通过降低T细胞区室中的自身反应性来治疗免疫病症相关疾病的方法与流程

本申请要求2016年8月29日提交的美国临时申请号62/380,904的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

所述发明涉及用于治疗在t细胞区室中具有自身反应性的患者的设备、药物组合物和方法。

发明背景

免疫反应的特征

一般而言，免疫反应是由个体与外来抗原物质(例如感染性微生物)之间的遭遇引发的。受感染的个体迅速作出以下响应：产生对免疫原的抗原决定簇/表位特异性的抗体分子并且扩增和分化抗原特异性调节和效应t淋巴细胞，包括产生细胞因子的细胞和杀伤性t细胞，其能够裂解受感染的细胞。使用给定微生物的初次免疫引起对见于该微生物上的抗原决定簇/表位特异性、但通常不能识别或仅不良地识别无关微生物表达的抗原决定簇的抗体和t细胞[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999),于p.102]。

作为这种初始响应的结果，免疫个体发展出免疫记忆的状态。如果再次遇到相同或密切相关的微生物，则随后发生二次响应。这种二级响应通常由更迅速、幅度更大且由抗体构成的抗体响应以及类似增强且通常更有效的t-细胞响应组成，所述抗体以更大亲和力结合抗原，并且更有效地从体内清除微生物。然而，针对感染因子的免疫反应并不总是导致病原体的消除。同上。

虽然免疫反应在其反应性方面具有高度特异性，但免疫系统可以区分的抗原特异性范围是巨大的。

免疫系统的细胞

免疫系统的细胞包括淋巴细胞，单核细胞/巨噬细胞，树突细胞，密切相关的朗格汉斯细胞，自然杀伤(nk)细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞和髓系细胞的其他成员。此外，一系列特化的上皮细胞和基质细胞提供其中发生免疫的解剖环境，通常通过分泌调节免疫系统细胞的生长和/或基因激活的关键因子，其也在响应的诱导和效应期中起直接作用。同上。

免疫系统的细胞见于外周组织的组织中，例如脾脏，淋巴结，肠道和扁桃体的派伊尔结(peyer'spatches)。淋巴细胞也见于中央淋巴器官：胸腺和骨髓中，它们在此经历发育步骤，这使它们能够介导成熟免疫系统的大量响应。大部分淋巴细胞和巨噬细胞包含见于血液和淋巴中的再循环细胞池，提供将免疫活性细胞递送到需要它们的位点，并允许局部产生的免疫变得普遍化的途径。同上。

术语“淋巴细胞”是指在整个身体的淋巴组织中形成的小的白细胞，并且在正常成人中构成循环血液中白细胞总数的约22-28％，其在保护身体抵抗疾病中发挥重大作用。个体淋巴细胞的特化之处在于它们定向于响应一组有限的结构相关抗原。这种定向在免疫系统首次接触给定抗原之前存在，表现为通过对淋巴细胞表面膜上抗原上的决定簇(表位)特异性的受体的存在。每个淋巴细胞具有受体的群体，所有受体都具有相同的结合位点。淋巴细胞的一个组或克隆与另一克隆的区别在于其受体的结合区域的结构，并且因此区别在于其可以识别的表位。淋巴细胞的彼此区别不仅在于其受体的特异性，而且还在于它们的功能。同上。

认识到两大类淋巴细胞：作为抗体分泌细胞的前体的b淋巴细胞(b细胞)，和t淋巴细胞(t细胞)。

b淋巴细胞

b淋巴细胞源自骨髓的造血细胞。成熟b细胞可以由表达被其细胞表面识别的表位的抗原激活。激活过程可以是直接的(依赖于通过抗原的膜ig分子的交联(交联依赖性b细胞激活))，或间接的(通过与辅助t细胞的相互作用，在称为同源物辅助的过程中)。在许多生理情况中，受体交联刺激和同源物辅助协同产生更强的b细胞响应[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

交联依赖性b细胞激活需要抗原表达多个拷贝的与细胞表面受体的结合位点互补的表位，因为每个b细胞表达具有相同可变区的ig分子。这种需要通过具有重复表位的其他抗原而得到满足，例如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白。交联依赖性b细胞激活是针对这些微生物产生的主要保护性免疫反应[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction”,fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

同源物辅助允许b细胞针对不能交联受体的抗原产生响应，并且同时提供共刺激信号，其可以在b细胞受弱交联事件刺激时挽救b细胞使其免于失活。同源物辅助取决于抗原与b细胞的膜免疫球蛋白(ig)的结合，抗原的内吞作用，以及其在细胞内体/溶酶体区室内片段化为肽。一些所得肽被加载到称为ii类主要组织相容性复合物(mhc)分子的一组特化细胞表面蛋白质中的凹槽中。所得的ii类/肽复合物表达在细胞表面，并充当称为cd4⁺t细胞的一组t细胞的抗原特异性受体的配体。cd4⁺t细胞在其表面上具有对b细胞的ii类/肽复合物特异的受体。b细胞激活不仅取决于t细胞通过其t细胞受体(tcr)的结合，而且这种相互作用还允许t细胞上的激活配体(cd40配体)与b细胞上的其受体(cd40)结合，信号传导b细胞激活。此外，t辅助细胞分泌几种细胞因子，其通过与b细胞上的细胞因子受体结合来调节受刺激的b细胞的生长和分化[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,“fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

在用于抗体产生的同源物辅助期间，cd40配体瞬时表达在激活的cd4⁺t辅助细胞上，并且它与抗原特异性b细胞上的cd40结合，从而转导第二共刺激信号。后一信号对于b细胞生长和分化以及通过防止已经遇到抗原的生发中心b细胞的凋亡而产生记忆b细胞是必需的。cd40配体在b细胞和t细胞二者中的过表达与人类sle患者的致病性自身抗体产生相关[desai-mehta,a.等人，“hyperexpressionofcd40ligandbybandtcellsinhumanlupusanditsroleinpathogenicautoantibodyproduction,”j.clin.invest.vol.97(9),2063-2073,(1996)]。

t淋巴细胞

t淋巴细胞源自造血组织中的前体，在胸腺中经历分化，并且然后接种到外周淋巴组织和再循环淋巴细胞池中。t淋巴细胞或t细胞介导广泛范围的免疫功能。这些包括辅助b细胞发育成抗体产生细胞的能力，增加单核细胞/巨噬细胞的杀微生物作用的能力，抑制某些类型的免疫反应，直接杀死靶细胞和炎症响应的动员。这些效果取决于其特定细胞表面分子的表达和细胞因子的分泌[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction”,fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

t细胞与b细胞的区别在于其抗原识别机制。免疫球蛋白(b细胞受体)与可溶性分子或颗粒表面上的单个表位结合。b细胞受体查看表达在天然分子表面上的表位。虽然抗体和b细胞受体进化为结合并保护抵抗细胞外液中的微生物，但t细胞识别其他细胞表面的抗原，并通过与这些抗原呈递细胞(apc)的相互作用并改变这些apc的行为而介导其功能。外周淋巴器官中存在可以激活t细胞的三种主要类型的抗原呈递细胞：树突细胞、巨噬细胞和b细胞。其中，最有效的是树突细胞，其唯一的功能是将外来抗原呈递给t细胞。未成熟的树突细胞位于整个身体的组织中，包括皮肤，肠道和呼吸道。当它们在这些位点遇到入侵的微生物时，它们将病原体及其产物内吞，并通过淋巴将其携带到局部淋巴结或肠道相关的淋巴器官。与病原体的遭遇诱导树突细胞从抗原捕获细胞成熟为能够激活t细胞的抗原呈递细胞(apc)。apc在其表面展示三种类型的蛋白质分子，其具有激活t细胞成为效应细胞的作用：(1)mhc蛋白，其将外来抗原呈递给t细胞受体；(2)与t细胞表面上的互补受体结合的共刺激蛋白；和(3)细胞-细胞粘附分子，其使t细胞能够与抗原呈递细胞(apc)结合足够久以被激活[“chapter24:theadaptiveimmunesystem,”molecularbiologyofthecell,alberts,b.等人，garlandscience,ny,(2002)]。

基于它们表达的细胞表面受体，t细胞被细分为两个不同的类别。大多数t细胞表达由α链和β-链组成的t细胞受体(tcr)。一小组t细胞表达由γ和δ链构成的受体。α/βt细胞中有两个亚谱系：表达辅助受体分子cd4(cd4⁺t细胞)的那些；和表达cd8(cd8⁺t细胞)的那些。这些细胞的区别在于它们如何识别抗原及其效应和调节功能。

cd4⁺t细胞是免疫系统的主要调节细胞。它们的调节功能依赖于它们的细胞表面分子(例如当t细胞被激活时，被诱导表达的cd40配体)的表达，以及在被激活时，它们分泌的一系列广泛的细胞因子。

t细胞还介导重要的效应子功能，其中一些功能由它们分泌的细胞因子的模式决定。细胞因子可以直接对靶细胞具有毒性，并且可以动员有效的炎症机制。

此外，t细胞，特别是cd8⁺t细胞，可以发展成细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，其能够有效裂解表达ctl识别的抗原的靶细胞[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

t细胞受体(tcr)识别由抗原的蛋白酶水解而衍生的肽组成的复合物，所述抗原结合到ii类或i类mhc蛋白的特化凹槽。cd4⁺t细胞仅识别肽/ii类复合物，而cd8⁺t细胞识别肽/i类复合物[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

tcr的配体(即肽/mhc蛋白复合物)在抗原呈递细胞(apc)内产生。通常，ii类mhc分子结合源自通过内吞过程而被apc摄取的蛋白质的肽。然后，这些负载肽的ii类分子在细胞表面表达，在此处它们可被cd4⁺t细胞结合，所述cd4⁺t细胞具有能够识别表达的细胞表面复合物的tcr。因此，cd4⁺t细胞特化为与源自细胞外来源的抗原反应[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

相反，i类mhc分子主要负载源自内部合成蛋白质(例如病毒蛋白质)的肽。这些肽通过蛋白质体的蛋白水解而从细胞溶质蛋白产生，并且移位到粗面内质网中。这种在长度上通常由9个氨基酸构成的肽与i类mhc分子结合并被带到细胞表面，在此处它们可以被表达适当受体的cd8⁺t细胞识别。这给予了t细胞系统，特别是cd8⁺t细胞检测如下细胞的能力：所述细胞表达不同于生物体其他部分的细胞的那些，或以远高于生物体其他部分的细胞的那些的量产生的蛋白(例如，病毒抗原)，或突变抗原(如活性癌基因产物)，即使这些完整形式的蛋白质既没有表达在细胞表面也没有被分泌[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

t细胞也可以基于其功能分成辅助t细胞；参与诱导细胞免疫的t细胞；抑制性t细胞；和细胞毒性t细胞。

辅助t细胞

辅助t细胞是刺激b细胞以产生对蛋白质和其他t细胞依赖性抗原的抗体反应的t细胞。t细胞依赖性抗原是免疫原，其中单个表位仅出现一次或有限次数，使得它们不能交联b细胞的膜免疫球蛋白(ig)或低效率地进行所述交联。b细胞通过其膜ig结合抗原，并且复合物经历内吞作用。在内体和溶酶体区室内，抗原通过蛋白水解酶被片段化成肽，并且一种或多种产生的肽被加载到ii类mhc分子中，其通行穿过此囊泡区室。然后，将所得的肽/ii类mhc复合物输出到b细胞表面膜。具有对肽/ii类分子复合物特异性的受体的t细胞识别b细胞表面上的这种复合物。[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

b细胞激活既依赖于t细胞通过其tcr的结合，也依赖于t细胞cd40配体(cd40l)与b细胞上的cd40的相互作用。t细胞不组成型表达cd40l。相反，cd40l表达作为与apc相互作用的结果而被诱导，所述apc表达被t细胞的tcr识别的同源抗原和cd80或cd86。cd80/cd86通常由激活的而不是静息的b细胞表达，使得涉及激活的b细胞和t细胞的辅助相互作用可以导致有效的抗体产生。然而，在许多情况下，t细胞上cd40l的初始诱导依赖于它们对组成型表达cd80/86的apc(例如树突细胞)表面上的抗原的识别。然后，这种激活的辅助t细胞可以有效地与b细胞相互作用并辅助b细胞。即使效率低，b细胞上的膜ig的交联也可与cd40l/cd40相互作用协同作用以产生强烈的b细胞激活。b细胞响应中的后续事件，包括增殖、ig分泌和(表达ig类别的)类别转换依赖于或通过t细胞衍生的细胞因子的作用增强[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

cd4⁺t细胞倾向于分化为主要分泌细胞因子il-4，il-5，il-6和il-10的细胞(th2细胞)或主要产生il-2，ifn-γ和淋巴毒素的细胞(th1细胞)。th2细胞非常有效地辅助b细胞发育成抗体产生细胞，而th1细胞是细胞免疫反应的有效诱导剂，涉及增强单核细胞和巨噬细胞的杀微生物活性，并且随后提高在细胞内囊泡区室中裂解微生物的效率。虽然具有th2细胞表型(即il-4，il-5，il-6和il-10)的cd4⁺t细胞是有效的辅助细胞，但th1细胞也具有成为辅助细胞的能力[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

t细胞参与细胞免疫的诱导

t细胞还可以起作用以增强单核细胞和巨噬细胞破坏细胞内微生物的能力。特别地，辅助t细胞产生的干扰素-γ(ifn-γ)增强了几种机制，通过这些机制，单核吞噬细胞破坏细胞内细菌和寄生虫，包括产生一氧化氮和诱导肿瘤坏死因子(tnf)的产生。th1细胞有效增强杀微生物作用，因为它们产生ifn-γ。相反，th2细胞产生的主要细胞因子中的两种(il-4和il-10)阻断这些活性[paul,w.e.,“chapter1:theimmunesystem:anintroduction,”fundamentalimmunology，第4版，编辑paul,w.e.,lippicott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)]。

抑制性或调节性t(treg)细胞

通过免疫反应的起始和下调之间的受控平衡维持免疫稳态。凋亡和t细胞无反应性二者的机制(一种耐受机制，其中t细胞在遇到抗原后内在地功能性失活[scwartz,r.h.,“tcellanergy”,annu.rev.immunol.,vol.21:305-334(2003)])促成免疫反应的下调。第三种机制通过经抑制剂或调节性cd4⁺t(treg)细胞对激活t细胞的主动抑制提供[综述于kronenberg,m.等人，“regulationofimmunitybyself-reactivetcells”,nature,vol.435:598-604(2005)]。组成型表达的il-2受体α(il-2rα)链的cd4⁺treg细胞(cd4⁺cd25⁺)是天然存在的无反应性和抑制性的t细胞子集[taams,l.s.等人，“humananergic/suppressivecd4+cd25+tcells:ahighlydifferentiatedandapoptosis-pronepopulation”,eur.j.immunol.vol.31:1122-1131(2001)]。cd4⁺cd25⁺treg的消耗导致小鼠中的全身性自身免疫疾病。此外，这些treg的转移防止自身免疫疾病的发展。类似于其鼠类对应物，人类cd4⁺cd25⁺treg在胸腺中产生，并且其特征在于通过细胞-细胞接触依赖性机制抑制响应性t细胞增殖的能力，不能产生il-2，和体外无反应性表型。根据cd25表达水平，人cd4⁺cd25⁺t细胞可分为抑制性(cd25^高)和非抑制性(cd25^低)细胞。已显示转录因子叉头家族的成员foxp3在鼠和人cd4⁺cd25⁺treg中表达，并且似乎是控制cd4⁺cd25⁺treg发育的主基因[battaglia,m.等人，“rapamycinpromotesexpansionoffunctionalcd4+cd25+foxp3+regulatortcellsofbothhealthysubjectsandtype1diabeticpatients”,j.immunol.,vol.177:8338-8347,(2006)]。

细胞毒性t淋巴细胞(ctl)

识别来自靶细胞内产生的蛋白质的肽的cd8⁺t细胞具有细胞毒性特性，因为它们导致靶细胞的裂解。ctl诱导的裂解的机制涉及ctl产生穿孔素，该分子可以插入靶细胞的膜中并促进该细胞的裂解。穿孔素介导的裂解通过颗粒酶增强，所述颗粒酶是由激活的ctl产生的一系列酶。许多活性ctl还在其表面上表达大量的fas配体。ctl表面上的fas配体与靶细胞表面上的fas的相互作用引发靶细胞的凋亡，导致这些细胞死亡。ctl介导的裂解似乎是破坏病毒感染细胞的主要机制。

引发

如本文所用，术语“未引发的细胞”(也称为原始细胞，幼稚细胞或无经验细胞)是指已产生特定特异性的抗原受体(t细胞的tcr，b细胞的bcr)，但从未遇到抗原的t细胞和b细胞。如本文所用，术语“引发”是指由此t细胞和b细胞前体遇到它们对其特异性的抗原的过程。

例如，在辅助t细胞和b细胞可以相互作用以产生特异性抗体之前，必须引发抗原特异性t细胞前体。引发涉及几个步骤：抗原摄取，加工和细胞表面表达通过抗原呈递细胞与ii类mhc分子结合，再循环和抗原特异性捕获淋巴组织中的辅助t细胞前体，以及t细胞增殖和分化[janeway,ca,jr.,“theprimingofhelpertcells”,semin.immunol.,vol.1(1):13-20(1989)]。辅助t细胞表达cd4，但并非所有cd4t细胞都是辅助细胞。同上。辅助t细胞克隆扩增所需的信号不同于其他cd4t细胞所需的那些信号。用于辅助t细胞引发的关键抗原呈递细胞似乎是巨噬细胞；并且辅助t细胞生长的关键第二信号是巨噬细胞产物白细胞介素1(il-1)。同上。如果引发的t细胞和/或b细胞接收第二种共刺激信号，它们就变成激活的t细胞或b细胞。

淋巴细胞激活

术语“激活”或“淋巴细胞激活”是指通过特异性抗原、非特异性促有丝分裂原或同种异体细胞刺激淋巴细胞，导致rna、蛋白质和dna的合成以及淋巴因子的产生；随后是各种效应细胞和记忆细胞的增殖和分化。例如，成熟b细胞可以通过遇到表达由其细胞表面免疫球蛋白ig识别的表位的抗原而被激活。激活过程可以是直接过程，依赖于通过抗原的膜ig分子的交联(交联依赖性b细胞激活)，或者是间接过程，在与辅助t细胞的亲密相互作用的情况下最有效地发生(“同源物辅助过程”)。t细胞激活依赖于tcr/cd3复合物与其同源配体的相互作用，该同源配体是结合在i类或ii类mhc分子的凹槽中的肽。通过受体结合启动的分子事件是复杂的。在最早的步骤中似乎是酪氨酸激酶的激活，导致控制几种信号传导途径的一组底物的酪氨酸磷酸化。这些包括一组将tcr连接到ras途径的衔接蛋白，磷脂酶cγ1（其酪氨酸磷酸化增加其催化活性并参与肌醇磷脂代谢途径，导致细胞内游离钙浓度升高和蛋白激酶c激活），以及一系列控制细胞生长和分化的其他酶。除了受体结合之外，t细胞的完全响应性还需要辅助细胞递送的共刺激活性，例如，通过抗原呈递细胞(apc)上的cd80和/或cd86结合t细胞上的cd28。激活的b淋巴细胞的可溶性产物是免疫球蛋白(抗体)。激活的t淋巴细胞的可溶性产物是淋巴因子。

趋化因子是趋化细胞因子，其构成具有不同免疫和神经功能的低分子量(8-11kda)结构相关蛋白家族[mackayc.r.,“chemokines:immunology’shighimpactfactors”,natimmunol.,vol.2:95-101,(2001)]；[younb.等人，“chemokines,chemokinereceptorsandhematopoiesis”,immunolrev,vol.177:150-174,(2000)]，其可以基于保守性半胱氨酸残基的相对位置而分成四个亚家族(c、cc、cxc和cx3c)[rossid.等人，“thebiologyofchemokinesandtheirreceptors”,annurevimmunol,,vol.18:217-242,(2000)]。趋化因子是引导白细胞在血液、淋巴结和组织之间迁移的必需分子。它们构成复杂的信号传导网络，因为它们并不总是局限于一种类型的受体[loetscherp.等人，“theligandsofcxcchemokinereceptor3,i-tac,mig,andip10,arenaturalantagonistsforccr3”,j.biol.chem.,vol.276:2986-2991,(2001)]。趋化因子通过激活表面受体来影响细胞，所述表面受体是七次跨膜结构域的g蛋白偶联受体。白细胞对特定趋化因子的响应由它们的趋化因子受体的表达决定。趋化因子与受体的结合激活各种信号级联，类似于最终激活生物响应的细胞因子的作用。分泌ccr5受体的配体、调节的激活正常t细胞表达和分泌因子(rantes)、巨噬细胞炎症蛋白(mip)-1α/和mip-1β[schrums.等人，“synthesisofthecc-chemokinesmip-1alpha,mip-1beta,andrantesisassociatedwithatype1immuneresponse”,jimmunol,vol.157:3598–3604,(1996)]和cxc趋化因子受体3(cxcr3)的配体、诱导的蛋白(ip)-10[taubd.d.等人，“recombinanthumaninterferon-inducibleprotein10isachemoattractantforhumanmonocytesandtlymphocytesandpromotestcelladhesiontoendothelialcells”,jexpmed.,vol.177:1809–1814,(1993)]与不希望的增强的th1响应相关。此外，升高的破坏性促炎细胞因子il-2和ifn-γ水平与t1d相关[rabinovitcha.等人，“rolesofcytokinesinthepathogenesisandtherapyoftype1diabetes”,cellbiochembiophys,vol.48(2-3):159-63,(2007)]。已经在th1胰腺浸润和其他以t细胞浸润为特征的炎性损伤中观察到趋化因子[bradleyl.m.等人，“islet-specificth1,butnotth2,cellssecretemultiplechemokinesandpromoterapidinductionofautoimmunediabetes”,jimmunol,vol.162:2511–2520,(1999)]。

血浆中的促炎细胞因子如il-1β，il-6和tnf-α已被首先检测到，并参与胰岛素抗性和t2d的发展，其受到抗炎和免疫抑制细胞因子tgf-β1和il-10的持续检查和调节[alexandrakik.等人，“inflammatoryprocessintype2diabetes:theroleofcytokines”,annalsofthenewyorkacademyofsciences,1084:89-117,(2006)]；[kumarn.p.等人，2015.eurjimmunol.doi:10.1002/eji.201545973，印刷前]。il-17a是一种众所周知的促炎细胞因子，其参与几种自身免疫疾病。

免疫耐受

免疫系统耐受自身抗原，即它可以区分在外来物质上表达的抗原决定簇和由宿主组织表达的抗原决定簇。该系统忽略宿主抗原的能力(称为免疫耐受或免疫学耐受)是涉及通过免疫耐受将可以识别自身抗原的细胞消除或失活的主动过程[fundamentalimmunology,第四版,williame.paul,编辑lippincott-ravenpublishers,philadelphia,(1999)，第2页]。

免疫耐受分为1)中枢耐受或2)外周耐受，这取决于最初诱导状态的位置，即，是在胸腺和骨髓中(中枢)还是在其他组织和淋巴结中(外周)。建立这些形式的耐受的生物学机制是不同的，但所得的效果是相似的[rakerv.k.等人，“tolerogenicdendriticcellsforregulatorytcellinductioninman”,frontimmunol,vol.,6(569):1-11,(2015)]。

作为免疫系统被驯化以区分自身分子与非自身分子的主要方式，中枢耐受通过将自身反应性淋巴细胞克隆在它们成熟为完全免疫活性细胞之前的某一点删除来建立。对于t淋巴细胞和b淋巴细胞，它分别在胸腺和骨髓中的淋巴细胞发育期间发生[sprentj.等人，“thethymusandcentraltolerance”,philostransrsoclondbbiolsci,vol.356(1409):609–616,(2001)]。在这些组织中，成熟中的淋巴细胞暴露于由胸腺上皮细胞和胸腺树突细胞或骨髓细胞呈递的自身抗原。自身抗原由于内源性表达，经由循环血液从外周位点输入抗原而存在，并且在胸腺基质细胞的情况下，通过转录因子aire的作用表达其他非胸腺组织的蛋白质[murphy,kenneth.janeway’simmunobiology:8thed.chapter15:garlandscience.(2012),pp.611-668]；[kleinl.,“airegetscompanyforimmunetolerance”,cell,vol.163(4):794-795,(2015)]。那些具有与自身抗原强烈结合的受体的淋巴细胞通过自身反应细胞的凋亡或通过无反应性(意味着非反应性的状态)的诱导而被除去[同上。275-334页]。弱自身反应性b细胞也可能保持免疫无活性状态，其中它们不响应其b细胞受体的刺激。或者，一些弱自我识别的t细胞分化成天然调节性t细胞(ntreg细胞)，其在外周充当哨兵以降低t细胞自身反应性的潜在实例[同上。611-668页]。

t细胞的缺失阈值比b细胞更严格，因为t细胞是可导致直接组织破坏的主要细胞群体。此外，对于生物体更有利的是让其b细胞识别更多种类的抗原，从而它们可以引发针对更多种病原体的抗体。由于b细胞只有在识别相同抗原的更多自限性t细胞确认后才能被完全激活，因此可以保持很好地检查自身反应性[murphy,kenneth.janeway’simmunobiology：第8版，第8章：garlandsciences.pp.275-334]。

这种负选择过程确保了潜在可能产生对个体自身组织的强免疫反应的t细胞和b细胞被破坏，同时保留了识别外来抗原的能力。淋巴细胞驯化中的这一步骤对于预防自身免疫是有害的。淋巴细胞的发育和驯化在胎儿发育中最为活跃，但随着未成熟的淋巴细胞产生在整个生命过程中持续，随着胸腺退化和骨髓在成年生活中缩小而减慢[murphy,kenneth.janeway'simmunobiology：第8版，第8章：garlandsciences.(2012),pp.275–334]；[jiangt.t.,“regulatorytcells:newkeysforfurtherunlockingtheenigmaoffetaltoleranceandpregnancycomplications”,jimmunol.,vol.192(11):4949-4956,(2014)]。

在t细胞和b细胞成熟并进入外周组织和淋巴结后，外周耐受发展[murphy,kenneth.janeway'simmunobiology：第8版，第8章：garlandsciences.pp.275–334]。它由许多重叠机制阐述，所述机制主要涉及t细胞水平的控制，特别是cd4⁺辅助t细胞，它编排免疫反应并给予b细胞确认信号，b细胞需要所述确认信号以进展从而产生抗体。由于离开胸腺的t细胞相对但不完全安全，因此可能会发生针对正常自身抗原的在胸腺中未被消除的不适当反应性。一些将具有可以响应t细胞在胸腺中没有遇到的自身抗原的受体(tcr)[murphy,kenneth.janeway'simmunobiology：第8版，第8章：garlandsciences.pp.275–334]。那些逃避胸腺中的胸腺内阴性选择的自身反应性t细胞可以造成细胞损伤，除非它们在外周组织中主要被ntreg细胞消除。

ccr7是归巢受体，其在t、b和树突细胞迁移到次级淋巴器官中是重要的[forsterr.等人，“ccr7coordinatestheprimaryimmuneresponsebyestablishingfunctionalmicroenvironmentsinsecondarylymphoidorgans”,cell,vol.99:23–33,(1999)]。已经描述了ccr7的多种作用，[hopkenu.e.等人，“thechemokinereceptorccr7controlslymphnode-dependentcytotoxictcellpriminginalloimmuneresponses”,eurjimmunol.,vol.34:461–470,(2004)]，包括诱导和维持中枢和外周耐受[huguess.等人，“immunity,16:169–181,(2002)]。基于cd45白细胞的两种同种型的表达，t细胞通常表征为幼稚和/或效应cd45ra⁺t细胞或记忆cd45ro⁺t细胞。

通常在胸腺髓质上皮细胞中表达的自身免疫调节剂(aire)通过介导外周自身抗原的异位表达和介导自身反应性t细胞的消除而在免疫耐受中起作用。[metzgert.c.等人，“controlofcentralandperipheraltolerancebyaire”,immunol.rev.2011,vol.241:89-103,(2011)]。

通过在重复暴露后诱导耐受，也可以抑制对某些抗原的适当反应性。幼稚cd4⁺辅助t细胞在外周组织中，或相应地，在附近的淋巴组织(淋巴结，粘膜相关的淋巴组织等)中分化成诱导的treg细胞(itreg细胞)。这种分化由t细胞激活时产生的il-2和来自任何各种来源(包括耐受树突状细胞(dc)或其他抗原呈递细胞)的tgf-β介导[curottodelafaille等人，“effectiverecruitmentandretentionofolderadultsinphysicalactivityresearch:palsstudy”,immunity,vol.30(6):626–635,(2009)]。

t记忆细胞

通过适应性免疫反应识别和根除病原体后，绝大多数(90-95％)的t细胞发生凋亡，并且其余细胞形成记忆t细胞池，称为中枢记忆t细胞(tcm)、效应记忆t细胞(tem)和常驻记忆t细胞(trm)[clark,r.a.,“residentmemorytcellsinhumanhealthanddisease”,sci.transl.med.,7,269rv1,(2015)]。

