治疗癌症的方法与流程

本申请一般涉及癌症治疗领域。更具体地，本申请涉及用于治疗癌症的组合疗法。

背景技术：

癌症的有效治疗仍然是临床医生面临的一项巨大挑战。化学治疗剂，例如核苷酸类似物化学治疗剂(如氟尿嘧啶)一直是癌症化疗的支柱。然而，很难提供一定剂量的此类药剂，以平衡其对癌症的高效性，同时避免患者中的严重不良事件。此外，癌症对化学治疗剂的抗性(“化学耐药性”)的发展使得其使用更成问题。因此，本领域对于可以增强化学治疗剂在癌症治疗中的治疗指数并尽可能降低或中和其化学耐药性的治疗方法存在持续的需求。

技术实现要素：

目前发现，核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂(如氟尿嘧啶)与某些用病毒载体表达的生物治疗剂(如γ-干扰素)的组合，协同诱导了可能通过多种细胞死亡途径的癌细胞的死亡。对于使用相同类型的化学治疗剂与纯化的γ-干扰素的组合治疗，也观察到类似的协同治疗效果。

值得注意的是，目前还发现核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂与半胱天冬酶抑制剂的组合诱导癌细胞死亡的水平增加。虽然不希望受理论的束缚，但人们认为对于半胱天冬酶依赖性细胞死亡的抑制或缺陷有效地导致向其他细胞死亡途径的“分流”，特别是坏死性凋亡，以响应本文所述的组合治疗中核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂(如氟尿嘧啶)的治疗。

因此，本文的一个方面提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中所述方法包含以下步骤：

(i)向人类受试者施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒；和

(ii)向人类受试者施用化学治疗剂，其中所述化学治疗剂是核苷酸类似物或核苷酸前体类似物。在一些实施方案中，所述方法进一步包含向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中所述方法包含以下步骤：

(i)向人类受试者施用化学治疗剂，其中所述化学治疗剂是核苷酸类似物或核苷酸前体类似物；和

(ii)向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中所述方法包含以下步骤：

(i)向人类受试者施用纯化的γ-干扰素；和

(ii)向人类受试者施用化学治疗剂，其中所述化学治疗剂是核苷酸类似物或核苷酸前体类似物。在一些实施方案中，所述方法还包含向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

在一些优选实施方案中，当施用半胱天冬酶抑制剂时，所述半胱天冬酶抑制剂是emricasan、pralnacasan、vx-799、vx-765或ncx-1000。

在一些实施方案中，任何上述方法中的所述核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂选自氟尿嘧啶(fluorouracil)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、恩曲他滨(emtricitabine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、奈拉滨(nelarabine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)。在一些优选实施方案中，待施用的所述核苷酸类似物化学治疗剂是氟尿嘧啶。

在一些实施方案中，所施用的化学治疗剂的剂量避免在人类受试者中引起超过中度的不良事件。在一些实施方案中，当向全身施用时，所述核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的剂量为约0.01mg/kg至约5mg/kg。在其他实施方案中，当向局部施用时，所述核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的剂量使局部用制剂中包含的化学治疗剂浓度达到约0.02％(w/v)至约2％(w/v)。在一些实施方案中，当向病灶内施用时，核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的剂量为约0.02mg/病灶至约10mg/病灶。

在一些实施方案中，待施用的重组病毒是重组dna病毒。在一些实施方案中，所述重组dna病毒是腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)或慢病毒。在一些优选实施方案中，所述重组dna病毒是腺病毒或慢病毒。在一个更优选实施方案中，所述重组dna病毒是腺病毒。在一个优选实施方案中，所述重组腺病毒是asn-002。

在其他实施方案中，所施用的重组病毒是重组rna病毒。在一些实施方案中，所述重组rna病毒是甲病毒属、黄病毒属、副粘病毒属、弹状病毒属或正粘病毒属。在一些优选实施方案中，所述黄病毒属是昆津(kunjin)病毒。

在一些实施方案中，当所述治疗方法包含施用重组病毒时，所述重组病毒具有靶向性。在一些实施方案中，所施用的重组病毒的一种或多种生物治疗剂的表达由靶选择性启动子或诱导型启动子驱动。

在一些实施方案中，当所述治疗方法包含施用表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒时，所述生物治疗剂包含细胞因子、调节凋亡性细胞死亡的蛋白质、调节坏死性细胞死亡的蛋白质、调节依赖性程序性(parthanatos)细胞死亡的蛋白质或调节自噬性细胞死亡的蛋白质中的一种或多种。

在一些优选实施方案中，所表达的生物治疗剂是细胞因子。在一些实施方案中，所表达的细胞因子是γ-干扰素、α-干扰素、tnfα或trail。在一些优选实施方案中，所表达的细胞因子是γ-干扰素。

在一些实施方案中，任何上述治疗方法可以进一步包含向人类受试者施用一种或多种免疫应答诱导剂或增强剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫应答诱导剂包含(i)纯化的极化细胞因子或纯化的趋化因子，和(ii)纯化的促炎剂。在一些实施方案中，所述纯化的极化细胞因子选自il-12、il-15、il-18、il-21、il-23和il-27。在一些实施方案中，所述纯化的趋化因子选自cxcl1、ccl25和ccl27。在一些实施方案中，所述纯化的促炎剂是巨大戟醇甲基丁烯酸酯。在其他实施方案中，所述纯化的促炎剂包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，所述tlr激动剂选自polyi:c、polya:u、脂多糖、甘露聚糖、cpg、瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)和glycoinositolphospholipids。

在一些实施方案中，所述治疗方法中的施用为分开进行。在其他实施方案中，包含核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的药物组合物的施用包含：(i)化学治疗剂和(ii)重组病毒、半胱天冬酶抑制剂或纯化的γ-干扰素中的一种或多种。

在一些优选实施方案中，待治疗的受试者患有选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌中的一种癌症。在一些优选实施方案中，待治疗的癌症是基底细胞癌或鳞状细胞癌。

在一些实施方案中，待治疗的受试者患有包含半胱天冬酶依赖性细胞死亡途径缺陷的细胞的癌症。在一些实施方案中，所述半胱天冬酶依赖性细胞死亡途径缺陷的癌细胞缺乏半胱天冬酶或fadd的表达或功能。

在其他实施方案中，所述癌症包含坏死性细胞死亡途径缺陷的细胞。在一些实施方案中，所述坏死性细胞死亡途径缺陷的癌细胞缺乏ripk1、ripk3或mlkl的表达或功能。

在任何上述治疗方法的一些实施方案中，待治疗的人类受试者在治疗之前经鉴定患有对一种或多种化学治疗剂单独治疗抗药或耐受的癌症。

在一些实施方案中，任何上述方法包含在第一次施用步骤之前确定待治疗的受试者患有对化学治疗剂单独治疗抗药或耐受的癌症的可能性的步骤。在一些实施方案中，确定癌症对一种或多种化学治疗剂单独治疗抗药或耐受的可能性的步骤包含确定癌症是否包含凋亡性细胞死亡途径缺陷或坏死性细胞死亡途径缺陷的细胞。

本文的一个相关方面提供了在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的另一相关方面提供了核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。

本文的另一方面提供了半胱天冬酶抑制剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了纯化的γ-干扰素在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用纯化的γ-干扰素。

本文的另一方面提供了一种应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒，其中所述人类受试者已经或将被施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂，其中所述人类受试者已经或将被施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。

本文的另一方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的半胱天冬酶抑制剂，其中所述人类受试者已经或将被施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂，其中所述人类受试者已经或将被施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的纯化的γ-干扰素，其中所述人类受试者已经或将被施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂，其中所述人类受试者已经或将被施用γ-干扰素。

本文的另一方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组表达病毒；和

(ii)核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的另一方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)半胱天冬酶抑制剂；和

(ii)核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的另一方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)纯化的γ-干扰素；和

(ii)核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

在上述药物组合物的优选实施方案中，所述药物组合物中提供的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的剂量避免在人类受试者中引起超过中度的不良事件。在一些优选实施方案中，待治疗的癌症选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌。在一些优选实施方案中，待治疗的癌症是基底细胞癌或鳞状细胞癌。

在一些实施方案中，上述药物组合物还包含控释基质。在一些实施方案中，所述控释基质包含sio2基质凝胶。

在一些优选实施方案中，所述核苷酸类似物化学治疗剂是氟尿嘧啶。

目前还发现，除了核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂之外的化学治疗剂(如曲贝替定)与某些用病毒载体表达的生物治疗剂(如纯化的γ-干扰素)的组合，协同诱导了可能通过多种细胞死亡途径的癌细胞的死亡。对于使用相同类型的化学治疗剂与纯化的γ-干扰素的组合治疗，也观察到类似的协同治疗效果。

值得注意的是，目前还发现非核苷酸类似物化学治疗剂与半胱天冬酶抑制剂的组合诱导癌细胞死亡的水平增加。虽然不希望受理论的束缚，但人们认为对于半胱天冬酶依赖性细胞死亡的抑制或缺陷有效地导致向其他细胞死亡途径的“分流”，特别是坏死性凋亡，以响应本文所述的组合治疗中核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂(如氟尿嘧啶)的治疗。

本文的另一方面提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中所述方法包含以下步骤：

(i)向人类受试者施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒；和

(ii)向人类受试者施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂以外的化学治疗剂。在一些实施方案中，所述方法还包含向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中所述方法包含以下步骤：

(i)向人类受试者施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂以外的化学治疗剂；和

(ii)向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中所述方法包含以下步骤：

(i)向人类受试者施用纯化的γ-干扰素；和

(ii)向人类受试者施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂以外的化学治疗剂。在一些实施方案中，所述方法还包含向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

在一些优选实施方案中，当要施用半胱天冬酶抑制剂时，所述的半胱天冬酶抑制剂是emricasan、pralnacasan、vx-799、vx-765或ncx-1000。

在任何上述方法的一些实施方案中，所述化学治疗剂选自dna结合剂、第二线粒体衍生的半胱天冬酶活化剂(smac)模拟物、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、核苷类似物、蛋白酶体抑制剂和聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂。在任何上述方法的一些优选实施方案中，所述化学治疗剂是曲贝替定或biranapant。在其他优选实施方案中，所述化学治疗剂是曲贝替定。

在一些实施方案中，所施用的化学治疗剂的剂量避免在人类受试者中引起超过中度的不良事件。

在一些实施方案中，所施用的重组病毒是重组dna病毒。在一些实施方案中，所述重组dna病毒是腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)或慢病毒。在一些优选实施方案中，所述重组dna病毒是腺病毒或慢病毒。

在其他实施方案中，所施用的重组病毒是重组rna病毒。在一些实施方案中，所述重组rna病毒是甲病毒属、黄病毒属、副粘病毒属、弹状病毒属或正粘病毒属。在一些优选实施方案中，所述黄病毒属是昆津病毒。

在一些实施方案中，当所述治疗方法包含施用重组病毒时，所述重组病毒具有靶向性。在一些实施方案中，所施用的重组病毒的一种或多种生物治疗剂的表达由靶选择性启动子或诱导型启动子驱动。

在一些实施方案中，当所述治疗方法包含施用表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒时，所述生物治疗剂包含细胞因子、调节凋亡性细胞死亡的蛋白质、调节坏死性细胞死亡的蛋白质、调节依赖性程序性(parthanatos)细胞死亡的蛋白质或调节自噬性细胞死亡的蛋白质中的一种或多种。

在一些实施方案中，所表达的细胞因子是γ-干扰素、α-干扰素、tnfα或trail。在一些优选实施方案中，所表达的细胞因子是γ-干扰素。

在一些实施方案中，任何上述治疗方法可以进一步包含向人类受试者施用一种或多种免疫应答诱导或增强剂。在一些实施方案中，一种或多种免疫应答诱导剂包含(i)纯化的极化细胞因子或纯化的趋化因子，和(ii)纯化的促炎剂。在一些实施方案中，所述纯化的极化细胞因子选自il-12、il-15、il-18、il-21、il-23和il-27。在一些实施方案中，所述纯化的趋化因子选自cxcl1、ccl25和ccl27。在一些实施方案中，所述纯化的促炎剂是巨大戟醇甲基丁烯酸酯。在其他实施方案中，所述纯化的促炎剂包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，所述tlr激动剂选自polyi:c、polya:u、脂多糖、甘露聚糖、cpg、瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)和glycoinositolphospholipids。

在一些实施方案中，所述治疗方法中的施用为分开进行。在其他实施方案中，包含化学治疗剂的药物组合物的施用包含：(i)化学治疗剂和(ii)重组病毒、半胱天冬酶抑制剂或纯化的γ-干扰素中的一种或多种。

在一些优选实施方案中，待治疗的受试者患有选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌中的一种癌症。

在一些实施方案中，待治疗的受试者患有包含半胱天冬酶依赖性细胞死亡途径缺陷的细胞的癌症。在一些实施方案中，所述半胱天冬酶依赖性细胞死亡途径缺陷的癌细胞缺乏半胱天冬酶或fadd的表达或功能。

在其他实施方案中，所述癌症包含坏死性细胞死亡途径缺陷的细胞。在一些实施方案中，所述坏死性细胞死亡途径缺陷的癌细胞缺乏ripk1、ripk3或mlkl的表达或功能。

在任何上述治疗方法的一些实施方案中，待治疗的人类受试者在治疗之前经鉴定患有对一种或多种化学治疗剂单独治疗抗药或耐受的癌症。

在一些实施方案中，任何上述方法包含在第一次施用步骤之前确定待治疗的受试者是否患有对化学治疗剂单独治疗抗药或耐受的癌症的步骤。在一些实施方案中，确定癌症是否对一种或多种化学治疗剂单独治疗抗药或耐受的步骤包含确定癌症是否包含凋亡性细胞死亡途径缺陷或坏死性凋亡细胞死亡途径缺陷的细胞。

本文的一个相关方面提供了在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的另一相关方面提供了除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。

本文的另一方面提供了半胱天冬酶抑制剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了除非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了纯化的γ-干扰素在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了除非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂在制备用于治疗人类受试者所患癌症的药物中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用纯化的γ-干扰素。

本文的另一方面提供了一种在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒在用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的应用，其中所述人类受试者已经或将被施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂，其中所述人类受试者已经或将被施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。

本文的另一方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的半胱天冬酶抑制剂，其中所述人类受试者已经或将被施用非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂，其中所述人类受试者已经或将被施用半胱天冬酶抑制剂。

本文的另一方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的纯化的γ-干扰素，其中所述人类受试者已经或将被施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。

本文的一个相关方面提供了应用于治疗人类受试者所患癌症的方法中的除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂，其中所述人类受试者已经或将被施用γ-干扰素。

本文的另一方面供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组表达病毒；和

(ii)除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。在一些实施方案中，一种或多种表达的生物治疗剂包含细胞因子。在一些实施方案中，所表达的细胞因子是γ-干扰素、α-干扰素、tnfα或trail。在一些优选实施方案中，表达的细胞因子是γ-干扰素。在一些优选实施方案中，所述药物组合物中的非核苷酸类似物化学治疗剂是曲贝替定或birinapant。在其他优选实施方案中，所述药物组合物中的化学治疗剂是曲贝替定。

