fc区残基的eu编号)；但是，由于抗体中的微小序列变异，asn297也可以位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸附近，即，在位置294和300之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有改善的adcc功能。参见，例如，us2003/0157108；us2004/0093621。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖-缺陷型”抗体变体相关的出版物的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；0kazaki,a.等人，j.mol.biol.336(2004)1239-1249；yamane-ohnuki,n.等人，biotech.bioeng.87(2004)614-622。能够生产去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白岩藻糖基化缺陷型的lec13cho细胞(ripka,j.等人，arch.biochem.biophys.249(1986)533-545；us2003/0157108；和wo2004/056312，特别在实施例11)，和敲除的细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因fut8敲除的cho细胞(参见，例如，yamane-ohnuki,n.等人，biotech.bioeng.87(2004)614-622；kanda,y.等人，biotechnol.bioeng.94(2006)680-688；和wo2003/085107)。可用于如本文报道的方法中的抗体变体可具有双分的寡糖，例如，其中与抗体的fc区连接的双天线寡糖由glcnac对分。这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的adcc功能。这样的抗体变体的例子例如描述在wo2003/011878；us6,602,684；和us2005/0123546。具有与fc区连接的、在寡糖中的至少一个半乳糖残基的抗体变体也可以在如本文报道的方法中使用。这样的抗体变体可以具有改善的cdc功能。这样的抗体变体例如描述在wo1997/30087；wo1998/58964；和wo1999/22764。c)fc区变体在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文报道的方法中使用的抗体的fc区中，由此产生fc区变体。该fc区变体可以包含人fc区序列(例如，人igg1,、igg2、igg3或igg4fc区)，所述人fc区序列包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如，取代)。在某些实施方案中，如本文报道的方法中使用了拥有一些但并非全部效应子功能的抗体变体，其使所述抗体变体成为下述应用的合乎需要的候选物:其中抗体的体内半寿期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和adcc)是不必要的或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定以证实cdc和/或adcc活性的降低/耗尽。例如，可以实施fc受体(fcr)结合测定以确保抗体缺少fcγr结合(因此可能缺少adcc活性)，但是保留fcrn结合能力。用于介导adcc的原代细胞(nk细胞)仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。ravetch,j.v.和kinet,j.p.，annu.rev.immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的fcr表达。评估目标分子的adcc活性的体外测定的非限制性例子描述在us5,500,362(参见，例如hellstrom,i.等人，proc.natl.acad.sci.usa83(1986)7059-7063)和hellstrom,i.等人，proc.natl.acad.sci.usa82(1985)1499-1502；us5,821,337(参见bruggemann，m.等人，j.exp.med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞测定术的actitm非放射性的细胞毒性测定(celltechnology,inc.mountainview，ca；和非放射性的细胞毒性测定(promesa，madison，wi)。用于这样的测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和天然杀伤(nk)细胞。备选地或额外地，可以在体内评估目标分子的adcc活性，例如，在动物模型中，诸如在clynes,r.等人，proc.natl.acad.sci.usa95(1998)652-656公开的动物模型中。也可以实施clq结合测定以证实抗体不能结合clq且因此缺少cdc活性。参见，例如，wo2006/029879和wo2005/100402中的clq和c3c结合elisa。为了评估补体激活，可以进行cdc测定(参见，例如，gazzano-santoro,h.等人，j.immunol.methods202(1996)163-171；cragg，m.s.等人，blood101(2003)1045-1052；和cragg，m.s.和m.j.glennie，blood103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法执行fcrn结合和体内清除率/半寿期确定(参见，例如，petkova，s.b.等人，int.immunol.18(2006)1759-1769)。具有减少的效应子功能的抗体包括具有fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(us6,737,056)。这样的fc突变体包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处的取代的fc突变体，包括将残基265和297取代成丙氨酸的所谓的“dana”fc突变体(us7,332,581)。描述了具有改善的或减少的与fcr的结合的某些抗体变体。(参见，例如，us6,737,056；wo2004/056312和shields,r.l.等人，j.biol.chem.276(2001)6591-6604。)在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善adcc的一个或多个氨基酸取代(例如，在fc区的位置298、333和/或334(残基的eu编号)处的取代)的fc区。在某些实施方案中，在fc区中做出改变，其导致改变的(即，提高的或减少的)clq结合和/或补体依赖性的细胞毒性(cdc)，例如，如在us6,194,551、wo99/51642和idusogie,e.e.等人，j.immunol.164(2000)4178-4184中所述。在us2005/0014934a1中描述了具有增加的半寿期和提高的与新生fc受体(fcrn)的结合的抗体，所述新生fc受体负责母亲igg向胎儿的转移(guyer,r.l.