与标准t细胞相比，这些记忆t细胞具有长寿命和不同的表型，例如特定表面标志物的表达，不同细胞因子概况的快速产生，直接效应细胞功能的能力以及独特的归巢分布模式。记忆t细胞在重新暴露于其各自的抗原后表现出快速反应，以消除入侵物的再感染，并由此迅速恢复免疫系统的平衡。越来越多的证据证实，自身免疫记忆t细胞阻碍了大多数治疗或治愈自身免疫疾病的尝试[clark,r.a.,“residentmemorytcellsinhumanhealthanddisease”,sci.transl.med.,7,269rv1,(2015)]。

自身免疫

未能建立免疫耐受或自我抗原的异常呈现(其引起针对宿主分子上的抗原决定簇/表位的组织破坏性免疫反应)，通常导致自身免疫疾病，这意味着当身体组织受到自身免疫系统攻击时发生的疾病[roundj.l.等人，“coordinationoftolerogenicimmuneresponsesbythecommensalmicrobiota”,jautoimmun,vol.34(3):220–225,(2010)]；[choij.等人，“thepathogenesisofsystemiclupuserythematosus-anupdate”,curropinimmunol,vol.24(6):651–657,(2012)]。自身免疫或具有主要自身免疫组分的示例性疾病包括但不限于艾迪生病(addison'sdisease)，斑秃(aa)，淀粉样变性，乳糜泻，克罗恩病，肾小球肾炎，桥本甲状腺炎，多发性硬化，1型糖尿病，重症肌无力，多发性肌炎，牛皮癣，类风湿性关节炎，硬皮病，干燥综合征和系统性红斑狼疮。一种自身免疫疾病的存在增加了发展另一种同时自身免疫疾病的机会。

葡萄糖稳态

通常，在葡萄糖摄取后，血浆葡萄糖浓度的增加触发胰岛素释放，其刺激内脏(肝脏和胃肠组织)和外周葡萄糖摄取并且压制内源(主要是肝脏)葡萄糖产生。在健康成人中，血糖水平被严格调控在70至99mg/dl的范围内，并且由特定激素(例如胰岛素、胰高血糖素、肠促胰岛素)以及中枢神经系统和外周神经系统维持，以满足代谢需求。脑、肌肉、胃肠道、肝脏、肾脏和脂肪组织内的各种细胞和组织也通过摄取、代谢、贮存和分泌而参与血糖调节[defronzor.a.,“pathogenesisoftype2diabetesmellitus”med.clin.n.am.,vol.88:787-835(2004)]；gerichj.e.,“physiologyofglucosehomeostasis”,diabetesobes.metab.vol.2:345-350,(2000)]。在正常的生理环境下，即使在食用高碳水化合物膳食后，葡萄糖水平也很少超过140mg/dl。

作为有效的抗脂肪分解(抑制脂肪分解)激素，已知胰岛素通过加速葡萄糖进入胰岛素敏感细胞内的转运，并且促进其经由在胰腺的郎格罕氏岛内的糖原生成(葡萄糖转换为糖原)和脂肪生成(脂肪形成)转换为贮存化合物来降低血糖水平，β-细胞产生胰岛素。

作为也在葡萄糖稳态中起作用的激素，胰高血糖素由郎格罕氏岛内的α-细胞响应低的正常葡萄糖水平或低血糖症而产生，并且通过加速糖原分解和促进糖异生而发挥增加葡萄糖水平的作用。在含葡萄糖的膳食之后，胰高血糖素分泌被高胰岛素血症抑制，这促成肝葡萄糖产生的抑制和正常的餐后葡萄糖耐受的维持。

包括葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)和胰高血糖素样肽1(glp-1)的肠促胰岛素也参与血糖的调节，部分地通过它们对胰岛素和胰高血糖素的作用[druckerd.j.等人，“theincretinsystem:glucagon-likepeptide-1receptoragonistsanddipeptidylpeptidase-4inhibitorsintype2diabetes”，lancet，第368卷:1696-1705,(2006)]。glp-1和gip两者均被视为葡萄糖依赖性激素，意味着它们仅在葡萄糖水平增加超过正常空腹血浆葡萄糖水平时才被分泌。通常，这些激素响应于膳食而释放，并且它们通过激活胰腺β-细胞上的某些受体，辅助刺激胰岛素分泌。然而，当葡萄糖水平低时，glp-1和gip水平(及其对胰岛素分泌的刺激作用)减小[druckerd.j.，“thebiologyofincretinhormones”，cellmetab，第3卷：153-165,(2006)]。

前胰高血糖素原衍生的肽：胰高血糖素glp1和glp2，由前胰高血糖素原基因编码，其在中枢神经系统、肠l-细胞、以及胰腺和胃α细胞中表达。通过激素原转变酶(pc)的翻译后切割负责生成所有这些肽的前胰高血糖素激素的成熟。每种组织中不同pc亚型的表达介导每种不同肽的产生。在α-细胞中，前蛋白转变酶枯草杆菌蛋白酶/kexin2型(pcsk2)的优势导致产生胰高血糖素连同产物肠高血糖素、肠高血糖素重复的胰多肽、间插肽1和主要的高血糖素原片段的产生[deya.等人，“significanceofprohormoneconvertase2，pc2，mediatedinitialcleavageattheproglucagoninterdomainsite，lys70-arg71，togenerateglucagon”，endocrinol.，第146卷:713-727,(2005)]。在肠内分泌细胞中，pcsk1/3酶切割前胰高血糖素原激素，以生成glp1和glp2连同肠高血糖素、间插肽1和胃泌酸调节素[mojsovs.，“preproglucagongeneexpressioninpancreasandintestinediversifiesatthelevelofpost-translationalprocessing”，j.biol.chem.，第261卷:11880-11889(1986)]。在某些条件下，胰岛α细胞是用于glp-1产生的肠外位点[porthab.等人，“activationoftheglp-1receptorsignallingpathway:arelevantstrategytorepairadeficientbeta-cellmass”，exptldiabetesres.article376509:1-11,(2011)]。glp-1的许多观察到的细胞作用之一是β细胞katp通道的抑制，所述β细胞katp通道通过电压依赖性钙通道启动ca²⁺流入，并且触发胰岛素的胞吐释放[macdonaldp.e.等人，“themultipleactionsofglp-1ontheprocessofglucose-stimulatedinsulinsecretion”，diabetes，第51卷(suppl.3):s434-s442,(2002)]。

将葡萄糖转运到细胞中

由于葡萄糖不易于通过所有细胞膜扩散，因此需要胰岛素和转运蛋白家族(促进葡萄糖转运蛋白[glut]分子)二者的辅助以获得进入大多数细胞[bryant等人，nat.rev.mol.cellbiol.“regulatedtransportoftheglucosetransporterglut4”,vol.3(4):267-277,(2002)]。glut充当穿梭物，形成跨越在其他情况下为疏水性的细胞膜的水性孔，通过所述水性孔葡萄糖可以更容易地移动。在12种已知的glut分子中，glut4被认为是用于脂肪、肌肉和心脏组织的主要转运蛋白，而glut1、2、3和8促进葡萄糖进入其他器官(例如，脑，肝)。glut4的激活并且进而促进葡萄糖进入肌肉和脂肪组织的扩散依赖于胰岛素的存在，而其他glut的功能较为独立于胰岛素[uldrym.等人，“theslc2familyoffacilitatedhexoseandpolyoltransporters”,thorensb,eur.j.physiol.2004;vol.447:480-489,(2004)]。

外周组织中的大部分葡萄糖摄取(≥80％)发生在肌肉中，其中葡萄糖可以立即用于能量或作为糖原储存。骨骼肌是胰岛素依赖性的，并且因此需要胰岛素来激活糖原合酶，糖原合酶是调节糖原产生的主要酶。虽然脂肪组织负责的外周葡萄糖摄取量小得多(2％-5％)，但它通过调节游离脂肪酸(其增加糖异生)从储存的甘油三酯的释放，影响肌肉和肝脏中的胰岛素敏感性，而在维持全身葡萄糖稳态中发挥重要作用。

虽然肝脏不需要胰岛素来促进葡萄糖摄取，但它确实需要胰岛素来调节葡萄糖输出。因此，例如，当胰岛素浓度低时，肝葡萄糖输出升高。此外，胰岛素有助于肝脏以糖原的形式储存大部分吸收的葡萄糖。

肾脏通过将葡萄糖释放到循环中(糖异生)，从循环中摄取葡萄糖以满足肾能量需求，以及在近端小管中重新吸收葡萄糖，而在葡萄糖稳态中起作用。肾脏还通过促进其在尿液中的排泄，而有助于消除过量的葡萄糖(当水平超过约180mg/dl时，尽管这个阈值可在慢性高血糖期间升高)。

人胰岛的细胞结构

在人胰岛中，含有胰岛素的β细胞与胰岛内的其他细胞类型混合，即发现含有胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的细胞分布遍及人胰岛[cabrerao.等人，“theuniquecytoarchitectureofhumanpancreaticisletshasimplicationsforisletcellfunction”,proc.natlacad.sci.u.s.,vol.103:2334-2339,(2006)]。人胰岛不显示明显的细分，但90％的α细胞与β细胞直接接触，并且β细胞与整个胰岛内的其他内分泌细胞自由混合。β、α和δ细胞等同且随机进入胰岛内的血管，排除了不同内分泌细胞组织在血管周围的层中的可能性。这些结果支持如下模型，其中没有胰岛灌注的设定顺序，并且其中任何给定的细胞类型可以影响其他细胞类型，包括其自身的细胞类型[g.dasilvaxavier等人，”per-arnt-sim(pas)domain-containingproteinkinaseisdownregulatedinhumanisletsintype2diabetesandregulatesglucagonsecretion”,diabetologia,vol.54:819-827,(2011)]。

作为自身免疫疾病的糖尿病

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢疾病。慢性高血糖与器官的长期损害、功能障碍和潜在的衰竭相关，所述器官包括眼睛、肾脏、神经、心脏和血管。尚未开发出用于治疗糖尿病的理想治疗剂。

1型糖尿病(t1d)

在1型糖尿病中，β细胞被自身免疫过程破坏并且很大程度上被α细胞替代。[ungerr.h.等人，“paracrinologyofisletsandtheparacrinopathyofdiabetes”,proc.natlacad.sci.,u.s.,vol.107(37):16009-16012,(2010)]。这些α-细胞缺乏通常由来自并置的β细胞的高局部胰岛素浓度提供的紧张抑制(tonicrestraint)，导致不适当的高胰高血糖素血症[raskinp.等人，glucagonanddiabetes.themedicalclinicsofnorthamerica62,713(1978)]；[habenerj.f.等人，“alphacellssomeofage”,trendsinendocrinology&metabolism:temvol.24,153-163(2013)]；[ungerr.h.等人，“glucagonocentricrestructuringofdiabetes:apathophysiologicandtherapeuticmakeover”,j.clinicalinvestig.vol.122(1):4-12,(2012)]；[vuguinp.m.等人，“novelinsightintoglucagonreceptoraction:lessonsfromknockoutandtransgenicmousemodels”,diabetes,obesity&metabolism,vol.13(1),144-150,(2011)]，其驱动增加胰高血糖素分泌的高血糖的激增[ungerr.h.等人，“glucagonocentricrestructuringofdiabetes:apathophysiologicandtherapeuticmakeover”,j.clinicalinvestig.vol.122(1):4-12,(2012)]。需要超常的胰岛素水平以匹配正常胰岛中的相邻β细胞给予α-细胞的胰岛素。这导致终生的高胰岛素血症，其使主体暴露于低血糖的频繁发生，这增加了继发病，诸如血管壁中低密度脂蛋白(ldl)积聚，导致动脉粥样硬化的阻塞和冠状动脉疾病。

t1d的四种病理特征是血糖水平、血红蛋白a1c、胰高血糖素和c肽

t1d中的免疫功能障碍是复杂的，对胰岛内和胰腺外都有影响。免疫系统的不同组分[例如，cd4⁺，cd8⁺t细胞，t调节细胞(treg)，b细胞，树突细胞(dc)，单核细胞/巨噬细胞(mo/mφ)，自然杀伤t细胞(nkt)]所有这些都被设想为积极促进t1d中的自身免疫反应，从而使开发遍及具有疾病的个体发挥作用的有效和成功治疗或者治愈措施的潜在努力变得复杂化。几项临床试验[bachj.f.,“anti-cd3antibodiesfortype1diabetes:beyondexpectations”,lancet.,vol.378:459–460,(2011)]；[wherrettd.k.等人，“antigen-basedtherapywithglutamicaciddecarboxylase(gad)vaccineinpatientswithrecent-onsettype1diabetes:arandomizeddouble-blindtrial”,lancet.,vol.378:319–327,(2011)]强调了开发用于t1d的疗法和寻找用于t1d的治愈措施中障碍，并指出需要对局部胰腺和系统水平产生全面免疫调节而不是靶向免疫系统的一个或几个组分的胰腺作用的方法。

t1d中的自身免疫的可能触发因素包括但不限于遗传、表观遗传、物理、社会和环境因素，其可独立或共同起作用以启动或加强自身免疫的发展。已将免疫系统中与t1d相关的功能障碍追溯到多种细胞类型和靶标的功能障碍，包括t细胞、b细胞、调节性t细胞(treg)、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞(dc)、自然杀伤(nk)细胞和自然杀伤t(nkt)细胞[lehuena.等人，“immunecellcrosstalkintypeidiabetes”,natrevimmunol.vol.10:501-513,(2010)]。由于t1d相关的自身免疫反应的多克隆性质以及t1d患者中免疫调节的全面挑战，仅靶向自身免疫反应的一个或几个组分的疗法和试验很可能失败，正如最近涉及用于t细胞的抗cd3ab，用于b细胞的抗cd19ab和gad65疫苗接种的试验已经失败[bachj.f.,“anticd-3antibodiesfortype1diabetes:beyondexpectations”,lancet,vol.378:459-460,(2011)]；[mathieuc.等人，“arrestingtypeidiabetesafterdiagnosis:gadisnotenough”,lancet,vol.378:291-292,(2011)]。

虽然已经探索干细胞疗法作为替代被破坏的胰岛β细胞的途径，但是这种方法在没有降低潜在的自身免疫反应的情况下几乎没有作用。

解决t1d中潜在的自身免疫性的尝试是不成功的[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcellsandthejourneytoacurefortype1diabetes”,autoimmunrev.,vol.10:103-107,(2010)]，这是由于自身免疫反应的多克隆性质以及t1d患者中免疫调节的全面挑战[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcellsandthejourneytoacurefortype1diabetes”,autoimmunrev.,vol.10:103-107,(2010)]；[abdir.等人，“immunomodulationbymesenchymalstemcells:apotentialtherapeuticstrategyfortype1diabetes”,diabetes,vol.57:1759-1767,(2008)]；[aguayo-mazzucatoc.等人，“stemcelltherapyfortypeidiabetes”,natrevendocrinol.,vol.6:139-148,(2010)]；[uccellia.等人，“mesenchymalstemcellsinhealthanddisease”,natrevimmunol.,vol.8:726-736,(2008)]；[zhaoy.等人，“immuneregulationoftlymphocytebyanewlycharacterizedhumanumbilicalcordbloodstemcell”,immunollett.,vol.108:78-87,(2007)]。已经提出了将单个方法组合来解决这些挑战[aguayo-mazzucatoc等人，“stemcelltherapyfortypeidiabetesmellitus”,natrevendocrinol,vol.6:139-148,(2010)]；[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcell-modulatedregulatorytlymphocytesreversetheautoimmune-causedtype1diabetesinnonobesediabetic(nod)mice”,plosone,vol.4:e4226,(2009)]；[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.vol.10(3),1-11,(2012)]，但遵守这些方法仍然很复杂，而且往往成本很高。

2型糖尿病

2型糖尿病(t2d)是高血糖病变，其中存在β-细胞，从而将其与1型糖尿病区别开来。尽管许多因素促成t2d的发展，但中心缺陷是胰岛素分泌不足(胰岛素缺乏)和/或在激素作用的复杂途径的一个或多个点上，组织对胰岛素的响应减弱(胰岛素抗性)[triplittc.l.,“examiningthemechanismsofglucoseregulation”,am.j.manag.care,vol.18(1suppl)s4-s10,(2012)]。胰岛素缺乏和胰岛素抗性经常共存，尽管对高血糖的贡献在t2d的范围内可以广泛变化。

有证据表明t2d的病因包括引发影响胰岛β细胞的炎症的自身免疫组分，这为胰岛素抗性的机制和通过免疫调节对胰岛素抗性的潜在治疗提供了新的见解。一些临床研究显示t2d患者[jagannathan-bogdanm.等人，“elevatedproinflammatorycytokineproductionbyaskewedtcellcompartmentrequiresmonocytesandpromotesinflammationintype2diabetes”,jimmunol,vol.186:1162-1172,(2011)]和肥胖患者[sumarac-dumanovicm.等人，”increasedactivityofinterleukin-23/interleukin-17proinflammatoryaxisinobesewomen”,intjobes(lond),vol.33:151-156,(2009)]中的il-17产生水平增加。其他研究显示，在t2d主体中th1相关的细胞因子il-12的水平增加[wuh.p.等人，“highinterleukin-12productionfromstimulatedperipheralbloodmononuclearcellsoftype2diabetespatients”,cytokine,vol.51:298-304,(2010)]。

组织区室

在多细胞生物中，特化执行共同功能的细胞通常被组织成嵌入分泌的细胞外大分子(即，细胞外基质(ecm))的复杂网络中的合作组件，以形成特化的组织区室。这样的组织区室中的个体细胞与ecm大分子接触。ecm有助于将细胞和区室保持在一起，并提供组织化晶格或支架，细胞可在其中迁移并彼此相互作用。在许多情况下，区室中的细胞可通过直接的细胞-细胞粘附而保持在适当位置。在脊椎动物中，这样的区室可以具有四种主要类型：结缔组织区室、上皮组织区室、肌肉组织区室和神经组织区室，它们源自三个胚胎胚层：外胚层、中胚层和内胚层。神经组织区室和部分的上皮区室从外胚层分化；结缔组织区室、肌肉组织区室和其他部分的上皮组织区室源自中胚层[kieckerc.等人，“molecularspecificationofgermlayersinvertebrateembryos”,cellmollifesci.,epubaheadofprint,(2015)pmid:26667903]。

干细胞生境

成体组织区室含有成体干细胞的内源生境，成体干细胞能够根据其在体内的位置分化成确定的内胚层、中胚层或外胚层结局的不同细胞谱系。例如，在存在一组适当的内部和外部信号的情况下，骨髓来源的成体造血干细胞(hsc)具有分化为血液、内皮细胞、肝细胞和肌肉细胞的潜力；脑来源的神经干细胞(nsc)具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和血细胞的潜力；肠和表皮来源的成体上皮干细胞(epsc)具有产生上皮隐窝和表皮层的细胞的潜力；脂肪来源的干细胞(asc)具有产生脂肪、肌肉、软骨、内皮细胞、神经元样细胞和成骨细胞的潜力；和骨髓来源的成体间充质干细胞(msc)具有产生骨、软骨、肌腱、脂肪、肌肉、骨髓基质和神经细胞的潜力[hodgkinsont.等人，“adultstemcellsintissueengineering”,expertrevmeddevices,vol.6(6):621-640]。

内源性成体干细胞嵌入给定组织区室的ecm组分内，其与支持细胞一起形成细胞生境。ecm支架内的此类细胞生境与周围的微环境一起促成重要的生化和物理信号，包括生长因子和转录因子，其为启动干细胞分化成定向前体细胞(committedprecursorscell)以及随后的前体细胞成熟以形成具有特化表型和功能特征的成体组织细胞所需的[hodgkinsont.等人，“adultstemcellsintissueengineering”,expertrevmeddevices,vol.6(6):621-640]。

生长因子

生长因子是与细胞表面受体结合的细胞外多肽分子，其触发细胞内信号传导途径，导致增殖，分化或其他细胞响应。这些途径刺激蛋白质和其他大分子的积累，并且它们通过提高其合成速率和降低其降解速率来实现。由生长因子受体激活的一种细胞内信号传导途径涉及酶pi3-激酶，其将来自atp的磷酸添加到质膜中的肌醇磷脂的3位。pi3激酶的激活导致几种蛋白激酶的激活，包括s6激酶。s6激酶磷酸化核糖体蛋白s6，增加核糖体翻译mrna子集的能力，其中大多数编码核糖体组分，其结果是蛋白质合成增加。当编码s6激酶的基因在果蝇中失活时，细胞数正常，但细胞大小异常小，且突变蝇很小。生长因子还激活称为eif4e的翻译起始因子，进一步增加蛋白质合成和细胞生长[farrarw.l.等人，“hematopoieticgrowth-factorsignaltransductionandregulationofgeneexpression”,vol.49:379-410,(1990)]。

生长因子刺激还导致基因调节蛋白myc的产生增加，myc在促有丝分裂原的信号传导中起作用。myc增加许多编码参与细胞代谢和大分子合成的蛋白质的基因的转录。以这种方式，它刺激细胞代谢和细胞生长[grifonid.等人，“drosophilamyc:amasterregulatorofcellularperformance”,vol.1849(5):570-581]。

一些细胞外信号蛋白，包括血小板衍生生长因子(pdgf)，可以充当生长因子和促有丝分裂原，刺激细胞生长和细胞周期进程。这种功能性重叠部分地通过控制这两个过程的细胞内信号传导途径中的重叠来实现。例如，信号传导蛋白ras被生长因子和促有丝分裂原二者激活。它可以刺激pi3-激酶途径促进细胞生长并刺激map-激酶途径以触发细胞周期进程。类似地，myc刺激细胞生长和细胞周期进程二者。充当生长因子和促有丝分裂原二者的细胞外因子有助于确保细胞在它们增殖时保持其适当的大小[kimw.s.等人，“thepivotalroleofpdgfanditsreceptorisoformsinadipose-derivedstemcells”,vol.30(7),793-799]。

由于许多促有丝分裂原、生长因子和存活因子是细胞周期进程、细胞生长和细胞存活的正调节因子，因此它们倾向于增加器官和生物体的大小。然而，在一些组织中，细胞和组织大小也受到抑制性细胞外信号蛋白的影响，所述细胞外信号蛋白与正调节因子相反并因此抑制器官生长。最充分理解的抑制信号蛋白是tgf-β3及其相关物。tgf-i3通过阻断g1中的细胞周期进程或通过刺激凋亡来抑制几种细胞类型的增殖。tgf-β3与细胞表面受体结合并启动细胞内信号传导途径，其导致称为smads的基因调节蛋白的活性变化。这导致编码细胞分裂和细胞死亡调节因子的基因转录的复杂变化。

tgf-i3家族成员骨形态发生蛋白(bmp)有助于触发凋亡，其去除小鼠爪中发育中的趾之间的组织。与tgf-13类似，bmp刺激调节细胞死亡的基因转录的变化[ehrlichm.,“endocytosisandtraffickingofbmpreceptors:regulatorymechanismsforfine-tuningthesignalingresponseindifferentcellularcontexts”,cytokinegrowthfactorrev.epubaheadofprintpmid:26776724,(2016)]。

成纤维细胞生长因子(fgf)

成纤维细胞生长因子(fgf)家族目前有十几个结构相关的成员。fgf1也称为酸性fgf。fgf2有时称为碱性fgf(bfgf)，且fgf7有时被命名为角化细胞生长因子。在脊椎动物中已知超过十几种不同的fgf基因。它们可以通过在不同组织中改变其rna剪接或起始密码子来产生数百种蛋白质同种型。fgf可以激活一组称为成纤维细胞生长因子受体(fgfr)的受体酪氨酸激酶。受体酪氨酸激酶是延伸通过细胞膜的蛋白质。结合旁分泌因子的蛋白质的部分位于细胞外侧，而休眠酪氨酸激酶(即可通过分裂atp使另一种蛋白质磷酸化的蛋白质)位于细胞内侧。当fgf受体结合fgf时(并且仅当它结合fgf时)，休眠激酶被激活，并使响应细胞内的某些蛋白质磷酸化，激活这些蛋白质[lix.等人，“fibroblastgrowthfactors,oldkidsonthenewblock”,semincelldevbiol.epubaheadofprint,pmid:26768548,(2016)]。

fgf与几种发育功能相关，包括血管生成(血管形成)、中胚层形成和轴突延伸。虽然fgf通常可以互相替代，但它们的表达模式赋予它们独立的功能。fgf2在血管生成中特别重要，而fgf8参与中脑和四肢的发育[peng等人，“stemscellsanddevelopment”,vol.17:761-774,(2008)]。

已发现血管生成因子如vegf、igf、pdgf、hgf、fgf、tgfβ、血管生成素-1和干细胞因子(scf)的表达水平在骨衍生的-、软骨衍生的-和脂肪衍生的-msc之间是不同的[peng等人，“stemscellsanddevelopment”,vol.17:761-774,(2008)]。

胰岛素样生长因子(igf-1)

igf-1是与胰岛素分子结构相似的激素，对身体的几乎每个细胞都有促进生长的作用，特别是骨骼肌、软骨、骨骼、肝脏、肾脏、神经、皮肤、造血细胞和肺部。它在儿童生长中起重要作用，并且在成人中继续具有合成代谢作用。igf-1主要由肝脏作为内分泌激素以及在靶组织中以旁分泌/自分泌方式产生。生长激素(gh)刺激生产，并且可以通过营养不良，生长激素不敏感，缺乏生长激素受体或下游信号分子(包括shp2和stat5b)的失效而延迟生产。其主要作用是通过与许多组织中许多细胞类型上存在的其特异性受体胰岛素样生长因子1受体(igf1r)结合而介导。与受体酪氨酸激酶igf1r结合，启动细胞内信号传导；igf-1是akt信号途径最有效的天然激活剂之一，是细胞生长和增殖的刺激物，并且是程序性细胞死亡的有效抑制剂。igf-1是生长激素(gh)作用的主要介质。生长激素在脑垂体中产生，释放到血流中，并且然后刺激肝脏产生igf-1。然后，igf-1刺激全身性身体生长。除了其胰岛素样作用外，igf-1还可以调节细胞生长和发育，尤其是神经细胞中，以及细胞dna合成[aquirreg.a.等人，“insulin-likegrowthfactor-1deficiencyandmetabolicsyndrome,j.trans.med.,vol.14(1):1-23,(2016)]。

转化生长因子βtgf-β

tgf-β超家族有超过30个结构相关成员，并且它们调节发育中一些最重要的相互作用。tgf-β超家族基因编码的蛋白质经过加工，使得羧基末端区域含有成熟肽。这些肽二聚成同二聚体(与它们自身)或异二聚体(与其他tgf-β肽)，并从细胞中分泌。tgf-β超家族包括tgf-β家族，激活素家族，骨形态发生蛋白(bmps)，vg-1家族和其他蛋白质，包括神经胶质衍生的神经营养因子(gdnf，肾脏和肠神经元分化所必需的)和mullerian抑制因子，其参与哺乳动物的性别决定。tgf-β家族成员tgf-β1、2、3和5在调节细胞之间的细胞外基质的形成和用于(正和负)调节细胞分裂中是重要的。tgf-β1通过刺激胶原蛋白和纤连蛋白合成以及通过抑制基质降解，来增加细胞外基质上皮细胞的量。tgf-β可以在控制上皮在何处和何时可以分支以形成肾、肺的管道，和唾液腺的导管中是重要的[aschnery.等人，“transforminggrowthfactor-β:masterregulatoroftherespiratorysysteminhealthanddisease”,amjrespircellmolbiol,epubaheadofprintpmid:26796672,(2016)]。

bmp家族的成员最初是通过其诱导骨形成的能力而被发现的。然而，骨形成仅是它们的许多功能之一，并且已经发现它们调节细胞分裂、凋亡(程序性细胞死亡)、细胞迁移和分化。通过在成熟多肽中具有7个而不是9个保守的半胱氨酸，可以将bmp与tgf-β超家族的其他成员区分开。bmp包括蛋白质，如nodal(负责左右轴形成)和bmp4(在神经管极性、眼睛发育和细胞死亡中很重要)[nettersheimd.等人，“bmpinhibitioninseminomasinitiatesacquisitionofpluripotencyvianodalsignalingresultinginreprogrammingtoanembryonalcarcinoma,plosgenet.vol.11(7):1-26,(2015)]。