本文的另一方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含：

(i)半胱天冬酶抑制剂；和

(ii)除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。

本文的另一方面提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含：

(i)纯化的γ-干扰素；和

(ii)除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。

在任何上述药物组合物的优选实施方案中，所述药物组合物中化学治疗剂的施用剂量避免在人类受试者中引起超过中度的不良事件。

在一些实施方案中，上述药物组合物还包含控释基质。在一些实施方案中，所述控释基质包含sio2基质凝胶。

本文还包含本申请中单独或共同公开或暗示的步骤、特征、整数、组合物和/或治疗剂，以及任何两种或更多种所述步骤或特征的组合。

除非另外特别说明，否则本文的任何实施方案应根据实际情况做出适当变动。

本发明不限于本中所述的具体实施方案的范围，这些实施方案仅用于举例说明本文的目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然包含在本发明的范围内。

在整个说明书中，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则提及单一步骤、物质组合物、步骤组合或物质组合物的组合应包括一个和数个(例如一个或多个)这些步骤、物质组合物、步骤组合或物质组合物的组合。

下文通过以下非限制性实施例并参见附图描述本发明。

附图说明

图1为用于诱导helarip3⁺和helarip^-细胞中细胞死亡的病毒剂量的asn-002滴定。线性图显示在三种不同的感染复数(moi)条件下，五天过程中用表达γ-干扰素(γ-ifn)的复制缺陷型重组腺病毒(asn-002)转导培养的hela(rip3^-)“hela-rip3”(rip3⁺)细胞中诱导的细胞死亡。(a)moi:10；(b)moi:100；(c)moi:1000。

图2为氟尿嘧啶诱导helarip3⁺和helarip^-细胞中细胞死亡的剂量响应。线性图显示培养的“hela”(rip3^-)和“hela-rip3”(rip3⁺)细胞在氟尿嘧啶中暴露培养48小时后，化学治疗剂氟尿嘧啶在其中诱导细胞死亡的剂量响应。

图3为细胞因子tnfα诱导rip3⁺中细胞凋亡非依赖性细胞死亡，但不诱导rip3^-hela细胞。条形图说明在凋亡性细胞死亡抑制剂存在下，tnfα在具有坏死性凋亡能力的hela细胞，培养的“hela-rip3”(rip3⁺)中诱导细胞死亡，但在相同的凋亡抑制剂存在下，其不在坏死性凋亡缺陷的hela细胞，“hela”(rip3^-)中诱导。

图4为使用低剂量氟尿嘧啶加低moi的表达γ-干扰素的复制缺陷型重组腺病毒(asn002)治疗rip3^-hela细胞协同诱导了细胞死亡。线性图说明暴露48小时后单独使用氟尿嘧啶、单独使用asn-002或氟尿嘧啶加asn-002的组合治疗在培养的rip3^-hela细胞中所诱导的细胞死亡。(a)将氟尿嘧啶和asn-002同时加入细胞中。(b)使用asn-002转导4小时后将氟尿嘧啶加入细胞中。组合治疗导致细胞死亡显著高于单独治疗所导致的细胞死亡，或基于单独治疗所导致的细胞死亡总和的预期细胞死亡。

图5为在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，氟尿嘧啶加adcmv(对照)和氟尿嘧啶加asn-002，在rip3⁺hela细胞中的组合治疗。条形图说明在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，(a)氟尿嘧啶加adcmv对照腺病毒；和(b)表达γ-ifn的氟尿嘧啶加asn-002腺病毒，在rip3⁺(具有坏死性凋亡能力)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图6为在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，asn-002腺病毒载体表达的γ-ifn或外源γ-ifn，在rip3⁺hela细胞中的治疗。条形图说明在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在的情况下，(a)adcmv对照腺病毒；(b)表达γ-ifn的asn-002腺病毒；和(c)纯化的γ-ifn，在rip3⁺(具有坏死性凋亡能力)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图7为在凋亡性细胞死亡抑制剂存在下，氟尿嘧啶加asn-002或纯化的γ-ifn，在rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞中的组合治疗。条形图说明在泛半胱天冬酶细胞凋亡抑制剂存在下，(a)氟尿嘧啶单独；(b)氟尿嘧啶加adcmv对照腺病毒；(c)氟尿嘧啶加表达γ-ifn的asn-002腺病毒；和(d)氟尿嘧啶加纯化的γ-ifn，在rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图8为在凋亡性细胞死亡抑制剂存在下，asn-002腺病毒载体表达的γ-ifn或纯化的γ-ifn，在rip3^-hela细胞中的治疗。条形图说明在泛半胱天冬酶细胞凋亡抑制剂存在下，(a)adcmv对照腺病毒；(b)表达γ-ifn的asn-002腺病毒和；(c)纯化的γ-ifn，在rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图9为birinapant在helarip3⁺和helarip^-细胞中诱导细胞死亡的剂量响应。线性图显示培养的“hela”(rip3^-)和“hela-rip3”(rip3⁺)细胞在指定浓度中暴露培养48小时后，化学治疗剂birinapant在其中诱导细胞死亡的剂量响应。

图10为曲贝替定在helarip3⁺和helarip^-细胞中诱导细胞死亡的剂量反应。线性图显示培养的“hela”(rip3^-)和“hela-rip3”(rip3⁺)细胞在指定浓度中暴露培养48小时后，化学治疗剂曲贝替定在其中诱导细胞死亡的剂量响应。

图11为顺铂在helarip3⁺和helarip^-细胞中诱导细胞死亡的剂量反应。线性图显示培养的“hela”(rip3^-)和“hela-rip3”(rip3⁺)细胞在指定浓度中暴露培养48小时后，化学治疗剂顺铂在其中诱导细胞死亡的剂量响应。

图12为细胞因子tnfα诱导rip3⁺中细胞凋亡非依赖性细胞死亡，但不诱导rip3^-hela细胞。条形图说明在凋亡性细胞死亡抑制剂存在下，tnfα在具有坏死性凋亡能力的hela细胞，培养的“hela-rip3”(rip3⁺)中诱导细胞死亡，但在相同的凋亡抑制剂存在下，不在坏死性凋亡缺陷的hela细胞，“hela”(rip3^-)中诱导。

图13为使用低剂量的birinapant加低moi的表达γ-干扰素的复制缺陷型重组腺病毒(asn002)治疗rip3^-hela细胞协同诱导了细胞死亡。线性图说明在暴露48小时后单独使用birinapant、单独使用asn-002或birinapant加asn-002的组合治疗在培养的rip3^-hela细胞中所诱导的细胞死亡。(a)将birinapant和asn-002同时加入细胞中。(b)使用asn-002转导4小时后将birinapant加入细胞中。组合治疗导致细胞死亡显著高于单独治疗所导致的细胞死亡，或基于单独治疗所导致的细胞死亡总和的预期细胞死亡。

图14为使用低剂量的曲贝替定加低moi的表达γ-干扰素的复制缺陷型重组腺病毒(asn-002)治疗rip3^-hela细胞协同诱导了细胞死亡。线性图说明单独使用曲贝替定、单独使用asn-002或曲贝替定加asn-002的组合治疗在培养的rip3^-hela细胞中所诱导的细胞死亡。(a)在暴露48小时后，将曲贝替定和asn-002同时加入细胞中。(b)使用asn-002转导后4小时后将曲贝替定加入细胞中。组合治疗导致细胞死亡显著高于单独治疗所导致的细胞死亡，或基于单独治疗所导致的细胞死亡总和的预期细胞死亡。

图15为使用低剂量顺铂加低moi的表达γ-干扰素的复制缺陷型重组腺病毒(asn002)治疗rip3^-hela细胞不能协同诱导细胞死亡。线性图说明在暴露48小时后单独使用顺铂、单独使用asn-002或顺铂加asn-002的组合治疗在培养的rip3^-hela细胞中所诱导的细胞死亡。与仅用顺铂或asn-002治疗相比，联合治疗不会显著诱导更多的细胞死亡。

图16为rip3^-hela细胞中的组合治疗的协同作用(birinapant加asn-002)取决于来自asn-002腺病毒载体的γ-ifn的表达。线性图说明通过使用以下物质治疗hela(rip3^-)细胞48小时所诱导的细胞死亡：(a)birinapant(5μm或30μm)加不表达γ-ifn的对照腺病毒(adcmv)；(b)birinapant(5μm或30μm)加表达γ-ifn的asn-002腺病毒；(c)birinapant(5μm或30μm)加浓度为10ng/ml的纯化的γ-ifn。birinapant与表达γ-ifn或表达纯化的γ-ifn的asn-002的组合治疗导致了相较于单独使用单一药剂治疗所导致显著更大的细胞死亡。相比之下，使用birinapant与不表达γ-ifn的对照腺病毒的组合治疗诱导了与单独使用birinapant相同的细胞死亡水平，这表明在(b)和(c)中观察到的细胞死亡协同作用取决于γ-ifn的存在，而不是腺病毒本身的存在。

图17为在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，asn-002腺病毒载体表达的γ-ifn或外源γ-ifn，在rip3⁺hela细胞中的治疗。条形图说明在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，(a)adcmv对照腺病毒；(b)表达γ-ifn的asn-002腺病毒；和(c)纯化的γ-ifn，在rip3⁺(具有坏死性凋亡能力)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图18为在凋亡性细胞死亡抑制剂存在下，asn-002腺病毒载体表达的γ-ifn或外源γ-ifn，在rip3^-hela细胞中的治疗。条形图说明在泛半胱天冬酶细胞凋亡抑制剂存在下，(a)adcmv对照腺病毒；(b)表达γ-ifn的asn-002腺病毒；和(c)纯化的γ-ifn，在rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图19为在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，单独使用曲贝替定或曲贝替定加asn-002或加纯化的γ-ifn，在rip3⁺hela细胞中的组合治疗。条形图说明在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂存在下，(a)曲贝替定加adcmv对照腺病毒；(b)曲贝替定加表达γ-ifn的asn-002腺病毒；(c)单独使用曲贝替定；和(d)曲贝替定加纯化的γ-ifn，在rip3⁺(具有坏死性凋亡能力)hela细胞中诱导的细胞死亡。

图20-为在凋亡性细胞死亡抑制剂存在下，单独使用曲贝替定或曲贝替定加asn-002或加纯化的γ-ifn，在rip3^-hela细胞中的组合治疗。条形图说明在细胞凋亡抑制剂存在下，(a)单独使用曲贝替定；(b)曲贝替定加adcmv对照腺病毒；(c)曲贝替定加表达γ-ifn的asn-002腺病毒；和(d)曲贝替定加纯化的γ-ifn，在rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞中诱导的细胞死亡。

一般技术和定义

除非另有特别定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语应被认为与本领域技术人员通常的理解具有相同含义(例如，在细胞培养，细胞生物学，病毒载体构建，基因治疗，分子遗传学，癌症生物学，癌症治疗，免疫学，药理学，蛋白质化学和生物化学领域)。

除非另有说明，否则本文中使用的细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。以下文献中对这些技术进行了全面描述和解释，例如，j.perbal，apracticalguidetomolecularcloning，johnwileyandsons(1984)，j.sambrooketal.，molecularcloning:alaboratorymanual，coldspringharbourlaboratorypress(1989)，t.a.brown(editor)，essentialmolecularbiology:apracticalapproach，volumes1and2，irlpress(1991)，d.m.gloverandb.d.hames(editors)，dnacloning:apracticalapproach，volumes1-4，irlpress(1995and1996)，andf.m.ausubeletal.(editors)，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepub.associatesandwiley-interscience(1988，includingallupdatesuntilpresent)，edharlowanddavidlane(editors)antibodies:alaboratorymanual，coldspringharbourlaboratory，(1988)，andj.e.coliganetal.(editors)currentprotocolsinimmunology，johnwiley&sons(包括迄今为止所有的更新)。

如本文中所用，除非另有说明，否则术语“约”表示指定值+/-10％，更优选+/-5％。

在整个说明书中，术语“包含”及其变式应被理解为包含所述元素、整数、步骤或元素组、整数组、步骤组，但不排除任何其他元素、整数、步骤或元素组、整数组、步骤组。

本申请中所使用的术语“或”旨在表示包含性的“或”而非排除性的“或”。即除非另有说明或上下文中明确指示，否则“x使用a或b”旨在表示任何自然的包含性序列。也就是说，如果x使用a；x使用b；或者x使用a和b两者，则“x使用a或b”满足前述任何情况。此外，a和b等中的至少一个通常表示a或b或a和b两者。此外，除非另有说明或上下文中明确指示为单数形式，否则本申请和权利要求书中使用的不定冠词“一”通常解释为“一个或多个”。

本文中所用的术语“不良事件”是指发生在受试者或患者中的任何不期望的临床事件(相比于受试者的基准健康状况)，并且是发生在患者中的任何非预期疾病或损伤或不良临床症状(包含异常的实验室检查结果)的不良医学事件。更具体地，本文中所提及的不良事件等级包含由美国国家癌症研究所公布的“不良事件的常用术语标准”(2010年6月14日的4.03版本)。其中包含1级：轻度不良事件，其表现为无需医疗干预的轻微症状；2级：中度不良事件，其需要较小、局部的或非侵入性的干预治疗；3级：严重或医学上显著不良事件，其不会立即危及生命，但可能需要住院治疗或延长住院时间；4级：危及生命且需要紧急干预治疗的不良事件；5级：不良事件相关的死亡。通常与癌症化学疗法相关的不良事件包含但不限于，疲劳、恶心、呕吐、腹泻、脱发、皮肤毒性(如皮疹、瘙痒和粘膜炎)、血小板减少症、贫血、眼部毒性、膀胱炎症、性功能障碍和生育能力丧失、认知功能障碍(如短期记忆丧失、注意力丧失和判断力丧失)、肾毒性、肝毒性和心脏毒性。

本文提及的术语“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、融合双抗体、三抗体、异源偶联抗体包括嵌合抗体的完整分子及其片段，和其他抗体类分子。抗体包含多种形式的修饰，包括例如但不限于，vh或vl结构域的结构域抗体、重链可变区的二聚体(vhh，如对于骆驼科所描述的)、轻链可变区的二聚体(vll)，仅含有可以直接或通过融合剂连接的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的fv片段或含有重链可变区和ch1结构域的fd片段。

本文所用的术语“半胱天冬酶抑制剂”包含对一种或多种特异性半胱天冬酶具有选择性的半胱天冬酶抑制剂(如半胱天冬酶-3型的选择抑制剂)，或者包含抑制广泛半胱天冬酶的泛半胱天冬酶抑制剂。

术语“化学治疗剂”是指对癌细胞具有细胞抑制和/或细胞毒性的一类小分子。

本文中所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足够量的给药剂(如重组病毒、化学治疗剂、纯化的蛋白质或半胱天冬酶抑制剂)，其将在某种程度上减轻所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。其结果为减缓和/或减轻疾病的体征、症状或病因，或生物体系的任何其他良性的改变。作为组合治疗的一部分施用的治疗剂的“治疗有效量”是指当单独使用时(即单一疗法)具有治疗效果的治疗剂的量，或是指凭借与一种或多种另外的治疗剂组合减少后的治疗有效量。

