制备用于药物用途的对映纯顺式-咪唑啉化合物的合成方法与流程

某些顺式-咪唑啉是mdm2和mdmx的拮抗剂。它们通过触发或恢复具有缺陷或无活性p53肿瘤抑制蛋白的细胞中的细胞凋亡而用作癌症化学治疗剂。这例如在美国专利no.6,734,302；6,617,346；和7,705,007以及授权前出版物us2005/0282803a1；us2007/0129416a1；和us2013/0225603a1中进行了解释。顺式-咪唑啉(如nutlin-3a)也正在开发用于杀死衰老细胞和治疗与衰老相关的病症：us2016/0339019a1。

miyazakietal，bioorganic&medicinalchemistryletters23(2013)728-732讨论了具有二氢咪唑并噻唑支架的新型p53-mdm2相互作用抑制剂的先导化合物优化。yuetal，int.j.mol.sci.2014,15,15741-15753讨论了磺酰胺和三唑苯并二氮杂的设计、合成和生物学评价。cn103923067b描述了mdmx/mdm2小分子抑制剂、它们的制备和用途。

这些顺式-咪唑啉的生物活性通常存在于单一对映体中。已经描述了几种制备经适当取代的顺式-咪唑啉的单对映体形式的方法。在wo2007/082805和相关专利中，化合物首先以外消旋形式制备，然后使用手性-hplc策略分离。us2012/0088915a1描述了另一种方法，其中使用手性催化剂将不对称性引入关键的键形成步骤。

然而，这些方法对于大规模制备上述类型的手性纯顺式-咪唑啉都不是最优的。典型的手性hplc-柱具有负载限制；为了放大合成，需要多次纯化，从而增加合成所需的时间，以及显著增加溶剂和改性剂的使用。us2012/0088915a1中描述的催化剂本身通过多步合成路线制备；最终目标的总体合成需要大量额外的化学转化。

技术实现要素：

本发明提供了通过手性拆分对映选择性合成顺式-咪唑啉及相关结构的方法。手性酸用于通过选择性结晶从外消旋混合物中分离顺式-咪唑啉的对映体前体。两种对映体可通过互补途径环化成所需的顺式-咪唑啉。根据本发明可以合成化合物，对映体过量高达99％。根据本发明制备的顺式-咪唑啉可用于治疗癌症、杀死衰老细胞或治疗与衰老相关的疾病。所描述的方法易于放大并且适合于制备足以用于临床开发的量的材料。

本发明包括化学合成顺式-咪唑啉的方法。根据式(a)的前体的外消旋混合物可以与根据式(b)的手性非外消旋芳香酸组合。然后将在反应条件下与手性酸缔合以产生最低限度可溶的结晶或无定形盐的前体的立体异构体与另一种对映体分离，所述另一种对映体可以与或也可以不与手性酸缔合。

这可以示例为：

本发明利用了当a的两种对映体中的一种与b的单一对映体相互作用以形成非对映体盐时产生的物理化学性质的差异。可以使用利用该差异的任何分离方法：例如，在一种对映异构体形成晶体或盐但另一种不形成晶体或盐的条件下结晶或盐形成。

在a与b反应之后，在进一步处理之前，通过例如用碱性溶液洗涤盐，可以将光学富集的a转化为游离碱。在一些情况下，每种对映异构体可以单独处理，并通过不同的化学步骤顺序，以产生相同的目标顺式-咪唑啉。该方法在化学上是有效的，因为a的两种对映体都转化为产物。

在目的是合成4-[[(4s,5r)-4,5-双(4-氯苯基)-4,5-二氢-2-[4-甲氧基-2-(1-甲基乙氧基)苯基]-1h-咪唑-1-基]羰基]-2-哌嗪酮(nutlin-3a)的情况下，该方法的几种不同的应用是可能的。r¹可以是例如叔丁氧基羰基(boc)、苄氧基羰基(cbz)、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、烯丙氧基羰基(alloc)或另一种胺保护基。替代地，r¹可以是最终将并入最终产物中的片段，例如

r³可以是苯基，x¹和x²可以是氯，并且手性酸(式b)可以是d-扁桃酸或l-扁桃酸。

随后的合成步骤通常包括选择性衍生化式a的两个氮原子，然后进行闭环反应以形成咪唑啉环。例如，为了制备nutlin-3a，将式a的氮进行酰化(必要时，使用脱保护步骤)，以得到中间体c，随后将其环化以得到最终产物。

根据本发明的合成方法制备的顺式-咪唑啉可具有高达90％、99％或更高的高度对映体过量。它们可以通过与分离的细胞(例如癌症或衰老细胞)组合并测定测试化合物对细胞的作用来测试其生物活性。

任选地，合成可包括使用一种或多种包括同位素标记(例如氘)的试剂。得到的顺式-咪唑烷可用作内标以测量顺式-咪唑烷浓度，例如，取自正在接受施用顺式-咪唑烷作为临床护理一部分的受试者或患者的生物样品中的顺式-咪唑烷浓度。

根据本发明的合成方法制备的顺式-咪唑烷可用于例如抑制mdm2或mdmx受体介导的途径。本发明包括用顺式-咪唑烷杀死细胞(例如癌细胞或衰老细胞)或细胞群体或抑制其生长。

根据本发明的合成方法制备的顺式-咪唑烷可以作为盐提供和/或与辅料组合，以产生适于人类给药的药物组合物。因此，本发明包括药物组合物，其包含根据任何方法制备的化合物和药学上相容的辅料。本发明包括根据所述方法中的任何一种制备用于医药或用于制备药物的化合物：例如，以治疗癌症或与衰老相关的病症。

根据下面的描述、工作实施例、所附的权利要求和附图，本发明的其他方面将是显而易见的。

附图说明

图1(a)、1(b)、1(c)和1(d)是根据本发明的方法生产nutlin-3a(一种示例性顺式-咪唑啉)的合成方案。在对中间体的一种胺衍生化之前或之后，可以用手性酸拆分立体异构体。

图2(a)、2(b)和2(c)提供了制备顺式-咪唑啉nutlin-3a的合成方法的详细概述。一旦拆分出立体异构体，可以将任一种异构体衍生化以通过其自身的合成途径产生目标化合物。