干细胞

如本文所用的术语“干细胞”是指具有高增殖潜力和自我更新的能力并可以产生子细胞的未分化细胞，所述子细胞可以经历终末分化成多于一种不同细胞表型。干细胞通过两个特征而与其他细胞类型区分开来。首先，它们是能够通过细胞分裂自我更新(有时在长时间不活动后)的非特化细胞。其次，在某些生理或实验条件下，它们可被诱导成为具有特殊功能的组织或器官特异性细胞。在一些器官中，例如肠道和骨髓，干细胞经常分裂以修复和更换磨损或受损的组织。然而，在其他器官中，例如胰腺和心脏，干细胞仅在特定条件下分裂[romitoa.等人，“pluripotentstemcells:currentunderstandingandfuturedirections”,stemcellsint.,id9451492,2016)]。

胚胎干细胞(emsc)是源自胚胎的干细胞，其为多潜能的，即它们能够在体外分化成内胚层、中胚层和外胚层细胞类型。[thomsonj.a.等人，“embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts”,science,vol.282(5391):1145-1147,(1992)]。

成体(体细胞)干细胞是在组织或器官中的分化细胞中发现的未分化细胞。它们在体内的主要作用是维持和修复其中发现它们的组织。已经在许多器官和组织中鉴定出成体干细胞，包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、胃肠道、肝脏、卵巢上皮和睾丸。成体干细胞被认为驻留在每个组织的称为干细胞生境的特定区域，在此处它们可以长时间保持静止(非分裂)，直到它们被对用于维持组织的更多细胞的正常需要激活，或被疾病或组织损伤激活。成体干细胞的实例包括但不限于造血干细胞和间充质干细胞[dzierzake.等人，“oflineageandlegacy:thedevelopmentofmammalianhematopoieticstemcells”,natureimmunol.,vol.9(2):129-136,(2008)]。

造血干细胞(hscs)

造血干细胞(也称为骨髓和淋巴细胞的集落形成单位(cfu-m,l)或cd34⁺细胞)是血液形成器官内罕见的多潜能细胞，其负责在生命期间持续产生血细胞[liy.等人，“inflammatorysignalingregulatesembryonichematopoieticstemandprogenitorcellproduction”,genesdev.,vol.28(23):2596-2612,(2014)]。

虽然没有仅由造血干细胞表达的单一细胞表面标记物，但通常已经接受人类hsc具有以下抗原谱：cd34⁺、cd59⁺、thyl⁺(cd90)、cd38低/-和c-kit-/低。除血小板和红细胞外，cd45也是hsc的常见标志物。hsc可以产生多种细胞类型，包括红细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、肥大细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、破骨细胞、以及t和b淋巴细胞。造血干细胞的调节是一个复杂的过程，涉及自我更新，存活和增殖，谱系定向和分化，并由多种机制协调，包括内部细胞编程和外部刺激，如与微环境基质的粘附相互作用和细胞因子的作用。

不同的旁分泌因子对于使造血干细胞沿特定途径分化是重要的。参与血细胞和淋巴细胞形成的旁分泌因子称为细胞因子。细胞因子可由几种细胞类型制成，但它们由造血作用位点的基质(间充质)细胞的细胞外基质收集和浓缩。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和多系生长因子il-3都与骨髓基质的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖结合。然后，细胞外基质以足够高的浓度将这些因子呈递给干细胞以与其受体结合[alvarezs.等人，“gm-csfandil-3activitiesinschistosomallivergranulomasarecontrolledbystroma-associatedheparansulfateproteoglycans”,jleukocbiol.,vol.59(3):435-441,(1996)]。

间充质干细胞(msc)

间充质干细胞(msc)(也称为骨髓基质干细胞或骨骼干细胞)是在各种组织中发现的非血液成体干细胞。它们的特征在于其纺锤形形态；在其细胞表面表达特异性标记物；及其在适当的条件下沿至少三个谱系(成骨、软骨形成和脂肪形成)分化的能力[najarm.等人，“mesenchymalstromalcellsandimmunomodulation:agatheringofregulatoryimmunecells”,cytotherapy,vol.18(2):160-171,(2016)]。

由于缺乏关于msc表型的共识，尚未鉴定出明确描述体内msc的单一标记物，但通常认为msc对细胞表面标记物cd105、cd166、cd90和cd44呈阳性，并且msc对典型的造血抗原，如cd45、cd34和cd14呈阴性。至于msc的分化潜能，研究报道骨髓来源的msc群体具有在体外和体内发育成终末分化的间充质表型的能力，包括骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪组织和造血支持基质。使用转基因和敲除小鼠和人类肌肉骨骼病变的研究报道msc在胚胎发育和成体稳态期间分化成多个谱系[najarm.等人，“mesenchymalstromalcellsandimmunomodulation:agatheringofregulatoryimmunecells”,cytotherapy,vol.18(2):160-171,(2016)]。

在重现体内过程的适当条件下的msc的体外分化分析，已导致鉴定干细胞定向所必需的各种因子。其中，分泌的分子及其受体(例如，转化生长因子-(β)，细胞外基质分子(例如胶原蛋白和蛋白多糖)，肌动蛋白细胞骨架和细胞内转录因子(例如，cbfal/runx2，ppary，sox9和mef2)已显示在驱动多能mscs定向至特定谱系以及维持其分化表型方面发挥重要作用[davisl.a.等人，“mesodermalfatedecisionsofastemcell:thewntswitch”,cellmollifesci.,vol.65(17):2568-2574,(2008)]。

骨髓含有多种前体和成熟细胞类型，包括造血细胞，它们是成熟血细胞的前体细胞以及作为广谱结缔组织细胞的前体的基质细胞，两者都能够分化成其他细胞类型[wangj.s.等人，“thecoronarydeliveryofmarrowstromalcellsformyocardialregeneration:pathophysiologicandtherapeuticimplications”,j.thorac.cardiovasc.surg.,vol.122:699-705,(2001)]；[tomitas.等人，“autologoustransplantationofbonemarrowcellsimprovesdamagedheartfunction”,circulation,vol.100(suppl.ii):247-256,(1999)]；[saito,t.等人，“myogenicexpressionofmesenchymalstemcellswithinmyotubesofmdxmiceinvitroandinvivo”,tissueeng.,vol.1:327-343,(1995)]。未经修饰的(即未分级的)骨髓或血液来源的细胞已用于几个临床研究中，例如，[hamanok.等人，“localimplantationofautologousbonemarrowcellsfortherapeuticangiogenesisinpatientswithischemicheartdisease:clinicaltrialandpreliminaryresult”,japancir.j.,vol.65:845-847,(2001)]；[strauerb.e.,等人，“repairofinfarctedmyocardiumbyautologousintracoronarymononuclearbonemarrowcelltransplantationinhumans”,circulation,vol.106:1913-1918,(2002)]；[assmus等人，“transplantationofprogenitorcellsandregenerationenhancementinacutemyocardialinfarction(topcare-ami)”,circulation.,vol.106:3009-3017,(2002)]；[dobertn.等人，“transplantationofprogenitorcellsandregenerationenhancementinacutemyocardialinfarction(topcare-ami)”,eur.j.nuel.med.mol.imaging.,vol.8:1146-51,(2004)]；[wollertk.c.等人，“intracoronaryautologousbone-marrowcelltransferaftermyocardialinfarction:theboostrandomizedcontrolledclinicaltrial”,lancet,vol.364:141-148,(2004)]。由于骨髓的单核级分含有基质细胞、造血前体和内皮前体，这些种群中每一种对观察到的作用的相对贡献(如果有的话)仍然是未知的。

小鼠模型已经表明treg的调节可以加强自身免疫疾病的治疗[allenbach等人，“roleofregulatorytcellsinanewmousemodelofexperimentalautoimmunemyositis”,amj.pathol.,vol.174(3):989-998,(2014)]。

脐带干细胞

脐带干细胞是上皮组织区室的细胞的实例。在体内，可以发现两种类型的脐带干细胞，即造血干细胞(uc-hs)和间充质干细胞，这些细胞进而可以在脐带血(uc-ms)或华顿氏胶质(wharton'sjelly,uc-mm)中找到。作为移植干细胞的重要来源，脐带血出于以下几个原因长期以来一直是研究者关注的焦点：(1)与骨髓相比，它每单位体积含有较多原始造血干细胞(hsc)，其增殖更快；(2)移植后排斥风险较低；(3)移植不需要完美的hla抗原匹配(与骨髓的情况不同)；(4)uc血液已成功用于治疗先天性代谢紊乱；(5)不需要从脐带血中收集和储存单核细胞的新技术，因为这些方法早已确立[mihuc.等人，“isolationandcharacterizationofstemcellsfromtheplacentaandtheumbilicalcord”,romanianjournalofmorphologyandembryology,2008,49(4):441-446,(2008)]。

脐带(uc)血管和周围的间充质(包括称为华顿氏胶质的结缔组织)来自胚胎和/或胚外中胚层。因此，这些组织以及原始生殖细胞从近端外胚层分化，其在形成胚胎原始细胞系时含有msc和甚至一些具有多潜能能力的细胞。推测uc基质材料来源于原始间充质，其处于朝向成人骨髓间充质的过渡状态[mihuc.等人，“isolationandcharacterizationofstemcellsfromtheplacentaandtheumbilicalcord”,romanianjournalofmorphologyandembryology,2008,49(4):441-446,(2008)]。

来自胎盘和脐带的血液相对容易收集在普通的献血袋中，其中含有抗凝血物质。通过在ficoll梯度上离心分离单核细胞，从中将分离出两个干细胞群体：(1)表达某些特征标记物(cd34,cd133)的造血干细胞(hsc)；(2)在某些条件下(例如，修饰的mccoy培养基和用胎牛血清(fbs)或胎牛犊血清(fcs)的将容器被覆)粘附于培养表面的间充质干细胞(msc)[munnd.等人，“preventionofallogeneicfetalrejectionbytryptophancatabolism”,science,vol.281:1191-1193,(1998)]；[munnd.等人，“inhibitionoftcellproliferationbymacrophagetryptophancatabolism”,jexpmed,vol.189:1363-1372,(1999)]。与骨髓msc相比，脐带血msc(uc-ms)可产生细胞因子，其促进供体中的移植和体外hsc存活[zhangx.等人，“successfulimmortalizationofmesenchymalprogenitorcellsderivedfromhumanplacentaandthedifferentiationabilitiesofimmortalizedcells”,biochembiophysrescommun,vol.351:853-859,(2006)]。

已经描述了免疫原性极低的脐带血来源的多能干细胞(cb-sc)群体，其展示胚胎细胞标记物(例如，转录因子ot-4和nanog，阶段特异性胚胎抗原(ssea)-3和ssea-4)和白细胞共同抗原cd45但对cd34是阴性的，这使其与其他已知的干细胞类型区别开来，包括造血干细胞(hsc)、间充质干细胞(msc)和单核/巨噬细胞(mo/mφ)[zhaoy.等人，“successfulimmortalizationofmesenchymalprogenitorcellsderivedfromhumanplacentaandthedifferentiationabilitiesofimmortalizedcells”,exp.cellres.,vol.312:2454–2464,(2006)]；[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)]；[zhaoy.等人，“immuneregulationoftlymphocytebyanewlycharacterizedhumanumbilicalcordbloodstemcell”,immunol.lett.,vol.108:78-87,(2010)]。

人脐带血来源的干细胞(cb-scs)和间充质干细胞(mscs)已被显示在体外调节免疫活性[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcellsandthejourneytoacurefortype1diabetes”,autoimmunrev.,vol.10:103-107,(2010]；[abdir.等人，“immunomodulationbymesenchymalstemcells,apotentialtherapeuticstrategyfortypeidiabetes”,diabetes,vol.57:1759-1767,(2008)]；[aguayo-mazzucatoc.等人，“stemcelltherapyfortypeidiabetes”,natrevendocrinol,vol.6:139-148,(2010)]；[uccellia.等人，“mesenchymalstemcellsinhealthanddisease”,natrevimmunol,vol.8:726-736,(2008)]；[zhaoy.等人，”immuneregulationoftlymphocytebyanewlycharacterizedhumanumbilicalcordbloodstemcell”,immunollett.,vol.108:78-87,(2007)]。随后的研究已证实，cb-sc可用于在非肥胖糖尿病小鼠(nod)中改变免疫功能和改善t1d的标记物[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcell-modulatedregulatorytlymphocytesreversetheautoimmune-causedtype1diabetesinnonobesediabetic(nod)mice”,plosone,vol.4:e4226,(2009)]，并且cb-sc已显示在共培养中调节t1d患者来源的胰岛细胞特异性致病性t细胞克隆的免疫功能[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcellsandthejourneytoacurefortype1diabetes”,autoimmunrev.,vol.10:103-107,(2010)]。动物模型中的研究证实了这些发现，并表明cb-sc治疗可以在没有干细胞移植的情况下再生胰岛β细胞的原生群体[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcell-modulatedregulatorytlymphocytesreversetheautoimmune-causedtype1diabetesinnonobesediabetic(nod)mice”,plosone,vol.4:e4226,(2009)]；[zhaoy.等人，“humancordbloodstemcellsandthejourneytoacurefortype1diabetes”,autoimmunrev.,vol.10:103-107,(2010]。

zhao等人开发了一种方法，其中将患者的血液通过称为生物反应器装置的连续闭环系统循环（所述生物反应器装置将淋巴细胞与全血分离），在贴壁cb-sc存在下短暂地共同培养淋巴细胞，且然后将“驯化的”淋巴细胞返回患者的血液循环[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletbetacellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed,vol.10:3,(2012]。在开放标签1/2期研究中，十二(12)名患有t1d的亚裔患者接受了使用生物反应器装置的单一治疗，且3名亚裔患者接受了使用没有贴壁cb-sc的生物反应器装置的单一治疗(即，仅处理对照)。按照制造商推荐的方案，将16号iv针留置于左(或右)肘正中静脉中，并使患者的血液以35ml/min通过血细胞分离器mcs+(haemonetics®,braintree,ma)6至7小时以分离淋巴细胞。将收集的淋巴细胞转移到所述装置中以暴露于同种异体cb-sc(或没有cb-sc的处理对照)，并将其他血液组分返回给患者。在装置中2至3小时后，在重力流动控制(2至3ml/min)下，用生理盐水，使淋巴细胞通过手中的背静脉返回患者的循环。在该过程中处理大约10,000ml血液，导致对淋巴细胞级分的大约两次重复驯化。患者住院两天以监测体温并针对治疗(一次这样的治疗)后的不良反应进行常规实验室血液检查。

基于一小组亚裔参与者的初步结果显示，所有参与者都能很好地耐受所述疗法，具有来自两次静脉穿刺的极小疼痛且没有不良事件，并且可以显著提高c肽水平，降低糖化血红蛋白a1c(hba1c)中值，并且在具有一些残留β细胞功能的患者(n=6)中降低胰岛素的日剂量中值。

在生物反应器装置疗法后4周，参与者外周血中cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg的百分比显著增加，而接受假疗法的参与者的外周血中treg的百分比与基线相比没有变化。治疗组的参与者在4周随访时表现出tgfβ1血浆水平的显著增加，但与假对照相比，没有表现出il-10血浆水平的变化。在生物反应器装置疗法后4周，淋巴细胞中的流式细胞术显示cd28和诱导型共刺激(icos)增加，这对于treg的建立、维持和功效至关重要[bour-jourdanh.等人，“intrinsicandextrinsiccontrolofperipheralt-celltolerancebycostimulatorymoleculesofthecd28/ b7family”,immunol.rev.,vol.241:180-205,(2011)]；[hornbacha.a.等人，“effectiveproliferationofhumanregulatorytcellsrequiresastrongcostimulatorycd28signalthatcannotbesubstitutedbyil-2”,j.immunol.,vol.179:7924-7931,(2007)]；[horis.,“effectiveproliferationofhumanregulatorytcellsrequiresastrongcostimulatorycd28signalthatcannotbesubstitutedbyil-2”,eur.j.immunol.,vol.40:664-667,(2010)]；[tangq等人，“ctla4expressionisanindicatorandregulatorofsteady-statecd4+foxp3+tcellhomeostasis”,j.immunol.,vol.,171:3348-3352,(2003)]；[vangk.b.,等人，“cuttingedge:cd28andc-rel-dependentpathwaysinitiateregulatorytcelldevelopment”,j.immunol.,vol.184:4074-77,(2010)]；[hermana.e.等人，“cd4+cd25+tregulatorycellsdependentonicospromoteregulationofeffectorcellsintheprediabeticlesion”,j.exptmed.vol.199:1479-1489,(2004)]；[gotsmani.等人，“impairedregulatoryt-cellresponseandenhancedatherosclerosisintheabsenceofinduciblecostimulatorymolecule”,circulation,vol.114:2047-2055,(2006)]；[nurievar.i.等人，“molecularmechnismsfortcelltolerance”,immunol.rev.vol,241:133-144,(2014)]；[rudenskya.y.,“regulatorytcellsandfoxp3”,immunol.rev.,vol.241:260-268,(2011)]，但假对照中两种分子的水平均未改变。il-4和il-12的表达显著增加，且il-5和il-13的表达降低。治疗后4周，促炎性il-17a的产生也减少。假治疗后，没有观察到这些细胞因子水平的变化。

尽管是富有启发性的，但使用连续闭环系统的治疗由于孵育的效率有限而对于商业用途来说是不切实际的，因为在其使用期间需要人员，并且使用起来很昂贵。

所描述的发明提供了实用的不连续系统，其采用处理设施来制备驯化的单核细胞产物。该治疗仅需要两次静脉穿刺，比典型的输血具有更低的感染风险，并且不向患者引入干细胞或使用过的试剂。此外，由于cb-sc具有非常低的免疫原性，因此消除了在治疗前进行人白细胞抗原(hla)匹配的需要。此方法可以为多种自身免疫疾病提供cb-sc介导的免疫调节疗法，同时减轻与其他方法相关的安全性和伦理问题。相对于其他方法，该方法的相对简单性还可以提供成本和时间上的节省。

发明概述

根据一个方面，所述发明提供了治疗以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的方法，其依次包括：(1)在无菌条件下，从患有以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的主体获得含有单核细胞的全血样品；(2)将(1)的全血样品运送到处理设施；(3)从全血样品中无菌纯化单核细胞(mnc)，形成单核细胞制剂；(4)将单核细胞制剂引入生物反应器装置，所述生物反应器装置包含活的贴壁脐带血干细胞(uc-sc)的群体，其中所述贴壁uc-sc至少80％汇合；(5)将所述单核细胞制剂与cb-sc共培养，使所述单核细胞制剂中的单核细胞和cb-sc可以在无菌条件下相互作用至少0.1小时、至少0.2小时、至少0.3小时、至少0.4小时、至少0.5小时、至少0.6小时、至少0.7小时、至少0.8小时、至少0.9小时、至少1.0小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少3.5小时、至少4小时、至少4.5小时、至少5小时、至少5.5小时、至少6小时、至少6.5小时、至少7小时、至少7.5小时、或至少8小时，以形成驯化的单核细胞产物；(6)在无菌条件下从所述生物反应器装置中收获驯化的单核细胞产物；(7)确认驯化的单核细胞产物的纯度、无菌性和存活力百分比，所述驯化的单核细胞产物具有至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹，或至少10¹⁰个单核细胞；(8)将驯化的单核细胞产物运送到临床设施，用于血管内输注到主体中；和(9)将治疗有效量的驯化的单核细胞产物血管内输注主体中；和(10)在主体生存期，根据需要在多个输注日期，依次重复步骤(1)至(9)，其中治疗有效量的驯化的单核细胞产物可有效调节主体的t细胞区室中的自身反应性，并减轻以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的症状。根据一个实施方案，所述主体是高加索人种。根据另一实施方案，所述以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病是自身免疫疾病。根据另一实施方案，所述自身免疫疾病是糖尿病。根据另一实施方案，所述自身免疫疾病是1型糖尿病。根据另一实施方案，所述自身免疫疾病是2型糖尿病。根据另一实施方案，所述脐带血单核干细胞与分离的单核细胞是同种异体的。根据另一实施方案，所述方法进一步包括通过依次包括以下步骤的方法制备包含uc-sc的生物医学装置：(a)获得从健康供体获得的新鲜脐带血单位；(b)通过密度梯度离心从脐带血分离单核细胞级分；(c)去除红细胞；(d)用生理缓冲盐水洗涤uc-单核细胞；(e)将所述uc单核细胞以至少为1×10⁶个细胞的接种密度，接种在生物反应器中的无血清培养中；(f)在无血清培养基中培养所述uc单核细胞，每2-3天更换一半/培养基以除去非贴壁细胞，持续至少10天生长到至少80％汇合；和(g)确认(f)中汇合的贴壁uc-sc的样品的无菌性和存活力。

根据另一方面，所述发明提供了包含治疗量的驯化的单核细胞产物的药物，其中所述驯化的单核细胞产物通过包括以下的方法产生：(1)在无菌条件下，从患有以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的主体获得含有单核细胞的全血样品；(2)将(1)的全血样品运送到处理设施；(3)从全血样品中无菌纯化单核细胞(mnc)，以形成单核细胞制剂；(4)将单核细胞制剂引入生物反应器装置，所述生物反应器装置包含活的贴壁脐带血干细胞(uc-sc)的群体，其中所述贴壁uc-sc至少80％汇合；(5)将所述单核细胞制剂与cb-sc共培养，使所述单核细胞制剂中的单核细胞和cb-sc可以在无菌条件下相互作用至少0.1小时、至少0.2小时、至少0.3小时、至少0.4小时、至少0.5小时、至少0.6小时、至少0.7小时、至少0.8小时、至少0.9小时、至少1.0小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少3.5小时、至少4小时、至少4.5小时、至少5小时、至少5.5小时、至少6小时、至少6.5小时、至少7小时、至少7.5小时、或至少8小时，以形成驯化的单核细胞产物，其中治疗有效量的驯化的单核细胞产物有效调节主体的t细胞区室中的自身反应性，并减轻以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的症状，和其中所述驯化的单核细胞产物包含：至少1×10⁸、至少1×10⁹，或至少1×10¹⁰个单核细胞；和(ii)调节的t细胞群体选自temcd4⁺、temcd8⁺、tcmcd4⁺cd45ra^-ccr7⁺、tcmcd8⁺ccr7⁺、tcmcd45ro⁺ccr7⁺、temcd45ro⁺ccr7^-、tcmcd4⁺、tcmcd8⁺、幼稚cd4⁺ccr7⁺、幼稚cd8⁺ccr7⁺、幼稚cd4⁺cd45ra⁺ccr7⁺、temccr7⁺cd4⁺、temccr7⁺cd8⁺、temcd45ro⁺cd62l^-、temcd8⁺ccr7⁺，cd4⁺hla^-dr⁺和cd8⁺hla^-dr⁺细胞。根据一个实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含减少的temcd4⁺细胞亚群和temcd8⁺细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含增加的tcmcd4⁺cd45ra^-ccr7⁺细胞亚群和增加的tcmcd8⁺ccr7⁺细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含增加的tcmcd45ro⁺ccr7⁺细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含减少的temcd45ro⁺ccr7^-细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含增加的tcmcd4⁺细胞亚群和tcmcd8⁺细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，驯化的单核细胞产物包含增加的幼稚cd4⁺ccr7⁺t细胞亚群和幼稚cd8⁺ccr7⁺t细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含增加的幼稚cd4⁺cd45ra⁺ccr7⁺t细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含减少的temcd4⁺细胞亚群和temcd8⁺细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含增加的temccr7⁺cd4⁺细胞亚群和temccr7⁺cd8⁺细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含减少的cd4⁺hla^-dr⁺t细胞亚群和cd8⁺hla^-dr⁺t细胞亚群。根据另一实施方案，与未处理的对照相比，所述驯化的单核细胞产物包含增加的temcd45ro⁺cd62l^-细胞亚群。根据另一实施方案，以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病是1型糖尿病，并且主体的t细胞区室中调节的自身反应性包括β细胞功能的改善。根据另一实施方案，β细胞功能的改善包括血清c-肽水平的增加。根据另一实施方案，所述组合物进一步包含选自以下的治疗剂：胰岛素、胰岛素类似物、双胍、噻唑烷二酮、促分泌素、磺酰脲、非磺酰脲促分泌素、格列奈、二甲双胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂、美格列奈、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽1(glp-1)模拟物、胰高血糖素样肽1(glp-1)激动剂、糊精类似物、二肽基肽酶-4抑制剂、肠促胰岛素模拟物、胃抑制肽类似物、糊精类似物、糖尿、非那雄胺、度他雄胺、米诺地尔、酮康唑、螺旋内酯固醇、氟他胺、环孢菌素、氯倍他索、抗cd3抗体、胰岛素受体的小分子激活剂、醋酸氟轻松或其组合。

附图简述

图1是根据所述发明的一个实施方案治疗自身免疫病症的方法的示意图。

图2是用于根据本发明的系统的生物反应器装置的示意图。

图3a-d显示了用连续闭环装置治疗后代谢控制的改善，在所述连续闭环装置中循环患者的血液，从全血分离单核细胞并与贴壁cb-sc的群体接触下短暂地共培养，并且随后，将驯化的自体细胞返回患者的循环。图3a显示了t2d主体中12周随访的hba1c水平。图3b显示在治疗后4周通过homa-irc-肽的胰岛素敏感性分析。图3c描绘了在具有受损的胰岛β细胞功能的c组t2d主体中，56周随访的c肽水平。图3d显示了在治疗后12周随访时，通过homa-bc-肽的胰岛β细胞功能分析。

图4a-d显示了用连续闭环装置治疗的抗炎作用。图4a显示在基线和治疗后4周t2d患者中血浆tgf-β1水平的上调。图4b显示细胞内细胞因子的流式分析，证明在治疗后4周对关键白细胞介素的不同作用。图4c显示了在基线和治疗后4周的t2d患者中cd86⁺cd14⁺单核细胞的下调百分比。图4d描绘了cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg的流式分析，证明在处理后4周tregs的百分比没有变化。

图5a-f显示了cb-sc对单核细胞的免疫调节的体外研究。图5a通过相差显微镜显示cb-sc与单核细胞(左下图)18小时的共培养。cb-sc与淋巴细胞的共培养(右上图)作为对照。与单核细胞共培养后，受损的cb-sc恢复扩增，并在7-10天后变为90-100％汇合(右下)。原始放大倍率，x100。图5b显示来自cb-sc与单核细胞共培养18小时的漂浮细胞的凋亡分析。图5c显示四种cb-sc制剂中细胞凋亡蛋白抑制剂(ciap)1而非ciap2的表达，如通过western印迹测定的。图5d：western印迹显示四种cb-sc制剂中肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)而非tnf-ri的表达。图5e：tnf-α以剂量-响应方式抑制cb-sc的增殖。使用cyquantr细胞增殖测定试剂盒(millipore,or)评估细胞增殖。图5f显示用inos抑制剂1400w的阻断实验证明，cb-sc衍生的一氧化氮(no)促成cb-sc对单核细胞的免疫调节。首先，用脂多糖(lps，10μg/ml)刺激单核细胞8小时，且然后在存在或不存在1400w(100nm)的情况下以cb-sc：单核细胞为1：5的比例，与cb-sc共培养48小时，然后通过使用humanth17forautoimmunity&inflammationpcrarraykit(sabiosciences,valencia,ca)进行实时pcr分析。

图6说明了使用不连续干细胞驯化(sce)系统治疗的治疗方案以及1/2期临床试验中高加索人t1d主体中的随访研究。

图7a-g显示在1/2期临床试验中使用连续sce系统治疗后，高加索人t1d患者中的免疫标志物的变化。所有主体均接受使用不连续sce系统的两次治疗。在时间0，患者接受第一次治疗；所有主体在三个月后接受第二次治疗。在治疗后2、8、12、26、40和56周安排随访，进行临床评估和实验室测试。在基线和治疗后的不同时间点，在t1d患者中，通过ficoll-hypaque(γ=1.077)从外周血中分离患者淋巴细胞用于流式细胞术分析。同种型匹配的igg用作对照。图7a显示外周血中的免疫细胞定量。图7b显示外周血中cd4⁺和cd8⁺t细胞的百分比。图7c显示在外周血中幼稚cd4⁺和cd8⁺t细胞的流式分析，证实在治疗后26周时幼稚cd4⁺t细胞的百分比增加。图7d显示了外周血中cd4⁺tcm和cd8⁺tcm细胞的流式分析，证实在治疗后18周时cd4⁺tcm细胞的百分比增加。图7e显示外周血中cd4⁺tem和cd8⁺tem细胞的流式分析，证实分别在治疗后18周和26周时cd4⁺tem和cd8⁺tem细胞的百分比下降。图7f显示外周血中cd4⁺hla-dr⁺的流式分析，证实在治疗后26周时其百分比下降。图7g显示外周血中cd8⁺hla^-dr⁺t细胞的流式分析，证实在治疗后26周时其百分比下降。对于所有统计分析(图7a-g)，配对student氏t检验(图7a-g)，数据显示为平均值±sd。