等人，j.immunol.117(1976)587-593和kim,j.k.等人，j.immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的fc区，所述取代改善fc区与fcrn的结合。这样的fc变体包括在一个或多个fc区残基：238、252、253、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有取代的那些，例如fc区残基434的取代(us7,371,826)。关于fc区变体的其它例子，也参见duncan,a.r.和winter,g.，nature322(1988)738-40；us5,648,260；us5,624,821；和wo94/29351。d)半胱氨酸工程改造的抗体变体在某些实施方案中，可能合乎需要的是，建立半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“硫代mab”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在抗体的可到达位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此使反应性巯基位于抗体的可到达位点处并且可以用于将抗体缀合至其它部分(诸如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代以下残基中的任何一个或多个：轻链的v205(kabat编号)；重链的a118(eu编号)；和重链fc区的s400(eu编号)。可以如例如us7,521,541中所述产生半胱氨酸工程改造的抗体。e)抗体衍生物在某些实施方案中，可以进一步修饰如本文报道的方法中使用的抗体以含有本领域已知的且容易得到的额外非蛋白性部分。适合用于衍生化抗体的部分包括、但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括、但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、亚乙基/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。由于它在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点。所述聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定:包括、但不限于待改善的抗体的特定特性或功能，抗体衍生物是否将用在确定条件下的疗法中等。在另一个实施方案中，可以在如本文报道的方法中使用抗体和非蛋白性部分的缀合物，所述非蛋白性部分可以通过暴露于辐射而选择性地加热。在一个实施方案中，非蛋白性部分是碳纳米管(kam,n.w.等人，proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。所述辐射可以具有任何波长，并且包括、但不限于这样的波长：其不伤害普通细胞，但是其将非蛋白性部分加热至杀伤在抗体-非蛋白性部分附近的细胞的温度。iii.重组方法和组合物首先由kohler和milstein(nature256(1975)495-497)报道了产生单克隆抗体的方法。此后，已经报道了通过稳定地引入编码抗体的核酸(dna)来产生具有骨髓瘤细胞的重组抗体(参见oi等人，proc.natl.acad.sci.usa80(1983)6351-6355)。可以使用来自抗体产生细胞的常规方法分离和测序抗体的编码核酸(对于完整抗体或用于可变结构域)。分离后，可以将编码核酸置于一种或多种表达载体中。如果仅分离可变结构域的编码核酸，则表达载体还包含分别编码重链和/或轻链恒定区的核酸(参见例如us5,658,570)。表达载体可以转染到原核(大肠杆菌)或真核宿主细胞(cho、hek、bhk、sp2/0)中，否则它们不会分泌抗体。如果编码核酸衍生自展示文库，例如噬菌体展示文库，酵母展示文库或通常细胞表面展示文库，则可将其直接克隆到表达载体中。可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如us专利号4,816,567中所述。为了重组生产抗体，将编码抗体(例如，如上所述)的核酸分离，并将其插入到一种或多种载体中用以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法容易地对这样的核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。适用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文中所述的原核和真核细胞。例如，抗体可以在细菌中制备，尤其是在不需要糖基化和fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，us5,648,237、us5,789,199和us5,840,523。(也参见charlton,k.a.，methodsinmolecularbiology，第248卷(lo,b.k.c.(编)，humanapress，totowa，nj，2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以分离自可溶级分中的细菌细胞糊，并且可以被进一步纯化。除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而导致具有部分地或完全地人糖基化模式的抗体的生产。参见gerngross,t.u.，nat.biotech.22(2004)1409-1414，和li,h.等人，nat.biotech.24(2006)210-215。适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞的生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴别出众多可以与昆虫细胞结合使用的杆状病毒菌株，特别是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见，例如，us5,959,177、us6,040,498、us6,420,548、us7,125,978和us6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的plantibodi技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮培养的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是用sv40转化的猴肾cvl系(cos-7)；人胚肾系(293或293细胞，其描述在例如graham,f.l.等人，j.genvirol.36(1977)59-74中)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠塞尔托利细胞(tm4细胞，其描述在例如mather,j.p.，biol.reprod.23(1980)243-251中)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；水牛鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562)；tri细胞，其描述在例如mather,j.p.