本文中所用的术语“核苷酸类似物化学治疗剂或核苷酸前体类似物化学治疗剂”是指一类结构类似于嘌呤、嘧啶和叶酸的抗代谢物。此类试剂作用在于抑制一种或多种对dna合成、引起dna损伤和诱导细胞凋亡起至关重要作用的酶。通常，此类试剂包含嘌呤或嘧啶环和环上的一个或多个非天然侧基，其不同于天然存在的核苷酸中发现的侧基。为简洁起见，该术语缩写为“核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂”。“非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂”是指除了核苷酸类似物化学治疗剂或核苷酸前体类似物化学治疗剂外的化学治疗剂。(如smac模拟剂)。

本文中所用的与蛋白质相关的术语“纯化的”(如“纯化的γ-干扰素”等)，是指基本上不含与原生或自然环境下的蛋白质相关的污染物。

本文中所用的术语“重组病毒”是指通过实验干预进行遗传修饰的任何病毒。

本文中所用的术语“顽固性癌症”是指在其用于治疗的过程中对特定化学治疗剂无反应的癌症。

本文中所用的术语“耐药性癌症”是指在治疗过程中最初对特定化学治疗剂有反应，但在使用化学治疗剂治疗后的一段时间后对该化学治疗剂无反应的癌症。

本文中所用的术语“小分子”是指分子量低于2000道尔顿的化学化合物或分子。

本文中所用的术语“协同”或“协同作用”是指由使用试剂组合产生的作用(如诱导癌细胞死亡)，其中所产生的效果在数量上大于各制剂单独使用时所产生的效果总和。例如，如果制剂“a”导致30％的细胞死亡而制剂“b”导致30％的细胞死亡，则这种作用的(非协同)总和为60％。如果实际制剂a和制剂b的组合导致超过60％的细胞死亡，则它们的组合效应将被认为是协同的。

本文中所用的术语“治疗剂”是指在治疗癌症中起直接作用的任何分子。所述治疗剂仅包含实施例，化学治疗剂、表达的生物治疗剂、重组病毒、纯化的细胞因子、抗体、半胱天冬酶抑制剂、免疫应答诱导或增强剂、纯化的极化细胞因子和纯化的趋化因子。

本文中所用的术语“治疗”是指医学专业人员直接治疗受试者(如通过向受试者施用治疗剂)，或由至少一方实施间接治疗(如医生、护士、药剂师或药品销售代表)以任何形式提供以下指令：(i)指示受试者根据要求保护的方法进行自我治疗(如自身给药)或(ii)指示第三方根据要求保护的方法治疗受试者。术语“治疗”的含义还包含预防复发或减缓待治疗的疾病，例如，通过在疾病的足够早期阶段施用治疗剂以预防或延缓其进展。

包含核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的癌症治疗组合方法

本文所述的方法包含通过施用如发明所述的化学治疗剂和至少一种其他治疗剂的组合方法来治疗患有癌症的人类受试者，以更有效地诱导癌细胞死亡。如本文所述，此类组合疗法协同诱导细胞的死亡。在一些实施方案中，通过施用至少一种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂和半胱天冬酶抑制剂的组合来治疗人类受试者，如本文所述，结果表明与单独使用化学治疗剂相比，其增加了癌细胞死亡的水平。

因此，本文提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中该方法包含以下步骤：(i)向人类受试者施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒；和(ii)向人类受试者施用化学治疗剂，其中化学治疗剂是核苷酸类似物或核苷酸前体类似物。任选地，该治疗方法还包含施用如本文所述的半胱天冬酶抑制剂。

本文还提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中该方法包含以下步骤：(i)向人类受试者施用核苷酸类似物化学治疗剂或核苷酸前体类似物化学治疗剂；和(ii)向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

本文还提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中该方法包含以下步骤：(i)向人类受试者施用纯化的γ-干扰素；和(ii)向人类受试者施用化学治疗剂，其中化学治疗剂是核苷酸类似物或核苷酸前体类似物。任选地，该方法还包含施用如本文所述的半胱天冬酶抑制剂。

包含非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂的癌症治疗组合方法

本文还提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中该方法包含以下步骤：(i)向人类受试者施用在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒；和(ii)向人类受试者施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。任选地，该治疗方法还包含施用如发明所述的半胱天冬酶抑制剂。

本文还提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中该方法包含以下步骤：(i)向人类受试者施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂；和(ii)向人类受试者施用半胱天冬酶抑制剂。

本文还提供了一种治疗患有癌症的人类受试者的方法，其中该方法包含以下步骤：(i)向人受试者施用纯化的γ-干扰素；和(ii)向人类受试者施用除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂。任选地，该方法还包含施用如文所述的半胱天冬酶抑制剂。

癌症

通过本文提供的方法治疗的癌症包含但不限于，急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、膀胱癌、骨肿瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、结直肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肉瘤、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、默尔克细胞癌、骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、尤因肉瘤、子宫癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、恶性皮肤肿瘤、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、甲状腺癌和子宫癌。在一些优选的实施方案中，待治疗的受试者患有选自结肠直肠癌、基底细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、胃癌和胰腺癌的癌症。在一些实施方案中，待治疗的癌症包含一种或多种待治疗的肿瘤。

目前本领域中已知各种类型癌症的症状、诊断检测和预后检测。详见国际综合癌症网络(nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp)。

在一些实施方案中，本文所述的方法治疗的受试者被鉴定为患有对单独化学治疗剂治疗(如使用单一化学治疗剂或与多种化学治疗剂组合)产生抗药或耐受的癌症。在一些实施方案中，待治疗的受试者先前已通过单独施用一种或多种化学治疗剂来治疗癌症，但治疗未成功。在其他实施方案中，本文所述的治疗方法还包含在治疗之前确定受试者是否患有对单独化学治疗剂治疗产生抗药或耐受的癌症。

目前已知细胞死亡通过许多不同但通常相互关联的途径发生，其可能包含：凋亡性细胞死亡、坏死性细胞死亡、依赖性程序性(parthanatos)细胞死亡和自噬性细胞死亡，尽管其他未指出的细胞死亡途径可能存在。细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式，其通过两种途径之一启动：一种内在途径，其中细胞通过该途径将其自身杀死作为对应激的直接响应；以及一种外在途径，其中细胞通过该途径将其自身杀死以响应从它的微环境所接收的信号。这两种途径都能激活启动半胱天冬酶，并最终激活效应半胱天冬酶，通过无差别地降解蛋白质来杀死细胞。坏死性凋亡是一种不依赖于半胱天冬酶的细胞自杀形式，其通常为响应与炎症相关的外界信号而发生，例如通过某些细胞因子如tnfα的信号传导。其中ripk3在细胞坏死的执行中起着关键作用。依赖性程序性(parthanatos)细胞死亡是另一种细胞程序性死亡的形式，是由聚adp核糖或“par”的积累和凋亡诱导因子(aif)由线粒体向细胞核迁移引起。parthanatos也称为多聚adp核糖聚合酶-1(parp-1)依赖性细胞死亡。parp-1在激活后响应极端基因组应激导致parthanatos并合成引起aif向细胞核迁移的par。自噬性细胞死亡是另一种独特的细胞死亡途径，其由极端细胞应激诱导，其特征在于细胞质空泡化(自噬体的形成)，然后过度吞噬和降解溶酶体中的细胞器和其他细胞质成分，导致细胞死亡。

在一些实施方案中，检测受试者癌症的癌细胞以确定它们是否缺乏一种或多种已知的细胞死亡途径(如凋亡性细胞死亡、坏死性细胞死亡)。该确定方法包含鉴定已知在细胞死亡途径中起作用的基因的突变和/或缺陷，例如凋亡性细胞死亡途径中的半胱天冬酶，以及坏死性细胞死亡途径中的ripk3或ripk1。鉴定出此类基因的缺陷或突变表明受试者不可能单独响应常规化学治疗，和/或是使用本文所述方法治疗癌症的合适候选者。

如本领域的技术人员所理解的，在组织特异性(如黑素瘤)和突变谱(如半胱天冬酶-8缺陷癌症或ripk3缺陷癌症)方面，根据待治疗的特定癌症类型，本文所述的治疗方法参与的细胞死亡途径可能不同。因此，本文所述的治疗方法参与多种细胞死亡途径的能力有希望增加成功治疗癌症的可能性。

在一些实施方案中，本文所述的治疗方法通过选自凋亡性细胞死亡，坏死性细胞死亡，依赖性程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡的至少一种细胞死亡途径诱导癌细胞死亡。在其他实施方案中，所述治疗通过选自凋亡性细胞死亡、坏死性细胞死亡、依赖性程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡中的至少两种细胞死亡途径诱导细胞死亡。在一些实施方案中，治疗方法通过坏死性细胞死亡诱导癌细胞死亡。在其他实施方案中，癌细胞死亡至少由凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡诱导。在另一些实施方案中，治疗方法通过除凋亡性细胞死亡或坏死性细胞死亡外的至少一种途径诱导癌细胞死亡(如依赖性程序性细胞死亡、自噬性细胞死亡或另一种细胞死亡途径)。

在一些实施方案中，待治疗的受试者患有包含至少一些半胱天冬酶依赖性细胞死亡途径缺陷的细胞的癌症。例如，这些细胞可能包含一种或多种半胱天冬酶(如caspase8、caspase3、caspase10、caspase2、caspase6或caspase7)的表达缺陷或功能缺陷(包括杂合或纯合功能丧失)。在一些实施方案中，半胱天冬酶依赖性细胞死亡途径缺陷的癌细胞缺乏半胱天冬酶或fadd的表达或功能。在其他实施方案中，癌症包含坏死性细胞死亡途径的细胞缺陷。在一些实施方案中，坏死性细胞死亡途径缺陷的癌细胞缺乏ripk1、ripk3或mlkl的表达或功能。在一些实施方案中，癌症包含依赖性程序性细胞死亡途径的细胞缺陷(如parp1缺陷癌细胞)。在其他实施方案中，癌症包含自噬性细胞死亡途径的细胞缺陷(如ambra1、atg12、atg16l1或atg4a缺陷癌细胞)。在一些实施方案中，待治疗的癌症包含多种选自凋亡性细胞死亡、坏死性细胞死亡、依赖性程序性细胞死亡和自噬性细胞死亡的死亡途径缺陷。各类候选癌症的基因突变及其鉴定方法如lawrenceetal(2014)，staceyetal(2015)，andbonillaetal(2016)所述。用于鉴定此类细胞缺陷的技术是本领域已知的，例如通过如navin(2014)和gawadetal(2016)所述的单细胞分离测序。

核苷酸类似物和核苷酸前体类似物化学治疗剂

本文所述的癌症治疗方法中所用的化学治疗剂是核苷酸类似物或核苷酸前体化学治疗剂。合适的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂包含但不限于氟尿嘧啶(fluorouracil)、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、恩曲他滨(emtricitabine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、尼拉滨(nelarabine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)及其任何组合。

在一些实施方案中，待施用的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂包含氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和多西氟尿苷(doxifluridine)中的一种或多种。

在一些优选实施方案中，治疗方法中所用的核苷酸化学治疗剂是氟尿嘧啶(fluorouracil)及其活性结构类似物(如卡培他滨)。在一些优选实施方案中，核苷酸类似物化学治疗剂是氟尿嘧啶(fluorouracil)。

非核苷酸类似物化学治疗剂

在一些实施方案中，除核苷酸类似物或核苷酸前体类似物以外的化学治疗剂选自dna结合剂、第二线粒体衍生的半胱天冬酶活化剂(smac)模拟物、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、核苷类似物、蛋白酶体抑制剂和聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂。

在一些实施方案中，待使用的非核苷酸类似物化学治疗剂是dna结合化学治疗剂。在一些实施方案中，当使用的化学治疗剂是dna结合化学治疗剂时，其选自曲贝替定(trabectedin)、放线菌素d(dactinomycin)、表阿霉素(epirubicin)和丝裂霉素c(mitomycinc)。在一些优选实施方案中，所施用的dna结合化学治疗剂是曲贝替定(trabectedin)。

在其他实施方案中，治疗方法包含施用smac模拟物化学治疗剂。合适的smac模拟物化学治疗剂包含但不限于birinapant(akatl32711；cas1260251-31-7))、lcl-161(novartis；cas1005342-46-0)、gdc-0152(genentech；cas873652-48-3)、gdc-0917/cudc-427(genentech；cas1446182-94-0)、sm-406/at-406(cas1071992-99-8)、bv6(cas1001600-56-1)及其任何组合。在一些实施方案中，smac模拟物化学治疗剂与不同类别的化学治疗剂组合施用。在一些优选实施例中，施用的smac模拟化学治疗剂是birinapant。

在一些实施方案中，待施用的化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。合适的拓扑异构酶抑制剂化学治疗剂包含但不限于多柔比星(doxorubicin)、安丫啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、喜树碱(camphothecin)及其任何组合。

在一些实施方案中，待施用的化学治疗剂是烷化剂。在一些实施方案中，烷化剂选自氮芥类(mechlorethamine)、异环磷酰胺(ifosamide)、尿嘧啶氮芥(uramustine)、卡莫司汀(carmustine)、白消安(busulfan)及其任何组合。

在其他实施方案中，待施用的化学治疗剂包含聚adp核糖聚合酶(parp)。在一些实施方案中，parp抑制剂化学治疗剂选自olaparib(azd-2281；cas763113-22-0)、veliparib(abt-888；cas912445-05-7)、talazoparib(bmn673；cas1207456-01-6)、niraparib(mk-4827；casno:1038915-60-4)及其任何组合。

在其他实施方案中，待施用的治疗剂包含蛋白酶体抑制剂化学治疗剂。在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂化学治疗剂选自硼替佐米(bortezomib，cas179324697)、卡非佐米(carfilzomib，cas868540-17-4)、npi-0052(cas437742-34-2)、mln9708(cas1201902-80-8)、cep-18770(cas847499-27-8)、onx0912(cas935888-69-0)及其任何组合。

重组病毒

本文所述的癌症组合治疗方法包含多种类型适合表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。

在一些实施方案中，待施用的重组病毒是dna病毒。合适类型的dna病毒包含腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)、逆转录病毒和慢病毒。本领域已知此类重组dna病毒的设计、生产和使用方法，例如，腺病毒参见fukazawaetal(2010)和“genetherapyprotocols”；aav参见“adeno-associatedvirus:methodsandprotocols”；hsv参见codyetal(2013)和“herpessimplexvirus:methodsandprotocols”；逆转录病毒参见“genetherapyprotocolsvol.1:productionandinvivoapplicationsofgenetransfervectors”和amer(2014)；慢病毒参见mertenetal(2016)和emeagietal(2013)。的。在一些优选实施方案中，治疗方法中所用的重组病毒是腺病毒。在其他优选实施方案中，重组病毒是慢病毒。