图8a-e显示在1/2期临床试验中sce治疗后，高加索人t1d患者中t细胞上ccr7表达的上调。所有主体均接受使用sce装置疗法的两次治疗：第一次治疗在t=0，且第二次治疗在三个月后。在治疗后2、8、12、18、26、40和56周安排随访，进行临床评估和实验室测试。在基线和sce装置疗法后的不同时间点，在t1d患者中，通过ficoll-hypaque(γ=1.077)从外周血中分离患者淋巴细胞用于流式细胞术分析。同种型匹配的igg用作对照。通过kaluza流式细胞术分析软件分析ccr7表达水平并以任意单位(a.u.)呈现。图8a显示幼稚cd4⁺t细胞上ccr7表达的上调。图8b显示幼稚cd8⁺t细胞上ccr7表达的上调。图8c展示cd4⁺tcm细胞上ccr7表达的上调。图8d显示cd8⁺tcm细胞上ccr7表达的上调。图8e显示cd4⁺和cd8⁺tem细胞上ccr7表达的调节。对于所有统计分析(图8a-e)，配对student氏t检验(图8a-e)，数据显示为平均值±sd。

图9a-c显示通过离体研究证实t细胞上ccr7表达的上调。图9a显示相差显微照片，其显示在不存在cb-sc的情况下(左图)，混合白细胞反应(mlr)中形成具有不同大小的细胞簇，但细胞簇在存在cb-sc的情况下(右图)消失。(b和c)收集来自混合白细胞反应的细胞，在共培养5天后用于流式分析。在存在cb-sc的情况下，将响应细胞(r)与同种异体刺激细胞(s)共培养。r:s的比例为1:2；cb-sc:r的比例为1:10。图9b显示门控cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞上ccr7表达的流式细胞术。未处理的cd4⁺淋巴细胞显示两个群体：一个是ccr7表达阳性；另一个是ccr7表达阴性(或非常暗淡)(左上图)。用cb-sc处理后，两个群体的平均荧光强度增加(左下图)。图9c通过流式细胞术证实，门控cd4⁺t细胞中的幼稚cd4⁺t细胞、cd45ro⁺ccr7⁺tcm和cd45ro⁺ccr7^-tem上的ccr7表达。数据显示在存在cb-sc的情况下，幼稚cd4⁺t细胞和cd4⁺tcm的百分比增加。用cb-sc处理后cd4⁺tem的百分比降低。

图10a-f显示在1/2期临床试验中sce治疗对高加索人t1d主体中β细胞功能的影响。所有主体均接受使用sce装置疗法的两次治疗(图10a-f)。t1d主体分别在开始和第3个月接受使用sce装置疗法的两次治疗。根据方案，在不同时间点检查空腹(蓝色)和胰高血糖素刺激的c肽水平(棕色)。对于胰高血糖素刺激的c肽产生，在30秒内施用胰高血糖素(1mg,i.v.)，并且在6分钟后收集血浆样品用于通过超灵敏c肽elisa试剂盒的c肽测试。这些数据来自具有一些残留胰岛β细胞功能的六名t1d主体(a组)(图10a-f)。通过治疗后56周的最终随访，主体1-4中保留了恢复的空腹和胰高血糖素刺激的c肽水平(图10a-d)。图10e-f显示主体5和6，其在诊断t1d后超过10年展示一些残留胰岛β细胞功能。在接受sce疗法后，主体5中的空腹c肽水平开始下降，但随后在40周时增加；主体6中的空腹c肽水平开始在26周时下降至0.09ng/ml，但在40周时提高至0.21ng/ml。其胰高血糖素刺激的c肽显示出与空腹c肽水平相似的趋势。

图11显示sce治疗的治疗方案和前瞻性、单臂、开放标签、单中心探索性研究的随访。在无菌条件下，通过单采术(apheresis)从各主体获得单核细胞，运送至处理设施，在处理设施中的sce装置中处理过夜，并且然后运送回临床设施以再输注至主体。

图12a-c显示制备和使用不连续sce装置的步骤的示意图。图12a显示用于sce装置的cgmp产生的步骤。图12b显示通过在cgmp处理设施中与脐带血干细胞(cb-sc)过夜共培养，来离体处理主体的单核细胞(mnc)的步骤。图12c显示所述方法的概述。

发明详述

术语“α细胞”或“α-细胞”在本文中可互换使用，是指当血糖水平下降过低时，产生和释放激素胰高血糖素的胰腺中的一类细胞。胰高血糖素刺激肝脏将葡萄糖释放到血液中以获取能量。

术语“a1c、糖化血红蛋白、糖基化血红蛋白、血红蛋白a1c、hga1c和hba1c”在本文中可互换使用，用于描述测量用糖包被(糖化)的血红蛋白的百分比的诊断测试，其反映了过去2到3个月的平均血糖。a1c水平越高，血糖控制越差，且糖尿病并发症的风险越高。在a1c≥6.5％诊断为糖尿病。

如本文所用，术语“施用”是指给予或应用。如本文所用的术语“施用”包括体内施用，以及离体直接施用于组织。

术语“成体”或“成年人”是指成熟的生物体或成熟的细胞，例如成熟的人或成熟的人细胞，而与年龄无关。

如本文所用，术语“同种异体”是指遗传上不同，但属于相同物种或从相同物种获得。

如本文所用，术语“改善”是指使某物变得更好或变得更好，或改善疾病状况。疾病状况可以是炎性病症，例如但不限于i型糖尿病或ii型糖尿病。

如本文所用，“类似物”是指在结构上与另一化合物相似但在组成上略有不同的化学化合物(如用不同元素的原子替代一个原子，或存在特定的官能团)，但可以从或可以不从母体化合物中衍生出来。“衍生物”与“类似物”的不同之处在于母体化合物可以是产生“衍生物”的起始材料，而母体化合物可能不一定用作产生“类似物”的起始材料。

如本文所用，术语“无反应性”是指身体防御机制对外来物质缺少反应，并且由外周淋巴细胞耐受的直接诱导组成。

如本文所用，术语“单采术(apheresis)”是指一种医疗技术，其中使供体或患者的血液经过分离出一种特定成分并将其余部分返回供体或患者血液循环的设备。

如本文所用，术语“应用”是指设置接触或铺设或展开。

如本文所用，术语“曲线下面积(auc)”是指药物的血浆浓度针对药物施用后时间绘制的曲线下的面积。该区域由梯形法则确定：数据点通过直线段连接，从横坐标到每个数据点建立垂线，并计算如此构造的三角形和梯形的面积之和。通常，所述面积的计算始于施用药物施用的时间，并在血浆浓度可忽略不计时结束。在实践中，在某些离散时间点测量药物浓度，并使用梯形法则估计auc。auc用于估计药物的生物利用度和估计药物的总清除率。

术语“自分泌信号传导”是指一类细胞信号传导，其中细胞分泌作用于其自身或相同类型的其他相邻细胞的信号分子。

术语“自身免疫病症”和“自身免疫疾病”可互换使用，是指当免疫系统错误地攻击并破坏健康身体组织的自身组分时发生的病况。自身免疫病症可以影响一种或多种器官或组织类型。通常受自身免疫病症影响的器官和组织包括：血管、结缔组织、内分泌腺体如甲状腺或胰腺、关节、肌肉、红细胞和皮肤。

如本文所用，术语“β细胞”或“β-细胞”是指产生胰岛素的胰腺细胞。

如本文所用，术语“血糖水平”是指给定量的血液中的葡萄糖的量。其记录为一分升中的毫克，或mg/dl。

如本文所用，术语“血糖监测”是指定期检查血糖水平以管理糖尿病。

如本文所用，术语细胞“培养物”是指在限定边界的空间内提供细胞，并且生长条件通常与细胞生长相容或用于维持其存活力。同样，用作动词的术语“培养”是指提供适合细胞生长或维持其存活力的空间和生长条件的过程。

如本文所用，术语“cd3”(tcr复合物)是指由四条不同的链构成的蛋白质复合物。在哺乳动物中，该复合物含有cd3γ链、cd3δ链和两条cd3ε链，其与t细胞受体(tcr)和ζ链结合以在t淋巴细胞中产生激活信号。tcr、ζ-链和cd3分子一起构成tcr复合物。cd3分子的细胞内尾部含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的保守基序，其对于tcr的信号传导能力是必需的。在itam磷酸化后，cd3链可以结合参与t细胞的信号级联的激酶zap70(ζ相关蛋白)。

如本文所用，术语“cd4”是指在免疫细胞(例如t辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)的表面上发现的糖蛋白。cd4是协助t细胞受体(tcr)与抗原呈递细胞通信的辅助受体。cd4直接与抗原呈递细胞表面上的主要组织相容性复合物(mhc)ii分子相互作用[dalgleisha.g.等人，“thecd4(t4)antigenisanessentialcomponentofthereceptorfortheaidsretrovirus”,nature,vol.312:763–768,(1984)]。

如本文所用，术语“cd8”是指充当用于t细胞受体(tcr)的辅助受体的跨膜糖蛋白。与tcr类似，cd8与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合，但对i类mhc蛋白具有特异性[leahyd.j.等人，“crystalstructureofasolubleformofthehumantcellcoreceptorcd8at2.6aresolution”,cell,vol.68(6):1145–62,(1992)]。

如本文所用，术语“cd13”是指在骨髓细胞上发现的ii型跨膜蛋白，其充当锌结合金属蛋白酶，催化从某些类型的急性非淋巴细胞白血病中表达的肽中去除nh2-末端氨基酸[xuw.等人，“progressinthedevelopmentofaminopeptidasen(apn/cd13)inhibitors”,currmedchemanticanceragents.,vol.5(3):281-301,(2005)]。

如本文所用，术语“cd20”是指b淋巴细胞抗原cd20并且是激活的-糖基化的磷蛋白，其从pro-b期开始(cd45r⁺)在所有b细胞的表面上表达，并浓度逐渐增加直至成熟[teddert.f.等人，“isolationandstructureofacdnaencodingtheb1(cd20)cell-surfaceantigenofhumanblymphocytes”,procnatlacadsciusa,vol.85(1):208–212,(1998)]。

如本文所用，术语“cd25”是指存在于激活的t细胞、激活的b细胞、一些胸腺细胞、骨髓前体和少突胶质细胞上的i型跨膜蛋白，其与cd122结合以形成可充当il-2的高亲和力受体的异二聚体[triplett,t.a.等人，europeanjournalofimmunology,vol.42(7):1893-1898,(2012)]。

如本文所用，术语“cd34”是指造血祖细胞抗原cd34，也称为cd34抗原，其是人体中作为细胞-细胞粘附因子起作用的蛋白质。它也可能介导干细胞与骨髓细胞外基质的附着或与基质细胞的直接附着[simmonsd.l.等人，”molecularcloningofacdnaencodingcd34,asialomucinofhumanhematopoieticstemcells”,j.immunol,,vol.148(1):267–271,(1992)]。

如本文所用，术语“cd38”是指存在于巨噬细胞、树突细胞和激活的b和nk细胞上的蛋白质标记物，其可介导淋巴细胞和内皮细胞之间的粘附[orcianim.等人，“cd38isconstitutivelyexpressedinthenucleusofhumanhematopoieticcells”,j.cell.biochem.,vol.105(3):905–912,(2008)]。

如本文所用，术语“cd45”是指白细胞共同抗原，是存在于除红细胞外的所有造血细胞上的协助细胞激活的i型跨膜蛋白；其表达于淋巴瘤、b细胞慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病和急性非淋巴细胞白血病。它是指位于除红细胞和血小板外的所有造血细胞中的蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)[kaplanr.等人，“cloningofthreehumantyrosinephosphatasesrevealsamultigenefamilyofreceptor-linkedprotein-tyrosine-phosphatasesexpressedinbrain”,proc.natl.acad.sci.u.s.a,vol.87(18):7000–7004,(1990)]。

如本文所用，术语“cd59”是指糖基磷脂酰肌醇(gpi)-连接的膜糖蛋白，其保护人细胞免受补体介导的裂解[huangy.等人，“definingcd59-c9bindinginteraction”,j.biol.chem.,vol.281(37):27398–27404,(2006)]。

如本文所用，术语“cd62l(l-选择蛋白)”是指通常在幼稚t细胞的表面上发现的细胞标记物[kohnl.a.等人，“lymphoidpriminginhumanbonemarrowbeginsbeforeexpressionofcd10withupregulationofl-selectin”,nat.immunol.,vol.13(10):963–971,(2012)]。

如本文所用，术语“cd69(分化簇69)”是指由cd69基因编码的人跨膜c型凝集素蛋白。t淋巴细胞和自然杀伤(nk)细胞在体内和体外的激活都诱导cd69的表达[cambiaggic.等人，“constitutiveexpressionofcd69ininterspeciest-cellhybridsandlocusassignmenttohumanchromosome12”,immunogenetics,vol.36(2):117–120,(1992)]。

如本文所用，术语“cd80”是指在激活的b细胞和单核细胞上发现的蛋白质，其提供t细胞激活和存活所必需的共刺激信号[zuccarino-cataniag.v.等人，“cd80andpd-l2definefunctionallydistinctmemorybcellsubsetsthatareindependentofantibodyisotype”,natimmunol.,vol.15(7):631-637,(2012)]。

如本文所用，术语“cd86”是指在抗原呈递细胞上表达的蛋白质，其提供t细胞激活和存活所必需的共刺激信号[jellisc.l.等人，“genomicorganizationofthegenecodingforthecostimulatoryhumanb-lymphocyteantigenb7-2(cd86)”,immunogenetics,vol.42:85-89,(1995)]。

如本文所用，术语“cd90”(分化簇90)是指25-35kda重度n-糖基化的、糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的保守细胞表面蛋白，其具有单个v样免疫球蛋白结构域，最初作为胸腺细胞抗原被发现[wetzela.等人，“humanthy-1(cd90)onactivatedendothelialcellsisacounterreceptorfortheleukocyteintegrinmac-1(cd11b/cd18)”,j.immunol.,172:3850-3857,(2004)]。

如本文所用，术语“cd100”是指信号素(semaphorin)家族的蛋白质。信号素是一类分泌的和膜蛋白，其充当轴突生长锥指导分子。它们主要充当短程抑制信号并通过多聚受体复合物发出信号[elhabazia..,“structureandfunctionoftheimmunesemaphorincd100/sema4d”,critrevimmunol.,vol.23(1-2):65-81,(2003)]。

如本文所用，术语“cd223”是指对t细胞功能具有不同生物学作用的细胞表面分子，其中一种是免疫检查点受体[castellic.,“lymphocyteactivationgene-3(lag-3,cd223)inplasmacytoiddendriticcells(pdcs):amoleculartargetfortherestorationofactiveantitumorimmunity”,oncoimmunology,vol.3(11):1-4,(2014)]。

如本文所用，术语“趋化因子”是指一类趋化细胞因子，其向白细胞发出在特定方向上移动的信号。趋化因子是由细胞分泌的小细胞因子或信号传导蛋白质的家族。它们的名字源于它们在附近的响应细胞中诱导定向趋化性的能力，并且因此，它们是趋化细胞因子。

如本文所用，术语“趋化因子受体7”是指在例如t细胞表面上发现的细胞因子受体，其与称为趋化因子的一类细胞因子相互作用。在哺乳动物中存在20种得到描述的不同趋化因子受体。每种具有7-跨膜(7tm)结构并与g蛋白偶联以在细胞内进行信号转导，使其成为g蛋白偶联受体的大蛋白家族的成员[griffithj.w.,“chemokinesandchemokinereceptors:positioningcellsforhostdefenceandimmunity”,annualreviewofimmunology,vol.32:659-702,(2014)]。

如本文所用，术语“趋化的”是指细胞沿着化学浓度梯度朝向或远离化学刺激的运动或取向。

如本文所用，术语“趋化性”是指运动细胞或部分朝向其认为有吸引力的环境条件和/或远离其发现排斥的环境的定向运动。

如本文所用，术语“集落刺激因子”是指负责控制白细胞产生的细胞因子。类型包括粒细胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。

如本文所用，术语“相容的”是指组合物的组分能够以这样的方式彼此组合，使得在正常使用条件下不存在会显著降低组合物功效的相互作用。

如本文所用，术语“组分”是指组成部分、元件或成分。

如本文使用，术语“病况”指的是各种健康状态，并且意为包括由任何潜在机制、病症、或损伤引起的病症或疾病。

如本文使用，术语“后果”是指先前发生的事物的效果、结果或结局。

如本文使用，术语“接触”及其所有语法形式是指触碰，或处于直接或局部接近的状态或情况。

如本文所用，术语“连接肽”或“c-肽”是指在胰岛素原分子中将胰岛素的a链连接到其b链的短的31-氨基酸的多肽。它被用作如糖尿病的自身免疫疾病的标志物。增加的水平是胰岛素释放的指示，因为它们以等摩尔量释放并且对患者而言是较好的结局。非常低的c肽证实了1型糖尿病和胰岛素依赖性，并且与高葡萄糖变异性、缺乏葡萄糖稳态和增加的并发症以及不良结局相关。通过评估适当的β细胞功能，在临床上验证c肽水平的测量[wahrenj.等人，“theclinicalpotentialofc-peptideinreplacementintype1diabetes”,diabetes,vol.61(4),761-772,(2012)]。

术语“脐带血衍生的干细胞(cb-sc)”和“脐带血单核细胞”可与术语“脐带血单核干细胞”互换使用。

如本文所用，术语“培养基”通常是指用于培养活细胞的任何制剂。“细胞培养物”是指体外培养的细胞。

如本文所用，术语“细胞因子”是指细胞分泌的小的可溶性蛋白质物质，其对其他细胞具有多种作用。细胞因子介导许多重要的生理学功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫反应。它们通过与位于细胞膜中的其细胞特异性受体结合而发挥作用，这允许在细胞中启动独特的信号转导级联，其最终将导致靶标细胞中的生化和表型变化。通常，细胞因子局部起作用。它们包括i型细胞因子，其涵盖许多白细胞介素，以及几种造血生长因子；ii型细胞因子，包括干扰素和白细胞介素-10；肿瘤坏死因子(“tnf”)相关分子，包括tnf和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，包括白细胞介素1(“il-1”)；和趋化因子，其为在各种免疫和炎症功能中起关键作用的分子家族。取决于细胞状态，相同的细胞因子可以对细胞具有不同的作用。细胞因子通常调节其他细胞因子的表达，并引发其他细胞因子的级联。细胞因子的非限制性实例包括例如il-1α、il-β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12/il-23p40、il-13、il-17、il-18、tgf-β、ifn-γ、gm-csf、gro-α、mcp-1和tnf-α。

如本文所用，术语“细胞计数”是指这样的过程，其中测量单个细胞的物理和/或化学特征，或通过扩展，测量大致相同大小或阶段的其他生物或非生物学颗粒的物理和/或化学特征。在流式细胞术中，当细胞或颗粒在流体流中通过测量装置(流式细胞仪)时进行测量。细胞分选器或流式分选器是流式细胞仪，其使用电和/或机械途径来转移和收集具有落入用户选择的值范围内的测量特征的细胞(或其他小颗粒)。

如本文所用，术语“分化”是指一个或多个细胞变为不同的和表型不同的细胞类型的过程。如本文所用，术语“分化诱导剂”是指作为细胞分化过程的直接或间接原因的化合物。尽管足以引起分化，但“分化诱导剂”对于分化不是必需的。

如本文所用，术语“疾病”或“病症”是指健康损害或功能异常的病况。

如本文所用，术语“染料”(也称为“荧光染料”或“荧光团”)是指使分子发荧光的分子组分。该组分是分子中的官能团，其吸收特定波长的能量并以不同(但同样特定的)波长重新发射能量。发射能量的量和波长取决于染料和染料的化学环境。许多染料是已知的，包括但不限于fitc、r-藻红蛋白(pe)、pe-德克萨斯红串联、pe-cy5串联、碘化丙锭(propidiumiodem)、egfp、eygp、ecf、dsred、别藻蓝蛋白(apc)、percp、sytox绿、香豆素、alexafluors(350、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700、750)、cy2、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、hoechst33342、dapi、hoechst33258、sytox蓝、色霉素a3、光神霉素、yoyo-1、sytox橙、溴化乙锭、7-aad、吖啶橙、toto-1、to-pro-1、噻唑橙、toto-3、to-pro-3、噻唑橙、碘化丙啶(pi)、lds751、indo-1、fluo-3、dcfh、dhr、snarf、y66f、y66h、ebfp、gfpuv、ecfp、gfp、amcyanl、y77w、s65a、s65c、s65l、s65t、zsgreenl、zsyellowl、dsred2、dsred单体、asred2、mrfp1、hcredl、单氯双胍、钙黄绿素、dylightfluors、花菁、羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、级联蓝、lucifer黄、nbd、pe-cy5缀合物、pe-cy7缀合物、apc-cy7缀合物、红613、荧光素、fluorx、bodidy-fl、tritc、x-罗丹明、丽丝胺罗丹明b、德克萨斯红、trured、gfp[prendergastf.g.等人，"chemicalandphysicalpropertiesofaequorinandthegreenfluorescentproteinisolatedfromaequoreaforskålea".biochemistry,vol.17(17):3448–53,(1978)]，及其衍生物。

如本文所用，术语“驯化的”是指在使两个细胞群体可以相互作用(意味着彼此具有相互作用或影响)条件下，共培养患者单核细胞和uc-sc的结果。

如本文所用，术语“富集”是指增加期望物质的比例，例如，与细胞群体中的其天然频率相比，增加细胞亚型的相对频率。

如本文所用，术语“流式细胞仪”是指用于查询细胞表型和特征的工具。它通过经过传感区域的激光(通过辐射的受激发射的光放大)/光束感测在液体流中移动时的细胞或颗粒。测量微观颗粒的相对光散射和以颜色区分的荧光。细胞的分析和区分是基于大小，粒度以及细胞是否携带抗体或染料形式的荧光分子。当细胞通过激光束时，光在所有方向上散射，并且以与轴成低角度(0.5-10°)向前方向散射的光与球体半径的平方成比例，并且因此与细胞或颗粒的大小成比例。光可能进入细胞；因此，90°光(直角，侧面)散射可以用荧光染料连接的抗体标记或用荧光的膜、细胞质或核染料染色。因此，可以有助于区分细胞类型，膜受体和抗原的存在，膜电位，ph，酶活性和dna含量。流式细胞术是多参数的，在每个细胞上记录几次测量；因此，可以鉴定在异质群体中的同质亚群[mariong.macey,flowcytometry:principlesandapplications,humanapress,2007]。

如本文所用，术语“foxp3(叉头盒p3；或scurfin)”是指参与免疫系统响应的蛋白质。作为fox蛋白家族的成员，foxp3在调节性t细胞的发育和功能中起转录因子调节蛋白的作用。调节性t细胞通常降低免疫反应，从而在控制自身反应性t细胞中发挥作用[kornetem.等人，“th1-likeicos+foxp3+tregcellspreferentiallyexpresscxcr3andhometoβ-isletsduringpre-diabetesinbdc2.5nodmice”,plosone.,vol.10(5):1-16,(2015)]。

如本文所用，术语“新鲜”是指在至少1小时内从患者收集或在4℃下储存的生物材料，但生物材料未冷冻和解冻。生物材料可以是以下但不限于从外周血、脐带血、血沉棕黄层、骨髓等分离的白细胞、单核细胞或干细胞。

如本文所用，术语“移植物”是指用于移植的任何组织或器官。它包括但不限于在同一个体中从一个身体部位转移到另一个身体部位的自身组织(“自体移植物”)，在遗传上相同的个体之间转移的组织或具有足够免疫学相容性以允许组织移植的组织(“同源移植物”)，在相同物种的遗传上不同的成员之间转移的组织(“同种异体的移植物”或“同种异体移植物”)，以及在不同物种之间转移的组织(“异种移植物”)。

如本文所用，术语“生长”是指细胞群和/或细胞大小的扩增。如本文所用，术语“生长因子”是指诱导或改变细胞生长速率或程度的物质。

如本文所用，术语“造血干细胞”是指从血液或从骨髓中分离的细胞，其可以自我更新，分化成各种特化细胞，所述特化细胞从骨髓移出到循环血液中，并且可以经历程序性细胞死亡(凋亡)。根据所述发明的一些实施方案，衍生自人主体的造血干细胞表达至少一种类型的细胞表面标志物，包括但不限于cds34、cd38、hla-dr、c-kit、cd59、sca-1、thy-1和/或cxcr-4或其组合。

如本文所用，术语“hla-dr”是指存在于几种细胞类型(包括抗原呈递细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞和激活的t细胞)上的人ii类组织相容性抗原。

如本文所用，术语“激素”是指在身体的一部分中产生并释放到血液中以触发或调节身体的特定功能的化学物质。

如本文所用，术语“免疫病症相关疾病”是指其中免疫系统的紊乱促成疾病发病的疾病。

如本文所用，术语“免疫耐受”或“免疫学耐受”是指免疫系统对通常具有引发免疫反应能力的物质无反应的状态。

如本文所用，术语“免疫调节细胞”是指能够通过表达趋化因子、细胞因子和免疫反应的其他介质来增强或减弱免疫反应的细胞。

如本文所用，术语“葡萄糖耐量受损(igt)”是指血糖水平高于正常但没有高到足以诊断糖尿病的病况。igt，也称为前驱糖尿病，是在口服葡萄糖耐量试验(ogtt)开始后2小时是140mg/dl至199mg/dl的水平。大多数患有前驱糖尿病的个体处于增加的发展2型糖尿病的风险中。

如本文所用，术语“炎性细胞因子”或“炎性介质”是指炎性过程的分子介质，其可以调节其作用为促炎或抗炎的。这些可溶性可扩散的分子在组织破损和感染的位点局部作用并且也在更远的位点起作用。一些炎性介质通过炎性过程激活，而其他炎性介质响应于急性炎症或通过其他可溶性炎性介质从细胞来源合成和/或释放。炎性响应的炎性介质的实例包括但不限于血浆蛋白酶、补体、激肽类、凝血和纤维蛋白溶解蛋白、脂质介质、前列腺素、白三烯、血小板激活因子(paf)、肽类和胺类，包括但不限于不限于组胺、血清素和神经肽，促炎细胞因子，包括但不限于白细胞介素-1-β(il-1β)、白细胞介素-4(il-4)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(il-8)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(if-γ)和白细胞介素-12(il-12)。

如本文所用，术语“输注”及其另外的语法形式是指为了治疗目的将除血液之外的流体引入主体(包括人)的血管中。

如本文所用，术语“输注溶液”是指含有磷酸盐缓冲盐水(pbs)的溶液，其补充有25usp单位/ml肝素和1％人血清白蛋白(hsa)并且是无血清的。

如本文所用，术语“炎症”是指对感染和损伤的生理反应，其中参与解毒和修复的细胞被炎症介质动员到受损部位。如本文所用，术语“急性炎症”是指通常具有突然发作的炎症，其特征在于以血管和渗出过程为主的经典体征。如本文所用，术语“慢性炎症”是指进展缓慢且主要特点是形成新结缔组织的的炎症。它可能是急性形式的延续或长期低级形式，并且通常导致永久组织损伤。

无论引发剂如何，伴随急性炎症的生理变化涵盖四个主要特征：(1)导致血流量净增加的血管舒张，其是对急性组织损伤的最早的物理响应之一；(2)响应炎性刺激，小静脉下衬的内皮细胞收缩，扩大细胞内连接处产生间隙，导致血管通透性增加，这使血浆蛋白和血细胞从血管中渗出；(3)炎症的特征通常在于白细胞在炎症部位的强烈浸润，特别是中性粒细胞(多形核细胞)。这些细胞通过在血管壁或未受损组织中释放有毒物质来促进组织损伤；和(4)由白细胞响应特定刺激释放的热原产生的发热。

在炎症过程期间，炎性响应的可溶性炎症介质以系统方式与细胞组分一起起作用，以试图包含和消除引起身体不适的因素。本文关于介质使用的术语“炎性”或“免疫-炎性”是指炎性过程的分子介质。这些可溶性可扩散的分子在组织破损和感染的位点局部起作用并且也在更远的位点起作用。一些炎性介质通过炎性过程激活，而其他炎性介质响应于急性炎症或通过其他可溶性炎性介质从细胞来源合成和/或释放。炎性响应的炎性介质的实例包括但不限于血浆蛋白酶、补体、激肽类、凝血和纤维蛋白溶解蛋白、脂质介质、前列腺素、白三烯、血小板激活因子(paf)、肽类和胺类，包括但不限于不限于组胺、血清素和神经肽，促炎细胞因子，包括但不限于白细胞介素-1、白细胞介素-4、白细胞介素-6、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素-γ和白细胞介素-12。