图3显示了化合物2的替代途径。

图4是用于产生nutlin-3a的氘代形式的合成方案。

具体实施方式

鉴于目前制备顺式-咪唑烷的方法存在缺陷，因此需要一种短的、化学有效的和可放大的合成顺式-咪唑啉(如nutlin-3a)的方法，其可用作mdm2和mdmx介导的途径的拮抗剂。本公开内容提供了制备关键中间体并将这些中间体转化为顺式-咪唑啉类最终产物的有效且灵活的方法。

图1(a)、1(b)、1(c)和1(d)提供了本发明的合成方法如何用于产生nutlin-3a的非限制性实例。这些方案可以一般地适用于制备其他顺式-咪唑啉。提供了一种前体，其具有连接在乙二胺中的两个手性中心的两个经取代的芳基。两种胺中的一种用胺保护基团保护，如图1(a)和1(c)所示，或者向目标顺式-咪唑啉(nutlin-3a)衍生化，如图1(b)和1(d)所示。如果合适，使用手性芳香酸如d-或l-形式的扁桃酸分离外消旋混合物。

分离后，通过选择性衍生化a中的两个胺基团继续合成，然后闭环以形成中心咪唑啉结构。如果手性分离的前体a具有衍生为脲的胺，则游离胺通过酰化转化为酰胺，反之亦然。如果手性分离的前体具有游离胺和受保护的胺，则游离胺首先转化为脲或酰胺，具体取决于前体的绝对立体化学。然后将另一种胺脱保护并用另一种试剂衍生化。然后关闭顺式-咪唑啉环，最终产生目标顺式-咪唑啉，nutlin-3。

适用于手性拆分的前体

概括地说，本发明包括根据以下结构和方案的合成方法。例如，本发明提供了制备式(ii)或式(iv)的盐的方法：

该方法包括在成盐条件下使式(i)化合物：

接触手性酸(ha)，由此产生80％ee(对映体过量)或更高的式(ii)或式(iv)

化合物，其中a-是手性酸的共轭碱；并且其中：

r¹选自以及r²⁰选自-och2r³⁰；-or³⁰；c1-10烷基；以及c3-10碳环和3至10元杂环，其中r²⁰中的每个c3-10碳环和3-至10-元杂环任选地被一个或多个选自卤素、-or³⁰、-sr³⁰、-n(r³⁰)2、-s(o)r³⁰、-s(o)2r³⁰-c(o)r³⁰、-c(o)or³⁰、-oc(o)r³⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r³⁰)、-p(o)(or³⁰)2、-op(o)(or³⁰)2、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基和c2-6炔基中的取代基取代；

r³⁰在每次出现时独立地选自氢；和c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c3-15碳环和3元至10元杂环，它们在每次出现时各自独立地任选地被一个或多个选自卤素、-cn、-no2、＝o、＝s和卤代烷基中的取代基取代；r⁴⁰和r⁴¹在每次出现时独立地选自氢和c1-10烷基；

r³、r⁴、r⁵、r⁶、和r⁷在每次出现时独立地选自氢、卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r¹⁰⁰、-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2和-cn；c1-10烷基、c2-10链烯基、c2-10炔基，其每一个在每次出现时独立地任选地被一个或多个选自卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r¹⁰⁰、-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r¹⁰⁰)、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2、-cn、c3-10碳环和3元至10元杂环；和c3-10碳环和3元至10元杂环中的取代基取代，其中r³、r⁴、r⁵、r⁶和r⁷中的每个c3-10碳环和3至10元杂环独立地任选地被一个或多个选自卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r^100-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r¹⁰⁰)、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基、和c2-6炔基的取代基取代；

r⁸、r⁹、r¹⁰、r¹¹和r¹²在每次出现时独立地选自氢、卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r¹⁰⁰、-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2和-cn；c1-10烷基、c2-10链烯基，c2-10炔基，其每一个在每次出现时独立地任选地被一个或多个选自卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r¹⁰⁰、-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r¹⁰⁰)、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2、-cn、c3-10碳环和3元至10元杂环；和c3-10碳环和3元至10元杂环中的取代基取代，其中r⁸、r⁹、r¹⁰、r¹¹和r¹²中的每个c3-10碳环和3元至10元杂环独立地任选地被一个或多个选自卤素，-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r^100-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r¹⁰⁰)、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基、和c2-6炔基中的取代基取代；并且

每次出现的r¹⁰⁰独立地选自氢；和c1-10烷基、c2-10链烯基、c2-10炔基、c3-10碳环和3元至10元杂环，它们各自在每次出现时独立地任选被一个或多个选自卤素、-cn、-no2、＝o、＝s和卤代烷基中的取代基取代。

当r¹是且r²⁰是任选经取代的饱和5-或6-元杂环时，则r¹可以是当r²⁰是被一个或多个选自卤素、-or³⁰、-sr³⁰、-n(r³⁰)2、-c(o)r³⁰、-c(o)or³⁰、-oc(o)r³⁰、-no2、＝o、＝s、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基、和c2-6炔基中的取代基取代的任选取代的c3-10碳环，则r¹可选自当r²⁰为-och2r³⁰、-or³⁰或任选取代的c1-10烷基时，则r¹可以选自

当r¹为时，r²⁰可以是被一个或多个选自卤素、-or³⁰、-sr³⁰、-n(r³⁰)2、-c(o)r³⁰、-c(o)or³⁰、-oc(o)r³⁰、-no2、＝o、＝s、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基、和c2-6炔基中的取代基取代的任选取代的c3-10碳环。当r¹为且r²⁰为任选取代的苯基时，则r¹可选自

当r¹为时，r²⁰可以是被一个或多个选自卤素、-or³⁰、-sr³⁰、-n(r³⁰)2、-c(o)r³⁰、-c(o)or³⁰、-oc(o)r³⁰、-no2、＝o、＝s、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基、和c2-6炔基中的取代基取代的任选取代的c3-10碳环。当r²⁰是任选取代的苯基时，则r¹可以选自和

合适的手性酸用于从其对映体中拆分手性前体

为了拆分式(ii)或(iv)的外消旋混合物，将其与手性酸组合，所述手性酸优先与两种立体异构体中的一种形成盐或晶体。盐与剩余液体分离，从而将一种立体异构体与另一种立体异构体分离。然后可以使用拆分的手性前体中的任一种或两种来制备所需的顺式-咪唑啉。