在其他实施方案中，所施用的重组病毒是重组、复制缺陷型或复制型rna病毒。合适类型的复制缺陷型或复制型rna病毒包含甲病毒(如辛德比斯病毒或塞姆利基森林病毒)、黄病毒(如昆津病毒)、副粘病毒(如仙台病毒)、弹状病毒(如水泡性口炎病毒)和正粘病毒(如甲型流感病毒)。本领域已知此类重组rna病毒的设计、生产和使用的方法，例如，甲病毒参见lundstrom(2015)和quetglasetal(2010)；黄病毒参见hoang-leetal(2009)和usme-ciroetal(2013)；副粘病毒参见cattaneo(2010)；弹状病毒参见finkeetal(2005)andchangetal(2010)；正粘病毒参见美国专利u.s.8475806。

在一些实施方案中，重组dna或rna病毒是一种无法在转导细胞中复制的复制缺陷型病毒。在其他实施方案中，重组病毒是具有复制能力的病毒，其可以在转导的宿主细胞中复制。或者，重组病毒是条件复制型病毒，其仅能在特定细胞类型或具有特定表达谱的细胞中复制，例如p53缺陷型癌细胞。

在本文所述方法中所用的合适的驱动重组病毒表达生物治疗剂的启动子的实施例包含但不限于组成型启动子，例如cmv、cag、ef-1-α、hsv1-tk、sv40、β-肌动蛋白和pgk启动子。在其他实施方案中，启动子是诱导型启动子，例如含有tet-操纵子的启动子。在某些实施方案中，靶选择性启动子用于驱动特定细胞类型或尤其是癌细胞中的生物治疗剂的表达。在本文所述方法中所用的合适的癌症/细胞类型选择性启动子的实施例包含但不限于erb2启动子(乳腺癌)、癌胚抗原启动子(结肠直肠癌)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体启动子(结肠直肠癌)、酪氨酸酶启动子(黑色素瘤)、黑皮质素受体(黑色素瘤)、人类端粒酶逆转录酶(htert)启动子(多种癌症)、ras相关核蛋白启动子(多种癌症)、乳腺癌转移抑制因子1启动子(多种癌症)、rad51c启动子(多种癌症)和微染色体维持复合体成分5启动子(多种癌症)。

在一些实施方案中，当重组病毒表达两种或更多种蛋白质时，重组病毒包含一种多顺反子mrna编码的表达盒(“多顺反子表达盒”)，其在转录时产生包含不同氨基酸序列或功能的独立多肽。在一些实施方案中，多顺反子表达盒对“多蛋白”进行编码，其中“多蛋白”包含通过小核糖核酸病毒(如口蹄疫病毒(fmdv)病毒的2a肽序列)编码分开的多个多肽序列。2a肽序列通过阻止在保守甘氨酸与最后一个脯氨酸之间形成正常肽键而进行共翻译，导致核糖体移动至下一个密码子，并且使新生肽在gly和pro之间被剪切。剪切后，短2a肽保持与“上游”蛋白质的c-末端融合，而脯氨酸被添加到“下游”蛋白质的n-末端，在翻译过程中，其允许将新生多肽序列剪切成单独的多肽。参见trichasetal(2008).。

在其他实施方案中，多顺反子表达盒在开放阅读框之间掺入一个或多个内部核糖体进入位点(ires)序列。ires序列及其用途是本领域已知的，参见martinez-sales(1999)。

在一些实施方案中，本文所述方法中所用的重组病毒具有靶向性，例如bucholzetal(2015)所述的特定细胞类型的靶向性。掺入重组病毒衣壳表面的合适靶向部分包含与癌细胞过表达的细胞表面受体结合的配体。例如，通过掺入预设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)配体来靶向乳腺癌细胞中过表达的her2/neu受体；对慢病毒的靶向参见(münchetal2011)；对avv的靶向参见(münchetal2013)。在另一实施例中，通过将抗体掺入病毒衣壳表面，预设计重组慢病毒来靶向在黑素瘤细胞表面上过表达的p糖蛋白(morizonoetal2005)。

表达的生物治疗剂

本文所述方法中所用的生物治疗剂包含通过使用表达载体(例如重组病毒)进行遗传编码和表达的生物分子，其包含肽、蛋白质和非编码rna，例如短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、mirna抑制剂和反义rna。优选地，待表达的生物治疗剂与人类同源物具高度的序列同一性。在一些优选实施方案中，待表达的生物治疗剂序列包含人类同源物的序列(如人类γ-ifn的氨基酸序列或编码人类γ-ifn的人类核酸序列)。在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂的序列与人类同源物至少约80％相同，例如82％，85％，88％，90％，92％，95％，97％，99％或在约80％至100％范围内任意百分比。

在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂包含待表达的肽或蛋白质。合适类型的待表达的蛋白质生物治疗剂包含但不限于细胞因子、调节凋亡性细胞死亡的蛋白质、调节坏死性细胞死亡的蛋白质、调节parthanatos细胞死亡的蛋白质、调节自噬性细胞死亡的蛋白质，或结合细胞受体并通过凋亡性细胞死亡、坏死性细胞死亡、parthanatos细胞死亡、自噬性细胞死亡及其任何组合激活细胞死亡的激动剂。

在一些实施方案中，本文所述的治疗方法中所用的重组病毒表达的生物治疗剂是细胞因子。待表达的合适细胞因子包括但不限于γ-干扰素、α-干扰素，b细胞活化因子(baff)、tl1、tnfα、rail、淋巴毒素α、淋巴毒素β、ox-40配体、light(也称为肿瘤坏死因子超家族成员14)、fas-配体、4-1bb配体、rank配体、cd30配体、cd40配体、糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白配体(gitrl)及其任何组合。在一些优选的实施方案中，待表达的细胞因子是γ-干扰素。

在其他实施方案中，待表达的生物治疗剂是调节凋亡性细胞死亡的蛋白质。合适的调节凋亡性细胞死亡的蛋白质包含但不限于fas相关死亡结构域蛋白(fadd；genbanknp_003815.1)、bcl-2相关死亡启动子(bad；genbanknp_004313.1)、bcl-2相关x蛋白(bax；genbanknp_001278357.1)、bh3相互作用结构域死亡激动剂(bid；genbanknp_001187.1)、bcl-2类蛋白11(bim；genbanknp_001191035.1)、bcl-2同源拮抗剂抗体(bak；genbanknp_001179.1)、细胞色素c(genbanknp_061820.1)、凋亡蛋白酶激活因子1(apaf1；genbanknp_001151.1)、含死亡域蛋白(cradd；genbanknp_003796.1)、tnf、肿瘤坏死因子受体1(tnfr1；genbanknp_001056.1)、abelson鼠科白血病病毒致癌基因同源物1(abl1；genbanknp_005148.2)、细胞死亡诱导dffa样效应物a(cidea；genbanknp_001270.1)，细胞死亡诱导dff45样效应物b(cideb；genbanknp_055245.2)、肿瘤蛋白p53(tp53；genbanknp_000537.3)、肿瘤蛋白p73(tp73；genbanknp_001119712.1)、casp8和fadd样凋亡调节因子(cflar；genbanknp_001120655.1)、死亡相关蛋白激酶1(dapk1；genbanknp_001275658.1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员25(tnfrsf25；genbanknp_001034753.1)、b细胞淋巴瘤/白血病10(bcl10；genbanknp_003912.1)、bcl-2样蛋白11(bcl2l11；genbanknp_001191035.1)、bcl-2相关转录因子1(bclaf1；genbanknp_001070908.1)、bcl2/腺病毒e1b-19kda相互作用蛋白1(bnip1；genbanknp_001196.2)、bcl2/腺病毒e1b-19kda相互作用蛋白3(bnip3；genbanknp_004043.3)、cd27(genbanknp_001233.1)、cd70(genbanknp_001243.1)、dna片段化因子亚基α(dffa；genbanknp_004392.1)、fas细胞表面死亡受体(fas；genbanknp_000034.1)、fas配体(faslg；genbanknp_000630.1)、生长停滞和dna病灶诱导蛋白(gadd45a；genbanknp_001186670.1)、细胞凋亡激活因子(hrk；genbanknp_003797.1)、淋巴毒素α(lta；genbanknp_000586.2)、bcl-2修饰因子(bmf；genbanknp_001003940.1)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(nod1；genbanknp_006083.1)、nadph氧化酶激活剂(noxa；genbanknp_066950.1)、p53上调凋亡调节剂(puma；np_001120712.1)、含有半胱天冬酶补充结构域的凋亡相关斑点样蛋白(pycard；genbanknp_037390.2)、肿瘤坏死因子受体超家族成员10a(tnfrsf10a；genbanknp_003835.3)、肿瘤坏死因子超家族成员10(tnfsf10；genbanknp_001177871.1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9；genbanknp_001552.2)、肿瘤坏死因子超家族成员8(tnfsf8；genbanknp_001235)、肿瘤抑制基因p53结合蛋白2(tp53bp2；genbanknp_001026855.2)、肿瘤坏死因子受体1型相关死亡域蛋白(tradd；genbanknp_003780.1)、tnf受体相关因子-3(traf3；genbanknp_001186356.1)及其任何组合。

在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂是调节坏死性凋亡细胞死亡的蛋白质。合适的调节坏死性凋亡细胞死亡的蛋白质包含但不限于干扰素调节因子的dna依赖性激活剂(dai；genbanknp_001153889.1)、受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(ripk3aka“rip3”；genbanknp_006862.2)、混合谱系激酶结构域样蛋白(mlkl；genbanknp_689862.1)、第二种线粒体衍生的半胱天冬酶激活因子(smac；genbanknp_063940.1)、含tir结构域的衔接子诱导β-干扰素(trif；genbanknp_891549)及其任何组合。在优选实施方案中，调节坏死性凋亡细胞死亡的蛋白质选自dai、ripk1、ripk3、mlkl和trif。在一些实施方案中，调节坏死性凋亡细胞死亡的蛋白质是以二聚体或寡聚体形式的ripk3或ripk1融合蛋白，参见cooketal(2014)andorozcoetal(2014)。

在进一步的实施方案中，待表达的生物治疗剂是调节parthanatos细胞死亡的蛋白质。合适的调节parthanatos细胞死亡蛋白质包含多聚adp核糖聚合酶1(parp1；genbanknp_001609.2)、凋亡诱导因子1、线粒体(aifm1，genbanknp_004199.1)及其任何组合。

在其他实施方案中，待表达的生物治疗剂是调节自噬性细胞死亡的蛋白质。合适的调节自噬性细胞死亡的蛋白质包含但不限于becn1调节的自噬蛋白1(ambra1，genbanknp_060219.2)中的活化分子、自噬相关蛋白12(atg12，genbanknp_004698)、自噬相关蛋白16-1(atg16l1，genbanknp_110430.5)、半胱氨酸蛋白酶atg4a(atg4a；genbanknp_443168.2)、半胱氨酸蛋白酶atg4b(atg4b；genbanknp_037457.3)、自噬相关蛋白4c、半胱氨酸肽酶(atg4c；genbanknp_835739.1)、自噬相关蛋白4d、半胱氨酸肽酶(atg4d；genbanknp_116274.3)、自噬相关蛋白5(atg5；genbanknp_001273035.1)、自噬相关蛋白9a(atg9a；genbanknp_001070666.1)、自噬相关蛋白9b(atg9b；genbankaai28588.1)、beclin-1(becn1；genbanknp_001300927.1)、γ-氨基丁酸受体相关蛋白(gabarap；genbanknp_009209.1)、gaba(a)型受体相关蛋白样1(gabarapl1；genbankcag38511.1))、gaba(a)型受体相关蛋白样2(gabarapl2；genbanknp_009216.1)、免疫相关的gtp酶家族m蛋白(irgm；genbanknp_001139277.1)、微管相关蛋白1a/1b轻链3a(map1lc3a；genbanknp_115903.1)、微管相关蛋白1a/1b轻链3b(map1lc3b；genbanknp_073729.1)、g蛋白信号调节因子19(rgs19；genbanknp_001034556.1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ulk1(ulk1；genbanknp_003556.1)、自噬相关蛋白10(atg10；genbanknp_113670.1)、自噬相关16样2蛋白(atg16l2；genbankaai46661.1)、自噬相关蛋白3(atg3；genbanknp_071933.2)、自噬相关蛋白7(atg7；genbanknp_006386.1)、自噬相关蛋白9a(atg9a；genbanknp_076990.4)、ras-相关蛋白24(rab24；genbanknp_001026847.1)、dna病灶调节的自噬调节蛋白1(dram1；genbanknp_060840.2)、序列相似性家族176、成员a蛋白(fam176a；genbankaah63016.1)及其任何组合。

在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂是fas受体(fasr)的激动剂抗体，例如scfv抗体，参见chodorgeetal(2012)所述的scfv抗体“e09”。

在其他实施方案中，待在治疗方法中使用的重组病毒表达的生物治疗剂是包括非编码rna。此类非编码rna包含影响rna干扰的短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)、mirna抑制剂、与mirna互补的反义rna(如ebertetal2007所述的“mirna海绵”)。

术语“rna干扰”通常是指双链rna分子降低核酸序列表达的过程，其中核酸序列与双链rna分子具有实质或完全同源性。然而，最近已经发现使用非rna双链分子可以实现rna干扰(参见us20070004667)。

“shrna”或“短发夹rna”是指rna分子，其中少于约50个核苷酸，优选约19至23个核苷酸，与位于相同rna分子上的互补序列碱基配对，并且其中所述序列和互补序列被至少约4至15个核苷酸的不成对区域分开，其在由两个碱基互补区域产生的茎结构上方形成单链环。

包含的shrna是双指和多指发夹dsrna，其中rna分子包含两个或多个由单链间隔区分开的茎-环结构。

一旦设计，包含双链区的核酸分子优选通过使用重组表达病毒的转导在体内表达。

在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂的非编码rna是针对癌症靶标的shrna。合适的shrna癌症靶标包含但不限于细胞周期蛋白d1(genbankbc023620.2)、iii类β-微管蛋白(genbanknm_006086)、活化c激酶受体1(rack1；genbanknm006098)、ras同源基因家族成员a(rhoa；genbankbc001360)、丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶5(mapkapk5；genbanknm003668)、生长分化因子11(gdf11；genbankaf028333)、engrailed1(en1；genbanknm_001426.3)和小眼(microphthalmia)相关转录因子(mitf；genbanknm_000248)。

在其他实施方案中，待表达的非编码rna是mirna。在本文所述的治疗方法中，合适的表达的mirna的实施例包含但不限于mir-491、mir-133a、mir-204、let7mirna、mir-24、mir-15a、mir16、mir-26a、mir-148b、mir-199a-3p、mir-512、mir874a及其任何组合。合适的用于抑制癌细胞的mirna靶标的实例，通过mirna海绵表达，包含但不限于mir-223、mir-211、mir-10b、mir-9、mir-17-92、mir-103、mir-106b、mir-107、mir-155、mir-21、mir-128及其任何组合。

在某些实施方案中，治疗方法中所用的重组病毒表达至少两种生物治疗剂，例如两种蛋白质；非编码rna和蛋白质；或两个非编码rna。

在一些优选实施方案中，两种待表达的生物治疗剂包含细胞因子和选自mlkl、smac、smac的n-末端四肽(avpi)(guoetal2002)、bax、dai、环gmp-amp合成酶(cgas；genbanknp_612450.2)和ripk3中的一种的蛋白质。