如本文所用，术语“抑制("inhibit")”及其各种语法形式(包括但不限于"inhibiting"或"inhibition")是指减少过程的量或速率，完全停止过程，或减少，限制或阻断其动作或功能。抑制可以包括使物质的量、速率、作用功能、或过程减小或降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%，或至少99%。

如本文使用的，术语“抑制剂”是指与第一分子结合从而降低第一分子的活性的第二分子。抑制剂通常通过其特异性和效价进行评估。

如本文所用，术语“胰岛素抗性”是指身体对给定量的胰岛素的正常反应降低的病况。结果，需要更高水平的胰岛素以使其具有其适当的效果。胰腺产生越来越多的胰岛素，直到它不再能够产生用于身体需求的足够的胰岛素。然后血糖上升。胰岛素抗性是2型糖尿病发展的风险因素。

如本文所用，术语“白细胞介素”是指白细胞分泌的细胞因子，其作为与其他白细胞通讯的途径。白介素调节细胞生长、分化和运动，并且刺激免疫反应，比如炎症。白细胞介素的实例包括但不限于白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(il-8)和白细胞介素-12(il-12)。

如本文所用，术语“分离的”是指一种材料，例如但不限于细胞或细胞群体，其基本上或实质上不含在其天然存在的环境中发现时通常伴随或与其相互作用的组分。

如本文所用，术语“白血球”或“白细胞(wbc)”指的是免疫细胞类型。大多数白血球在骨髓中制造并且发现于血液和淋巴组织。白血球帮助身体对抗感染和其他疾病。粒细胞、单核细胞和淋巴细胞是白血球。

如本文所用，术语“淋巴细胞”指的是小的白细胞(白血球)，其保护身体抵御疾病中起大作用。有两种主要类型的淋巴细胞：b细胞和t细胞。b细胞产生攻击细菌和毒素的抗体，而t细胞自身攻击体细胞。淋巴细胞分泌产物(淋巴因子)，其调节许多其他类型的细胞的功能活性并且通常存在于慢性炎症的位点。

如本文所用，术语“巨噬细胞”是指由骨髓中的单核细胞干细胞产生的单核活跃吞噬细胞。这些细胞广泛分布在体内，并且形态和运动性不同。吞噬活性通常由血清识别因子介导，包括某些免疫球蛋白和补体系统的组分，但也可以是非特异性的。巨噬细胞还参与抗体的产生和细胞介导的免疫反应，特别是向淋巴细胞呈递抗原。它们分泌多种免疫调节分子。

如本文所用，术语“主要组织相容性复合物(mhc)”是指编码细胞表面分子的一组基因，所有脊椎动物中，所述细胞表面分子通过测定组织相容性控制免疫系统的基本部分。mhc分子的主要功能是结合来自病原体的肽片段并将其展示在细胞表面上以供适当的t细胞识别。

如本文所用，术语“模拟物”是指含有模拟肽活性的化学部分的化合物。例如，如果肽含有两个具有功能活性的带电化学部分，则模拟物将两个带电化学部分置于空间取向和约束结构中，使得带电化学功能保持在三维空间中。模拟物本身可能是肽。模拟物也可以是非肽和/或可以包含通过非肽键连接的氨基酸，例如但不限于ψ键[benkirane,n.,等人，j.biol.chem.,vol.271:33218-33224,(1996)]，美国专利号5,637,677及其母案申请包含关于模拟物生产的详细指导。

如本文所用，术语“促有丝分裂化合物”是指能够在至少一组适于生长或培养的条件下影响至少一种细胞类型的细胞分裂速率的化合物。

如本文所用，术语“调节”意指调控，改变，适应或调整至某一量度或比例。

如本文所用，术语“多能的”是指可以发育成多于一种细胞类型但比多潜能细胞更受限制的细胞。成体干细胞和脐带血干细胞被认为是多能的。

如本文所用，术语“阴性选择”是指除了保留感兴趣的细胞类型之外，所有细胞类型的消除或去除。

如本文所用，术语“口服葡萄糖耐量试验(ogtt)”是指在空腹过夜后由健康护理专业人员给予的诊断前驱糖尿病和糖尿病的测试。取血样，然后患者饮用高葡萄糖饮料。以2至3小时的间隔采集血样。将测试结果与标准进行比较，并显示身体如何随时间使用葡萄糖。当两小时血糖大于或等于200mg/dl时诊断为糖尿病。

如本文所用，术语“旁分泌信号传导”是指经由作用于相邻细胞的分泌信号分子的短程细胞-细胞通信。

如本文所用，术语“前驱糖尿病”是指血糖水平高于正常但没有高到足以诊断糖尿病的病况。患有前驱糖尿病的人处于增加的发展2型糖尿病和发展心脏病和中风的风险中。指示前驱糖尿病的结果包括：5.7％-6.4％的a1c。100mg/dl-125mg/dl的空腹血糖，和140mg/dl-199mg/dl的口服葡萄糖耐量试验(ogtt)2小时血糖。

术语“多潜能的”是指可以产生构成身体的所有细胞类型的细胞。例如，胚胎干细胞被认为是多潜能的。诱导的多潜能干细胞(ipsc)是通过被迫表达对维持胚胎干细胞的定义性质重要的基因和因子，而被遗传重编程为胚胎干细胞样状态的成体细胞。多潜能标志物包括但不限于oct-4、nanog和sox-2。

如本文所用，术语“阳性选择”是指分离靶细胞群体。

如本文所用，术语“祖细胞”是指干细胞的早期后代，其只能分化，但不再能自身成熟。祖细胞成熟为前体细胞，前体细胞成熟至成熟表型。祖细胞被称为集落形成单位(cfu)或集落形成细胞(cfc)。祖细胞的特定谱系由后缀表示，例如但不限于cfu-e(红细胞)，cfu-f(成纤维细胞)，cfu-gm(粒细胞/巨噬细胞)和cfu-gemm(多潜能造血祖细胞)。

如本文所用，术语“增殖”及其各种语法形式是指数量的增加。术语“增殖”和“扩展”在本文中可互换使用。

术语“繁殖("propagate"或"propagation")”是指导致复制，以增加数目或数量。

如本文所用，术语“纯化”是指除去外源或外来要素。

如本文所用，术语“减少("reduce"或"toreduce")”是指程度、强度、范围、大小、量、密度或数量的减小、下降、减弱或消除。

如本文所用，术语“调节性t细胞(treg)”，以前称为抑制性t细胞，是指调节免疫系统以维持对自身抗原的耐受并消除自身免疫疾病的t细胞亚群。

如本文用作名词的术语“修复”是指恢复功能的任何纠正、强化、重建、补救、补偿、发声、更新、修理、修补等。当用作动词时，它意味着纠正、加强、重建、补救、补偿、发声、更新、修理、修补或以其他方式恢复功能。

如本文所用，术语“干细胞”是指具有高增殖潜力和自我更新的能力且可以产生子细胞的未分化细胞，所述子细胞可以经历终末分化成多于一种不同细胞表型。

术语“主体”或“个体”或“患者”可互换使用来指哺乳动物来源的动物物种的成员，包括但不限于人，非人灵长类动物；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养的哺乳动物，如狗和猫；实验动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠和豚鼠等。

如本文所用，术语“需要这种治疗的主体”是指患者，其(i)将患有具有自身免疫组分的病症，(ii)正患有具有自身免疫组分的病症；或(iii)已患有具有自身免疫组分的病症。根据一些实施方案，该短语还用于指患者，其(i)将接受所述的干细胞驯化器(sce)治疗；(b)正在接受所述的sce治疗；或(c)已接受所述的sce治疗，除非该短语的上下文和用法另有说明。

如本文所用，术语“实质上("substantial"或"substantially")”，“基本上("essential"或"essentially")”表示由这些术语描述的特征以一定量存在或具有提供与本发明的实施相关的技术效果的影响。例如，组合物中“实质量”的物质是提供可归因于该物质的技术效果的量。同样地，如果组合物被指示为“实质上不”包含特定物质，则这意味着允许该组合物包含不显著量的该物质，只要这些量对组合物中的其他成分不具有任何技术影响，并且本身并没“有影响”，或换句话说，“实质上没有”和“基本上没有”意味着例如可存在痕量或效果，只要它们不具有整体技术影响。如本文所用，术语“基本上不含”或“实质上不含”是指大幅或显著地不含污染物质、杂质或材料，例如污染物质、杂质或材料的存在量小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％，如通过分析方案测定的。

如本文所用，术语“实质上同质的”当应用于细胞时，是指细胞群体，其中群体中至少约70％的细胞具有相同的细胞类型，如通过对一种或多种分化标记物的测定所确定的。

如本文所用，术语“抑制”是指阻止，掩盖或消除生物学事件。

术语“表面抗原”是指通常定位于细胞外表面的物质，例如通过与细胞膜结合。细胞“标记物”是与细胞充分结合，由此成为该细胞或细胞类型的特征的可检测元件。例如，细胞表面标记物可以以最小的细胞活性破坏来检测，并且可以促进细胞类型的表征、其鉴定，并最终进行其分离。细胞分选技术基于细胞生物标志物，其中细胞表面标志物可用于从细胞群体中进行阳性选择或阴性选择，即包含或排除。

如本文所用，术语“t细胞区室”是指嵌入分泌的细胞外大分子的复杂网络中的t淋巴细胞的合作组件，其中区室的细胞可以迁移并彼此相互作用。t细胞区室的示例性成员包括幼稚t细胞群体、经历抗原的t细胞群体、调节性t细胞群体(tregs)、辅助t细胞群体、细胞毒性t细胞群体、记忆t细胞群体(tcm)、效应t细胞群体(tem)。

术语“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量("amounteffective"或"effectiveamount")”或“药学有效量”可互换使用，是指足以提供预期治疗益处的量。然而，暴露水平基于各种因素，包括损伤的类型、患者的年龄、重量、性别、医疗病症、病症的严重性、施用的途径、和采用的具体活性剂。因此，剂量方案可以广泛地变化，但是可以由医师常规地使用标准方法确定。此外，术语“治疗有效量”和“药学有效量”包括预防或防止量。在所述发明的预防性或防止性应用中，sce装置和治疗用于治疗易患或以其他方式处于疾病、病症或病况的风险中的患者，其量足以消除或降低所述风险，减轻严重性，或延迟疾病、病症或病况的发作，包括疾病、病症或病况的生化，组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病、病症或病况发展过程中出现的中间病理表型。

如本文所用，术语“治疗组分”是指在一定百分比的群体中消除，减少或预防特定疾病表现的进展的治疗有效剂量(即，施用的剂量和频率)。通常使用的治疗组分的实例是ed50，其描述了在50％的群体中对特定疾病表现具有治疗有效性的特定用量中的剂量。

如本文所用，术语“治功效果”是指治疗的后果，其结果被认为是理想的和有益的。治功效果可以包括直接或间接地阻止，减少或消除疾病表现。治功效果还可以包括直接或间接地阻止，减少或消除疾病表现的进展。

术语“治疗窗”是指提供治疗功效而没有不可接受的毒性的浓度范围。在施用药物剂量后，其效果通常显示出特征性的时间模式。在药物浓度超过用于期望效果的最小有效浓度(“mec”)之前存在滞后期。在响应开始后，随着药物继续被吸收和分配，效果的强度增加。其达到峰值，之后药物消除导致效果强度下降，当药物浓度回落到mec以下时效果强度消失。因此，药物作用的持续时间由浓度超过mec的时间段确定。治疗目标是获得并保持治疗窗内的浓度，其用于期望响应并具有最小的毒性。低于mec的药物响应对于期望效果而言将是亚治疗性的，而对于不利效果，高于mec毒性的概率将增加。增加或减少药物剂量会使响应曲线向上或向下移动强度标度，并用于调节药物的作用。增加剂量也延长药物的作用持续时间，但有增加不良反应的可能性的风险。因此，除非药物是无毒的，否则增加剂量不是延长药物作用持续时间的有用策略。

相反，应给予另一药物剂量以维持治疗窗内的浓度。通常，药物治疗范围的下限似乎近似等于产生约一半最大可能治功效果的药物浓度，并且治疗范围的上限是使不超过约5％至约10％的患者会经历毒性作用。这些数字可以是高度可变的，并且一些患者可以从超过治疗范围的药物浓度中获益很大，而其他患者可能在低得多的值下受到显著毒性。治疗目标是维持在治疗窗口内的稳态药物水平。对于大多数药物，与该期望范围相关的实际浓度不是并且不需要是已知的，并且足以理解功效和毒性通常是浓度依赖性的，以及药物剂量和施用频率如何影响药物水平。对于其中导致功效和毒性的浓度之间存在小的(2至3倍)差异的少量药物，已经定义了与有效治疗相关的血浆浓度范围。

在这种情况下，目标水平策略是合理的，其中选择与功效和最小毒性相关的期望目标稳态药物浓度(通常在血浆中)，并计算预期达到该值的剂量。随后测量药物浓度，并且如果必要则调整剂量以更紧密地接近目标。

在大多数临床情况中，药物以一系列重复剂量或作为连续输注施用，以维持与治疗窗相关的稳态浓度的药物。为了维持所选择的稳态或目标浓度(“维持剂量”)，调节药物施用速率使得输入速率等于损失速率。如果临床医生选择所需的血浆中药物浓度并且知道该药物在特定患者中的清除率和生物利用度，则可以计算适当的剂量和给药间隔。

如本文所用，术语“全能细胞”是指具有产生体内任何和所有细胞类型以及胚胎外或胎盘细胞的潜力的细胞。受精后第一对细胞分裂内的胚胎细胞是全能细胞。

术语“治疗("treat"或"treating")”包括废除、实质上抑制、减慢或逆转疾病、病况或病症的进展，实质上减轻病况的临床或美容症状，实质上预防疾病、病况或病症的临床或美容症状的出现，并且保护免受有害或不适的症状。如本文所用，术语“治疗”进一步指完成以下一种或多种：(a)降低病症的严重性；(b)限制所治疗的病症的特征性症状的发展；(c)限制所治疗的病症的特征性症状的恶化；(d)限制病症在先前曾患有该病症的患者中复发；和(e)限制症状在先前有病症的该症状的患者中的复发。

如本文所用，术语“1型糖尿病”是指特征在于由于胰岛素完全缺乏导致的高血糖水平的病况，其中当身体的免疫系统攻击胰腺中产生胰岛素的β细胞并将其破坏时出现胰岛素完全缺乏。然后，胰腺产生很少或不产生胰岛素。1型糖尿病最常在年轻人中发展，但也可以在成年人中出现。

如本文所用，术语“2型糖尿病”是指特征在于由缺乏胰岛素或身体无法有效使用胰岛素引起的高血糖水平的病况。2型糖尿病最常在中年和老年人中发展，但也可以在年轻人中出现。

如本文所用，术语“脐带(uc)单核细胞(mnc)”，“(uc-mnc)”是指造血谱系的细胞，例如淋巴细胞，单核细胞，干细胞和祖细胞，以及源自脐带血(cb)的间充质基质细胞。

如本文所用，术语“未分化的”是指尚未发育出更特化的细胞特征的细胞。“分化”的细胞是具有更特化细胞特征的细胞。术语“未分化的”和“分化的”是相对于彼此的。分化的和未分化的细胞彼此区别之处在于，例如，形态学特征，例如相对大小和形状，核体积与细胞质体积的比例；和表达特征，例如可检测的已知分化标志物的存在。示例性分化标志物包括蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、功能特征和形态特征。

治疗以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的方法

根据一个方面，所述发明提供了治疗以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的方法，其包括：

(1)在无菌条件下，从患有以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的主体获得含有单核细胞的全血样品；

(2)将(1)的全血样品运送到处理设施；

(3)从全血样品中无菌纯化单核细胞(mnc)，形成单核细胞制剂；

(4)将单核细胞制剂引入生物反应器装置，所述生物反应器装置包含活的贴壁脐带血干细胞(uc-sc)的群体，其中所述贴壁uc-sc至少80％汇合；

(5)将所述单核细胞制剂与cb-sc共培养，使所述单核细胞制剂中的单核细胞和cb-sc可以在无菌条件下相互作用至少0.1小时、至少0.2小时、至少0.3小时、至少0.4小时、至少0.5小时、至少0.6小时、至少0.7小时、至少0.8小时、至少0.9小时、至少1.0小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少3.5小时、至少4小时、至少4.5小时、至少5小时、至少5.5小时、至少6小时、至少6.5小时、至少7小时、至少7.5小时、或至少8小时，以形成驯化的单核细胞产物；

(6)在无菌条件下从所述生物反应器装置中收获驯化的单核细胞产物；

(7)确认驯化的单核细胞产物的纯度、无菌性和存活力百分比，所述驯化的单核细胞产物具有至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸个单核细胞；

(8)将驯化的单核细胞产物运送到临床设施，用于血管内输注到主体中；和

(9)将治疗有效量的驯化的单核细胞产物血管内输注主体中；

(10)在主体生存期，根据需要在多个输注日期，依次重复步骤(1)至(9)，

其中治疗有效量的驯化的单核细胞产物有效调节主体的t细胞区室中的自身反应性，并减轻免疫疾病的症状。

根据一些实施方案，以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病选自1型糖尿病(t1d)或2型糖尿病(t2d)。根据一些实施方案，以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病是糖尿病。根据一些实施方案，以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病是1型糖尿病。根据一些实施方案，以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病是2型糖尿病。

根据一些实施方案，单核细胞群体包含免疫调节细胞的群体。根据一些实施方案，免疫调节细胞的群体包含白细胞的群体。根据一些实施方案，白细胞的群体包含淋巴细胞的群体，粒细胞的群体，嗜碱性粒细胞的群体，单核细胞的群体，或其组合。根据一些实施方案，免疫调节细胞的群体包含抗原捕获细胞的群体，抗原呈递细胞的群体，或两者。根据一些实施方案，抗原呈递细胞的群体表达cd80，cd86或两者。根据一些实施方案，抗原呈递细胞的群体包含巨噬细胞，树突细胞，或两者。根据一些实施方案，淋巴细胞的群体包含t淋巴细胞的群体，b淋巴细胞的群体，自然杀伤(nk)细胞的群体，或其组合。

根据一些实施方案，t淋巴细胞的群体包含t细胞的一个或多个群体。根据一些实施方案，t细胞的群体包含激活的t细胞。根据一些实施方案，激活的t细胞的群体选自幼稚t细胞、引发t细胞、激活的t细胞、效应t细胞、细胞毒性t细胞、t辅助细胞、记忆t细胞、nk细胞、和treg细胞。根据一些实施方案，t细胞的群体包含表达一种或多种炎性介质(淋巴因子)的t细胞。根据一些实施方案，炎性介质选自白细胞介素-1-β(il-1β)、il-2、白细胞介素-4(il-4)、il-5、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(ii-8)、il-10、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(ifn-γ)、白细胞介素-12(il-12)和淋巴毒素。根据一些实施方案，t淋巴细胞的群体包含表达一种或多种选自以下的标记物的t细胞：t细胞受体(tcr)/cd3、cd4、cd8、cd25、cd28、cd40配体(cd40l)、fox3、fas、mhci、mhcii、基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)、zap70(ζ相关蛋白)。

根据一些实施方案，b淋巴细胞的群体包含b细胞的一个或多个群体。根据一些实施方案，b细胞的群体包含激活的b细胞。根据一些实施方案，b细胞的群体选自幼稚b细胞，激活的b细胞，成浆细胞(plasmaplasts)和记忆b细胞。根据一些实施方案，b淋巴细胞的群体包含表达一种或多种选自ii类mhc，cd40，免疫球蛋白的标志物的b细胞。

从全血样品中纯化单核细胞的方法是众所周知的。根据一个实施方案，通过密度梯度离心(例如，使用ficollpaque分级分离)除去红细胞，以将血沉棕黄层与红细胞分离。术语“血沉棕黄层”是指含有大部分白细胞的血液样本的薄浅灰白色级分。

根据一些实施方案，从全血样品中纯化单核细胞是使用自动单采术分离器通过单采术进行。简言之，从患者体内取出全血，并且然后通过含有旋转室的设备。血液通过重力沿室壁分离成其组分(血浆、富含血小板的血浆、白细胞和红细胞)。分选出单核细胞，并将剩余的血液组分重新引回到患者的血流中。

根据一些实施方案，磁珠激活细胞分选是用于从外周血单核细胞纯化特定细胞群的阳性选择技术。因为在这样的方案之后所需细胞的数量和活性可能降低，所以一些人更喜欢更温和的底物粘附和阴性选择方案。

根据一些实施方案，生物反应器装置包括一个或多个表面，所述表面包含活的贴壁脐带血干细胞(uc-sc)的群体。制备包含uc-sc的生物反应器的方法通过依次包括以下步骤的方法：

(a)获得从健康供体获得的新鲜脐带血单位；

(b)通过密度梯度离心从脐带血分离单核细胞级分；

(c)去除红细胞；

(d)用生理缓冲盐水洗涤uc-单核细胞；

(e)将所述uc单核细胞以至少为1×10⁶个细胞的接种密度，接种在生物反应器中的无血清培养中；

(f)在无血清培养基中培养所述uc单核细胞，每2-3天更换一半/培养基以除去非贴壁细胞，并且持续至少10天生长到至少80％汇合；和

(g)确认cb-sc培养物的样品的无菌性和存活力。

cb-sc的培养物是圆形的并且附着在生物反应器装置的底部表面。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面是未涂覆的塑料。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面是带正电的表面。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面是疏水表面，例如聚苯乙烯或玻璃。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面被涂覆。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面不包含细胞饲养层。

根据一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少80％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少85％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少90％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少95％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少96％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少97％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少99％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少99％汇合。

将来自患者的单核细胞制剂引入生物反应器中以将患者的单核细胞和uc-sc细胞共培养。根据一些实施方案，单核制剂与uc-cb层分离。根据一些实施方案，患者的单核细胞是非贴壁的。根据一些实施方案，患者的单核细胞接触uc-cb层中的细胞。根据一些实施方案，培养基包含生长因子，可溶性炎症介质等。根据一些实施方案，培养基有效支持患者的单核细胞和uc-cb细胞层二者。根据一些实施方案，培养基包含由患者的单核细胞和uc-cb细胞产生的免疫调节介质和可溶性因子。

根据一些实施方案，相互作用条件包括生物反应器的轻微摇动。根据一些实施方案，生物反应器的轻微摇动是间歇性的。根据一些实施方案，培养基循环通过生物反应器。

患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少2小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少3小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少4小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少5小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少6小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少7小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少8小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少9小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少10小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少11小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少12小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少13小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少14小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少15小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少16小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少17小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少18小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少19小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少20小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少21小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少22小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少23小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少24小时。

根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:2的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:5的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:10的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:20的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:50的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:60的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:70的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:80的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:90的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:100的比例共培养。

这种相互作用的结果是驯化的单核细胞产物。

在无菌条件下从生物反应器装置收获驯化的单核细胞产物。

用于确认驯化的单核细胞产物的纯度，无菌性和存活力；百分比存活力的测定包括以下。

根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物的内毒素水平小于约0.5内毒素单位/ml，并且驯化的单核细胞产物是革兰氏染色阴性的。还对驯化的单核细胞产物进行支原体和无菌性测试，例如，通过实时pcr并符合usfda良好实验室规范的要求。

“可检测响应”是指可以在测定中检测的任何信号或响应，其可以在有或没有检测试剂的情况下进行。可检测响应包括但不限于放射性衰变和能量(例如，荧光、紫外、红外、可见)发射、吸收、偏振、荧光、磷光、透射、反射或共振转移。可检测响应还包括色谱迁移率、浊度、电泳迁移率、质谱、紫外谱、红外谱、核磁共振光谱和x射线衍射。或者，可检测响应可以是测量生物材料的一种或多种性质的测定的结果，例如解链温度点、密度、电导率、表面声波、催化活性或元素组成。“检测试剂”是产生指示感兴趣物质存在或不存在的可检测响应的任何分子。检测试剂包括多种分子中的任何一种，例如抗体、核酸序列和酶。为了便于检测，检测试剂可包含标记物。

标记物可以通过各种已建立的方法的任一种进行测定。基于抗体的技术包括但不限于荧光激活细胞分选(facs)免疫荧光、酶免疫组织化学和免疫印迹。进一步的测定可包括用于检测细胞因子水平或mrna的测定，或检测特定标记物的编码的“western印迹”技术。术语“western印迹”是指鉴定复杂混合物中蛋白质的方法；蛋白质在凝胶介质中电泳分离；从凝胶转移到蛋白质结合片或膜，其含有暴露于特异性抗体的分离蛋白质，所述特异性抗体结合，定位并使得目标蛋白质可视化。进一步的测定可包括聚合酶链式反应，印迹杂交(也称为northern印迹)和原位杂交。这些和其他此类测定的细节描述于例如美国专利号5,656,493；5,333,675；5,234,824；5,187,083，其各自通过引入并入本文，并描述于标准参考文献中包括j.sambrook和d.w.russell,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；第3版，2001；f.m.ausubel,编辑,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols；第5版，2002；和e.harlow和d.lane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,1988。

根据一些实施方案，可检测标志物包括但不限于自身免疫调节剂(aire)、cd3⁺、cd4⁺、cd8⁺、cd14⁺、cd16⁺、cd19⁺、cd25⁺、cd45⁺、cd56⁺、cd80⁺、cd86⁺、cd270、foxp3⁺、il-υ、il-β、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-18、il-21、il-22、il-23、il-27、tgf-β1、一氧化氮(no)、pd-l1、btla、tnf-α、th1/th2、c-肽、ccr-7、oct-4、nanog、阶段特异性胚胎抗原(ssea)-3、和ssea-4。

通过排除摄取嵌入dna染料7-氨基放线菌素d(7aad)的垂死细胞来确定细胞存活力。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约70％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约75％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约80％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约90％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约95％存活。

为了通过流式细胞术确定细胞数，将从外周血样品获得的细胞与小鼠抗人mabs(biolegend、sandiego、ca)一起孵育，所述mabs包括percp/cy5.5-缀合的抗-cd3、percp/cy5.5-缀合的抗-cd4、pe-缀合的抗-cd8、fitc-缀合的抗-cd45ra、pe-缀合的抗-cd45ro、pe-缀合的抗-cd56、apc-缀合的抗-ccr7。使用bdmultitest试剂cd3fitc/cd8pe/cd45percp/cd4apc和cd3fitc/cd16+cd56pe/cd45percp/cd19apc(bdbiosciences,sanjose,ca)对细胞进行免疫染色。对于所有荧光素缀合的iggmab，使用同种型匹配的小鼠抗人igg抗体(beckmancoulter)作为阴性对照。染色后，收集细胞并使用bdfacscalibur^tm细胞计数器分析。使用cellquestpro软件(bectondickinson,md)分析最终数据。

对于离体研究，将细胞在室温下染色30分钟，并且然后在流式分析之前用pbs洗涤。细胞使用小鼠抗人单克隆ab(mab)染色，所述ab包括apc-af750-缀合的抗-cd4、apc-af750-或krome橙-缀合的抗-cd8、pe-或fitc-缀合的抗-cd45ra、fitc-缀合的抗-cd45ro、ecd-缀合的抗-cd62l，和pe-cy7-缀合的抗-ccr7。对于所有荧光素缀合的iggmab，使用同种型匹配的小鼠抗人igg抗体(beckmancoulter)作为阴性对照。染色后，收集细胞并使用gallios流式细胞仪(beckmancoulter)分析，其配备有3种激光(488nm蓝色，638nm红色和405nm紫色激光)，用于同时读取多达10种颜色。使用kaluza流式细胞分析软件(beckmancoulter)分析最终数据。

根据一些实施方案，存在于驯化的单核细胞产物中的uc-sc将通过使用生物标志物的流式细胞术检测，所述生物标志物包括但不限于oct-4、nanog、阶段特异性胚胎抗原(ssea)-3和ssea-4。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于2％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于1％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.9％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.8％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.7％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.6％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.5％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.4％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.3％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.2％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.1％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.009％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.008％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.007％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.006％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.005％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.004％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.003％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.002％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.001％的脐带血单核干细胞。

根据一些实施方案，血管内输注到主体中的驯化的单核细胞产物的治疗有效量包括至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、或至少10¹⁰个单核细胞。