手性酸可选自市售的光学纯试剂。它可以由式(iii)或式(v)表示：

其中r²⁰⁰选自氢；和c1-10烷基、c2-10链烯基、c2-10炔基、c3-10碳环和3元至10元杂环，其各自在每次出现时独立地任选地被一个或多个选自卤素、-cn、-no2、＝o、＝s和卤代烷基的取代基取代；以及

r²⁰¹、r²⁰²、r²⁰³、r²⁰⁴和r²⁰⁵在每次出现时独立地选自氢、卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r¹⁰⁰、-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2和-cn；c1-10烷基、c2-10链烯基、c2-10炔基，其每一个在每次出现时独立地任选地被一个或多个选自卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r¹⁰⁰、-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r¹⁰⁰)、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2、-cn、c3-10碳环和3元至10元杂环；和c3-10碳环和3元至10元杂环的取代基取代，其中r⁸、r⁹、r¹⁰、r¹¹和r¹²中的每个c3-10碳环和3元至10元杂环独立地任选地被一个或多个选自卤素、-or¹⁰⁰、-sr¹⁰⁰、-n(r¹⁰⁰)2、-s(o)r¹⁰⁰、-s(o)2r^100-c(o)r¹⁰⁰、-c(o)or¹⁰⁰、-oc(o)r¹⁰⁰、-no2、＝o、＝s、＝n(r¹⁰⁰)、-p(o)(or¹⁰⁰)2、-op(o)(or¹⁰⁰)2、-cn、c1-6烷基、c2-6链烯基、和c2-6炔基的取代基取代。

例如，手性酸可以是：

测试生物活性

可以在分子水平上针对化合物作为mdm2的激动剂，从而促进p53活性并引起衰老细胞裂解(senolysis)的能力筛选化合物。实施例c提供了用于该目的的测定的说明。

还可以针对化合物杀死或改变细胞群中的靶细胞表型的能力筛选化合物。使培养的细胞与化合物接触，测定细胞的细胞毒性或抑制程度。可以将化合物杀死或抑制靶细胞的能力与化合物对对照细胞类型的作用进行比较。在靶细胞是癌细胞的情况下，对照细胞可以是相同组织来源的非癌细胞，或通常在施用化合物的环境中的正常细胞。在细胞是衰老细胞的情况下，对照细胞可以是以低密度自由分裂的细胞，和/或处于高密度在静止状态的正常细胞。实施例d提供了使用人肺成纤维细胞imr90细胞系的示例说明。类似的方案可用于测试细胞杀死或抑制癌细胞和其他类型靶细胞的能力。

还可以测试化合物改善被认为由衰老细胞引起或介导的疾病以及其他病况的过程的能力。参见us2016/0339019a1。

纯度

当根据本发明制备顺式-咪唑啉时，它可以以高对映体纯度生产。例如，根据所使用的化合物和方法，可以制备具有至少80％、90％、95％、98％或99％的对映体过量(ee)的式(ii)或式(iv)的化合物。可通过粗品盐的重结晶富集对映体过量，以实现所需的对映体纯度。用于对映选择性的外消旋混合物和手性酸的量将取决于特定外消旋混合物和手性酸的性质。通常，外消旋混合物与手性酸以约3：1至约0.5：1、或约3：1至约1：1的摩尔比接触。合宜地选择结晶溶剂、温度和其它条件将促进对映体-富集过程。

掺入氘并用于生物测定

任选地，本发明的合成方法可用于生产例如用稳定同位素标记的顺式-咪唑啉。通过仔细选择试剂，可以以区域控制的方式将同位素标记掺入目标顺式-咪唑啉的几个位点。本公开的实施例b提供了关于通过氘代2-异丙氧基-4-甲氧基苯甲酸引入7个氘原子的示例说明。

这种标记的化合物可以用作例如定量测定中的内标。例如，为了确定血浆样品中的nutlin-3a浓度，向血浆中加入预定量的[d⁷]nutlin-3a，然后加入乙腈以沉淀蛋白质。上清液含有提取的nutlin-3a(包含待测量的原始样品中的nutlin-3a和[d⁷]nutlin-3a内标)。通过超高压液相色谱和串联质谱(uhplc/ms/ms)分析上清液。将nutlin-3a峰面积比[d⁷]nutlin-3a峰面积的比率和校准样品的理论浓度拟合到回归模型，根据该回归模型可以回溯计算原始血浆样品。

药物组合物的制备及其用途

根据本发明的合成方法制备的顺式-咪唑啉可以配制成药物组合物或药物，例如，通过与一种或多种合适的辅料组合和/或置于装置中以促进给药。适用于制备此类药物的材料和方法可以在例如最新版的remington:thescienceandpracticeofpharmacy(目前在第22版)和其他标准参考来源中找到。这种药物或组合物可以与其在临床医学中的用途的信息一起包装或附带有关该用途的信息。根据情况，本发明的药物和药物组合物可适用于对有此需要的患者给药，以治疗或减轻诸如由衰老细胞引起或介导的癌症或病症之类的病症的症状。

定义

在本公开内容中使用的术语“顺式-咪唑啉”是指本发明的合成方法的目标化合物。该术语是为了方便而使用并且作为示例，并且不对超出明确陈述或以其他方式要求的所要求保护的发明赋予任何限制。在可能的范围内，本公开中使用的术语顺式-咪唑啉可以在必要的变更后用更通用的术语“化合物”或“结构”替换。除非明确说明或以其他方式要求，否则本公开中任何化合物的用途包括共轭碱或酸(任选为盐形式)用作所示结构的替代或补充的用途。

通常认为“衰老细胞”源自通常复制但是由于衰老或导致细胞状态改变的其他事件而不能再复制的细胞类型。它仍具有代谢活性，通常采用衰老相关的分泌表型(sasp)。衰老细胞的细胞核通常以与衰老相关的异染色质灶和具有染色质改变增强衰老的dna片段为特征。在不暗示对本公开内容所主张的未明确陈述或要求的主题的实践有任何限制的情况下，本发明的前提是假设衰老细胞引起或介导与组织损伤或衰老相关的某些病症。为了实施本发明的方面，可以将衰老细胞鉴定为表达至少一种选自p16、与衰老相关的β-半乳糖苷酶和脂褐素中的标记物；有时表达这些标记物中的两种或更多种，以及任选的其他sasp标记物(如白细胞介素6)。