免疫应答诱导剂，免疫应答增强剂和/或检查点抑制剂抗体的组合

在一些实施方案中，在任何上述治疗方法中，该方法还包含施用一种或多种免疫应答诱导剂或免疫应答增强剂，以通过受试者的免疫应答增加癌细胞的死亡。

在一些优选实施方案中，一种或多种免疫应答诱导剂的施用包含：(i)纯化的极化细胞因子或纯化的趋化因子；和(ii)纯化的促炎剂。纯化的极化细胞因子用于诱导初始t细胞成为成熟的辅助性t细胞1型(th1)和/或th2细胞，以促进针对癌细胞的免疫应答。

在一些实施方案中，施用的纯化的极化细胞因子选自il-12、il-15、il-18、il-21、il-23、il-27及其组合。在一些实施方案中，纯化的趋化因子选自cxcl1、ccl25、ccl27及其组合。

在一些实施方案中，一种或多种免疫应答诱导剂包含选自4-ibb、ox40、cd70、icos和cd40中的一种受体的激动剂。

在一些实施方案中，纯化的促炎剂包含toll样受体(tlr)激动剂。合适的tlr激动剂包含但不限于polyi:c、polya:u、脂多糖、甘露聚糖、cpg、瑞喹莫德、咪喹莫特、glycoinositolphospholipids及其任何组合。在其他实施方案中，纯化的促炎剂是巨大戟醇甲基丁烯酸酯(cas75567-37-2)。

在其他实施方案中，当治疗方法包含施用免疫应答增强剂时，免疫应答增强剂包含il10抗体、il10受体抗体、il4抗体、l4受体抗体及其任何组合。

在另一些实施方案中，治疗方法包含施用免疫检查点抑制剂。合适的免疫检查点抑制剂的实施例包含但不限于针对程序性死亡的抗体(pd-1)、针对pd-配体1的抗体(pdl-1)、针对细胞毒性t-淋巴细胞相关蛋白4的抗体(ctla-4)、针对腺苷a2a受体的抗体(a2ar)、针对b和t淋巴细胞衰减蛋白(btla)的抗体、针对细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)的抗体、针对吲哚胺的抗体2，3-双加氧酶(ido)的抗体、针对抗淋巴细胞活化基因-3(lag3)的抗体、抗t细胞免疫球蛋白结构域、粘蛋白结构域3(tim-3)、针对杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的抗体、针对cd94的抗体、针对白细胞相关免疫球蛋白样受体1(lair1)的抗体、针对任何白细胞免疫球蛋白样受体亚家族a(lilra)成员1-6(lilra1-lilra6)的抗体、针对任何白细胞免疫球蛋白样受体亚型的抗体家族b(lilrb)成员1-5的抗体及其任何组合。

核苷酸类似物和核苷酸前体类似物化学治疗剂的给药方法

本文公开的组合治疗方法实现了协同效应。因此，在优选实施方案中，化学治疗剂(例如核苷酸类似物化学治疗剂，如氟尿嘧啶)的剂量，重组病毒的剂量，纯化的γ-干扰素的剂量，或任意两者在组合治疗中的剂量相对于本领域中单独施用每种药剂的可接受标准剂量有所减少。在一些本文所述的治疗方法的实施方案中，减少的剂量避免在所治疗的受试者中引起超过中度不良事件。在一些优选实施方案中，相对于标准剂量，施用剂量减少约25％至约95％，例如30％，35％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或相对于标准剂量，其他在约25％至约95％范围内的剂量减少百分比。在一些优选实施方案中，相对于标准剂量，施用剂量减少约50％至约85％。

在优选实施方案中，对于例如皮肤癌和其他适于直接局部给药的以病灶和肿瘤形式存在的癌症(如黑素瘤)，其给药方法是向病灶内给药。在一些优选实施方案中，该方法包含向病灶内施用氟尿嘧啶。在一些实施方案中，向病灶内施用的氟尿嘧啶剂量范围为每次给药约0.02mg/病灶至约10mg/病灶，例如，约0.05mg/病灶，0.075mg/病灶，0.1mg/病灶，0.15mg/病灶，0.2mg/病灶，0.25mg/病灶，0.3mg/病灶，0.5mg/病灶，0.7mg/病灶，0.8mg/病灶，1mg/病灶，1.5mg/病灶，2mg/病灶，3mg/病灶，3.5mg/病灶，4mg/病灶，4.5mg/病灶，5mg/病灶，5.5mg/病灶，6mg/病灶，7mg病灶，8mg/病灶，9mg/病灶或其他在约0.02mg/病灶至约10mg/病灶范围内的病灶内给药剂量。在一些优选实施方案中，向病灶内施用的氟尿嘧啶剂量范围为约2.5mg/病灶至约10mg/病灶。

在一些实施方案中，待治疗的癌症包含通过如本文所述的向全身施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂进行治疗。在其他实施方案中，给药方法是向腹膜内给药。在一些实施方案中，给药方法是向胸膜内给药。在一些实施方案中，当通过向全身、腹膜内或胸膜内施用氟尿嘧啶时，施用剂量为每次给药约0.01mg/kg至约5mg/kg，例如0.015mg/kg，0.02mg/kg，0.03mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.06mg/kg，0.07mg/kg，0.08mg/kg，0.1mg/kg，0.12mg/kg，0.13mg/kg，0.15mg/kg，0.17mg/kg，0.20mg/kg，0.22mg/kg，0.25mg/kg，0.27mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，0.9mg/kgkg，1mg/kg，1.5mg/kg，2mg/kg，2.5mg/kg，3mg/kg，4mg/kg或其他在约0.1mg/kg至约5mg/kg内的剂量。在一些优选实施方案中，氟尿嘧啶的剂量为约0.01mg/kg至约2mg/kg。

在其他实施方案中，癌症(如皮肤癌)的治疗包含向局部施用氟尿嘧啶。在一些实施方案中，氟尿嘧啶局部施用浓度为约0.01％(w/v)至约3％(w/v)，例如0.02％，0.03％，0.04％，0.05％，0.08％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，1％，1.2％，1.3％，1.5％，1.7％，2％，2.2％，2.5％，2.8％或其他在约0.01％(w/v)至约3％(w/v)范围内的局部施用浓度。在一些实施方案中，氟尿嘧啶局部施用浓度为约0.02％(w/v)至约2％。在优选实施方案中，氟尿嘧啶局部施用浓度为约0.1％至约0.5％。

在其他实施方案中，当化疗药物的给药方法是向病灶内施用时，核苷酸类似物化学治疗剂(如氟尿嘧啶)的每个治疗周期的总聚集剂量范围为每治疗周期约1mg/病灶至约125mg/病灶。例如，约1.5mg/病灶，2mg/病灶，3mg/病灶，5mg/病灶，7mg/病灶，8mg/病灶，10mg/病灶，12mg/病灶，15mg/病灶，18mg/病灶，20mg/病灶，22mg/病灶，25mg/病灶，30mg/病灶，40mg/病灶，50mg/病灶，75mg/病灶，90mg/病灶，100mg/病灶或其他在约1mg/病灶至约125mg/病灶范围内的病灶内总聚集剂量。

在一些实施方案中，待治疗的受试者在治疗周期内多次施用核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。在一些实施方案中，当通过向全身、腹膜内或胸膜内施用化学治疗剂时，核苷酸类似物化学治疗剂(如氟尿嘧啶)的每个治疗周期的总聚集剂量范围为每治疗周期每总聚集剂量约0.05mg/kg至约25mg/kg，例如0.075mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg，0.25mg/kg，0.3mg/kg，0.35mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.6mg/kg，0.65mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，1.1mg/kg，1.25mg/kg，1.5mg/kg，2mg/kg，2.5mg/kg，3mg/kg，4mg/kg，5mg/kg，8mg/kg，10mg/kg，12mg/kg，15mg/kg，18mg/kg或在其他约0.05mg/kg至约25mg/kg范围内的总聚集剂量。在一些实施方案中，每治疗周期的总聚集剂量范围为每治疗周期每总聚集剂量约1mg/kg至约10mg/kg。

非核苷酸类似物化学治疗剂的给药方法

在其他实施方案中，在组合疗法中施用的化学治疗剂是非核苷酸类似物化学治疗剂。在上述实施方案中，化学治疗剂(例如非核苷酸类似物化学治疗剂，如曲贝替定)的剂量，重组病毒的剂量，纯化的γ-干扰素的剂量，或任意两者在组合治疗中的剂量相对于本领域中单独施用每种药剂的可接受标准剂量有所减少。在一些本文所述的治疗方法的实施方案中，所施用的化学治疗剂的减少剂量避免在所治疗的受试者中引起超过中度不良事件。在一些优选实施方案中，相对于化学治疗剂的标准剂量，化学治疗剂的施用剂量减少约25％至约95％，例如30％，35％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或相对于标准剂量，其他在约25％至约95％的范围内的剂量减少百分比。在一些优选实施方案中，相对于标准剂量，施用剂量减少约50％至约85％。

在一些实施方案中，当通过向全身、腹膜内或胸膜内施用时。通过上述施用途径对于广泛的非核苷酸类似物化学治疗剂的标准施用剂量是已知的。在一些实施方案中，向全身、腹膜内或胸膜内施用剂量的范围为约0.01mg/kg至约50mg/kg，例如0.03mg/kg，0.05mg/kg，0.1mg/kg，0.5mg/kg，1mg/kg，1.5mg/kg，2mg/kg，3mg/kg，5mg/kg，7mg/kg，10mg/kg，12mg/kg，20mg/kg，25mg/kg，30mg/kg，35mg/kg，40mg/kg，45mg/kg或其他在约0.01mg/kg至约50mg/kg内的剂量。优选剂量范围为约0.01mg/kg至约2mg/kg。

向病灶内施用剂量范围为约0.01mg/病灶至约25mg/病灶，例如0.05mg/病灶，0.1mg/病灶，0.5mg/病灶，1mg/病灶，1.5mg/病灶，2mg/病灶，3mg/病灶，5mg/病灶，7mg/病灶，10mg/病灶，12mg/病灶，15mg/病灶，20mg/病灶或其他在约0.05mg/病灶至约25mg/病灶范围内的剂量。优选地，向病灶内施用剂量范围为约0.1mg/病灶至约10mg/病灶。上述施用剂量范围适用于非核苷酸类似物化学治疗剂，包括但不限于拓扑异构酶抑制剂化学治疗剂(例如阿霉素、安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐、替尼泊苷、伊立替康、拓扑替康和喜树碱)；smac模拟物(例如lcl161、gdc-0152、gdc-0917和sm-406)；烷化剂(例如氮芥类(mechlorethamine)、异环磷酰胺(ifosamide)、尿嘧啶氮芥(uramustine)、卡莫司汀(carmustine)、白消安(busulfan))；parp抑制剂(例如olaparib)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米、npi-0052、mln9708、cep-18770和onx0912)。

在一些优选实施方案中，施用的非核苷酸类似物化学治疗剂是曲贝替定。在一些优选实施方案中，当向病灶内施用曲贝替定时，施用剂量范围为约0.0025mg/病灶至约0.3mg/病灶，例如0.005mg/病灶，0.0075mg/病灶，0.01mg/病灶，0.02mg/病灶，0.025mg/病灶，0.04mg/病灶，0.05mg/病灶，0.07mg/病灶，0.1mg/病灶，0.15mg/病灶，0.2mg/病灶，0.25mg/病灶或其他在约0.0025mg/病灶至约0.3mg/病灶内的病灶内剂量。在优选实施方案中，向病灶内施用曲贝替定的施用剂量范围为约0.0025mg/病灶至约0.05mg/病灶。

在一些实施方案中，当向全身、腹膜内或胸膜内施用曲贝替定的施用剂量为约0.0025mg/kg至约2mg/kg，例如0.005mg/kg，0.0075mg/kg，0.01mg/kg，0.02mg/kg，0.025mg/kg，0.04mg/kg，0.05mg/kg，0.07mg/kg，0.1mg/kg，0.15mg/kg，0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg，0.7mg/kg，0.8mg/kg，1mg/kg，1.25mg/kg，1.5mg/kg或其他在约0.0025mg/kg至约2mg/kg内的曲贝替定剂量。在优选的实施方案中，曲贝替定的施用剂量范围为约0.01mg/kg至约0.1mg/kg。在一些优选实施方案中，曲贝替定的施用范围为约0.02mg/kg至约0.07mg/kg。在一些优选实施方案中，在约3小时内静脉输注曲贝替定，施用剂量为约0.02mg/kg至约0.07mg/kg，并且每三周重复一次治疗，直至治疗结束。

在一些优选实施方案中，施用的非核苷酸类似物化学治疗剂是birinapant。在一些优选实施方案中，向病灶内施用birinapant的施用剂量范围为约0.02mg/病灶至约2mg/病灶，例如0.03mg/病灶，0.04mg/病灶，0.05mg/病灶，0.06mg/病灶，0.08mg/病灶，0.1mg/病灶，0.2mg/病灶，0.3mg/病灶，0.4mg/病灶，0.6mg/病灶，0.8mg/病灶，1mg/病灶，1.2mg/病灶，1.5mg/病灶，1.8mg/病灶或其他在约0.02mg/病灶至约2mg/病灶范围内的病灶内剂量。在优选实施方案中，向病灶内施用birinapant的施用剂量范围为约0.02mg/病灶至约0.8mg/病灶。

在其他实施方案中，以iv施用birinapant，施用剂量为约0.02mg/kg至约4mg/kg，例如0.04mg/kg，0.06mg/kg，0.08mg/kg，0.1mg/kg，0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.6mg/kg，0.8mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，3mg/kg或其他在约0.02mg/kg至约4mg/kg内的birinapant剂量。在一些优选实施方案中，向全身施用birinapant的施用剂量范围为约0.1mg/kg至约0.8mg/kg。在其他实施方案中，使用与iv给药相同的剂量范围，向腹膜内或胸膜内施用birinapant。

重组病毒的施用剂量

在一些优选实施方案中，用于表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒的施用途径是向病灶内施用。在一些实施方案中，向病灶内施用重组病毒的施用剂量为约1×10⁷感染性颗粒/病灶至约1×10¹²感染性颗粒/病灶，例如2x10⁸，3x10⁸，4x10⁸，5x10⁸，6x10⁸，8x10⁸，1x10⁹，1.5x10⁹，2x10⁹，3x10⁹，4x10⁹，6x10⁹，8x10⁹，9x10⁹，1x10¹⁰，2x10¹⁰，3x10¹⁰，4x10¹⁰，5x10¹⁰，6x10¹⁰，8x10¹⁰，1x10¹¹，2x10¹¹，3x10¹¹，4x10¹¹，5x10¹¹，6x10¹¹，8x10¹¹，9x10¹¹，1x10¹²，1.5x10¹²，2x10¹²，3x10¹²，4x10¹²，5x10¹²，6x10¹²，8x10¹²，9x10¹²或其他在约1x10⁷感染性颗粒/病灶至约1x10¹²感染性颗粒/病灶内的感染性颗粒/病灶。在一些优选实施方案中，向病灶内施用病毒的施用剂量范围为约1×10⁸感染性颗粒/病灶至约1×10¹¹感染性颗粒/病灶。