根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约24小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约25小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约26小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约27小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约28小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约29小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约30小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约31小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约32小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约33小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约34小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约35小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约36小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约37小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约38小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约39小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约40小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约41小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约42小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约43小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约44小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约45小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约46小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约49小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约50小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约51小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约52小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约53小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约54小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约55小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约56小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约57小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约58小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约59小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约60小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约61小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约62小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约63小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约64小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约65小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约66小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约67小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约68小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约69小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约70小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约71小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约72小时。

根据一些实施方案，治疗有效量的驯化的单核细胞产物有效调节主体的t细胞区室中的自身反应性，并减轻免疫疾病的症状。根据一些实施方案，通过测量合适的生物标志物可以测量生物效应，即降低t细胞区室中的自身反应性。术语“生物标志物”(或“生物印记”)是指肽、蛋白质、核酸、抗体、基因、代谢物或用作生物状态指示物的任何其他物质。其为客观测量并评价作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学响应的细胞或分子指示剂的特征。如本文所用，术语“指示剂”是指源自一系列观察到的事实的任何物质、数量或比例，所述事实可以揭示作为时间函数的相对变化；或可见的信号、标志、标记、注释或症状或其存在或出现的证据。一旦提出的生物标志物已被验证，它可用于诊断疾病风险，个体中疾病的存在，或定制对个体中疾病的治疗(药物治疗或施用方案的选择)。根据一些实施方案，在评估所描述的疗法中，一种或多种生物标志物可以用作天然终点(例如存活或不可逆的发病率)的替代。如果治疗改变生物标志物，并且该改变与改善的健康状况具有直接相关性，则生物标志物可以作为评估临床益处的替代终点。临床终点是可用于测量患者感觉、功能或存活情况如何的变量。替代终点是旨在替代临床终点的生物标志物；这些生物标志物被证明以监管机构和临床社区可接受的置信水平预测临床终点。

根据一些实施方案，治疗量的驯化的单核产物有效延迟发作，延迟进展，调节主体的t细胞区室中的自身反应性，减轻免疫疾病的症状，或其组合。根据一些实施方案，调节的结果包括在具有一些残留β细胞功能的主体的胰腺中的功能性β细胞的生长、增殖或两者的增加。根据一些实施方案，调节包括减少促炎细胞因子(例如il-4、il-5、il-12和il-17)的分泌。根据一些实施方案，调节包括改变驯化的单核产物移植物中的单核细胞群体。

根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少1个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少2个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少3个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少4个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少5个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少6个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少7个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少8个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少9个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少10个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少11个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少12个月。

根据一些实施方案，在主体生存期，根据需要在多个输注日期，依次重复步骤所述方法的步骤。

根据一些实施方案，所述方法可以有效维持和改善具有残留β细胞功能的个体中的胰岛β细胞功能。根据一些实施方案，所述方法可以有效改变t记忆群体。根据一些实施方案，所述方法可以有效地将驯化的单核细胞产物中的一些细胞转化为耐受剂(tolerizingagent)。

组合物

根据另一方面，所述发明提供了用于治疗以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的药物组合物，其包含治疗量的驯化的单核细胞产物，其中治疗有效量的驯化的单核细胞产物有效调节主体的t细胞区室中的自身反应性，并且减轻免疫疾病的症状，并且其中驯化的单核细胞产物通过包括以下的方法产生：

(1)在无菌条件下，从患有以淋巴细胞自身反应性为特征的疾病的主体获得含有单核细胞的全血样品；

(2)将(1)的全血样品运送到处理设施；

(3)从全血样品中无菌纯化单核细胞(mnc)，以形成单核细胞制剂；

(4)将单核细胞制剂引入生物反应器装置，所述生物反应器装置包含活的贴壁脐带血干细胞(uc-sc)的群体，其中所述贴壁uc-sc至少80％汇合；

(5)将所述单核细胞制剂与cb-sc共培养，使所述单核细胞制剂中的单核细胞和cb-sc可以在无菌条件下相互作用至少0.1小时、至少0.2小时、至少0.3小时、至少0.4小时、至少0.5小时、至少0.6小时、至少0.7小时、至少0.8小时、至少0.9小时、至少1.0小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时、至少3.5小时、至少4小时、至少4.5小时、至少5小时、至少5.5小时、至少6小时、至少6.5小时、至少7小时、至少7.5小时、或至少8小时，以形成驯化的单核细胞产物，且

其中治疗有效量的驯化的单核细胞产物有效调节主体的t细胞区室中的自身反应性，并减轻免疫疾病的症状，和

其中所述驯化的单核细胞产物包含：

(i)至少1×10¹⁰个单核细胞；和

(ii)调节的t细胞群体选自temcd4⁺、temcd8⁺、tcmcd4⁺cd45ra^-ccr7⁺、tcmcd8⁺ccr7⁺、tcmcd45ro⁺ccr7⁺、temcd45ro⁺ccr7^-、tcmcd8⁺、幼稚cd4⁺ccr7⁺、幼稚cd8⁺ccr7⁺、temcd4⁺ccr7⁺、temcd45ro⁺cd62l^-、temcd8⁺ccr7⁺、cd4⁺hla^-dr⁺和cd8⁺hla^-dr⁺细胞。

根据一些实施方案，单核细胞群体包含免疫调节细胞的群体。根据一些实施方案，免疫调节细胞的群体包含白细胞的群体。根据一些实施方案，白细胞的群体包含淋巴细胞的群体、粒细胞的群体、嗜碱性粒细胞的群体、单核细胞的群体、或其组合。根据一些实施方案，免疫调节细胞的群体包含抗原捕获细胞的群体、抗原呈递细胞的群体、或两者。根据一些实施方案，抗原呈递细胞的群体表达cd80、cd86或两者。根据一些实施方案，抗原呈递细胞的群体包含巨噬细胞、树突细胞、或两者。根据一些实施方案，淋巴细胞的群体包含t淋巴细胞的群体、b淋巴细胞的群体、自然杀伤(nk)细胞的群体、或其组合。

根据一些实施方案，t淋巴细胞的群体包含t细胞的一个或多个群体。根据一些实施方案，t细胞的群体包含激活的t细胞。根据一些实施方案，激活的t细胞的群体选自幼稚t细胞、引发t细胞、激活的t细胞、效应t细胞、细胞毒性t细胞、t辅助细胞、记忆t细胞、nk细胞和treg细胞。根据一些实施方案，t细胞的群体包含表达一种或多种炎性介质(淋巴因子)的t细胞。根据一些实施方案，炎性介质选自白细胞介素-1-β(il-1β)、il-2、白细胞介素-4(il-4)、il-5、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(ii-8)、il-10、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(ifn-γ)、白细胞介素-12(il-12)和淋巴毒素。根据一些实施方案，t淋巴细胞的群体包含表达一种或多种选自以下的标记物的t细胞：t细胞受体(tcr)/cd3、cd4、cd8、cd25、cd28、cd40配体(cd40l)、fox3、fas、mhci、mhcii、基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)、zap70(ζ相关蛋白)。

根据一些实施方案，b淋巴细胞的群体包含b细胞的一个或多个群体。根据一些实施方案，b细胞的群体包含激活的b细胞。根据一些实施方案，b细胞的群体选自幼稚b细胞、激活的b细胞、成浆细胞和记忆b细胞。根据一些实施方案，b淋巴细胞的群体包含表达一种或多种选自ii类mhc、cd40、免疫球蛋白的标志物的b细胞。

从全血样品中纯化单核细胞的方法是众所周知的。根据一个实施方案，通过密度梯度离心(例如，使用ficollpaque分级分离)除去红细胞，以将血沉棕黄层与红细胞分离。术语“血沉棕黄层”是指含有大部分白细胞的血液样本的薄浅灰白色级分。

根据一些实施方案，从全血样品中纯化单核细胞是使用自动单采术分离器通过单采术进行。简言之，从患者体内取出全血，并且然后通过含有旋转室的设备。血液通过重力沿室壁分离成其组分(血浆、富含血小板的血浆、白细胞和红细胞)。分选出单核细胞，并将剩余的血液组分重新引回到患者的血流中。

根据一些实施方案，磁珠激活细胞分选是用于从外周血单核细胞纯化特定细胞群的阳性选择技术。因为在这样的方案之后所需细胞的数量和活性可能降低，所以一些人更喜欢更温和的底物粘附和阴性选择方案。

根据一些实施方案，生物反应器装置包括一个或多个表面，所述表面包含活的贴壁脐带血干细胞(uc-sc)的群体。用于制备包含uc-sc的生物反应器的方法包括：

(a)获得从健康供体获得的新鲜脐带血单位；

(b)使用ficollhistopaque通过密度梯度离心从脐带血分离单核细胞级分；

(c)去除红细胞；

(d)用生理缓冲盐水洗涤uc-单核细胞；

(e)将单核细胞接种在生物反应器中的无血清培养中；其中接种密度是至少1×10⁶个细胞，

(f)在无血清培养基中培养单核细胞，每2-3天更换一半/培养基以除去非贴壁细胞，持续至少10天以生长到至少80％汇合；和

(g)将生物反应器在37℃孵育；和

(h)确认cb-sc培养物的样品的无菌性和存活力。

cb-sc的培养物是圆形的并且附着在生物反应器装置的底部表面。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面是未涂覆的塑料。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面是带正电的表面。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面是疏水表面，例如聚苯乙烯或玻璃。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面被涂覆。根据一些实施方案，生物反应器装置的表面不包含细胞饲养层。

根据一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少80％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少85％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少90％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少95％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少96％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少97％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少99％汇合。根据本发明的一些实施方案，脐带血单核细胞在共培养前生长至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天到至少99％汇合。

将来自患者的单核细胞制剂引入生物反应器中以将患者的单核细胞和uc-sc细胞共培养。根据一些实施方案，单核制剂与uc-cb层分离。根据一些实施方案，患者的单核细胞是非贴壁的。根据一些实施方案，患者的单核细胞接触uc-cb层中的细胞。根据一些实施方案，培养基包含生长因子、可溶性炎症介质等。根据一些实施方案，培养基有效支持患者的单核细胞和uc-cb细胞层二者。根据一些实施方案，培养基包含由患者的单核细胞和由uc-cb细胞产生的免疫调节介质和可溶性因子。

根据一些实施方案，相互作用条件包括生物反应器的轻微摇动。根据一些实施方案，生物反应器的轻微摇动是间歇性的。根据一些实施方案，培养基循环通过生物反应器。

患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少2小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少3小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少4小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少5小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少6小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少7小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少8小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少9小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少10小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少11小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少12小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少13小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少14小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少15小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少16小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少17小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少18小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少19小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少20小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少21小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少22小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少23小时。患者的单核制剂和cb-sc在相互作用条件下在无菌条件下共培养至少24小时。

根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:2的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:5的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:10的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:20的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:50的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:60的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:70的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:80的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:90的比例共培养。根据一些实施方案，脐带血单核干细胞和患者单核细胞以至少1:100的比例共培养。

这种相互作用的结果是驯化的单核细胞产物。

在无菌条件下从生物反应器装置收获驯化的单核细胞产物。

用于确认驯化的单核细胞产物的纯度、无菌性和存活力；百分比存活力的测定包括以下。

根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物的内毒素水平小于约0.5内毒素单位/ml，并且驯化的单核细胞产物是革兰氏染色阴性的。还对驯化的单核细胞产物进行支原体和无菌性测试，例如，通过实时pcr且符合usfda良好实验室规范的要求。

“可检测响应”是指可以在测定中检测的任何信号或响应，其可以在有或没有检测试剂的情况下进行。可检测响应包括但不限于放射性衰变和能量(例如，荧光、紫外、红外、可见)发射、吸收、偏振、荧光、磷光、透射、反射或共振转移。可检测响应还包括色谱迁移率、浊度、电泳迁移率、质谱、紫外谱、红外谱、核磁共振光谱和x射线衍射。或者，可检测响应可以是测量生物材料的一种或多种性质的测定的结果，例如解链温度、密度、电导率、表面声波、催化活性或元素组成。“检测试剂”是产生指示感兴趣物质存在或不存在的可检测响应的任何分子。检测试剂包括多种分子中的任何一种，例如抗体、核酸序列和酶。为了便于检测，检测试剂可包含标记物。

标记物可以通过各种已建立的方法的任一种进行测定。基于抗体的技术包括但不限于荧光激活细胞分选(facs)免疫荧光，酶免疫组织化学和免疫印迹。进一步的测定可包括用于检测细胞因子水平或mrna的测定，或检测特定标记物的编码的“western印迹”技术。术语“western印迹”是指鉴定复杂混合物中蛋白质的方法；蛋白质在凝胶介质中电泳分离；从凝胶转移到蛋白质结合片或膜，其含有暴露于特异性抗体的分离蛋白质，所述特异性抗体结合，定位并使得目标蛋白质可视化。进一步的测定可包括聚合酶链式反应，印迹杂交(也称为northern印迹)和原位杂交。这些和其他此类测定的细节描述于例如美国专利号5,656,493；5,333,675；5,234,824；5,187,083，其各自通过引用引入本文，并描述于标准参考文献中包括j.sambrook和d.w.russell,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；第3版，2001；f.m.ausubel,编辑,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols；第5版，2002；和e.harlow和d.lane,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,1988。

根据一些实施方案，可检测标志物包括但不限于自身免疫调节剂(aire)、cd3⁺、cd4⁺、cd8⁺、cd14⁺、cd16⁺、cd19⁺、cd25⁺、cd45⁺、cd56⁺、cd80⁺、cd86⁺、cd270、foxp3⁺、il-υ、il-β、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-8、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-18、il-21、il-22、il-23、il-27、tgf-β1、一氧化氮(no)、pd-l1、btla、tnf-α、th1/th2、c-肽、ccr-7、oct-4、nanog、阶段特异性胚胎抗原(ssea)-3、和ssea-4。

通过排除摄取嵌入dna染料7-氨基放线菌素d(7aad)的垂死细胞来确定细胞存活力。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约70％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约75％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约80％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约90％存活。根据一些实施方案，通过7-aad，驯化的单核细胞产物至少约95％存活。

为了通过流式细胞术确定细胞数，将从外周血样品获得的细胞与小鼠抗人mabs(biolegend，sandiego，ca)一起孵育，所述mabs包括percp/cy5.5-缀合的抗-cd3、percp/cy5.5-缀合的抗-cd4、pe-缀合的抗-cd8、fitc-缀合的抗-cd45ra、pe-缀合的抗-cd45ro、pe-缀合的抗-cd56、apc-缀合的抗-ccr7。使用bdmultitest试剂cd3fitc/cd8pe/cd45percp/cd4apc和cd3fitc/cd16+cd56pe/cd45percp/cd19apc(bdbiosciences,sanjose,ca)对细胞进行免疫染色。对于所有荧光素缀合的iggmab，使用同种型匹配的小鼠抗人igg抗体(beckmancoulter)作为阴性对照。染色后，收集细胞并使用bdfacscalibur^tm细胞计数器分析。使用cellquestpro软件(bectondickinson,md)分析最终数据。

对于离体研究，将细胞在室温下染色30分钟，并且然后在流式分析之前用pbs洗涤。细胞使用小鼠抗人单克隆抗体(mab)染色，所述单克隆抗体包括apc-af750-缀合的抗-cd4、apc-af750-或krome橙-缀合的抗-cd8、pe-或fitc-缀合的抗-cd45ra、fitc-缀合的抗-cd45ro、ecd-缀合的抗-cd62l，和pe-cy7-缀合的抗-ccr7。对于所有荧光素缀合的iggmab，使用同种型匹配的小鼠抗人igg抗体(beckmancoulter)作为阴性对照。染色后，收集细胞并使用gallios流式细胞仪(beckmancoulter)分析，其配备有3种激光(488nm蓝色、638nm红色和405nm紫色激光)，用于同时读取多达10种颜色。使用kaluza流式细胞分析软件(beckmancoulter)分析最终数据。

根据一些实施方案，存在于驯化的单核细胞产物中的uc-sc可通过使用生物标志物的流式细胞术检测，所述生物标志物包括但不限于oct-4、nanog、阶段特异性胚胎抗原(ssea)-3和ssea-4。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于2％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于1％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.9％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.8％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.7％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.6％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.5％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.4％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.3％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.2％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.1％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.009％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.008％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.007％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.006％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.005％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.004％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.003％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.002％的脐带血单核干细胞。根据一些实施方案，驯化的单核细胞产物含有少于0.001％的脐带血单核干细胞。

根据一些实施方案，血管内输注到主体中的驯化的单核细胞产物的治疗有效量包括至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、或至少10¹⁰个驯化的单核细胞。

根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约24小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约25小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约26小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约27小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约28小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约29小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约30小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约31小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约32小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约33小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约34小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约35小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约36小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约37小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约38小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约39小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约40小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约41小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约42小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约43小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约44小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约45小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约46小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约49小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约50小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约51小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约52小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约53小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约54小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约55小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约56小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约57小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约58小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约59小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约60小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约61小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约62小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约63小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约64小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约65小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约66小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约67小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约68小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约69小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约70小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约71小时。根据一些实施方案，从主体获得全血样品并将驯化的单核细胞产物输注回相同主体的最短时间为约72小时。

根据一些实施方案，治疗量的驯化的单核产物有效延迟发作，延迟进展，调节主体的t细胞区室中的自身反应性，减轻免疫疾病的症状，或其组合。根据一些实施方案，t细胞区室包含cd4⁺tcm(cd45ra^-ccr7⁺)、tregs、cd4⁺hla^-dr⁺或cd8⁺hla^-dr⁺t细胞中的一种或多种。根据一些实施方案，调节的结果包括在主体的胰腺中的功能性β细胞的生长、增殖或两者的增加。根据一些实施方案，调节包括减少促炎细胞因子(例如il-4、il-5、il-12和il-17)的分泌。根据一些实施方案，调节包括改变驯化的单核产物移植物中的单核细胞群体。

根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少1个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少2个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少3个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少4个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少5个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少6个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少7个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少8个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少9个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少10个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少11个月。根据一些实施方案，自身反应性调节的持续时间持续至少12个月。

根据一些实施方案，在主体生存期，根据需要在多个输注日期，依次重复步骤所述方法的步骤。

根据一些实施方案，所述方法有效维持和改善具有残留β细胞功能的个体中的胰岛β细胞功能。根据一些实施方案，所述方法有效改变t记忆群体。根据一些实施方案，所述方法有效地将mnc转化为耐受剂，其可以使细胞耐受。

根据一些实施方案，所述发明的组合物可以使用赋形剂、载体或媒介物配制，其包括但不限于溶剂。如本文所用，术语“赋形剂”、“载体”或“媒介物”是指适合于本文所述组合物的配制和施用的载体材料。本文中可用的载体和媒介物包括本领域已知的任何无毒且不与其他组分相互作用的此类材料。如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指可用于本发明组合物的配制和施用的任何实质上无毒的载体，在其中本发明的趋化性造血干细胞产物将保持稳定和生物可利用。

药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使得其适合施用至正在治疗的哺乳动物。它还应该保持驯化的单核细胞产物的稳定性和生物利用度。用于所述发明组合物的示例性药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。如本文所用的术语“缓冲液”是指其化学组成中和酸或碱而没有ph显著变化的溶液或液体。本发明所设想的缓冲液的实例包括但不限于dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(pbs)、林格氏溶液、5％葡萄糖水溶液(d5w)、生理盐水(0.9％nacl)。根据一些实施方案，输注溶液对主体组织是等渗的。根据一些实施方案，输注溶液对主体组织是高渗的。所述发明的组合物可包括药学上可接受的载体，例如无菌水溶液，常见溶剂(如醇类)中的非水溶液，或液体油基中的溶液。

根据一些实施方案，所述发明的组合物的载体可包括释放剂，比如缓释或延释载体。根据此类实施方案，载体可以是能够缓释或延释活性剂以提供更有效施用的任何材料，例如，导致组合物的较低频率和/或减少的剂量，改进操作便利性，并且延长或延迟对正在治疗、预防或促进的疾病、病症、病况、综合征等的作用。这样的载体的非限制性实例包括天然和合成聚合物等的脂质体、微海绵、微球、或微胶囊。脂质体可由多种磷脂(例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱)形成。

本发明的组合物可以无菌的可注射水溶液或油性混悬剂形式胃肠外施用。如本文所用，术语“肠胃外("parenteral"或"parenterally")”是指通过注射引入体内(即注射施用)，所述注射包括但不限于输注技术。包含趋化性造血干细胞产物的本发明组合物通过球囊导管递送至主体，所述球囊导管适于将流体组合物(即，能够流动的组合物)递送到选定的解剖结构中。

所述发明的无菌药物组合物可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌溶液或悬浮液。溶液通常被认为是两种或更多种物质的均匀混合物；它经常(尽管不一定)是液体。在溶液中，溶质(或溶解物质)的分子在溶剂的分子中均匀分布。悬浮液是分散体(混合物)，其中细碎物质与另一物质组合，且前者被细分和混合使其不会快速沉降。在日常生活中，最常见的悬浮液是固体在液体水中的悬浮液。可以使用的示例性媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠(盐水)溶液。根据一些实施方案，使用高渗溶液。此外，可用使用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。对于肠胃外应用，示例性媒介物由溶液组成，例如油性或水性溶液，以及悬浮液，乳液或植入物。水性悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，并且包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。

所述发明的其他组合物可以使用本领域已知的技术容易地制备，例如描述于remington'spharmaceuticalsciences，第18或19版，由mackpublishingcompanyofeaston,pa出版，其通过引用并入本文。

根据所述发明的另一方面，所述药物组合物可以进一步包括一种或多种相容的活性成分，其目的在于为所述组合物提供除驯化的单核细胞产物所提供的以外的另一药物效果。如本文所用，“相容的”是指此类组合物的活性成分能够以这样的方式彼此组合，使得在正常使用条件下不存在实质上降低每种活性成分或组合物的功效的相互作用。根据一些实施方案，组合疗法包括向有此需要的主体施用药物组合物，其包含治疗量的驯化的单核细胞产物和有效治疗免疫疾病的症状的治疗剂。例如，在免疫疾病是糖尿病的情况下，治疗剂可以选自胰岛素、胰岛素类似物、双胍、噻唑烷二酮、促分泌素、磺酰脲、非磺酰脲促分泌素、格列奈、二甲双胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂、美格列奈、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰高血糖素样肽1(glp-1)模拟物、胰高血糖素样肽1(glp-1)激动剂、糊精类似物、二肽基肽酶-4抑制剂、肠促胰岛素模拟物、胃抑制肽类似物、糊精类似物、糖尿、非那雄胺、度他雄胺、米诺地尔、酮康唑、螺旋内酯固醇、氟他胺、环孢菌素、氯倍他索、抗cd3抗体、胰岛素受体的小分子激活剂、醋酸氟轻松，或其组合。

除非上下文另外明确地规定，在提供数值范围时，可以理解，在该范围的上限和下限之间的每个介于其间的值(至下限单位的十分之一)、和该规定范围中的任何其他规定值或介于其间的值包含在本发明内。可以独立地包括在较小范围中的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内，并服从规定范围中的任何具体排除限制。当规定范围包括一个或两个限值时，排除那些包括的限值中的任一或两者的范围也包括在本公开中。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管已经描述了示例性方法和材料，但与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施或测试本发明。本文所提到的所有出版物通过引用并入本文来公开，并结合所引用的出版物描述方法和/或材料。

如在本文中和在所附权利要求中所用的，单数形式“一("a","and","the")”括复数引用，除非上下文另有明确说明。术语“包含("comprises","comprising')”、“包括("includes","including")”、“具有(having)”和它们的词形变化指“包括但不限于”。除非另有明确说明，否则本申请中使用的术语和短语及其变体应被解释为开放式的而非限制性的。作为前述的示例，术语“包括”应理解为“包括但不限于”等含义。术语“实例”用于提供讨论中的项目的示例性实例，而不是其详尽或限制性列表。诸如“常规”、“传统”、“已知”和类似含义的术语之类的形容词不应被解释为将所描述的项目限制到给定时间段，或者限定给定时间内可用的项目，而是这些术语应该被理解为包含现在或将来的任何时候可得、已知的常规、传统、正常或标准技术。同样地，与连词“和”相关联的一组项目不应被解读为要求这些项目中的每一项都存在于分组中，而应该被解读为“和/或”，除非另有明确说明。类似地，与连词“或”相关联的一组项目不应被解读为要求该组之间的相互排他性，而是还应该被解读为“和/或”，除非另有明确说明。在某些情况下，诸如“一个/种或多个/种”，“至少”，“诸如但不限于”或其他类似短语之类的扩展词和短语的存在不应被理解为意味着在实例中期望或需要更窄的情况（其中可能不存在这样扩展的短语）。

此外，例如本文描述的系统和方法的序列的任何序列和/或时间顺序，本公开是说明性的，并且不应被解释为本质上是限制性的。因此，应该理解，可以将处理步骤示出并描述为按序列或时间顺序，但是它们不必限于以任何特定序列或顺序执行。

尽管本文已经参考一些实施方案描述和说明了所描述的发明，但是对于本领域普通技术人员显而易见的是，其他实施方案可以执行类似的功能和/或实现相同的结果。因此，应该理解的是，所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或替换，以便形成所公开发明的不同模式。因此，诸如变化、改编、修改和等同布置的许多不同实施方案落入所述发明的范围和精神内。

本文讨论的出版物仅因它们在所述发明提交日期前的公开而提供。本文没有任何内容应解释为承认所述发明由于在先发明而不享有先于此类出版物的权利。进一步地，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，其可能需要单独确认。

实施例

提出下列实施例，以为本领域普通技术人员提供如何制造和使用所述发明的完整公开和描述，并且不意欲限制本发明人认为的其发明的范围，也不意欲表示下面的实验是实施的全部实验或仅被实施的实验。已经做出努力以确保关于使用的数字的准确性，但是一些实验误差和偏差在所难免。除非另由指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。

闭环生物反应器装置

闭环生物反应器装置在class100k洁净室中制造，并在引入脐带血单核细胞之前进行γ-照射。在生物反应器装置中，从患者血液中分离的淋巴细胞缓慢地通过具有贴壁脐带血单核细胞的堆叠的材料盘，并且通过底板中的孔收集的淋巴细胞返回到患者体内。用于生产该装置的材料根据美国药典被批准用于体内使用(即，vi级塑料级)。

图1示出了根据所述发明的一些实施方案用于治疗自身免疫病症的系统10，其具有用于从患者2抽血的流体导管12，以及单采术设备14，干细胞生物反应器装置20和流体返回导管18。在使用中，经由流体导管12从主体2中抽血，例如用血液动力学泵，并通过单采术设备14处理，以从血液中分离淋巴细胞。血液可以经由流体返回导管18返回患者2。将分离的淋巴细胞递送至生物反应器装置20，其中淋巴细胞群的部分通过与生物反应器装置20内的脐带血单核细胞的相互作用而受到调节。

图2提供了根据本发明的生物反应器装置20的示意图，其包括腔室22，流体入口导管23，以脐带血单核干细胞26接种的多个基底表面层24。层之间的通道25允许淋巴细胞21从入口23流到出口27。在使用中，来自单采术设备的淋巴细胞被供入腔室22，在腔室22中发生淋巴细胞21的调节/激活。在适当的一段时间后，可以将激活和调节的淋巴细胞21从生物反应器装置20中取出并返回患者2。

实施例1：使用包含贴壁uc-sc细胞的闭环生物反应器装置治疗华裔患者的1型糖尿病

在一项开放标签、1期/2期研究中，将患有长期t2d的华裔患者(n=36)分为三组(a组，口服药物，n=18；b组，口服药物+胰岛素注射，n=11；具有β细胞功能受损的c组，使用口服药物+胰岛素注射，n=7)。所有患者接受通过闭环系统循环患者的血液的装置的一次治疗，所述系统从全血分离单核细胞，将它们与贴壁脐带血干细胞(uc-sc)短暂共培养，并将如此驯化的自体细胞返回患者的循环[zhao等人，“targetinginsulinresistanceintype2diabetesviaimmunemodulationofcordblood-derivedmultipotentstemcells(cb-scs)instemcelleducatortherapy:phasei/iiclinicaltrial”,bmcmed.,vol.11:160,(2013)]。

临床发现表明，这些t2d患者在该治疗后实现了改善的代谢控制和减少的炎症标记物的表达。a组和b组的hba1c中值从基线时的8.61％±1.12显著降低至12周时的7.25％±0.58(p=2.62e-06)，以及治疗后一年时的7.33％±1.02(p=0.0002)。胰岛素抗性的稳态模型评估(homa)(homa-ir)证实治疗后胰岛素敏感性得到改善。如通过c肽水平的恢复所证明的，c组主体中的胰岛β细胞功能显著恢复。机理研究表明，这种治疗通过单核细胞的免疫调节和th1/th2/th3细胞因子产生的平衡逆转了免疫功能障碍。