“与衰老相关的”疾病、病况或病症是通过一种或多种症状或体征呈现的生理病症，其中患有该病症的受试者需要或将受益于这些症状或体征的减轻。该病症如果它主要发生在65岁以上的人群中，或者如果它是由衰老细胞引起或介导，则与衰老相关。可以使用根据本发明的顺式-咪唑啉潜在地治疗或控制的与衰老相关的病症的列表包括us2016/0339019a1(laberge等人)和/或wo2017/008060(lópez-domínguez等人)中描述的病症，包括但不限于骨关节炎。

本公开中提及的“手性芳香酸”是芳香氨基酸的两种可能的对映体中的一种。当两种对映体均未明确提及、描述或以其他方式需要时，该术语交替地指代一种或另一种对映体，但不是同时指两者。

本发明化合物包括任何组合的所示化合物，和/或其结晶和无定形形式，药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物和多晶型物，除非排除这些化合物的其他形式。

“前体”或“中间体”是合成、购买或以其他方式获得的结构，其可进行一个或多个化学反应步骤和/或分离步骤，所述化学反应步骤和/或分离步骤改变结构和/或分离反应混合物的组分以得到所需的目标化合物，例如顺式-咪唑啉。

通过官能团的化学修饰将“保护基团”引入分子中，以在随后的化学反应中获得化学选择性。代表性的可除去的胺保护基团包括但不限于苄氧羰基(cbz)、对甲氧基苄基羰基(moz或meoz)、叔丁氧基羰基(boc)、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、烯丙氧基羰基(alloc)、苯甲酰基(bz)、对甲氧基苄基(pmb)、3,4-二甲氧基苄基(dmpm)、对甲氧基苯基(pmp)和甲苯磺酰基(ts)。

术语“对映体过量”或“ee”是指手性物质的纯度。特别地，对映体过量反映了材料含有的一种对映体的量比其他对映体的量较大的程度。外消旋混合物的ee为0％，而单一纯对映体的ee为100％。

术语“盐”或“药学上可接受的盐”是指衍生自所提及的化合物的药学上相容的有机和/或无机抗衡离子的盐。

术语“cx-y”当与化学部分(例如烷基、链烯基或炔基)结合使用时，意指包括在链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“cx-y烷基”是指经取代或未经取代的饱和烃基，其包括在链中含有x至y个碳的直链烷基和支链烷基，包括卤代烷基，如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基，等等。术语“cx-y链烯基”和“cx-y炔基”是指长度和可能的取代基与上述烷基类似的经取代或未经取代的不饱和脂族基团，但相应含有至少一个双键或三键。

术语“碳环”是指饱和环、不饱和环或芳香环，其中环的每个原子是碳。碳环包括3至10元单环、6至12元双环和6至12元桥环。双环碳环的每个环可选自饱和环、不饱和环和芳香环。举例来说，芳香环(例如苯基)可以稠合到饱和或不饱和的环上，例如环己烷、环戊烷或环己烯。饱和双环、不饱和双环和芳香双环的任何组合，如化合价允许，包括在碳环的定义中。示例性的碳环包括环戊基、环己基、环己烯基、金刚烷基、苯基、茚满基和萘基。

术语“杂环”是指包含一个或多个杂原子的饱和环、不饱和环或芳香环。示例性的杂原子包括n、o、si、p、b和s原子。杂环包括3至10元单环、6至12元双环和6至12元桥环。双环杂环的每个环可以选自饱和环、不饱和环和芳香环，其中环中的至少一个包括杂原子。举例来说，芳香环，例如吡啶基，可以稠合到饱和或不饱和的环上，例如环己烷、环戊烷、吗啉、哌啶或环己烯。

术语“杂芳基”包括芳香单环结构，优选5-至7-元环，更优选5-至6-元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选1-4个杂原子，更优选1或2个杂原子。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环状环的多环状环系统，其中两个邻接的环共用两个或更多个碳，其中所述环中的至少一个是杂芳香的，例如，其他环状环可以是芳香的或非芳香的碳环的或杂环的。杂芳基包括，例如，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。

具有碳-碳双键或碳-氮双键的化学实体可以以z-或e-形式(或顺式-或反式-形式)存在。此外，一些化学实体可以以各种互变异构形式存在。除非另有说明，否则所提及的化学实体旨在包括所有z-、e-和互变异构形式。

术语“经取代的”是指具有取代结构的一个或多个碳上的氢的取代基的部分。应当理解，“取代”或“被......取代”包括隐含的条件，即这种取代符合被取代的原子和取代基的允许化合价，并且取代产生稳定的化合物，例如，其不会自发地经历诸如重新排列、环化和消除之类的转变。

术语“经取代的”包括有机化合物的所有允许的取代基。允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳香和非芳香取代基。诸如氮之类的杂原子可以具有氢取代基和/或有机化合物的满足杂原子化合价的任何允许的取代基。取代基可包括，例如，卤素、羟基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(如硫代酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基(sulfhydryl)、烷硫基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基、碳环、杂环、环烷基、杂环烷基、芳香族和杂芳香族部分。