在其他实施方案中，向全身、腹膜内或胸膜内施用表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。在一些实施方案中，向全身、腹膜内或胸膜内施用的重组病毒的施用剂量为每次给药约1×10⁸感染性颗粒至约1×10¹³感染性颗粒，例如2x10⁸，3x10⁸，4x10⁸，5x10⁸，6x10⁸，8x10⁸，1x10⁹，1.5x10⁹，2x10⁹，3x10⁹，4x10⁹，6x10⁹，8x10⁹，9x10⁹，1x10¹⁰，2x10¹⁰，3x10¹⁰，4x10¹⁰，5x10¹⁰，6x10¹⁰，8x10¹⁰，1x10¹¹，2x10¹¹，3x10¹¹，4x10¹¹，5x10¹¹，6x10¹¹，8x10¹¹，9x10¹¹，1x10¹²，1.5x10¹²，2x10¹²，3x10¹²，4x10¹²，5x10¹²，6x10¹²，8x10¹²，9x10¹²，或其他在约1x10⁸感染颗粒至约1×10¹³感染性颗粒内的每次给药感染性颗粒数。在优选实施方案中，施用剂量为约1×10⁹至约1×10¹²感染性颗粒。

在一些实施方案中，在每个治疗周期中，在与化学治疗剂的组合治疗中向待治疗的受试者施用多剂重组病毒。

在其他实施方案中，当向病灶内施用重组病毒时，重组病毒颗粒每个治疗周期的总聚集剂量范围为约1×10⁸感染性颗粒/病灶至约1×10¹³感染性颗粒/病灶，例如2x10⁸，3x10⁸，4x10⁸，5x10⁸，6x10⁸，8x10⁸，1x10⁹，1.5x10⁹，2x10⁹，3x10⁹，4x10⁹，6x10⁹，8x10⁹，9x10⁹，1x10¹⁰，2x10¹⁰，3x10¹⁰，4x10¹⁰，5x10¹⁰，6x10¹⁰，8x10¹⁰，1x10¹¹，2x10¹¹，3x10¹¹，4x10¹¹，5x10¹¹，6x10¹¹，8x10¹¹，9x10¹¹，1x10¹²，1.5x10¹²，2x10¹²，3x10¹²，4x10¹²，5x10¹²，6x10¹²，8x10¹²，9x10¹²或其他在约1×10⁸感染性颗粒/病灶到约1×10¹³感染性颗粒/病灶内的每治疗周期感染性颗粒总数。

在一些实施方案中，当向全身、腹膜内或胸膜内施用重组病毒时，重组病毒每个治疗周期的总聚集剂量为每个治疗周期约1×10⁹个感染性颗粒至约1×10¹⁴个感染性颗粒，例如，2x10⁹，3x10⁹，4x10⁹，5x10⁹，6x10⁹，8x10⁹，1x10¹⁰，2x10¹⁰，3x10¹⁰，4x10¹⁰，5x10¹⁰，6x10¹⁰，8x10¹⁰，9x10¹⁰，1x10¹¹，1.5x10¹¹，2x10¹¹，3x10¹¹，4x10¹¹，6x10¹¹，8x10¹¹，9x10¹¹，1x10¹²，2x10¹²，3x10¹²，4x10¹²，5x10¹²，6x10¹²，8x10¹²，9x10¹²，1x10¹³，2x10¹³，3x10¹³，4x10¹³，5x10¹³，6x10¹³，8x10¹³，9x10¹³或其他在约1×10⁹感染性颗粒到约1×10¹⁴感染性颗粒内的每治疗周期感染性颗粒总数。

半胱天冬酶抑制剂剂量

在一些优选实施方案中，向全身、腹膜内或胸膜内施用半胱天冬酶抑制剂的施用剂量为约0.1mg/病灶至约5mg/病灶，例如0.2mg/病灶，0.5mg/病灶，1mg/病灶，1.5mg/病灶，2mg/病灶，2.5mg/病灶，3mg/病灶，3.5mg/病灶，4mgmg/病灶，4.5mg/病灶，或其他在约0.1mg/病灶至约5mg/病灶内的病灶内剂量。

在其他实施方案中，向全身、腹膜内或胸膜内施用半胱天冬酶抑制剂。在一些实施方案中，向全身、腹膜内或胸膜内施用半胱天冬酶抑制剂的施用剂量范围为约0.1mg/kg至约10mg/kg，例如0.2mg/kg，0.5mg/kg，1mg/kg，1.5mg/kg，2mg/kg，3mg/kg，4mg/kg，5mg/kg，6mg/kg7.5mg/kg，9mg/kg或其他在约0.1mg/kg至约10mg/kg内的半胱天冬酶抑制剂剂量。

适用于本文所述治疗方法的半胱天冬酶抑制剂包含但不限于emricasan、pralnacasan、vx-799、vx-765和ncx-1000。

具体施用剂量的确定

在一些实施方案中，待治疗的受试者在多个治疗周期中施用如本文所述的组合治疗。治疗周期数范围为1至7，例如2，3，4，5，6或其他在1至7内的治疗周期数。当受试者经过多个给药周期治疗时，化学治疗剂、重组病毒、γ-干扰素或半胱天冬酶抑制剂疗每个治疗周期的总聚集剂量可在不同的治疗周期之间变化。

在一些实施方案中，当待治疗的受试者患有基底细胞癌时，受试者的治疗周期包含在一周内2-3次施用。在其他实施方案中，当待治疗的受试者患有基底细胞癌时，治疗周期包含在两周内施用2-3次。

在一些优选实施方案中，当人类受试者要治疗适于向病灶内给药的癌症(例如基底细胞癌)时，5-fu和重组病毒都通过向病灶内给药。在典型性优选实施方案中，重组病毒是用于表达γ-干扰素的(非复制性)腺病毒，其施用剂量范围为约5×10¹⁰病毒颗粒/病灶至约3×10¹¹病毒颗粒/病灶，与剂量为约1mg/病灶至约25mg/病灶的氟尿嘧啶组合施用。上述的组合治疗每周重复一次，持续长达四周。

在受试者的病症确实改善的情况下，在可靠的医学建议下，可以暂时减少或暂时停止施用剂量一段时间(例如“药物假期”)。药物假期的长度可以在2天到1年之间不等，仅举例来说，包括2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天或60天。药物休假期间的剂量减少可以是10％至100％，仅举例来说，包括10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。

本领域普通技术人员将理解，如本文所述，化学治疗剂与重组病毒、γ-干扰素和/或半胱天冬酶抑制剂组合的合适治疗有效剂量将取决于诸如具体化学治疗剂、癌症阶段、需要治疗的受试者或宿主的特征(例如体重)以及待治疗的具体类型癌症的性质等因素。但其仍然可以以本领域已知的方式根据围绕病例的具体情况来确定，包括例如具体施用的化学治疗剂、施用途径、所治疗的癌症和所治疗的受试者。所需施用剂量可方便地以单剂或以同时(或在短时间内)或以适当间隔施用的分次剂量存在，例如每天两剂，三剂，四剂或多剂。

上述剂量可以根据许多变量而改变，不限于使用的化学治疗剂、重组病毒和/或半胱天冬酶抑制剂的活性和毒性、待治疗的癌症类型、给药方式、个别受试者的要求、所治疗的癌症阶段以及执业医生的判断。

根据本文所述的方法，化学治疗剂与其他药剂(例如至少一种重组病毒、一种γ-干扰素和/或一种半胱天冬酶抑制剂)组合施用于治疗癌症以实现协同治疗效果。通常，组合施用的药剂不一定必须在相同的药物组合物中施用，并且由于其不同的物理和化学特性，优选通过不同的途径施用。

化学治疗剂可以与任何重组、半胱天冬酶抑制剂和/或纯化的γ-干扰素同时施用(例如，同时、基本上同时或在相同的治疗方案内)或依次施用，其取决于癌症的性质和阶段、患者的病情以及实际使用的治疗药物的选择。

本领域技术人员已知，当治疗剂(例如化学治疗剂和重组病毒)用于治疗组合时，治疗有效剂量可以变化。

本领域技术人员能够理解，可以根据多种因素改变用于缓解的癌症的给药方案。这些因素包括所使用的治疗剂的特定组合、受试者患有的癌症类型和阶段以及受试者的年龄，体重，性别，饮食和治疗条件。

组成本文公开的组合疗法的化学治疗剂和其他治疗剂(例如重组病毒、半胱天冬酶抑制剂和/或γ-干扰素)可以作为如本文所述的组合药物组合物施用，或者以单独剂型通过相同或不同的给药途径基本同时施用。构成组合疗法的治疗剂也可以依次给药，其中任一种治疗剂通过需要两步给药的方法给药。两步给药方案可以为顺序施用活性药剂或间隔使用单独的活性药剂。多次给药步骤的时间间隔范围从几分钟至几小时，其取决于每种药剂的性质，例如药剂的效力、溶解度、生物利用度、血浆半衰期和动力学特征。还可以评估各种生理参数的昼夜变化以确定最佳给药间隔。

初始给药可以通过任何实用的途径，例如静脉注射，推注，5分钟至约5小时的输注，丸剂，胶囊，注射，局部施用，透皮贴剂等或其组合。在一些优选实施方案中，向病灶内注射给药。

本文所述方法的化学治疗剂、重组病毒、半胱天冬酶抑制剂和/或纯化的γ-干扰素的组合可用于制备根据本文所述任何方法中治疗患有癌症的受试者的药物。

组合药物组合物

本文描述了用于治疗癌症的组合药物组合物，其包含治疗有效量的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂以及下列中的至少一种：(i)用于在本文所述的人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒；(ii)半胱天冬酶抑制剂；(iii)γ-干扰素。

在一些优选实施方案中，组合药物组合物中的核苷酸类似物化学治疗剂是氟尿嘧啶。

本发明还描述了用于治疗癌症的组合药物组合物，其包含治疗有效量的：(i)非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂与(i)用于在本文所述的人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒；(ii)半胱天冬酶抑制剂；(iii)纯化的γ-干扰素中的至少一种的组合。

在一些实施方案中，包含在组合药物组合物中的非核苷酸化学治疗剂选自dna结合剂、第二线粒体衍生的半胱天冬酶活化剂(smac)模拟物、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、核苷类似物、蛋白酶体抑制剂和聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂。在一些优选实施方案中，包含在组合药物成分物中的化学治疗剂是曲贝替定或birinapant。

在一些优选实施方案中，用于上述组合药物组合物中使用的重组病毒是用于表达γ-干扰素的重组腺病毒。

控释组合药物组合物

本文还提供了控释药物组合物。控释是指从剂型中释放治疗剂，其中它们在延长时间段内根据所需特征掺入。控释曲线包括例如持续释放、延长释放、脉冲释放和延迟释放曲线。与立即释放组合物不同，控释组合物允许根据预定的特征在延长时间段内将药剂输送至受试者。与常规快速释放剂型相比，这种释放速率可以在延长时间段内提供有效治疗水平的治疗剂，从而提供更长的药理学反应时间，同时使副作用最小化。这种较长的反应时间提供了许多固有的益处，这些益处是相应的短效立即释放制剂所无法实现的。

在一些实施方案中，控释药物组合物包含：(i)在人受试者中用于表达一种或多种细胞因子的重组表达病毒；(ii)控释sio2基质凝胶。

在其他实施方案中，本文提供的控释药物组合物包含：(i)控释基质；(ii)分散在控释基质中的半胱天冬酶抑制剂和如本文文所述的分散在控释基质中的化学治疗剂；(iii)如本文所述的分散在控释基质中的化学治疗剂。任选地，含有半胱天冬酶抑制剂和化学治疗剂的控释药物制剂还包含在如本文所述的用于在人类受试者中表达一种或多种生物治疗剂的重组病毒。

在其他实施方案中，控释药物组合物包括：(i)控释基质；(ii)分散在控释基质中的重组病毒；(iii)如本文所述的分散在控释基质中的化学治疗剂。

本文还提供了控释药物组合物，其包含：(i)控释基质；(ii)分散在控释基质中的纯化的γ-干扰素；(iii)如本文所述的分散在控释基质中的化学治疗剂。

本文提供的控释药物组合物允许定制组合制剂中活性药剂的释放曲线，使得这些活性药剂中的一种或多种在优选的时间间隔内发生释放。在一些优选实施方案中，控释药物组合物中的化学治疗剂是核苷酸类似物化学治疗剂，例如氟尿嘧啶。

在其他实施方案中，控释药物组合物中的化学治疗剂是非核苷酸类似物化学治疗剂，例如曲贝替定或birinapant。在其他实施方案中，化学治疗剂是曲贝替定。

在一些实施方案中，药物组合物包含约0.7mg至约340mg的核苷酸类似物化学治疗剂，例如1mg，3mg，5mg，10mg，20mg，40mg，60mg，80mg，100mg。120mg，150mg，280mg，200mg，250mg，270mg或其他在约0.7mg至约340mg内剂量的化学治疗剂。在一些实施方案中，控释药物组合物包含约5mg至约200mg的核苷酸类似物化学治疗剂。在其他实施方案中，控释药物组合物包含约25mg至约150mg的核苷酸类似物化学治疗剂。

在一些实施方案中，活性药剂中的一种或多种在约1小时至约5周的时间段内释放，例如2小时，3小时，4小时，6小时，8小时，12小时，18小时，24小时，2天，3天，5天，1周，10天，2周，18天，3周，4周或其他在约1小时至约5周内的时间段。

在一些实施方案中，控释释放曲线在给药后的释放期开始时具有较高的释放速率，然后随时间降低(一级释放动力学)。在其他实施方案中，释放速率在施用后的释放期间逐渐增加。在优选实施方案中，释放曲线在给药后的整个释放期间保持相对恒定，直至释放所有活性剂(零级释放动力学)。

在优选实施方案中，在施用控释药物组合物后，化学治疗剂的释放曲线适于避免在人类受试者中引起超过中度的不良事件。在一些实施方案中，化学治疗剂的释放速率为每日总剂量的约0.5％至每日总剂量的约10％，例如0.6％，0.8％，1％，1.1％，1.2％，1.5％，1.8％，2％，2.5％，2.75％，3％，3.5％，4％，6％，7％，8％，9％或其他在约0.5％至约10％内的每日总剂量百分比。

在一些实施方案中，控释制剂中化学治疗剂的释放速率(占总剂量的百分比)不同于制剂中另一种活性剂的释放曲线(例如重组病毒和/或半胱天冬酶抑制剂)。

在任何上述药物组合物的一些实施方案中，化学治疗剂是如本文所述的核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。在优选的实施方案中，核苷酸类似物化学治疗剂是氟尿嘧啶。

在任何上述药物组合物的其他实施方案中，化学治疗剂是非核苷酸类似物或核苷酸前体类似物化学治疗剂。在一些实施方案中，上述组合药物组合物中的化学治疗剂选自：dna结合剂、第二线粒体衍生的半胱天冬酶活化剂(smac)模拟物、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂。在一些优选实施方案中，化学治疗剂是曲贝替定或birinapant。

在一些实施方案中，当控释药物组合物包含γ-干扰素时，γ-干扰素以约1μg/天至约10μg/天的速率释放进行全身输送，例如2μg/天，3μg/天，4μg/天，5μg/天，7μg/天，8μg/天或其他在约1μg/天至约10μg/天范围内的全身输送纯化的γ-干扰素释放速率。