等人，annalsn.y.acad.sci.383(1982)44-68中；mrc5细胞；和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub,g.等人，proc.natl.acad.sci.usa77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系诸如y0、ns0和sp2/0。关于适合用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，yazaki,p.和wu,a.m.，methodsinmolecularbiology，第248卷(lo,b.k.c.(编)，humanapress，totowa，nj(2004)，第255-268页。iv.免疫缀合物在本发明的方法中，还可以使用免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的抗体，所述细胞毒性剂为例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素或其片段)，或者放射性同位素。在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(adc)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(参见us5,208,020、us5,416,064和ep0425235b1)；他汀(auristatin)如单甲基他汀(monomethylauristatin)药物部分de和df(mmae和mmaf)(参见us5,635,483、us5,780,588和us7,498,298)；多拉司他汀；加利车霉素或其衍生物(参见us5,712,374、us5,714,586、us5,739,116、us5,767,285、us5,770,701、us5,770,710、us5,773,001和us5,877,296；hinman，l.m.等人，cancerres.53(1993)3336-3342；和lode，h.n.等人，cancerres.58(1998)2925-2928)；蒽环霉素如道诺霉素或多柔比星(参见kratz，f.等人，curr.med.chem.13(2006)477-523；jeffrey，s.c.等人，bioorg.med.chem.lett.16(2006)358-362；torgov，m.y.等人，bioconjug.chem.16(2005)717-721；nagy，a.等人，proc.natl.acad.sci.usa97(2000)829-834；dubowchik，g.m.等人，bioorg.&med.chem.letters12(2002)1529-1532；king，h.d.等人，j.med.chem.45(2002)4336-4343；和us专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷类如多西紫杉醇，紫杉醇，拉罗他赛，替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)等；单端孢霉烯；和cc1065。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，包括但不限于白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)a链、相思豆毒蛋白(abrin)a链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)a链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(trichothecenes)。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。有多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括at211,i131,i125,y90,re186,re188,sm153,bi212,p32,pb212和lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包括用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如tc99m或i123，或用于核磁共振(nmr)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，mri)，例如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备，例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)，琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)，亚氨基硫烷(it)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二酸酯)，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛(如戊二醛)，双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双重氮化物衍生物(如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯。例如，可以如vitetta，e.s.等人，science238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见wo94/11026。接头可以是“可切割的接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸不稳定接头，肽酶敏感接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫键的接头(chari，r.v.等人，cancerres.52(1992)127-131；us5,208,020)。本文中的免疫缀合物或adc明确考虑但不限于用交联剂制备的这种缀合物，所述交联剂包括但不限于bmps,emcs,gmbs,hbvs,lc-smcc,mbs,mpbh,sbap,sia,siab,smcc,smpb,smph,sulfo-emcs,sulfo-gmbs,sulfo-kmus,sulfo-mbs,sulfo-siab,sulfo-smcc,和sulfo-smpb,和svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯),它们是可商购的(例如，来自piercebiotechnology，inc.，rockford，il，usa)。提供以下实施例，附图和序列以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求中阐述。应理解，可以在所述程序中进行修改而不背离本发明的精神。