在一项安全性研究中，36名患有t2d的中国患者接受了使用该装置的治疗，并且其结果与t1d参与者的安全性评估类似[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3):1-11,(2012)]。在治疗过程期间和治疗后超过一年，没有参与者经历任何重大不良事件。患者主诉仅限于在静脉穿刺期间肘正中静脉部位的轻微不适和一些手臂疼痛，其在单采术后迅速消退。

用该装置治疗后，t2d患者的血糖控制得到改善。在接受这种疗法并出院后，患者继续其常规药物治疗。随访研究证实a组(n=18)和b组(n=11)的中值糖化血红蛋白(hba1c)从基线的8.61％±1.12显著降低至治疗后4周的7.9％±1.22(p=0.0004)，治疗后12周为7.25％±0.58(p=0.003)(图3a)，并且在c组患者(n=7)中治疗后1年时为7.33％±1.02(p=0.036)。根据美国糖尿病协会(ada)推荐的成人糖尿病治疗的a1c目标(<7％)，a组中28％(5/18)的主体，b组中36％(4/11)的主体和c组中29％(2/7)的主体在治疗后12周达到该目标。超过31％的所有主体达到并保持<7％标准超过一年。此外，根据功效标准，a组中18例主体中的11例(61.1％)，b组中11例主体中的8例(72.7％)，c组中7例主体中的4例(57.1％)，在治疗后4周具有a1c值降低(>0.5％)。a组中18例主体中的13例(72.2％)，b组中11例主体中的9例(81.8％)，c组中7例主体中的6例(85.7％)具有a1c值降低(>0.5％)。在治疗后12周，36例所有主体中的28例(78％)中的a1c值降低了1.28±0.66。

为了探索胰岛素敏感性的变化，测定了a组和b组中的胰岛素抗性的稳态模型评估(homa)(homa-ir)，即空腹血糖和c肽(而不是胰岛素，这是由于主体接受胰岛素注射)的乘积。数据显示homa-irc-肽水平在随访4周时显著降低(图3b)，这显示治疗后胰岛素敏感性得到改善。与改善的β细胞功能一致，治疗后12周时二甲双胍的中值日剂量减少33％~67％，并且胰岛素减少35％。

在胰岛β细胞功能受损的长期t2d主体中，空腹c肽的水平显著增加(c组，糖尿病病持续时间14±6年，n=7，p=0.0073)(图3c)。治疗12周后，空腹c肽水平达到正常生理水平，并维持通过该测量的最后一次随访(56周)(基线时0.36±0.19ng/ml对比治疗后一年时1.12±0.33ng/ml，p=0.00045，图3c)。通过使用homa-bc-肽的β-细胞功能分析证实，在接受治疗后，c组主体中的胰岛β细胞的功能显著增强(图3d)。数据显示c肽的恢复可能与胰岛β细胞的再生相关，如我们在之前的1型糖尿病研究中所证实的[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3):1-11,(2012)]。

纠正免疫功能障碍的功效结果

为了确定改善代谢控制的分子和细胞机制，检查了干细胞生物反应器装置疗法在t2d中的抗炎和免疫调节的作用。elisa用于检测血浆中的促炎细胞因子il-1il-6和tnf-α，其主要涉及胰岛素抗性和t2d。在这些长期t2d主体中，il-1il-6和tnf-α均处于背景水平，并且治疗后未能显示变化(分别为p=0.557，p=0.316，p=0.603)，可能是因为代谢性炎症是慢性亚程度炎症[shoelsons.e.等人，“inflammationandinsulinresistance”,jclininvest,vol.116:1793-1801,(2006)]，并且血清样品直接从t2d患者的血液中收集，而不是来自t2d主体的脂多糖(lps)激活的单核细胞[devarajs.等人，“low-densitylipoproteinpostsecretorymodification,monocytefunction,andcirculatingadhesionmoleculesintype2diabeticpatientswithandwithoutmacrovascularcomplications:theeffectofalpha-tocopherolsupplementation”,circulation,vol.102:191-196,(2000)]。在治疗后4周，t2d主体的血浆中的抗炎和免疫抑制细胞因子tgf-β1相对于基线水平显著增加(图4a)。然而，il-10在所有参与者中均未改变(p=0.497)。这些发现显示tgf-β1的上调是通过这种治疗促成逆转胰岛素抗性的潜在机制。

随后，使用更灵敏的细胞内流式细胞术分析，在t2d主体的外周血中检查白细胞介素-17(il-17，也称为il-17a)和th1/th2免疫反应相关的细胞因子。il-17a是参与自身免疫疾病的众所周知的促炎细胞因子。在该治疗后，il-17、il-12和th2相关细胞因子il-4和il-5的产生均显著降低(图4b)。

为了探索调节th1/th2免疫反应的潜在细胞机制，我们重点关注单核细胞/巨噬细胞上表达的共刺激分子cd80/cd86的变化，单核细胞/巨噬细胞是在t2d的慢性炎症和肥胖相关的胰岛素抗性的发作中起关键作用的专业抗原呈递细胞。结果证实cd86+cd14⁺单核细胞的百分比在治疗后4周显著降低(图4c，p=0.0212)。cd80⁺cd14⁺单核细胞水平无显著变化(p=0.13)。cd86⁺cd14⁺单核细胞/cd80+cd14⁺单核细胞的比例从3.86±2.56降低至1.22±0.48(p=0.01)。对淋巴细胞上表达的cd80/cd86配体cd28/ctla-4的进一步流式分析显示，在接受干细胞生物反应器装置疗法后4周，ctla-4的表达显著增加(治疗前0.51％±0.5对比治疗后1.98％±0.51，p=9.02e-05)。然而，流式分析未能显示共刺激分子cd28的表达差异(治疗前69.98％±14.17对比治疗后61.5％±10.89，p=0.225)。此外，检查了在接受干细胞驯化者疗法后cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg群体的变化。流式分析未鉴定出基线与治疗后4周或12周之间的任何差异(图4d，p=0.689)。因此，这些数据显示，该治疗通过抗原呈递细胞单核细胞而非treg的作用调节th1/th2免疫反应。

cb-sc对单核细胞免疫调节的体外机制研究

为了更好地理解cb-sc对单核细胞的免疫调节作用，进行了使用从人外周血纯化的cd14⁺单核细胞的体外共培养实验。将纯化的cd14⁺单核细胞与cb-sc以不同比例共培养。将cd14⁺单核细胞加入cb-sc后有强烈的反应(图5a，左下图)。流式分析证实，在cb-sc：单核细胞为1：5的比例下，与cb-sc共培养18小时导致单核细胞显著凋亡(图5b)。相应地，细胞存活力和cb-sc的附着也受到凋亡单核细胞的存在的影响(图5a，左下图)。在结构上，cb-sc的细胞过程长度缩短，但大多数仍附着在底部(图5a，左下图)。共培养2-3天后，这些受损的cb-sc恢复；它们继续扩增并在7-10天后变为90~100％汇合(图5a，右下图)。机理研究表明，cb-sc展示细胞凋亡蛋白抑制剂(ciap)1，其保护cb-sc免受单核细胞的细胞毒性作用，使其能够存活和增殖(图5c)。我们发现cb-sc表达肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)但不表达tnfri(图5d)。重组tnf在不同剂量下显示对cb-sc的细胞毒性(图5e)。以1:10的比例，使用tnfriimab(20μg/ml)预处理的cb-sc显著阻断单核细胞的毒性作用并保护50％的cb-sc具有良好的存活力和形态。

为了进一步探索cb-sc对单核细胞的免疫调节作用，将脂多糖(lps)刺激的纯化的cd14⁺单核细胞与cb-sc共培养。实时pcr阵列显示，与cb-sc共培养可以显著下调lps刺激的炎症相关基因的数量，包括趋化因子、多种细胞因子和基质金属肽酶、以及信号传导途径分子nf-κb(图5f)。这些数据证实，单核细胞与cb-sc的体外共培养导致单核细胞中炎症相关基因表达的显著下调。

以前的工作已显示，cb-scs通过一氧化氮(no)的产生作为免疫调节剂作用于淋巴细胞[zhaoy.等人，“immuneregulationoftlymphocytebyanewlycharacterizedhumanumbilicalcordbloodstemcell”,immunollett,vol.108:78-87,(2007)]。为了确定no是否参与cb-sc对单核细胞的免疫调节，将特异性诱导型一氧化氮合酶(inos)抑制剂1400w应用于共培养系统。数据证实，在inos抑制剂1400w的存在下，cb-sc对lps刺激的单核细胞的抑制作用可以显著逆转(图5f)。阻断cb-sc中的no产生可显著增加单核细胞中趋化因子ccl20和细胞因子(例如，il-1α、il-6、il-8、il-23和tnf-α)的表达。这些结果显示，cb-sc衍生的no在cb-sc对单核细胞的免疫调节和抗炎作用中起重要作用。

实施例2：使用包含贴壁uc-sc细胞的闭环生物反应器装置用于治疗高加索人种患者的1型糖尿病

为了评估包含贴壁uc-sc细胞的闭环生物反应器装置用于治疗高加索人种患者的1型糖尿病的免疫调节作用，在具有确认的t1d的15名主体中进行了1/2期临床试验。

在endocrinologyandnutritionservice,hospitaluniversitariocentraldeasturias(oviedo,spain)接受护理的t1d患者参加了在2012年11月27日至2014年10月1日期间进行的该1期/2期开放标签临床试验。主要研究者设计了临床试验，并获得了regionalcommitteeforclinicalreasrchethics和thecomisiónpermanentedetrasplantesdelconsejointertrritorialdelsistemanacionaldesalud的临床治疗方案的伦理批准和同意书。已从每位参与者处获得签署的知情同意书。临床试验在具有确认的t1d的15名主体中进行(表1a；具有残留胰岛β功能的a组t1d患者和表1b；没有残留胰岛β功能的b组t1d患者)。如下面1/2期临床试验的图表流程图1中所示，并且如果他们符合美国糖尿病协会(ada)的2012年诊断标准，并且如果血液检查表明存在至少一种针对胰岛β细胞的自身抗体，则主体符合招募要求。关键排除标准包括临床显著的肝脏(ast或alt2≥x正常上限)、肾脏(肌酸酐≥2.0mg/dl)或心脏病；怀孕或哺乳的母亲；免疫抑制药物治疗；已知病毒性疾病的活跃感染；或与免疫缺陷相关的疾病；或血红蛋白<10g/dl或血小板<100k/ml；在一个月内使用免疫抑制药物治疗。

治疗和随访

本研究中的所有参与者都接受了包含贴壁uc-sc细胞(tianhestemcellbiotechnology，usa)的闭环生物反应器的两次治疗。如前所述进行cb-sc培养物和闭环装置的制备[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletbetacellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed,vol.10:3,(2012)]。简要而言，源自健康同种异体供体的人脐带血单位获自centrocomunitariodesangreytejidosdeasturias(ccst,oviedo,spain)。针对hivi&ii、hbsag、hbcag、hcv、hivnat、sts、hbvnat、hcvnat、htlvi/ii、西尼罗病毒、查加斯病(chagas)和cmv筛选所有脐带血样品，并且仅将无病原体的脐带血单位用于临床治疗。从新鲜脐带血单位(至少100ml/单位)分离人cb-sc。这是通过取50ml管完成的，并且将它们放入支架中。将3ml的histopaque^(r)-1077加入每个管中，(20ml锥形离心管)，并升至室温以分离cb-sc。将3ml全血小心地分层到histopaque^(r)-1077上。在室温下以400×g进行离心30分钟。离心后，抽取上层至含有cb-sc的不透明界面的0.5cm之内。将不透明的界面转移到新的干净的20ml锥形管中。用10ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤细胞。通过混合并以250×g离心数分钟完成洗涤后，弃去上清液，并且再洗涤两次后，将cb-sc重悬于0.5ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液中。产生人cb-sc并将脐带血单核细胞以至少1×10⁶个细胞的密度，25ml/皿铺板于150×15mm皮氏培养皿(bectondickinsonlabware，franklinlakes，nj，未经组织培养处理的培养皿)中的rpmi1640培养基中，并在37℃，8％co2中孵育。将脐带血单核细胞铺板在生物反应器装置中的无血清培养基(lonza，walkersville，md)中，并在37℃，8％co2中孵育约2-3周。观察到cb-sc细胞是圆形的并且进一步验证了在皮氏培养皿底部的附着。2-3周后，将cb-sc与通过单采术而分离的mnc共培养(参见下文第[00327]段)。制备生长到80％汇合的cb-sc(约1×10⁷个细胞/装置)用于临床试验。一个生物反应器装置由一个脐带血单位产生，并在一次治疗中用于一个主体。

对于生物反应器装置疗法，将16号iv针放置在左或右肘正中静脉中，并且使患者的血液通过血细胞分离器mcs+(haemonetics®,braintree,ma)以分离单核细胞。对于通过单采术的单个mnc收集阶段，在6-7小时内从每个登记的主体处理大约10l血液，收集约1×10¹⁰个mnc。将分离的单核细胞转移到生物反应器装置中以用同种异体cb-sc连续处理，并且其他血液组分自动返回到患者的循环。在生物反应器装置中，从患者外周血中分离的mnc缓慢通过具有贴壁cb-sc的堆叠盘，其中cb-sc：mnc为1:20的比率、1:30的比率、1:40的比率、或1:50的比率。接触2-3小时后，cb-sc处理的单核细胞通过手中的背静脉与生理盐水一起返回患者的血液循环。花费8-9个小时。患者住院一天以监测体温并进行关于治疗后的不良反应的血细胞计数测试。3个月后，所有主体接受使用生物反应器装置疗法的第二次治疗，如上所述。在治疗后2、8、12、18、26、40和56周安排随访，用于临床评估和实验室测试(图6)。

为了评估β细胞功能，在基线和包括贴壁uc-sc细胞的闭环生物反应器装置的治疗后，检查空腹和胰高血糖素刺激的c肽水平。进行胰高血糖素刺激的c肽测试。在空腹状态下从每个主体取出5-10ml静脉血样品用于基线c-肽测量。通过静脉内注射1mg胰高血糖素进行胰高血糖素试验，随后，在6分钟后从单独的静脉部位进行第二次抽血5-10ml。胰高血糖素测试的主体选择仅仅基于他们同意进行测试。

离心血液样品后，分离血清，然后在-20℃冷冻。

主要研究终点是通过治疗后56周的闭环治疗的可行性和安全性，以及初步评估疗法改变t1d主体免疫标志物的效果。次要研究终点是该疗法在改善β细胞功能方面的有效性的初步证据。在闭环治疗之前收集基线血液样品。

混合淋巴细胞反应(mlr)和离体共培养

人血沉棕黄层血液单位购自bloodcenterofnewjersey(eastorange,nj)。如前所述收获cb-sc[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)];[zhaoy.等人，“targetinginsulinresistanceintype2diabetesviaimmunemodulationofcordblood-derivedmultipotentstemcells(cb-scs)instemcelleducatortherapy:phasei/iiclinicaltrial”,bmcmed.,vol.11:160,(2013)]。这是通过取50ml管完成的，并且将它们放入支架中。将3ml的histopaque^(r)-1077加入每个管中，(20ml锥形离心管)，并升至室温以分离cb-sc。将3ml全血小心地分层到histopaque^(r)-1077上。在室温下以400×g进行离心30分钟。离心后，抽取上层至含有cb-sc的不透明界面的0.5cm之内。将不透明的界面转移到新的干净的20ml锥形管中。用10ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤细胞。通过混合并以250×g离心数分钟完成洗涤后，弃去上清液，并且再洗涤两次后，将cb-sc重悬于0.5ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液中。为了通过混合白细胞反应(mlr)检查cb-sc对t细胞的免疫调节作用，在存在或不存在cb-sc的情况下，将响应细胞与经3000拉德辐照的同种异体刺激细胞共培养，其中r:s比例为1:2。cb-sc:响应细胞的比例为1:10。共培养4-5天后，用olympusix71倒置显微镜拍摄细胞并收集细胞用于流式分析。

为了分析cd45ro⁺cd62l^-tem细胞上的ccr7表达，将成体外周血-单核细胞(pbmc)与cb-sc以1:10的cb-sc：pbmc比例在无血清培养基(lonza,walkersville,md)中共培养，并在37℃，8％co2下孵育。未处理的pbmc用作对照。分别在24和48小时收集cb-sc处理的pbmc用于流式细胞术。

为了进行离体研究，由cord:usecordbloodbank(orlando,fl)提供人脐带血单位。仅使用无病原体的脐带血单位来分离cb-sc。从新鲜脐带血单位(至少100ml/单位)分离人cb-sc。这是通过取50ml管完成的，并且将它们放入支架中。将3ml的histopaque^(r)-1077加入每个管中，(20ml锥形离心管)，并升至室温以分离cb-sc。将3ml全血小心地分层到histopaque^(r)-1077上。在室温下以400×g进行离心30分钟。离心后，抽取上层至含有cb-sc的不透明界面的0.5cm之内。将不透明的界面转移到新的干净的20ml锥形管中。用10ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤细胞。通过混合并以250×g离心数分钟完成洗涤后，弃去上清液，并且再洗涤两次后，将cb-sc重悬于0.5ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液中。产生人cb-sc并将脐带血单核细胞以至少1×10⁶个细胞/ml的密度，25ml/皿铺板于150×15mm皮氏培养皿(bectondickinsonlabware，franklinlakes，nj，未经组织培养处理的培养皿)中的rpmi1640培养基中，并在37℃，8％co2中孵育。将脐带血单核细胞铺板在生物反应器装置中的无血清培养基(lonza，walkersville，md)中，并在37℃，8％co2中孵育约2-3周。观察到cb-sc细胞是圆形的并且进一步验证了在皮氏培养皿底部的附着。制备生长到80％汇合的cb-sc(约1×10⁷个细胞/装置)用于与同种异体淋巴细胞共培养。

在临床试验的准备中，在治疗前且分别在治疗后2、8、18、26和56周，从患者获得外周血样品(每个主体10ml)。将细胞与小鼠抗人mab(biolegend,sandiego,ca)一起温育，所述mab包括percp/cy5.5-缀合的抗cd3，percp/cy5.5-缀合的抗-cd4、pe-缀合的抗-cd8、fitc-缀合的抗cd45ra、pe-缀合的抗cd45ro、pe-缀合的抗cd56、apc缀合的抗ccr7。为了测试外周血中不同亚群的百分比和绝对细胞数，用bdmultitest试剂cd3fitc/cd8pe/cd45percp/cd4apc和cd3fitc/cd16+cd56pe/cd45percp/cd19apc(bdbiosciences,sanjose,ca)对细胞进行免疫染色。对于所有荧光素缀合的iggmab，使用同种型匹配的小鼠抗人igg抗体(beckmancoulter)作为阴性对照。染色后，收集细胞并使用bdfacscalibur^tm细胞计数器分析。使用cellquestpro软件(bectondickinson,md)分析最终数据。

对于离体研究，即流式细胞术分析，将细胞在室温下染色30分钟，并且然后在流式分析之前用pbs洗涤。我们使用了几种小鼠抗人单克隆抗体(mab)，其包括apc-af750-缀合的抗-cd4、apc-af750-或krome橙-缀合的抗-cd8、pe-或fitc-缀合的抗-cd45ra、fitc-缀合的抗-cd45ro、ecd-缀合的抗-cd62l和pe-cy7-缀合的抗-ccr7。对于所有荧光素缀合的iggmab，使用同种型匹配的小鼠抗人igg抗体(beckmancoulter)作为阴性对照。染色后，收集细胞并使用gallios流式细胞仪(beckmancoulter)分析，其配备有3种激光(488nm蓝色，638nm红色和405nm紫色激光)，用于同时读取多达10种颜色。使用kaluza流式细胞分析软件(beckmancoulter)分析最终数据。

使用意在治疗方法，其中15名患者接受使用包含贴壁uc-sc细胞的闭环生物反应器装置的治疗。所有参与者都被纳入安全分析。通过分析无法完成疗法的患者数量和在12个月探访之前失访的患者数量来评估治疗的可行性。主要功效终点是基线和随访之间免疫标记物的变化。通过双尾配对student氏t检验进行数据的统计分析，以确定基线和随访之间的统计学显著性。值以平均值±sd(标准偏差)给出。

结果

在高加索人t1d主体中使用生物反应器装置疗法的两次治疗的安全性概况和可行性

在先前的临床试验中，所有主体均接受一次治疗[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)]；[zhaoy.等人，“targetinginsulinresistanceintype2diabetesviaimmunemodulationofcordblood-derivedmultipotentstemcells(cb-scs)instemcelleducatortherapy:phasei/iiclinicaltrial”,bmcmed,,vol.11:160,(2013)]。由于大量致病性自身免疫细胞可能残留在淋巴结和其他组织中，在程序过程中未能进入血流，并因此可能已经逃过暴露于cb-sc这一可能性，在初步阶段后三个月，这些t1d主体(n=15)中加入二次治疗。在使用生物反应器装置疗法的两次治疗过程中或在56周的随访期间，没有参与者经历任何显著的不良事件。在程序过程中，一些参与者仅注意到在静脉穿刺期间部位(肘正中静脉)的轻微不适和一些手臂疼痛。在随访研究中未发现发热或排斥。

闭环治疗在高加索人主体的记忆t细胞区室调节中的临床功效

为了评估闭环治疗的免疫调节作用，使用流式细胞术检查闭环治疗后15名参与者的免疫标记物。临床数据指出，在一年的随访期间，每个细胞群的总细胞数没有变化，包括白细胞共同抗原cd45⁺核细胞、cd3⁺t细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、cd56⁺nk细胞和cd20⁺b细胞(图7a)。外周血中的总cd4⁺和cd8⁺t细胞百分比的定量在一年内保持非常稳定(图7b)。

使用用于表征幼稚和记忆t细胞的常见表面标志物，例如cd45ra和ccr7，来研究闭环治疗对不同t细胞亚群的调节作用。在闭环治疗后26周，幼稚cd4⁺t(cd45ra⁺ccr7⁺)细胞的百分比显著增加(p=0.0042)，并维持通过最终随访(治疗后56周，p=0.0021)(图7c)。在任何随访中，幼稚cd8⁺t细胞的百分比没有显示出显著变化(图7c)。这些发现表明，sce疗法恢复幼稚cd4⁺t细胞的再生，这是正常免疫能力的重要部分。

为了探讨闭环治疗对记忆t细胞的影响，通过流式细胞术检查中枢记忆t细胞和效应记忆t细胞(分别为tcm和tem)。这些主体的总体分析证实，在接受生物反应器装置疗法后18周，cd4⁺tcm(cd45ra^-ccr7⁺)细胞的百分比显著且不断增加(p=0.018)(图7d)。相比之下，cd8⁺t细胞的百分比仅在18周时短暂提高(p=0.034)，但在持续随访期间恢复至基线水平(图7d)。与b组主体(4/9,44％)相比，a组主体中cd4⁺tcm细胞的百分比(4/6,67％)在随访18周时更有效地增加至超过30％的阳性细胞(数据未显示)。对tem(cd45ra⁺ccr7^-)细胞的总体分析显示，cd4⁺细胞和cd8⁺t细胞分别在第18周(p=0.03)和第26周(p=0.0024)显著降低(图7e)。在26周随访时，与b组主体(7/9,78％)相比，a组主体中cd8⁺t细胞的百分比(6/6,100％)更有效地降低超过15％的阳性细胞；在26周随访时，5/6(83％)的a组主体相对于7/9(78％)的b组主体的cd4⁺t细胞减少(数据未显示)。此外，使用hla-dr作为t细胞的激活标记物，临床数据证实cd4⁺hla^-dr⁺t细胞和cd8⁺hla^-dr⁺t细胞的百分比在26周随访时相对于基线水平显著下降(分别为p=0.002和p=0.006)(图7f和g)。

在高加索人t1d主体中，闭环治疗后t细胞上ccr7表达的上调

c-c趋化因子受体7(ccr7)在t细胞经由高内皮小静脉的淋巴结归巢和介导t细胞稳态中起重要作用[forsterr.等人，“ccr7anditsligands:balancingimmunityandtolerance”,natrevimmunol,vol.8:362-371,(2008)]；[moschovakisg.l.等人，“multifacetedactivitiesofccr7regulatet-cellhomeostasisinhealthanddisease”,eurjimmunol,vol.42:1949-1955,(2012)]。为了进一步探索闭环治疗的免疫调节作用，通过流式细胞术分析幼稚t细胞、tcm和tem细胞上的ccr7表达水平。临床数据显示a组和b组主体均显著增加了幼稚cd4⁺t细胞(图8a)、幼稚cd8⁺t细胞(图8b)和cd4⁺t细胞(图8c)上的ccr7表达。a组主体中幼稚cd4⁺t细胞的显著响应早在闭环治疗后8周发生，与b组主体在26周时延迟响应相当(图8a)。在a组和b组主体中，在8周随访时同时显示幼稚cd8⁺t细胞上ccr7的表达上调(图8b)。a组主体中cd8⁺t细胞上ccr7的表达也有所改善，并在18周随访时开始(图8d)，但b组主体中在56周随访时具有延迟响应(p=0.046，图8d)。在两组中，接受干细胞生物反应器装置疗法后，在56周随访时cd4⁺t和cd8⁺t细胞上的ccr7表达水平都显著增强(图8e)。数据显示，在闭环治疗后，cd4⁺和cd8⁺t细胞上ccr7的表达上调可能导致t1d主体中t细胞的重新分布。

用cb-sc闭环治疗后，通过离体研究t细胞上ccr7的表达上调

ccr7是表征不同t细胞亚群的关键标志物，其表达可以通过多种因子调节(britschgi等，2008)。为了进一步证明幼稚t细胞、tcm和tem细胞上的ccr7上调，在存在或不存在cb-sc的情况下，采用混合白细胞反应(mlr)。相差显微镜显示，在不存在cb-sc的情况下，显著数量的不同大小的细胞簇在上清液中漂浮(图9a，左图)，但存在cb-sc的情况下则没有(图9a，右图)。这指示cb-sc对t细胞增殖的抑制活性。流式细胞术显示，用cb-sc处理后，cd4⁺和cd8⁺t细胞上的ccr7表达的总体水平增加(图9b)。

进一步分析门控cd4⁺t细胞上的ccr7表达。与cb-sc未处理组(仅响应者或响应者+刺激者)相比，cb-sc处理组(响应者+刺激者+cb-sc或响应者+cb-sc)中幼稚t(cd45ra⁺ccr7⁺)细胞上的ccr7表达的百分比和平均荧光强度(mfi)均增强(图9c，左图)。在cb-sc处理组中tcm细胞(cd45ro⁺ccr7⁺)的百分比增加。相反，在cb-sc处理组中tem细胞(cd45ro⁺ccr7^-)的百分比降低(图9c，右图)。tem细胞(cd45ro⁺ccr7^-)上ccr7表达的平均荧光强度从cb-sc未处理组中的1.85±0.07上调到cb-sc处理组中的2.24±0.01(p=0.017)。

为了进一步确认tem细胞上ccr7的表达上调，应用另一个主要的淋巴结归巢受体cd62l作为用于人tem细胞(cd45ro⁺cd62l^-)的标记物[lefrancois等人，immunol.rev.,vol.211:93–103,(2006)]。用cb-sc处理后，分析门控cd45ro⁺cd62l^-tem细胞上的ccr7表达水平。数据证实，用cb-sc处理后，cd45ro⁺cd62l^-tem细胞上的ccr7表达的平均荧光强度从基线水平1.87±0.04上调至2.09±0.07(p=0.02)。

因此，这些数据显示，可以通过cb-scs的处理调节tem细胞上的ccr7表达。

干细胞生物反应器装置疗法在改善高加索人主体的胰岛β细胞功能中的临床功效

为了测试干细胞生物反应器装置疗法在高加索人t1d主体的代谢控制中的治疗潜力，通过测量空腹血浆c-肽和胰高血糖素刺激的c-肽水平来检查胰岛β细胞功能。在a组主体中，临床结果证实在两例最近发病的t1d主体(即最可能具有残留β细胞群体的那些主体)中，12周时空腹和胰高血糖素刺激的c肽水平的上调(图10a和b)。恢复的空腹和胰高血糖素刺激的c肽水平在主体1中保留通过治疗后56周的最终随访(图10a)。主体2中的胰高血糖素刺激的c肽水平在一年随访期间稳定，而空腹c肽水平略微下降(图10b)。在研究时具有10年t1d的主体3仍然取得了适度的改善，包括空腹c肽从基础时的0.25ng/ml增加至56周时的0.36ng/ml，以及胰高血糖素刺激的c肽水平从基础的0.4ng/ml增加到26周的0.52ng/ml(图10c)。在研究时具有3年t1d的主体4，保持正常的β细胞功能，空腹c肽水平没有随时间显著变化，从基线时的1.05ng/ml到40周时的0.88ng/ml，和胰高血糖素刺激的c肽水平没有随时间显著变化，从基线时的2.18ng/ml到40周时的2.01ng/ml(图10d)。主体5和6在诊断t1d后超过10年显示出一些残留的胰岛β细胞功能。在接受闭环治疗后，主体5中的空腹c肽水平最初从基线时的0.23ng/ml降至26周时的0.14ng/ml，但在40周时增加至0.3ng/ml(图10e)。主体6中的空腹c肽水平最初从基线时的0.26ng/ml下降至26周时的0.09ng/ml，但在40周时提高至0.21ng/ml(图10f)。他们的胰高血糖素刺激的c肽水平显示出与空腹c肽水平相似的趋势。