取代基可包括，例如，卤素、羟基、氧代(＝o)、硫代(＝s)、氰基(-cn)、硝基(-no2)、亚氨基(＝nh)、肟基(＝n-oh)、肼基(＝n-nh2)、-r^b-or^a、-r^b-oc(o)-r^a、-r^b-oc(o)-or^a、-r^b-oc(o)-n(r^a)2、-r^b-n(r^a)2、-r^b-c(o)r^a、-r^b-c(o)or^a、-r^b-c(o)n(r^a)2、-r^b-o-r^c-c(o)n(r^a)2、-r^b-n(r^a)c(o)or^a、-r^b-n(r^a)c(o)r^a、-r^b-n(r^a)s(o)tr^a(其中t为1或2)、-r^b-s(o)tr^a(其中t为1或2)、-r^b-s(o)tor^a(其中t为1或2)以及-r^b-s(o)tn(r^a)2(其中t为1或2)；和烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基和杂芳基烷基、其中任何一个可任选地被烷基、链烯基、炔基、卤素、羟基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、氧代(＝o)、硫代(＝s)、氰基(-cn)、硝基(-no2)、亚氨基(＝nh)、肟基(＝n-oh)、肼(＝n-nh2)、-r^b-or^a、-r^b-oc(o)-r^a、-r^b-oc(o)-or^a、-r^b-oc(o)-n(r^a)2、-r^b-n(r^a)2、-r^b-c(o)r^a、-r^b-c(o)or^a、-r^b-c(o)n(r^a)2、-r^b-o-r^c-c(o)n(r^a)2、-r^b-n(r^a)c(o)or^a、-r^b-n(r^a)c(o)r^a、-r^b-n(r^a)s(o)tr^a(其中t为1或2)、-r^b-s(o)tr^a(其中t为1或2)、-r^b-s(o)tor^a(其中t为1或2)以及-r^b-s(o)tn(r^a)2(其中t为1或2)取代；其中每个r^a独立地选自氢、烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，其中每个r^a(如化合价允许)可以任选地被烷基、链烯基、炔基、卤素、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、氧代(＝o)、硫代(＝s)、氰基(-cn)、硝基(-no2)、亚氨基(＝nh)、肟基(＝n-oh)、肼(＝n-nh2)、-r^b-or^a、-r^b-oc(o)-r^a、-r^b-oc(o)-or^a、-r^b-oc(o)-n(r^a)2、-r^b-n(r^a)2、-r^b-c(o)r^a、-r^b-c(o)or^a、-r^b-c(o)n(r^a)2、-r^b-o-r^c-c(o)n(r^a)2、-r^b-n(r^a)c(o)or^a、-r^b-n(r^a)c(o)r^a、-r^b-n(r^a)s(o)tr^a(其中t为1或2)、-r^b-s(o)tr^a(其中t为1或2)、-r^b-s(o)tor^a(其中t为1或2)以及-r^b-s(o)tn(r^a)2(其中t为1或2)取代；并且其中每个r^b独立地选自直接键或直链或支链亚烷基、亚烯基或亚炔基链，并且每个r^c是直链或支链亚烷基、亚烯基或亚炔基链。

如果合适，取代基本身可以被取代。除非特别说明为“未经取代的”，否则提及化学部分包括取代的变体。例如，提及“杂芳基”基团或部分隐含地包括经取代和未经取代的变体。

本公开中使用的其他术语具有其普通含义，如在实施本发明的技术领域的普通技术人员将理解的含义。

实施例

实施例a：示例性顺式-咪唑啉的制备

图2(a)、2(b)和2(c)显示了顺式-咪唑啉nutlin-3a的合成方案，作为本发明操作的非限制性说明。图3显示了化合物2的另一种途径。所用的方法如下。

方案1：1,2-双(4-氯苯基)乙烷-1,2-二胺(化合物11)的合成

通过修改wein,m.etal.cancerres.clin.oncol.1988,114,347-58的方法，将4-氯苯甲醛(2.90g，20.6mmol)(化合物10)和ch3co2nh4(349mg,4.5mmol)的混合物在120℃加热3小时。将反应混合物冷却至室温，然后倒入etoac/h2o(150ml/150ml)中。分离两相，有机相用5％naoh(150ml)洗涤。将etoac相经无水na2so4干燥并浓缩。将残余物用石油醚(50ml)洗涤并过滤，得到n-[1,2-双(4-氯苯基)-2-[(e)-(4-氯苯基)亚甲基氨基]乙基]-4-氯-苯甲酰胺(2.61g，收率93％)，为白色固体，其不经进一步纯化即用于下一步骤。

将n-[1,2-双(4-氯苯基)-2-[(e)-(4-氯苯基)亚甲基氨基]乙基]-4-氯-苯甲酰胺(2.61g，4.8mmol)悬浮于50％h2so4(30毫升)中。将反应混合物在180℃加热3小时。当冷却至室温时，将混合物用冰水(20ml)稀释，并将得到的混合物用etoac(3×50ml)萃取。将水相用nh4oh(浓的)碱化，并用et2o(3×50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(2×20ml)洗涤，用无水na2so4干燥并浓缩。通过硅胶上的柱色谱法纯化残余物，得到化合物11(553mg，41％收率)，为白色固体。ms(esi)m/z＝281.5[m+h]⁺.¹hnmr(400m,dmso-d6),δ7.28(m,4h),7.16(m,4h),3.93(s,2h),1.95(br,s,4h).¹³cnmr(100m,dmso-d6),δ143.1,131.4,129.8,127.9,61.6。

方案2：2-氨基-1,2-双(4-氯苯基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物12)的合成

向化合物11(1.01g，3.6mmol)的dcm(20ml)溶液中，在0℃下加入boc2o(765mg，3.5mmol)。将反应混合物在该温度下搅拌2小时，然后用水(15ml)淬灭。分离两相，水相进一步用dcm(15ml×2)萃取。将合并的有机相用水(15ml)洗涤，经无水na2so4干燥并浓缩，得到化合物12(1.32g，收率96％)，为白色固体，将其不经进一步纯化用于下一步骤。ms(esi)m/z＝381.4[m+h]⁺.¹hnmr(400m,dmso-d6),δ7.38～7.30(m,8h),4.52(m,1h),3.96(m,1h),1.20(m,9h)。

方案3：化学拆分-化合物1和化合物4的合成

在室温下，向化合物12(2.61g，6.9mmol)的thf(52ml)溶液中加入d-扁桃酸(546mg，3.6mmol)。将混合物在70℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌1小时，并在0℃下搅拌30分钟。过滤后，收集滤饼(1.14g，89％ee)，并进一步从thf(22ml)中结晶，得到化合物4-盐(918mg，>99％ee)，为白色晶体，其从饱和na2co3的水溶液游离出来，得到化合物4(610mg，收率23％)，为白色固体。浓缩滤液，将残余物倒入etoac/饱和na2co3水溶液(50ml/50ml)的混合物中。分离得到的两相，收集有机相，用无水na2so4干燥，浓缩。将残余物(1.46g，3.8mmol，50％ee)溶解在thf(30ml)中，然后加入l-扁桃酸(400mg，2.6mmol)。将该混合物在70℃加热1小时，然后在室温下搅拌2小时，并且在0℃下搅拌30分钟。过滤所得混合物，收集滤饼(1.04g，91％ee)，并进一步从thf(20ml)中结晶，得到化合物1-盐(660mg，>99％ee)，为白色晶体，再次从饱和na2co3的水溶液游离出来，得到化合物1(415mg，收率16％)，为白色固体。