实施例方法电喷雾电离质谱(esi-ms)通过添加0.5μl的n-聚糖酶加(roche)和磷酸钠缓冲液(0.1m，ph7.1)使蛋白质等分试样(50μg)去糖基化，以获得115μl的最终样品体积。将混合物在37℃温育18h。然后为了还原和变性，加入在4m胍*hcl(pierce)和50μl8m胍*hcl中的60μl0.5mtcep(pierce)。将混合物在37℃温育30min。通过尺寸排阻层析法(sepharoseg-25，等度，40％乙腈和2％甲酸)使样品脱盐。在配备有纳米esi源(triversananomate，advion)的q-tof仪器(maxis，bruker)上记录esi质谱(+ve)。ms参数设置如下：转移：漏斗rf，400vpp；iscid能量，0ev；多极rf，400vpp；四极：离子能量，4.0ev；质量小，600m/z；来源：干燥气体，8l/min；干燥气体温度，160℃；碰撞室：碰撞能量，10ev；碰撞rf：2000vpp；离子冷却器：离子冷却器rf，300vpp；转移时间：120μs；预脉冲存储，10μs；扫描范围m/z600至2000。对于数据评估，使用内部开发的软件(massanalyzer)。fcrn表面等离振子共振(spr)分析使用biacoret100仪器(biacoreab，uppsala，sweden)通过表面等离振子共振(spr)技术分析野生型抗体和突变体与fcrn的结合特性。该系统已成熟用于分子相互作用的研究。它允许连续实时监测配体/分析物结合，从而确定各种测定设置中的动力学参数。spr技术是基于接近金涂覆的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的变化表明由固定化配体与溶液中注入的分析物的相互作用引起的表面质量变化。如果分子与表面上的固定配体结合，则质量增加，在解离的情况下则质量减少。在当前测定中，通过胺偶联将fcrn受体固定在biacorecm5-生物传感器芯片(gehealthcarebioscience，uppsala，sweden)上至400响应单位(ru)的水平。在室温下用pbs，0.05％tween20ph6.0(gehealthcarebioscience)作为运行和稀释缓冲液进行测定。在室温下以50μl/min的流速注射200nm天然或氧化抗体样品。缔合时间为180s，解离期为360s。通过短时间注射hbs-p，ph8.0达到芯片表面的再生。通过比较注射后180s秒和注射后300s的生物应答信号高度来进行spr数据的评估。相应的参数是ru最大水平(注射后180s)和晚期稳定性(注射结束后300s)。实施例1单链c1q融合多肽的表达将含有六组氨酸标签多肽的澄清上清液在4℃加载到ni-nta亲和层析树脂(qiagen，hanbrechtikon，switzerland)上。在各自用含有300mmnacl，ph7.4以及含有20mm咪唑的20mm磷酸钠缓冲液洗涤步骤后，在explorer100层析系统(gehealthcarelifesciences，uppsala，sweden)上，使用含有100mm或300mm咪唑的相同缓冲液以3ml/min的流速用分批洗脱洗脱多肽。根据ce-sds(labchipgx，caliper)在变性和还原条件下合并级分，使用amiconultra-15(merckmillipore)浓缩，并对调节至ph7.4的含有500mmnacl的50mm磷酸钠缓冲液透析。使用nanodrop分光光度计(nanodroptechnologies，wilmington，de)定量经纯化的多肽，通过ce-sds(labchipgx，caliper)分析并储存在-80℃。实施例2c1q亲和柱的制备在含有125mmnacl和0.02％tween，调节至ph7.2，并在3mlpbs中补充1片完全蛋白酶抑制剂(completeultratablets，rochediagnosticsgmbh，mannheim，germany)的2mmmops缓冲液中的具有avi标签的单链c1q融合多肽，使用来自avidity的生物素化试剂盒，根据制造商的说明书(bulkbira，avidityllc，denver，co，usa)进行生物素化。生物素化反应在室温下进行过夜。为了分离连接酶，重复ni-sepharose层析(见上文)。将修饰的多肽针对包含500mmnacl，ph7.2的50mm磷酸钠缓冲液在4℃透析过夜以除去咪唑。将1克链霉抗生物素蛋白琼脂糖凝胶(gehealthcare)加入到生物素化和透析的多肽中(对于标准分析应用，选择3mgc1q)并振荡温育2小时。将受体衍生的琼脂糖填充到1mltricorn5/50柱(gehealthcare)中。实施例3使用c1q亲和柱进行层析将受体衍生的琼脂糖填充到1mltricorn5/50柱(gehealthcare)中，然后将c1q柱用20mmhepes(ph7.4)平衡。条件：柱尺寸：50mmx5mm床高：50mm上样：30μg蛋白质/样品流速：0.5ml/min平衡缓冲液：20mmhepes，ph7.4洗脱缓冲液：20mmhepes，500mmnacl，ph7.4洗脱：10cv平衡缓冲液，30cv至40％洗脱缓冲液，5cv至100％洗脱缓冲液将含有30μg分析物(抗体或包含fc-区的融合多肽)的样品调节至ph5.5并使用hplc-system10advp(shimadzu，duisburg，germany)或ultimate3000(thermofisherscientific，dreieich，germany)施用至c1q柱。然后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液(20mmhepes，ph7.4)洗涤具有50mm床高的柱。用盐梯度洗脱亲和结合的分析物至30mm柱体积内的20mmhepes，500mmnacl，ph7.4(洗脱缓冲液)。为了完全洗脱，盐浓度在梯度中增加至100％洗脱缓冲液。实验在室温下进行。通过连续测量280nm处的吸光度获得洗脱曲线。在样品注射后，分析物峰x到达检测器所需的时间称为保留时间。实施例4使用c1q的spr测定使用biacoret200仪器(biacoreab，uppsala，sweden)通过表面等离振子共振(spr)技术分析野生型抗体和突变体对c1q的结合特性。该系统已成熟用于分子相互作用的研究。它允许连续实时监测配体/分析物结合，从而确定各种测定设置中的动力学参数。spr技术是基于接近金涂覆的生物传感器芯片表面的折射率的测量。折射率的变化表明由固定化配体与溶液中注入的分析物的相互作用引起的表面质量变化。如果分子与表面上的固定配体结合，则质量增加，在解离的情况下则质量减少。在当前测定中，通过生物素capture试剂将c1q分子固定在biacore生物传感器芯片(gehealthcarebioscience，uppsala，sweden)上。c1q已经耦合到6000响应单元(ru)的水平。在室温下用pbs，0.05％tween20ph6.0(gehealthcarebioscience)作为运行和稀释缓冲液进行测定。在室温下以50μl/min的流速注入样品。缔合时间为100s，解离期为240s。通过biotincapturekit的供应商再生试剂盒进行再生。通过比较注射后100秒的生物反应信号高度来进行spr数据的评估。相应的参数是ru水平(注射后100s)。作为样品，使用wt-igg1抗体(500nm)和抗独特型fab复合抗体。各自的传感图在图6中示出。可以看出，使用本文所用的c1q配体，fab-复合体igg的结合是可能的。当前第1页12当前第1页12