在一些实施方案中，当控释药物组合物包含γ-干扰素时，γ-干扰素以约5ng/天至约200ng/天的速率释放进行局部输送，例如，在肿瘤内灌输，例如10ng/天，20ng/天，30ng/天，50ng/天，75ng/天，100ng/天，125ng/天，150ng/天，175ng/天或其他在约10ng/天到约200ng/天内的局部输送释放速率。

用于控释药物组合物的合适的控释基质已在本领域中描述。在一些实施方案中，控释基质包含用于持续输送包含小分子药物和重组病毒的活性治疗剂的生物可吸收的溶胶-凝胶衍生的烷氧基硅烷si(or)4基质凝胶(“sio2基质凝胶”)。其如国际专利申请wo2005082781“制备调节生物可吸收溶胶-凝胶法二氧化硅的方法”和wo2007135224“保存硅胶基质材料的方法、使用该方法生产的包装袋及该包装袋作为包装二氧化硅产品的应用”中所述。这项技术已经由delsitechltd(turku,finland)商业化。

简而言之，通过溶胶-凝胶法制备sio2基质凝胶溶胶-凝胶，其中sio2基质凝胶由包含sio2的凝胶化的溶胶制备。sio2衍生的溶胶-凝胶通常由醇盐或无机硅酸盐制备，所述醇盐或无机硅酸盐通过水解形成溶胶，所述溶胶含有部分水解的二氧化硅物质或完全水解的硅酸。随后的含sioh物质的缩合反应导致形成较大的二氧化硅物质，并且其中硅氧烷键的量增加。此外，物质积聚，形成纳米尺寸的颗粒和/或更大的聚集体，直到形成凝胶。在凝胶形式中，固态占主导地位，但该体系仍然含有不同含量的液体，该材料在干燥之前通常是柔软的和具有粘弹性，并且在彻底干燥后硬且脆。在溶胶的形式中，液态占主导地位，但该体系含有不同量的固相，并且该材料仍然是可流动的。从制备sio2溶胶直到溶胶变成凝胶的时间称为溶胶老化时间。溶胶老化时通常发生自发干燥，使得体系允许在环境条件下蒸发。通过在凝胶形成之前向溶胶中加入所需量的(i)化学治疗剂和(ii)用于表达生物治疗剂的重组病毒、半胱天冬酶抑制剂、和/或纯化的γ-干扰素中的至少一种，来实现控释药物组合物的产生。

可以根据需要调节基于sio2凝胶的控释药物组合物中活性药剂的释放速率。通常，对于水凝胶与醇盐的摩尔比约为2的sio2凝胶，sio2凝胶基质的溶解速率和活性药剂的释放速率最大，其比率低于或高于此，都会导致较慢的溶解和释放速率。此外，还应注意，包含在sio2凝胶基质中的大量活性药剂增加了基质的溶解和活性药剂的释放速率。

控释药物组合物可以制备成纳米微球，主要用于口服、肠胃外、肺部、局部、透皮和外科手术植入给药。

本领域普通技术人员已知的许多其他类型的控释系统适用于本文所述的制剂。这种输送系统的实例包括，例如，聚合物类体系，如聚乳酸和聚乙醇酸，聚酰胺和聚己内酯；多孔基质，非聚合物脂质类体系，包括固醇，如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸，或中性脂肪，如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；硅橡胶体系；肽类体系；蜡涂层，生物侵蚀性剂型，使用常规粘合剂的压制片剂等。详见例如，us4327725，4624848，4968509，5461140，5456923，5516527，5622721，5686105，5700410，5977175，6465014和6932983。

在一些实施方案中，任何上述药物组合物还包含如本文所述的免疫应答诱导或增强剂(例如纯化的趋化因子、纯化的极化细胞因子或tlr激动剂)。

治疗剂的配方

本文所述的任何治疗剂可以单独配制或以如本文所述的组合药物组合物形式配制，以用于通过任何常规手段向受试者给药，给药途径包括但不限于病灶内、肠胃外(例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或胸膜内)、口服或透皮。

治疗剂可以配制成任何合适的剂型，包括但不限于可注射制剂、水性口服分散液、用于待治疗患者的口服摄取的液体、喷雾、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等、固体口服剂型、控释制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及速释和控释混合制剂。

口服使用的药物制剂可以通过将一种或多种固体赋形剂与一种或多种本文所述的治疗剂混合获得，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在添加合适的助剂后加工颗粒混合物以获得片剂或糖衣丸核心。合适的赋形剂包括，例如，填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；或其他如聚乙烯吡咯烷酮(pvp或聚维酮)或磷酸钙。如果需要，可以加入崩解剂，如交联的交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

除治疗剂外，药物固体剂型还可包括一种或多种药学上可接受的添加剂，例如相容的载体、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂其中的一种或多种组合。

适用于本文所述固体剂型的载体包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、氯化钠、三钙磷酸盐、磷酸氢二钾、硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、蔗糖、微晶纤维素、乳糖、甘露糖醇等。

适用于本文所述固体剂型的填充剂包括但不限于乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡聚糖、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸酯硬脂酸酯(hpmcas)、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠、聚乙二醇等。

为了尽可能有效地从固体剂型基质中释放治疗剂，通常在制剂中使用崩解剂，尤其是当剂型用是使用粘合剂压制时。当水分被吸收到剂型中时，崩解剂通过溶胀或毛细管作用帮助破坏剂型基质。适用于本文所述固体剂型的崩解剂包括但不限于天然淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉，如national1551或amijel，或淀粉羟乙酸钠，如或纤维素如木制品甲基晶体纤维素，如avicelph101、ph102、ph105、p100、和甲基纤维素，交联羧甲基纤维素，或交联纤维素，如交联羧甲基纤维素钠交联羧甲基纤维素或交联羧甲基纤维素，交联淀粉，如羟基乙酸淀粉钠，交联聚合物如交联聚维酮，交联聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸盐如海藻酸盐或藻酸盐如海藻酸钠，粘土如hv(硅酸铝镁)，胶如琼脂、瓜尔胶、蝗虫豆、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，羟基乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑橘渣，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠与淀粉的组合等。

粘合剂赋予固体口服剂型配方粘结性：对于粉末填充的胶囊配方，它们有助于形成可以填充到软壳或硬壳胶囊中的栓塞，并且对于片剂配方，它们确保片剂在压制后保持完整并且有助于在压制或填充步骤前确保混合均匀性。适合用作本文所述固体剂型中的粘合剂的材料包括但不限于羧甲基纤维素，甲基纤维素(如)，羟丙基甲基纤维素(如羟丙基甲基纤维素usppharmacoat-603，乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(aqoatehs-lf和hs)，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素(如)，乙基纤维素(如)，微晶纤维素(如)，微晶葡萄糖，直链淀粉，硅酸铝镁，多糖酸，膨润土，明胶，聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物，交联聚维酮，聚维酮，淀粉，预胶化淀粉，黄蓍胶，糊精，糖，如蔗糖(如)，葡萄糖，右旋葡萄糖，糖蜜，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇(如)，乳糖，天然或合成树胶，如阿拉伯树胶，黄蓍胶，印度胶，isapol外壳粘液，淀粉，聚乙烯吡咯烷酮(如cl，cl，xl-10，和k-12)，落叶松阿拉伯半乳聚糖，聚乙二醇，蜡，海藻酸钠等。

通常，在粉末填充的明胶胶囊制剂中使用20-70％的粘合剂。无论是直接压片，湿法制粒，碾压，还是使用其他赋形剂(如填料本身可以作为中等粘合剂)，片剂配方中的粘合剂用量水平各不相同。本领域技术人员可以确定制剂中粘合剂含量，但片剂制剂中粘合剂的使用量高达70％是常见的。

适用于本文所述固体剂型的润滑剂或助流剂包括但不限于硬脂酸，氢氧化钙，滑石，玉米淀粉，硬脂酰富马酸钠，碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌，硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸锌，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇如carbowax^tm，peg4000，peg5000，peg6000，丙二醇，油酸钠，山嵛酸甘油酯，棕榈酸硬脂酸甘油酯，苯甲酸甘油酯，月桂基硫酸镁或十二烷基硫酸钠等。

适用于本文所述固体剂型的稀释剂包括但不限于糖(包括乳糖，蔗糖和右旋葡萄糖)，多糖(包括葡聚糖和麦芽糖糊精)，多元醇(包括甘露醇，木糖醇和山梨糖醇)，环糊精等。

适用于本文所述固体剂型的润湿剂包括，例如，油酸，单硬脂酸甘油酯，单油酸山梨糖醇酯，单月桂酸脱水山梨糖醇酯，油酸三乙醇胺，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，季铵化合物(如)，油酸钠，十二烷基硫酸钠，硬脂酸镁，多库酯钠，三醋精，维生素etpgs等。

适用于本文所述固体剂型的表面活性剂包括，例如，十二烷基硫酸钠，脱水山梨糖醇单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，聚山梨醇酯，聚合物，胆汁盐，单硬脂酸甘油酯，环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如(basf)等。

适用于本文所述固体剂型的悬浮剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮k12，聚乙烯吡咯烷酮k17，聚乙烯吡咯烷酮k25，或聚乙烯吡咯烷酮k30，聚乙二醇，例如，分子量为约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的聚乙二醇，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(s630)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚山梨醇酯-80，羟乙基纤维素，海藻酸钠，树胶，例如黄蓍胶和阿拉伯树胶，瓜尔胶，黄原胶，包括黄原胶，糖，纤维素，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚山梨醇酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨糖醇单月桂酸酯，聚维酮等。

应当理解，在本文所述的固体剂型中使用的添加剂之间存在相当大的重叠部分。因此，上面列出的添加剂应仅视为示例性的，而非限制性的，添加剂类型包括在本文所述的固体剂型中。根据所需的具体性质，本领域技术人员可以轻易地确定这些添加剂的量。

用于口服给药的液体制剂剂型可以是水悬浮液，其选自包括但不限于药学上可接受的水性口服分散液，乳液，溶液，酏剂，凝胶和糖浆。

如usppharmacists'pharmacopeia(2005年版，第905章)中所定义，本文所述的水性悬浮液和分散体可保持均匀状态至少4小时。均匀性应通过与确定整个组合物的均匀性一致的取样方法确定。在一个实施方案中，可以通过持续少于1分钟的物理搅拌将水性悬浮液重新悬浮成均匀的悬浮液。在另一个实施方案中，可以通过持续少于45秒的物理搅拌将水性悬浮液重新悬浮成均匀的悬浮液。在另一个实施方案中，可以通过持续少于30秒的物理搅拌将水性悬浮液重新悬浮成均匀的悬浮液。在另一个实施方案中，不需要通过搅拌来保持均匀的水分散体。

除了上面列出的添加剂之外，液体制剂还可以包括本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂。示例性乳化剂是乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，二甲基甲酰胺，十二烷基硫酸钠，二十二烷基磺酸钠，胆固醇，胆固醇酯，牛磺胆酸，磷脂酰胆碱，油，例如，棉籽油，花生油，玉米胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇，脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，或这些物质的混合物等。

注射用配方

适用于肌肉、皮下或静脉注射的制剂可包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液，分散液，悬浮液或乳液，以及用于重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体，稀释剂，溶剂或载体的实例，包括水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，甘油，聚氧乙烯蓖麻油等)，其合适的混合物，植物油(如橄榄油)和注射用有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。适用于皮下注射的制剂还可含有添加剂，例如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸等，可以确保防止微生物的生长。还可能需要包括等渗剂，例如糖，氯化钠等。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现注射用药物形式的延长吸收。

对于静脉注射，本文所述的治疗剂可以在水溶液中配制，优选在生理相容的缓冲液中，例如hank溶液，ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于透粘膜给药，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。对于其他肠胃外注射，合适的制剂可包括水性或非水性溶液，优选具有生理相容性的缓冲剂或赋形剂。此类赋形剂通常是本领域已知的。

肠胃外注射可涉及推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，并添加有防腐剂。本文所述的药物组合物以适于肠胃外注射的形式作为油性或水性载体中的无菌悬浮液，溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶形式治疗剂的水溶液。另外，治疗剂的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或右旋葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加治疗剂溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。或者，治疗剂可以是粉末形式，在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)来构成。本文所述的治疗剂可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。在单位剂型中，将制剂分成含有适量一种或多种治疗剂的单位剂量。单位剂量可以呈包含离散量制剂的包装形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊以及小瓶或安瓿中的粉末。含水悬浮液组合物可以装在单剂不可再密封容器中。或者，可以使用多剂可再密封容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。仅举例来说，用于肠胃外注射的制剂可以以单位剂型存在，其包括但不限于安瓿，或在多剂量容器中，并添加有防腐剂。

具体实施方式

实施例1：氟尿嘧啶与表达纯化的γ-干扰素(γ-ifn)的腺病毒(asn-002)组合体外协同诱导hela(rip3^-)或hela(rip3⁺)细胞死亡

材料和方法

响应asn-002腺病毒转导的细胞死亡动力学

将hela-rip3^-或hela-rip3⁺细胞接种在六孔板中，并在感染前粘附24小时。用各种多重感染(moi)的asn-002感染细胞，其中asn-002是用于表达γ-ifn的复制缺陷型腺病毒。用病毒在无血清培养基中转导细胞2小时。然后加入完整的dmem培养基并在5天内评估细胞。

氟尿嘧啶的剂量响应

将hela-rip3^-或hela-rip3⁺细胞(250,000/孔)接种在完整的dmem培养基中的六孔板中。24小时后，用多剂的氟尿嘧啶治疗细胞。通过台盼蓝排除分析法在治疗后48小时测定细胞活力。

响应氟尿嘧啶加asn002腺病毒的组合转导的细胞死亡动力学

在感染前24小时将hela-rip3^-细胞(250,000/孔)细胞接种在六孔板中。asn-002感染在无血清培养基中进行，感染复数(moi)为10。两剂氟尿嘧啶与病毒共同施用，并在3天内分析细胞死亡动力学。

在泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂存在下，hela-rip3^-或hela-rip3⁺细胞中tnfα诱导细胞死亡

在用tnfα和环己酰亚胺(tcz治疗)治疗前24小时，将hela-rip3细胞(250,000/孔)接种在六孔板中。在tnfα(50ng/ml)治疗前1小时，用chx(250ng/ml)和泛半胱天冬酶抑制剂zvad(50μm)预治疗细胞。通过台盼蓝排除分析法在12-15小时后测定细胞活力。

结果

响应asn-002腺病毒转导的细胞死亡动力学

如图1所示，在10，100和1000的多重感染下，用asn-002转导hela-rip3^-(“hela”)或hela-rip3⁺(“hela-rip”)细胞导致细胞死亡在5天内逐渐加快，t1/2分别约为4天，3天和2.5天。hela-rip3^-和hela-rip3⁺之间细胞死亡的时间相似，但是，moi为10或100的hela-rip3⁺细胞的时间稍快。