替代地，可以颠倒这两个拆分步骤的顺序，得到化合物1-盐，为化合物12和l-扁桃酸的结晶固体；然后用d-扁桃酸处理残余物，回收化合物4-盐，其为白色结晶产品。

方案4：n-[(1s,2r)-2-氨基-1,2-双(4-氯苯基)乙基]-2-异丙氧基-4-甲氧基-苯甲酰胺(化合物2)的合成

在0℃下，向2-异丙氧基-4-甲氧基-苯甲酸(194mg，923μmol)的dcm(15ml)溶液中加入dipea(238mg，1.84mmol)和hatu(1.05g，2.76mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后加入化合物1(351mg，921μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(20ml)并将所得混合物用dcm(30ml×3)萃取。将合并的有机相用无水na2so4干燥并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(dcm：meoh＝501)纯化残余物，得到boc-化合物2(321mg，收率61％)，为白色固体。lcms(esi)m/z＝573.1[m+h]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):8.28(m,1h),7.52(m,1h),7.40(m,9h),6.57(m,1h),6.51(m,1h),5.41(m,1h),4.94(m,1h),4.69(m,1h),3.75(s,3h),1.20(m,15h).[α]d＝-34°(c＝0.40,chcl3)。

向boc-化合物2(460mg，802μmol)的dcm(8ml)溶液中加入hco2h(1.00g，8.77mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后浓缩。将残余物倒入水(50ml)中并将所得混合物调节至ph9。然后将该混合物用dcm(15ml×2)萃取，并将合并的有机相用盐水(10ml)洗涤，经na2so4干燥并浓缩，得到化合物2(350mg，收率92％)，为黄色油状物，将其不经进一步纯化用于下一步骤。lcms(esi)m/z＝实测值472.9[m+h]+。

方案52-异丙氧基-4-甲氧基苯甲酰氯(化合物6)的合成

在0℃下向2-异丙氧基-4-甲氧基-苯甲酸(400mg，1.90mmol)的dcm(15ml)溶液中加入草酰二氯(483mg，3.81mmol)，然后加入一滴dmf。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后除去过量的溶剂，得到粗化合物6，将其不经进一步纯化用于下一步反应。

方案6：顺式-n-(2-氨基-1,2-双(4-氯苯基)乙基)-2-异丙氧基-4-甲氧基苯甲酰胺(化合物7)的合成

在0℃，向顺式-1,2-双(4-氯苯基)乙烷-1,2-二胺(440mg，1.56mmol)和et3n(253mg，2.51mmol)在dcm(20ml)中的混合物中添加上面制备的化合物6。将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过浓缩除去过量的溶剂，并通过硅胶柱色谱法(etoac：己烷＝2：1)纯化残余物，得到化合物7(512mg，收率65％)。ms(esi)m/z＝474.8[m+h]⁺.¹hnmr(400m,cdcl3),δ8.88(m,1h),8.12(d,j＝8.8hz,1h),7.26～7.19(m,4h),7.03～6.99(m,4h),6.56(dd,j1＝5.6hz,j2＝8.8hz,1h),6.49(d,j＝5.6hz,1h),5.44(m,1h),4.76(m,1h),4.41(m,1h),3.83(s,3h),1.44(m,6h)。

方案7：化合物2和化合物2-异构体的合成

在室温下将d-扁桃酸(78mg，512.65μmol)加入到化合物7(504mg，1.06mmol)的thf(10ml)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后在0℃下搅拌45分钟。过滤所得混合物。将滤饼(98mg，ee80％)从mtbe/thf(3ml/5ml)中重结晶，得到化合物2-盐(25mg，>99％ee)，其经k2co3游离释放得到游离碱化合物2。浓缩滤液，然后用k2co3水溶液(30ml)游离，得到化合物7(442mg，934μmol)。将该物质溶解在thf(4ml)中，并且在室温下加入l-扁桃酸(68mg，447μmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时并过滤。将滤饼(148mg，ee91％)从mtbe/thf(8ml/2ml)中重结晶，得到化合物2-异构体盐(38mg，>99％ee)，其也通过k2co3游离，以得到游离碱化合物2-异构体。

方案8：n-((1r,2s)-1,2-双(4-氯苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基)-3-氧代哌嗪-1-甲酰胺(化合物3)的合成

在0℃下，向化合物2(100mg，211μmol)的dcm(8ml)溶液中，加入cdi(68mg，419μmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。在室温下加入哌嗪-2-酮(42mg，420μmol)并将反应混合物在室温下搅拌2小时。加入水(10ml)并将所得混合物用etoac(10ml×3)萃取。将合并的有机相用盐水(10ml)洗涤，经无水na2so4干燥并浓缩，得到化合物3(83mg，收率66％)，为白色固体。lcms(esi)m/z＝599.1[m+h]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):8.29(m,1h),7.94(s,1h),7.46(m,7h),7.36(m,2h),6.99(m,1h),6.57(m,1h),6.52(m,1h),5.59(m,1h),5.11(m,1h),4.70(m,1h),3.80(m,1h),3.75(s,3h),3.61(m,1h),3.32(m,2h),2.96(m,2h),1.18(m,6h).[α]d＝+88.7°(c＝0.12,chcl3)。

方案9：n-((1r,2s)-2-氨基-1,2-双(4-氯苯基)乙基)-3-氧代哌嗪-1-甲酰胺(化合物5)的合成

在0℃下，向化合物4(152mg，399μmol)的dcm(10ml)溶液中，加入cdi(130mg，801μmol)。将该混合物在室温下搅拌1小时。加入哌嗪-2-酮(80mg，799μmol)并将反应混合物在相同温度下搅拌2小时。加入水(10ml)并将所得混合物用etoac(10ml×3)萃取。将合并的有机相用盐水(10ml)洗涤，经无水na2so4干燥并浓缩。通过制备型tlc(dcm：meoh＝12：1)纯化残余物，得到boc-化合物5(130mg，64％收率)，为白色固体。lcms(esi)m/z＝529.1[m+na]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):7.90(s,1h),7.50(m,4h),7.38(m,5h),6.89(m,1h),4.92(m,2h),3.75(m,1h),3.53(m,1h),3.24(m,2h),2.90(m,2h),1.15(s,9h)。