氟尿嘧啶的剂量响应

确定核苷酸类似物化学治疗剂氟尿嘧啶的剂量响应曲线(图2)。48小时的ed50约为50μm。

tnfα在hela细胞中对细胞死亡的诱导是rip3依赖性和凋亡性细胞死亡非依赖性的。

如图3所示，在任何条件下，tnfα都不能在hela(rip3^-)细胞中诱导细胞死亡。相反，相对于未治疗的细胞，即使存在凋亡性细胞死亡抑制剂(环己酰亚胺加zvad)，tnfα仍诱导高水平的细胞死亡(约70％)。这些数据表明，tnfα主要(如果非唯一)通过rip3依赖性途径诱导细胞死亡，其可能是坏死性细胞死亡。

用氟尿嘧啶和asn-002的组合协同诱导hela(rip3^-)细胞的细胞死亡。

如图4所示，氟尿嘧啶与γ-ifn表达腺病毒载体(asn-002)转导的组合诱导的细胞死亡水平显著高于基于仅通过这些个体药剂(化学治疗剂或asn-002)诱导的细胞死亡百分比总和所预期的细胞死亡水平。这表明氟尿嘧啶和γ-ifn表达在诱导癌细胞死亡中的协同作用。

实施例2：在rip3⁺和rip3^-hela细胞中存在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂的情况下，氟尿嘧啶、asn-002、氟尿嘧啶加asn-002、氟尿嘧啶加纯化的γ-ifn诱导细胞死亡

为了了解氟尿嘧啶或asn-002单独和联合治疗激活数种可能的细胞死亡途径中的哪一种，在hela(rip3⁺/具有坏死性细胞死亡能力)细胞中存在凋亡性细胞死亡和/或坏死性细胞死亡抑制剂的情况下，使用这些药剂进行实验。

如图5a所示，10μm氟尿嘧啶(加上阴性对照adcmv-null病毒)在hela-rip3⁺细胞中诱导约35％的细胞死亡。值得注意的是，相对于单独使用氟尿嘧啶治疗，在泛半胱天冬酶抑制剂zvad(50μm)存在下，氟尿嘧啶诱导的细胞死亡率大大增加，死亡率约80％。在坏死性细胞死亡抑制剂necrosulfonamide(1μm)存在下的氟尿嘧啶所诱导的细胞死亡水平仅略高于单独使用氟尿嘧啶时的细胞死亡率(45％vs35％)。在凋亡性细胞死亡抑制剂(zvad)和坏死性细胞死亡抑制剂(nsa)都存在的情况下的氟尿嘧啶所诱导的细胞死亡水平与单独使用氟尿嘧啶相似。

如图5b所示，用氟尿嘧啶加asn002的组合治疗诱导约90％的协同细胞死亡，其在zvad存在下增加至约97％。nsa没有显著改变由单独组合诱导的细胞死亡。相反，在凋亡性细胞死亡(zvad)和坏死性细胞死亡(nsa)抑制剂都存在的情况下，氟尿嘧啶加asn-002大大减少了细胞死亡水平至37％，其与单独使用氟尿嘧啶观察到的结果相近。

单独使用asn-002(图6b)或单独使用纯化的γ-ifn(图6c)治疗分别诱导约25％和30％的细胞死亡。如单独使用氟尿嘧啶所观察到的，在zvad存在下单独使用asn-002治疗大大增强了asn-002诱导的细胞死亡水平至约60％，而在nsa存在下单独使用asn治疗与不用asn治疗诱导了相同水平的细胞死亡。与仅在zvad存在下用asn-002治疗不同，在zvad和nsa都存在下用asn-002治疗，其导致细胞死亡水平不超过仅由asn引起的细胞死亡水平。

在后续实验中，对rip3^-(坏死性凋亡缺陷型)hela细胞进行与上述相同的治疗。如图7a和7b所示，单独使用氟尿嘧啶或与adcmv组合治疗诱导rip3^-hela细胞中的细胞死亡水平与在rip3⁺hela细胞中响应相同治疗所观察到的结果相近。然而，在rip3^-hela细胞中存在zvad时用氟尿嘧啶治疗不仅不能增加相对于单独使用氟尿嘧啶(或氟尿嘧啶加adcmv)所诱导的细胞死亡，甚至还略低。单独使用asn-002(图8b)或单独使用纯化的γ-ifn(图8c)治疗rip3^-hela细胞分别诱导约35％和30％的细胞死亡。在zvad存在下使用这些药剂治疗导致了细胞死亡的显著但不完全的挽救。

用氟尿嘧啶加asn002(图7c)或氟尿嘧啶加纯化的γ-ifn(图7d)的组合治疗rip3^-hela细胞也分别协同诱导约83％和73％的细胞死亡水平。然而，在zvad存在下，组合治疗分别降低至68％和55％的细胞死亡水平。

这些结果表明，在凋亡性细胞死亡抑制剂(例如zvad)存在抑制的情况下，组合治疗诱导的细胞死亡至少部分地被“分流”至坏死性细胞死亡，其证明为(1)rip3⁺细胞死亡在zvad和nsa存在的情况下大大减少，但nsa本身并没有影响；(2)zvad不能加剧rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞的细胞死亡。有趣的是，即使在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡的细胞死亡途径都受到抑制的情况下，仍然观察到残留的细胞死亡，这表明了凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡非依赖性的细胞死亡途径，其中凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡均被抑制。或者，这可能反映了抑制剂不能完全抑制凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡的细胞死亡途径。由于已知许多癌症缺乏凋亡性细胞死亡或坏死性细胞死亡的细胞死亡途径，氟尿嘧啶和γ-ifn的组合在缺乏这些细胞死亡途径中的任何一种或两种的细胞中，所诱导细胞死亡的能力表明这种治疗很可能对广泛的癌症，特别是对常规化学治疗方法难以治愈或耐药的癌症具有高效性。

实施例3：化学治疗剂与表达γ-干扰素的腺病毒(asn-002)组合体外协同诱导hela(rip3^-)或hela(rip3⁺)细胞死亡

材料和方法

响应asn-002腺病毒转导的细胞死亡动力学

将hela-rip3^-或hela-rip3⁺细胞接种在六孔板中，并在感染前粘附24小时。用各种多重感染(moi)的asn-002感染细胞，其中asn-002是用于表达γ-ifn的复制缺陷型腺病毒。用病毒在无血清培养基中转导细胞2小时。然后加入完整的dmem培养基并在5天内评估细胞。

化疗药物的剂量响应

将hela-rip3^-或hela-rip3⁺细胞(250,000/孔)接种在完整的dmem培养基中的六孔板中，24小时后，用多剂的氟尿嘧啶、birinapant或顺铂治疗细胞。通过台盼蓝排除分析法在治疗后48小时测定细胞活力。

响应化学治疗剂加asn-002腺病毒的组合转导的细胞死亡动力学

在感染前24小时将hela-rip3^-细胞(250,000/孔)细胞接种在六孔板中。asn-002感染在无血清培养基中进行，感染复数(moi)为10。两剂化学治疗剂与病毒共同施用，并在3天内分析细胞死亡动力学。

在泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂存在下，hela-rip3^-或hela-rip3⁺细胞中tnfα诱导细胞死亡

在用tnfα和环己酰亚胺(tcz治疗)治疗之前24小时，将hela-rip3细胞(250,000/孔)接种在六孔板中。在tnfα(50ng/ml)治疗前1小时，用chx(250ng/ml)和泛半胱天冬酶抑制剂zvad(50μm)预治疗细胞。通过台盼蓝排除分析法在12-15小时后测定细胞活力。

结果

响应asn-002腺病毒转导的细胞死亡动力学

如图1所示，在10，100和1000的多重感染下，用asn-002转导hela-rip3^-(“hela”)或hela-rip3⁺(“hela-rip”)细胞导致细胞死亡在5天内逐渐加快，t1/2分别约为4天，3天和2.5天。hela-rip3^-和hela-rip3⁺之间细胞死亡的时间相似，但是，moi为10或100的hela-rip3⁺细胞的时间稍快。

剂量响应

在hela-rip3^-(“hela”)和hela-rip3⁺(“hela-rip”)细胞中测定birinapant(图9)、曲贝替定(图10)和顺铂(图11)的剂量响应曲线。48小时的ed50约为30μm(birinapant)、10nm(曲贝替定)和10μg/ml(顺铂)。

tnfα对细胞死亡的诱导在hela细胞中是rip3依赖性和细胞凋亡非依赖性的。

如图12所示，在任何条件下，tnfα都不能在hela(rip3^-)细胞中诱导细胞死亡。相反，相对于未治疗的细胞，即使存在凋亡性细胞死亡抑制剂(环己酰亚胺加zvad)，tnfα仍诱导高水平的细胞死亡(约70％)。这些数据表明，tnfα主要(如果非唯一)通过rip3依赖性途径诱导细胞死亡，其可能是坏死性细胞死亡。

用birinapant和asn-002的组合或曲贝替定和asn-002的组合协同诱导hela(rip3^-)细胞中的细胞死亡。

如图13(birinapant)和图14(曲贝替定)所示，这些化学治疗剂中的任意一种与γ-ifn表达腺病毒载体(asn-002)转导的组合诱导的细胞死亡水平显著高于基于仅通过这些个体药剂(化学治疗剂或asn-002)诱导的细胞死亡百分比总和所预期的细胞死亡水平。这表明这些试剂在诱导癌细胞死亡中的协同作用。这些结果与顺铂加asn-002组合获得的结果形成对比(图15)，实际上，其诱导的细胞死亡水平与相同浓度的顺铂诱导的细胞死亡水平大致相同(15μg/ml)。

实施例4：化学-病毒组合治疗的协同作用取决于γ-ifn的表达

为了确定在用asn-002转导后在hela(rip3^-)细胞中观察到的协同细胞死亡是否依赖于γ-ifn的表达(“有效载荷”)，使用ad-cmvnull(仅载体)腺病毒(阴性对照)以及外源γ-ifn(阳性对照)各自与birinapant组合进行实验。

如图16所示，birinapant与ad-cmv-null病毒组合(图16a)诱导的细胞死亡水平与单独使用birinapant在相同浓度下诱导的细胞死亡水平无法区分。与该发现一致，单独使用ad-cmv-null病毒未能诱导显著的细胞死亡(图16b)。重要的是，如图16c所示，纯化的γ-ifn与birinapant组合协同诱导的细胞死亡水平与asn-002加birinapant组合协同诱导所观察到的细胞死亡水平相似。这些结果表明用asn-002加birinapant观察到的协同细胞死亡依赖于γ-ifn的表达而非依赖于腺病毒本身的存在。

实施例5：在rip3⁺和rip3^-hela细胞中存在凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡抑制剂的情况下，曲贝替定、asn-002、曲贝替定加asn-002或纯化的γ-ifn诱导细胞死亡

为了了解单独使用曲贝替定治疗和与γ-ifn(表达或外源添加的病毒)组合激活数种可能的细胞死亡途径中的哪一种，在hela(rip3⁺/具有坏死性凋亡能力)细胞和hela(rip3^-/坏死性凋亡缺陷)细胞中均存在凋亡性细胞死亡和/或坏死性细胞死亡抑制剂的情况下，使用单独这些试剂或组合进行实验。

如图19a和19c所示，2.5nm曲贝替定(加上阴性对照adcmv-null病毒或单独使用)在hela-rip3⁺细胞中诱导约35％的细胞死亡。在泛半胱天冬酶抑制剂zvad存在下，相对于单独使用曲贝替定治疗，其诱导的细胞死亡显著增加至约95％(图19c)。在坏死性细胞死亡抑制剂nsa存在下，曲贝替定诱导的细胞死亡水平略低于单独使用曲贝替定治疗所观察到的细胞死亡水平(图19c)。在凋亡性细胞死亡(zvad)和坏死性细胞死亡(nsa)抑制剂均存在的情况下，曲贝替定诱导约60％的细胞死亡水平，此介于单独使用曲贝替定和曲贝替定加zvad治疗所诱导的细胞死亡的中间水平，这表明在这些条件下曲贝替定可通过除凋亡性细胞死亡或坏死性细胞死亡之外的途径诱导大量细胞死亡。

单独使用asn002(图17b)和单独使用纯化的γ-ifn(图17c)在rip⁺hela细胞中观察到了相似的结果，其相较于对照病毒(图17a)未观察到细胞死亡。asn002(图18b)显示在zvad存在下，在rip^-hela细胞中细胞死亡显著减少，单独使用的γ-ifn在zvad存在下，在rip3^-细胞中的结果也是如此(图18c)，其相较于对照adcmv病毒(图18a)在任何条件下均未观察到细胞死亡。

如图19b所示，用曲贝替定与asn002的组合治疗协同诱导约80％的细胞死亡，其在zvad存在下增加至约97％。nsa没有显著改变组合治疗所诱导的细胞死亡。在凋亡性细胞死亡抑制剂(zvad)和坏死性细胞死亡抑制剂(nsa)均存在的情况下，曲贝替定与asn-002的组合(图19b)诱导了约80％的细胞死亡水平，其与单独使用组合治疗观察到的结果相似，但低于仅存在zvad凋亡抑制剂时观察到的结果。用曲贝替定与纯化的γ-ifn的组合观察到类似的规律(图19d)，尽管这种组合导致比曲贝替定加asn-002的组合稍低的细胞死亡。

在rip3^-(坏死性凋亡缺陷)hela细胞中使用相同的治疗方案进行测试。单独使用曲贝替定(图20a)或加adcmv-null(图20b)诱导rip3^-hela细胞中的细胞死亡水平(33％)与在rip3⁺hela细胞中观察到的结果相似。令人惊讶的是，尽管凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡的抑制表明，在这些条件下，曲贝替定有效地参与除凋亡性细胞死亡或坏死性细胞死亡以外的细胞死亡途径，但单独使用曲贝替定(图20a)或加上adcmv-null(图20b)在zvad(87％细胞死亡)存在下治疗所诱导的rip3^-hela细胞中的细胞死亡相对于单独使用曲贝替定治疗大大增加。

如图20c所示，用曲贝替定与asn-002的组合治疗诱导了与在rip3⁺hela细胞中观察到的相似的约77％的协同细胞死亡，其在zvad存在下增加至约88％(图13c)，与在zvad存在下单独使用曲贝替定治疗所观察到的水平相似。同样地，曲贝替定与纯化的γ-ifn组合产生类似的结果(图20d)。

这些数据有力地表明，在凋亡性细胞死亡、坏死性细胞死亡或两者都被阻断的条件下，单独使用曲贝替定或以组合形式通过除凋亡性细胞死亡或坏死性细胞死亡(例如，parthanatos或自噬性细胞死亡)以外的细胞死亡途径诱导高水平的细胞死亡。因此，曲贝替定(单独使用或组合治疗)对癌细胞的功效可能不仅可以保留对抗细胞凋亡缺陷的癌细胞，而且实际上可以增强。实际上，这一结论也可能适用于曲贝替定治疗凋亡性细胞死亡和坏死性细胞死亡途径均有缺陷的癌症。

本领域技术人员将理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可对具体实施方案中所示的本发明进行各种变化和/或修改。因此，本发明的实施例在任何方面都被认为是说明性的而非限制性的。

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本申请要求于2016年7月25日提交的au2016902922和au2016902923的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

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