向boc-化合物5(80mg，158μmol)的dcm(5ml)溶液中加入tfa(360mg，3.16mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后浓缩。将残余物倒入水中，并将所得混合物调节至ph9。然后用dcm(15ml×2)萃取混合物。将合并的有机相用盐水(10ml)洗涤，经na2so4干燥并浓缩，得到化合物5(59mg，收率93％)，为黄色油状物，将其不经进一步纯化用于下一步骤。lcms(esi)m/z＝407.1[m+h]⁺。

方案10：n-((1r,2s)-1,2-双(4-氯苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基苯甲酰氨基)乙基)-3-氧代哌嗪-1-甲酰胺(化合物3)的合成

在0℃下，向化合物5(59mg，147μmol)的dcm(5ml)溶液，加入三乙胺(60mg，593μmol)并滴加2-异丙氧基-4-甲氧基-苯甲酰氯(51mg，219μmol)的dcm(5ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。加入水(10ml)并将所得混合物用dcm(10ml×3)萃取。将合并的有机相用盐水(10ml)洗涤，经无水na2so4干燥并浓缩。将残余物用制备型tlc(dcm：meoh＝12：1)纯化，得到化合物3(62mg，收率70％)，为白色固体。lcms(esi)m/z＝599.1[m+h]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):8.29(m,1h),7.94(s,1h),7.46(m,7h),7.36(m,2h),6.99(d,j＝9.2hz,1h),6.57(d,j＝2.0hz,1h),6.52(dd,j＝8.8hz,2.0hz,1h),5.60(m,1h),5.11(m,1h),4.70(m,1h),3.80(m,1h),3.75(s,3h),3.61(m,1h),3.32(m,2h),2.96(m,2h),1.18(m,6h)。

方案11：4-[[(4s,5r)-4,5-双(4-氯苯基)-4,5-二氢-2-[4-甲氧基-2-(1-甲基乙氧基)苯基]-1h-咪唑-1-基]羰基]-2-哌嗪酮((-)-nutlin-3a)的合成

在0℃下，向ph3po(120mg，432μmol)的dcm(6ml)溶液中滴加tf2o(240mg，850μmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。在0℃下滴加化合物3(130mg，217μmol)的dcm(2ml)溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。浓缩反应混合物，并用制备型tlc(dcm：meoh＝11：1)纯化残余物，得到(-)-nutlin-3a(83mg，收率62％)，为白色固体。lcms(esi)m/z＝581.1[m+h]⁺.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):7.92(s,1h),7.54(m,1h),7.13(m,4h),7.04(m,2h),6.98(m,2h),6.61(m,2h),5.66(m,1h),5.58(m,1h),4.72(m,1h),3.82(s,3h),3.58(m,2h),3.27(m,2h),2.81(s,2h),1.25(m,3h),1.21(m,3h).[α]d＝-140°(c＝0.18,chcl3)。

方案12：合成(-)-nutlin-3a的替代方法

在0℃下，向化合物3(29mg，48.37μmol)和thf(1ml)的溶液中加入2-氟吡啶(23mg，236.89mmol)和tf2o(33mg，117.86μmol)。将反应混合物在40℃搅拌过夜，然后浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到(-)-nutlin-3a(6mg，收率18％)。

实施例b：掺入氘

图4是用于生产用氘标记的nutlin-3a的合成方案。使用的程序如下。

方案1：4-甲氧基-2-((丙烷-2-基-d7)氧基)苯甲酸甲酯的合成(1)

向2-羟基-4-甲氧基-苯甲酸甲酯(199mg，1.09mmol)的dmf(10ml)溶液中加入k2co3(301mg，2.18mmol)和[d⁷]2-碘-丙烷(195mg，1.10mmol)。将反应混合物在70℃下搅拌过夜，然后倒入水(30ml)中。将得到的混合物用etoac(40ml×3)萃取，并将合并的有机相经无水na2so4干燥并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(石油醚：etoac＝20：1)纯化残余物，得到化合物1(226mg，收率90％)。ms(esi)m/z＝232.3[m+h]⁺.¹hnmr(300m,cdcl3),δ7.82(m,1h),6.52-6.49(m,2h),3.86(s,3h),3.84(s,3h)；¹³cnmr(100m,cdcl3),δ166.4,163.9,159.8,133.7,113.9,105.0,102.1,71.3(m),55.4,51.6,21.2(m)。

方案2：4-甲氧基-2-((丙烷-2-基-d7)氧基)苯甲酸(2)的合成

向化合物1(211mg，912.24μmol)的thf/h2o(5ml/5ml)溶液中加入lioh(66mg，2.75mmol)。将反应混合物在45℃搅拌过夜，然后调节至ph3-4。将得到的混合物用etoac(40ml×3)萃取，并将合并的有机相经无水na2so4干燥并浓缩，得到化合物2(168mg，收率85％)，将其直接用于下一步骤。

方案3：((1r,2s)-1,2-双(4-氯苯基)-2-(4-甲氧基-2-((丙烷-2-基-d7)氧基)苯甲酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯的合成(3)

在0℃下，向化合物2(156mg，715.97μmol)的dcm(15ml)溶液中加入dipea(185mg，1.43mmol)和hatu(518mg，2.15mmol)。将该混合物在0℃下搅拌30分钟，然后加入((1r,2s)-2-氨基-1,2-双(4-氯苯基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(273mg，715.97μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后用水(30ml)洗涤。用dcm(30ml×3)萃取水相。将合并的有机相用无水na2so4干燥并浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(dcm：meoh＝50：1)纯化残余物，得到化合物3(321mg，收率77％)。ms(esi)m/z＝602.0[m+na]⁺。

方案4：n-((1s,2r)-2-氨基-1,2-双(4-氯苯基)乙基)-4-甲氧基-2-((丙烷-2-基-d7)氧基)苯甲酰胺的合成(4)

在室温下，向化合物3(385mg，699.34μmol)的dcm(7ml)溶液中加入tfa(3ml)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后倒入na2co3水溶液(20ml)中。用dcm(30ml×3)萃取所得混合物。将合并的有机相经无水na2so4干燥并浓缩，得到化合物4(301mg，收率96％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。

方案5：n-((1r,2s)-1,2-双(4-氯苯基)-2-(4-甲氧基-2-((丙烷-2-基-d7)氧基)苯甲酰氨基)乙基)-3-氧代哌嗪-1-甲酰胺(5)的合成

向化合物4(315mg，706.29μmol)的dcm(10ml)溶液中加入cdi(153mg，1.06mmol)。将混合物在室温下搅拌1.5小时。然后加入哌嗪-2-酮(85mg，848.98μmol)。将反应混合物搅拌过夜，浓缩，然后通过制备型tlc直接纯化，得到化合物5(318mg，收率74％)。ms(esi)m/z＝606.4[m+h]⁺.¹hnmr(400m,cdcl3):δ8.39(m,1h),8.26(m,1h),7.28(m,2h),7.19(m,2h),6.96(m,2h),6.93(m,2h),6.62(m,2h),5.76(m,1h),5.09(m,1h),4.17(m,2h),3.86(s,3h),3.74(m,1h),3.62(m,1h),3.42(m,2h)。

方案6：[d⁷]nutlin-3a的合成

在0℃下，向三苯基氧化膦(130mg，496.18μmol)的dcm(10ml)溶液中加入tf2o(140mg，496.45μmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后加入化合物5(301mg，496.25μmol)。将反应混合物在室温下搅拌，过夜，然后倒入水(15ml)中。将所得混合物用dcm(20ml×3)萃取，并将合并的有机相经na2so4干燥并浓缩。通过制备型hplc纯化残余物，得到[d⁷]nutlin-3a(151mg，收率52％)。ms(esi)m/z＝589.9[m+h]⁺.¹hnmr(400m,meoh-d4):δ7.59(m,1h),7.14(m,2h),7.05(m,4h),6.94(m,2h),6.67(m,2h),5.76(m,1h),5.57(m,1h),3.87(s,3h),3.77(m,2h),3.38(m,2h),2.92(m,2h).[α]d＝-135.6°(c＝0.1,chcl3)，而对于nutlin-3a，[α]d＝-140°(c＝0.18,chcl3)。

实施例c：测量mdm2抑制

mdm2(小鼠双微体2同源物，也称为e3泛素-蛋白连接酶)是p53肿瘤抑制因子的负调节物。抑制mdm2促进p53活性，从而赋予衰老细胞裂解活性(senolyticactivity)。可以通过监测对p53的作用，在细胞中间接测量化合物作为mdm2激动剂的能力。

p53荧光素酶报告基因rko稳定细胞系可以从signosisinc.，santaclaraca获得。在p53荧光素酶细胞系中，荧光素酶活性与p53的活性特异性相关。细胞系通过以下方式建立：转染p53荧光素酶报告载体和g418表达载体，然后进行g418选择。

该测定如下进行。用候选化合物处理来自报告细胞系的细胞24小时。然后除去培养基，用pbs洗涤细胞，并向每个孔中加入20μl裂解缓冲液。使用读板器搅拌器将细胞摇动10秒。制备荧光素酶缓冲液并将其加入孔中。然后使用victor^tm多标记板读数器(perkinelmer，sanjoseca)读取p53活性。

实施例d：测量衰老细胞裂解活性

人成纤维细胞imr90细胞可以从美国典型培养物保藏中心获得，保藏编号为ccl-186。在含有fbs和pen/strep的dmem中，在3％o2、10％co2和约95％湿度的气氛中将细胞维持在<75％汇合。细胞分为三组：受照射的细胞(在使用前照射后培养14天)，增殖正常细胞(在使用前低密度培养一天)和静止细胞(在使用前高密度培养4天)。

在第0天，如下制备经照射的细胞。洗涤imr90细胞，以50,000个细胞/ml的密度置于t175烧瓶中，并以10-15gy照射。照射后，将细胞以100μl接种在96孔板中。在第1、3、6、10和13天，吸出每个孔中的培养基并用新鲜培养基替换。

在第10天，如下制备静止健康细胞。洗涤imr90细胞，将其与3ml含tryple胰蛋白酶的试剂(thermofisherscientific，waltham，massachusetts)组合并培养5分钟直至细胞变圆(roundup)并开始从板上脱离。将细胞分散，计数并在培养基中以50,000个细胞/ml的浓度制备。将100μl细胞接种在96孔板的每个孔中。在第13天更换培养基。

在第13天，如下制备增殖的健康细胞群。洗涤健康的imr90细胞，将其与3ml的tryple组合并培养5分钟直至细胞变圆(roundup)并开始从板上脱离。将细胞分散，计数并在培养基中以25,000个细胞/ml的浓度制备。将100μl细胞接种在96孔板的每个孔中。

在第14天，将测试bcl-2抑制剂或mdm2抑制剂与细胞组合如下。在96孔pcr板中以200倍最终所需浓度制备每种测试化合物的dmso稀释系列。在即将使用之前，将dmso储液以1：200稀释成预热的完全培养基。从每个孔中的细胞中吸出培养基，并加入100μl/孔的含有化合物的培养基。

为了测试根据本发明制备的顺式-咪唑啉的衰老细胞裂解活性，将化合物与细胞一起培养6天，在第17天用新鲜培养基和相同的化合物浓度替换培养基。bcl-2抑制剂(如001967)与细胞一起培养3天。该测定系统使用热稳定荧光素酶的特性来实现产生稳定的发光信号同时抑制在细胞裂解过程中释放的内源性atp酶的反应条件。在培养期结束时，向每个孔中加入100μlcelltiter-试剂(promegacorp.,madison,wisconsin)。将细胞板在轨道振荡器上放置30秒，并测量发光。

同样地，根据本发明制备的顺式-咪唑啉杀死癌细胞的能力可以在细胞裂解活性中测定，其中细胞与测试化合物接触。将对癌细胞的作用与对相同组织来源的非癌细胞的作用进行比较。

通过引用并入

除非明确说明，否则本公开中提供的示例性程序不限制要求保护的发明。在相容程度上，本发明的合成方法可用于生产在美国专利no.6,734,302；6,617,346；和7,705,007以及授权前出版物us2005/0282803a1；us2007/0129416a1和us2013/0225603a1中公开的任何结构。

本说明书中提及的所有出版物，专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。

虽然已经参考具体实施例和图示描述了本发明，但是可以进行改变并且可以替换等同物以适应特定背景或预期用途，作为常规开发和优化的问题并且在本领域中普通技术人员的理解范围内，从而可以在不脱离所要求保护的范围的情况下，实现本发明的益处。