总之，a组中的参与者(即具有一些残留胰岛β细胞功能的主体)在治疗后56周维持其空腹c肽水平(0.46±0.33ng/ml对于基线时0.52±0.34ng/ml，p=0.78)(表2a和2b)。一致地，胰岛素的中值日剂量(0.37±0.16u/kg体重对比基线时0.38±0.16，p=0.84)和中值糖化血红蛋白(hba1c)(7.8±1.48对比基线时7.6±1.3，p=0.81))治疗后56周后稳定。数据证实，接受闭环治疗后，a组患者中的残留β细胞功能得到挽救和保存，而没有随着t1d的自然病史而显著线性下降。此外，在接受两次sce疗法后，没有残留的胰岛β细胞功能的严重长期b组患者的空腹c肽水平没有观察到变化(表2a和2b)。他们对sce疗法的响应与长期严重的华裔t1d患者中报道的响应明显不同。

此外，在接受两次生物反应器装置疗法后，没有残留胰岛β细胞功能的严重长期b组患者的空腹c肽水平没有观察到变化(表2a和2b以及表3a和3b)。他们对闭环治疗的响应与长期严重的华裔t1d主体中报道的响应明显不同[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)]和[zhaoy.,“stemcelleducatortherapyandinductionofimmunebalance”,currdiabrep.,vol.,12:517-523,(2012)]。需要进一步探索这种差异背后的潜在机制。

克服自身免疫记忆对于消除t1d和其他自身免疫疾病的自身免疫至关重要。所描述的研究证实了采用闭环治疗的双治疗方法的安全性和可行性，其没有显著改变主体免疫系统中不同细胞区室的数量和比例。在接受sce治疗后，这些欧洲背景的高加索人t1d主体的外周血中cd4⁺tem和cd8⁺tem细胞的百分比均显著降低，而cd4⁺tcm似乎受益于闭环治疗。值得注意的是，在闭环治疗后，幼稚t细胞和tcm细胞上的ccr7表达水平显著增加，这通过该离体研究进一步证实。ccr7⁺tcm的百分比以ccr7^-tem为代价增加。这些发现提供了改变t1d中自身免疫记忆区室的方案。

使用血液和淋巴作为导管，幼稚t细胞在次级淋巴组织(slt)之间不断再循环。本研究显示，在接受闭环治疗后，t1d主体中幼稚cd4⁺t细胞的百分比显著增加。在一年的随访期间，总cd4⁺t细胞的数量在外周血中恒定保持。由于大多数t细胞寿命短(3个月)，数据表明幼稚cd4⁺t细胞的扩增表示通过闭环治疗对t1d主体的免疫系统平衡的正常恢复。临床证据证实，慢性炎症或自身免疫疾病(例如，慢性鼻窦炎)中[pant等人，“accumulationofeffectormemorycd8+tcellsinnasalpolyps”,am.j.rhinol.allergy,vol.27(5):117-126,(2013)]和长期t1d主体中[matteucci等人，“alteredproportionsofnaïve,centralmemoryandterminallydifferentiatedcentralmemorysubsetsamongcd4+andcd8+tcellsexpressingcd26inpatientswithtype1diabetes”,j.clin.immunol,vol.31:977-984,(2011)]的tem群体增加。此外，在长期t1d主体中，幼稚t细胞和tcm的百分比和绝对细胞数均减少[matteucci等人，“alteredproportionsofnaïve,centralmemoryandterminallydifferentiatedcentralmemorysubsetsamongcd4+andcd8+tcellsexpressingcd26inpatientswithtype1diabetes”,j.clin.immunol,vol.31:977-984,(2011)]。值得注意的是，本文的临床数据证实，在接受闭环治疗后，这些t1d主体中幼稚cd4⁺t细胞和tcm的百分比均显著增加，但cd4⁺tem和cd8⁺tem下降。因此，数据证实闭环治疗纠正了tem的功能障碍，并有利于长期t1d主体中tcm的分化。不同的是，在t1d试验中，通过使用alefacept疗法(一种使用基因工程化的靶向和删除cd2⁺t细胞的融合蛋白的方法)的新发t1d患者的治疗，cd4⁺tcm和tem连同cd8⁺tcm(但不是cd8⁺tem)一起降低。

实施例3：前瞻性、单臂、开放标签、单中心探索性研究以评估用于治疗t1d患者的不连续治疗方案的安全性、可行性和功效

研究目标

主要目标：评估不连续治疗方案在t1d患者主体的试验组中的安全性。

次要目标

评估t1d患者中不连续治疗的可行性。

评估不连续治疗通过12个月改善t1d患者的β细胞功能的初步功效。

评估不连续治疗后t1d患者中的免疫功能的标志物。

一般研究设计

这是一项前瞻性、单臂、开放标签、单中心探索性研究，旨在评估不连续治疗对t1d患者治疗的安全性、可行性和功效。将招募多达10名符合资格标准的患者。t1d患者将由研究的主要研究者或共同研究者进行评估。将在初次筛选访问时获得知情同意。初始筛选访问将在开始治疗的30天内进行(表4)。第二次筛查访问将在疗法的7天内进行。符合所有标准的主体将被安排接受治疗。所有登记主体的单核细胞将接受包含贴壁uc-sc细胞的生物反应器装置的治疗。在单次单采术中收集单核细胞，其中在第-1天处理10-12l(~1×10¹⁰个单核细胞)的血液。然后，将含有来自每个主体的单核细胞的mnc产物在17小时的时间段内暴露于该装置，以形成干细胞驯化的mnc产物。在第0天，经3-5小时的时间段，将驯化的mnc产物静脉内输注回患者。所有治疗的主体将在第+1天接受电话随访评估，以监测急性不良事件+7±1天。随访将在治疗后第1个月、第3个月、第6个月、第9个月和第12个月(±5天)进行。将指示主体记录每日胰岛素剂量、糖水平和身体活动。在输入驯化的mnc产物后，将由医生监测和调整每日胰岛素剂量。

如前所述制备cb-sc培养物和装置单元[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)]。简要而言，源自健康同种异体供体的人脐带血单位获自fda-登记的cordusecordbloodbank(orlando,fl)。针对hiv1/2、hbsag、hbcag、hcv、hivnat、sts、hbvnat、hcvnat、abscr、htlvi/ii、西尼罗病毒、查加斯病和cmv筛选所有脐带血样品，并且仅将无病原体的脐带血单位用于临床治疗。从新鲜脐带血单位(至少100ml/单位)分离人cb-sc。将50ml管放入支架中。将3ml的histopaque^(r)-1077加入每个管中，(20ml锥形离心管)，并升至室温以分离cb-sc。将3ml全血小心地分层到histopaque^(r)-1077上。在室温下以400×g进行离心30分钟。离心后，抽取上层至含有cb-sc的不透明界面的0.5cm之内。将不透明的界面转移到新的干净的20ml锥形管中。用10ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤细胞。通过混合并以250×g离心数分钟完成洗涤后，弃去上清液，并且再洗涤两次后，将cb-sc重悬于0.5ml等渗磷酸盐缓冲盐水溶液中。产生人cb-sc并将脐带血单核细胞以至少1×10⁶个细胞的密度，25ml/皿铺板于150×15mm皮氏培养皿(bectondickinsonlabware，franklinlakes，nj，未经组织培养处理的培养皿)中的rpmi1640培养基中，并在37℃，8％co2中孵育。将脐带血单核细胞铺板在生物反应器装置中的无血清培养基(lonza，walkersville，md)中，并在37℃，8％co2中孵育约2-3周。观察到cb-sc细胞是圆形的并且进一步验证了在皮氏培养皿底部的附着。制备生长到80％汇合的cb-sc(约1×10⁷个细胞/装置)用于临床试验。所需的内毒素水平为<0.05eu/ml。一个装置将从一个脐带血单位产生，并用于一个主体。

在mnc产物与cb-sc共培养过夜后，收集装置处理的mnc产物并经3小时、4小时或5小时的时间段，静脉内(iv)输注回主体。

主要研究终点

主要研究终点包括治疗相关不良事件的发生。将评估治疗期间发生的(特别是需要暂时或永久停止疗法的那些)以及12个月的随访期发生的不良事件。

次要研究终点(可行性终点)

可行性终点包括无法完成不连续治疗的患者数量以及在12个月随访前失访的患者数量。

将记录中断疗法的任何非不良事件相关原因(例如，装置的技术问题)。

次要研究终点(功效终点)

功效终点包括：

•在3小时混合膳食耐受性试验(mmtt)的前2小时内c肽曲线下面积(auc)，以及12个月时auc的评估和随时间的变化；

•评估3小时mmtt的峰值c肽水平，12个月时的峰值c肽水平和随时间的变化；

•评估12个月时基础c肽水平和随时间的变化；

•评估每日胰岛素需求；

•评估hba1c水平随时间的变化；和

•评估自身抗体水平随时间的变化。

次要研究终点(探索性终点)

探索性终点包括基线、1、3、6、9和12个月的常规免疫细胞标志物的测量，和基线、1、3、6、9和12个月的记忆t细胞标志物的流式细胞术。用于测试的血液样本将被运送到位于barbaradaviscenterfordiabetes,schoolofmedicine,universityofcolorado的nih/niddk指定的northamericanautoantibody/hlacorelaboratory。

主体选择和退出

此研究将招募总共10名符合以下资格标准的主体：

纳入标准

1)成人患者(≥18岁)。

2)必须具有基于2015年美国糖尿病协会对糖尿病的澄清和诊断标准的1型糖尿病的诊断。

3)必须进行血液测试，其确认至少一种针对胰岛β细胞的自身抗体(ica，iaa，ia2，gad65，znt8)的存在。

4)空腹c肽水平>0.3ng/ml。

5)用于单采术的足够的静脉通路。

6)提供知情同意的能力。

7)必须同意遵守所有研究要求并愿意完成所有的研究访问。

排除标准

符合以下任何标准的潜在主体将被排除在参与之外：

1)ast或alt2>x正常上限。

2)肌酸酐>2.0mg/dl。

3)已知的冠状动脉疾病或ekg提示冠状动脉疾病，除非获得心脏病专家的心脏许可(cardiacclearance)。

4)已知的主动感染。

5)怀孕或哺乳的母亲。

6)在登记的一个月内使用免疫抑制药物治疗，包括但不限于泼尼松、环孢菌素、他克莫司、西罗莫司和化疗。

1)存在任何其他自身免疫疾病(狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等)。

2)除乙酰水杨酸(asa)外的抗凝血。

3)血红蛋白<10g/dl或血小板<100k/ml。

4)无法或不愿意提供知情同意。

5)存在研究者认为将妨碍参与的任何其他身体或心理的医学病症。

主体招募和筛选

如果已经获得主体同意参加临床试验，则将进行满足上述纳入或排除标准所必需的诊断测试。筛选要求清单将包括定期血细胞计数分析，血液检测以确认至少一种针对胰岛β细胞的自身抗体的存在，以及其他相关检测以排除临床上显著的肝脏、肾脏或心脏病；怀孕；免疫抑制药物治疗；病毒性疾病；或与人类免疫缺陷病毒(hiv)相关的疾病。

主体的提前退出

预计对患者的风险很小且类似于标准的单采术程序。返回患者的细胞是将由cb-sc处理(或驯化)的自体细胞。在这项研究中，患者可能会退出此方案：

•如果患者对sce处理的细胞发生某种类型的过敏或超敏反应，妨碍产物的输注。

•如果技术困难妨碍完成单采术。

•如果患者不想完成所需的治疗后随访测试。

参加本试验对所有主体都是自愿的。如果主体决定不参加，主体可以随时自行撤回其同意并中断参与，而不会影响他们未来在医疗保健机构的护理。在患者因上述或任何其他意外原因而退出的情况下，将允许他们继续接受治疗相关问题的医疗护理。

退出主体的数据收集和随访

即使主体可提前退出研究，也必须在随后12周收集毒性数据。我们将使用所有可能的方法(例如，主体的电话号码，（如果可能）hippa表格中列出的直系亲属的电话，挂号信等)，以确认主体确实失访。如果患者在其12个月的随访之前退出研究，将进行替代患者的登记。

学习装置

作为连续闭环系统的一部分，已经描述了用于共同培养淋巴细胞和cb-sc的腔室(160x160x200cm)[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)]和t2d[zhaoy.等人，“targetinginsulinresistanceintype2diabetesviaimmunemodulationofcordblood-derivedmultipotentstemcells(cb-scs)instemcelleducatortherapy:phasei/iiclinicaltrial”,bmcmed.,vol.11:160,(2013)]，这项探索性研究将使用不连续的系统，即从主体获得的全血样本将被送到处理设施，处理设施将准备驯化的mnc产物，并且一旦驯化的mnc产物符合发布标准，将驯化的mnc产物运回临床设施以输注到主体体内。

每个生物反应器装置将在class100k洁净室中设计，制造，组装和包装。在通过γ-辐射(铯-137)灭菌后，每个装置将在室温下储存在class100k洁净室的暗柜中，其为fda批准的用于细胞分离和培养的设施。用于生产该装置的材料根据美国药典被fda批准用于体内使用(即，等级vi级塑料)。灭菌装置是一次性使用的。cb-sc由一个脐带血单位产生，用于一个主体应用。cb-sc由于其独特的附着能力而保留在装置内部[zhaoy.等人，“reversaloftype1diabetesviaisletβ-cellregenerationfollowingimmunemodulationbycordblood-derivedmultipotentstemcells”,bmcmed.,vol.10(3),1-11,(2012)]。

治疗方案

将安排符合所有标准的主体通过以下不连续方法治疗。对每个主体收集全血样品，并通过单采术收集单核细胞；在第-1天处理10-12l(~1×10¹⁰个单核细胞)的血液。将单核细胞制剂运送到cgmp处理设施。在处理设施中，经17小时的时间段，将单核细胞制剂引入含有贴壁uc-sc细胞的生物反应器装置中。对驯化的单核细胞产物进行无菌性、存活力和纯度测试；一旦满足释放标准，处理设施将把驯化的单核细胞产物送到临床设施。在第0天，将产物静脉内输注回患者。所有治疗的主体将在第+1天接受电话随访评估，以监测急性不良事件。所有治疗的主体将在+7±1天参加安全性访问。随访将在治疗后第1个月、第3个月、第6个月、第9个月和第12个月(±5天)进行，如图11中所示。将指示主体记录每日胰岛素剂量、糖水平和身体活动。在治疗后，将由其自己的医生监测和调整患者的每日胰岛素剂量。

将主体分配到治疗组的方法

基于作为胰岛β细胞功能的指标的空腹c肽水平(胰岛素生物合成的副产物，正常参考范围0.8-3.1ng/ml)，所有参与者将被表征并被指派为具有中度t1d和一些残留β细胞功能(空腹c肽水平≥0.3ng/ml，n=10)的一组。每位参与者将接受一次治疗。

研究装置的制备和使用

通过cgmp处理设施中的单核细胞和cb-sc的过夜共培养，将包含贴壁uc-sc细胞的生物反应器装置用于处理mnc制备物的应用延长至17小时。制备和使用sce装置的方案如按照图12a-c中的图表的以下步骤所示，并如下所述。

步骤1：收集人脐带血单位

来自健康供体的人脐带血单位将由fda-登记的cord:usecordbloodbankinc.提供。根据监管机构的要求，针对传染病筛查所有脐带血样本。

步骤2：在装置中制备cb-sc

在将cb-sc引入装置之前，根据以下方案，从新鲜脐带血单位(至少100ml/单位)中分离脐带血单核细胞：

1)取50ml管并放入支架：通常使用4管；

2)以20ml/管，将histopaque®-1077加入每个管中以分离单核细胞；

3)将单核细胞以1×10⁶个细胞，25-30ml/皿接种于装置(tianhestemcellbiotechnologisinc.)中的无血清培养基中；

4)将细胞在37℃，8％co2条件下孵育10~20天；

5)细胞观察：cb-sc呈圆形并附着在培养皿的底部。如果细胞密度达到至少80％汇合，则可以准备cb-sc用于临床应用。

步骤3：测试cb-sc培养物的内毒素和革兰氏染色

内毒素测试

将来自cb-sc培养物的上清液收集到1.8ml灭菌管中。通过使用endosafe-pts便携式测试系统(charlesriver，charleston，sc)和endosafe许可的pts内毒素盒(0.05eu/ml灵敏度，fisherscientific)测试内毒素。标准内毒素水平为<0.5eu/ml。只有符合此标准的sce装置才能用于临床试验。

革兰氏染色

将来自cb-sc培养物的上清液收集到1.8ml灭菌管中。革兰氏染色将使用革兰氏染色试剂盒(bddiagnosticsystems,sparks,md)进行。只有负染色的装置才能用于临床试验。将测试样本以如下方式施加到干净的载玻片上，该方式将产生来自cb-sc培养物的上清液的薄且均匀的涂片。使涂片风干。使用以下技术之一将涂片固定在载玻片上。

使载玻片通过低火2-3次进行热固定。在染色之前将载玻片冷却至室温。或者，通过用无水甲醇浸泡1-2分钟固定载玻片并在染色前用自来水冲洗。

测试程序

革兰氏染色的测试程序如下：

•用初级染色剂(革兰氏结晶紫)浸泡固定涂片并染色1分钟。

•通过用冷自来水轻轻洗涤除去初级染色剂。

•用媒染剂(革兰氏碘或稳定的革兰氏碘)浸泡载玻片并在载玻片上保留1分钟。

•通过用自来水轻轻洗涤除去媒染剂。

•将媒染剂脱色(革兰氏脱色剂)，直到从载玻片流出的溶剂是无色的(3-60秒)。

•将载玻片在冷自来水中轻轻洗涤。

•用复染剂(革兰氏番红或革兰氏碱性品红)浸泡载玻片并染色30-60秒。

•用冷自来水洗涤载玻片。

•用吸水纸或纸巾吸干载玻片或使其风干。

•在油浸镜头下检查涂片。

步骤4：制备生物反应器装置

通过执行以下步骤在处理设施中制备所述装置：

1)在用于制备所述装置的gmp设施中对罩进行消毒；

2)用70％乙醇纱布清洁装置侧面，并小心地取下所有盖子；

3)丢弃装置内的所有上清液；

4)以20ml/层向每层加入生理盐水，洗涤每层，并去除所有漂浮的细胞和碎片；

5)用生理盐水(20ml/层)的另外洗涤；

6)从顶部和底部取下盖子，替换为plastisolhorseshoey连接器，并用medicaldevicesuperglue密封(这些胶水符合用于医疗装置的usp6级标准)；

7)以15-20ml/层向每层加入生理盐水，并用盖子密封；

8)转动设备并检查泄漏；

9)放入灭菌容器中。

步骤5：通过进入包含cb-sc的贴壁单层的装置，共培养单核细胞产物

1)在第-1天，患者将在临床设施中通过单采术进行稳态单核收集，其中最佳目标是处理10-12l(~10¹⁰个单核细胞)的血液。基于耐受性和静脉通路，可以在达到目标之前停止单采术。需要处理至少6升以继续下一阶段。在单采术结束时，将血浆加入收集袋中，以产生250ml的产物体积。根据血液和骨髓移植计划标记政策，在将产物与供体断开之前，对产物进行标记。

2)产物将由gmp设施根据血液和骨髓移植计划sop进行包装，储存和接收。

3)一旦到达gmp设施，gmp设施将把mnc产物暴露至设备。

4)根据血液和骨髓移植程序细胞输注sop，在第0天，将驯化的单核细胞(mnc)产物输注给患者。

收到研究治疗用品后，必须进行清点并填写设备收据日志，并由接收货物的人签字。重要的是，指定的研究者计数并验证货物包含货物清单中记录的所有物品。在给定的货物中任何损坏或无法使用的研究装置将记录在研究文件中。研究者必须将提供至研究者所在地的任何损坏或无法使用的研究治疗通知研究主办者。

将这些装置在室温下储存在适合细胞培养物的gmp设施的暗柜中。没有避光的需要。存储注意事项包括避免丢弃设备或将重物放在设备顶部。

所有空装置(没有干细胞)都具有相同的质量。任何单个装置都将分配给任何单个主体并分发。

唯一的标准是在装置中培养的cb-sc的质量。如果细胞密度达到≥80％的汇合，内毒素水平<0.5eu/ml，则可将具有cb-sc的装置分配给主体并准备用于临床应用。进行常规研究装置核对以记录装置分配、使用的装置、剩余装置和无意中损坏的装置。将此核对记录在装置责任表上，并由研究团队签名并注明日期。

根据机构生物危害废物处置sop，在治疗结束时丢弃设备。在研究完成后，将对运送的装置、消耗的装置和剩余的装置进行最终核对。将此核对记录在装置核对表上，并签名并注明日期。在退回或销毁未使用的研究装置之前，将对所发现的任何差异进行调查，解决和记录。现场销毁的任何设备都将记录在研究文件中。

步骤6：测试经处理的mnc产物(下文称为最终产物)的内毒素、革兰氏染色、支原体和干细胞标记物

内毒素检测

将来自cb-sc处理的mnc的样品收集到1.8ml灭菌管中。通过使用endosafe-pts便携式测试系统(charlesriver，charleston，sc)和endosafe许可的pts内毒素盒(0.05eu/ml灵敏度，fisherscientific)测试内毒素。按照pts仪器上的简单提示进行常规ptslal测定。以下代表典型的测定程序：

仪器操作

•按下pts键盘上的菜单键以打开仪器(菜单5关闭仪器)。

•pts读取器在加热至37℃时启动“系统自检”-这需要大约5分钟。

•pts读取器显示“自检良好”，且然后显示“插入药盒”。

样本插入

•插入药盒。

•使用前，让药盒在袋中达到室温。

•从袋中取出药盒，使样品池朝上插入pts读取器前面的插槽。

•将药盒牢牢按入插槽。

输入所需的信息

•一旦将药盒牢固地插入pts读取器后，pts读取器提示用户输入以下信息：

•输入oid(操作员id)。

•输入批号＃(药盒批号＃)。

•输入校准代码(如果已输入特定批次＃的校准代码，则pts读取器不再提示输入代码。(要删除所有存储的批次＃和相应的校准代码，请选择菜单，2，然后从初始菜单中选择4)。

批号＃(确认输入的药盒批号)

•输入样品批次＃。

•输入样品id(使用样品id标题下的菜单键进行选择和滚动，可以输入和存储五十(50)个样品)。

•输入稀释因子。

•在将上述信息输入pts读取器时，正在预热药盒。

分配样品

•一旦输入所有测试信息，pts读取器将显示：

•添加样本；按回车键。

•将25μl样品移液到插入药盒的所有四(4)个样品储槽中，并且然后按pts读取器键盘上的回车键。

•泵将样品等分试样吸入测试通道，从而启动测试。

•结果将在大约15分钟内获得。测试完成时，pts读取器给出测定结束的声音通知。在测试结束时，内毒素测量值和测定验收标准显示在屏幕上。

标准内毒素水平为<0.5eu/ml。只有符合此标准的最终产物才能用于临床输注。

革兰氏染色

将来自cb-sc培养物的上清液收集到1.8ml灭菌管中。革兰氏染色将使用革兰氏染色试剂盒(bddiagnosticsystems,sparks,md)进行。只有负染色的装置才能用于临床试验。这通过如下完成：将测试样本以如下方式施加到干净的载玻片上，该方式将产生来自cb-sc培养物的上清液的薄且均匀的涂片。使涂片风干。使用以下技术之一将涂片固定在载玻片上。

将载玻片通过低火焰2-3次进行热固定。在染色之前将载玻片冷却至室温。或者，通过用绝对甲醇浸泡1-2分钟固定载玻片并在染色前用自来水冲洗。

测试程序

革兰氏染色的测试程序如下：

•用初级染色剂(革兰氏结晶紫)浸泡固定涂片并染色1分钟。

•通过用冷自来水轻轻洗涤除去初级染色剂。

•用媒染剂(革兰氏碘或稳定的革兰氏碘)浸泡载玻片并在载玻片上保留1分钟。

•通过用自来水轻轻洗涤除去媒染剂。

•脱色(革兰氏脱色剂)，直到从载玻片流出的溶剂是无色的(3-60秒)。

•将载玻片在冷自来水中轻轻洗涤。

•用复染剂(革兰氏番红或革兰氏碱性品红)浸泡载玻片并染色30-60秒。

•用冷自来水洗涤载玻片。

•用吸水纸或纸巾吸干或使其风干。

•在油浸镜头下检查涂片。

检测支原体、细胞存活力和无菌性

可通过以下方法评估来自cb-sc处理的mnc的样品中的无菌性和支原体污染。

对于常规细胞培养物，可以在相差显微镜下监测细胞存活力，以排除支原体和其他细菌的污染。

或者，通过排除吸收插入dna染料7-氨基放线菌素d(7aad)的垂死细胞来确定细胞存活力[brocklebanka.m.等人，“enumerationofcd34+cellsincordblood:avariationonasingle-platformflowcytometricmethodbasedontheishagegatingstrategy”,cytometry.vol.46:254-261,(2001)]；[barnettd,等人，“absolutecd4+t-lymphocyteandcd34+stemcellcountsbysingle-platformflowcytometry:thewayforward”,br.jhaematol.vol.106:1059-1062,(1999)]；[sutherland,等人，“theishageguidelinesforcd34+celldeterminationbyflowcytometry.internationalsocietyofhematotherapyandgraftengineering”,jhematotherapy.vol.5:213-226,(1996)]和美国专利号4,520,110；4,859,582；5,055,556；欧洲专利号76.695；加拿大专利号1,179,942(pe,apc)；美国专利号4,876,190(percp)；美国专利号5,286,486；5,486,616；5,569,587；5,569,766；5,627,027(cy)；美国专利号4,714,680；4,965,204,5,035,994(cd34)；美国专利号5,776,709(裂解/无洗涤方法)；美国专利号5,723,218和5,187,288(trucount管)，其各自的内容以其整体通过引用并入本文。

实时pcr：将来自驯化的mnc产物的样品收集到1.8ml灭菌管中，并按照usfdagoodlaboratorypracticeregulations(21cfr58).3).的要求由bioreliance(rockville,md)进行测试。

将通过使用直接接种方法在bioreliancecompany进行无菌性测试。

通过流式细胞术测试干细胞标志物cd45和oct3/4

为了排除cb-sc对驯化的mnc产物的污染，进行对cb-sc标记物cd45和oct3/4双重染色的流式细胞术。

主体顺应性监测

主体将接受生物反应器装置的一次治疗。如前所述，在治疗后1、3、6、9和12个月(±5天)安排随访，以进行临床评估和实验室检查。在细胞输注后次日进行电话随访。

在先和伴随治疗

所有t1d主体应在研究之前或期间接受其每日胰岛素注射。在不连续治疗后，由主体自己的医生而不是研究pi调整每日胰岛素剂量。在本研究期间，不允许使用其他新的糖尿病药物或疗法。

包装

生物反应器装置将包装在盒中(4台装置/盒)，并通过良好生产规范(gmp)标签系统运送到cgmp设施。

在使用该装置处理后，驯化的mnc产物将在消毒冷却器中运送到临床位点。对每个主体使用一台含有来自一个脐带血单位的cb-sc的装置。

设盲

在这项单臂研究中，从所有主体获得并富集的mnc产物接受使用该装置的开放标签处理。

研究程序-访问1

登记筛选：

首先，根据不连续治疗的纳入标准和排除标准，对所有同意的主体进行登记筛选。如果患者符合美国糖尿病协会的2015年诊断标准并且血液检查确认至少一种针对胰岛β细胞本身的自身抗体的存在，则他们将有资格登记。

使用不同的免疫细胞标记物的完全血细胞计数(cbc)。

ekg。

按照血液和骨髓移植计划sop进行静脉评估。没有足够静脉通路的患者将被推荐能够维持单采术流速的中心静脉导管放置。导管放置将在单采术程序前不早于5天进行，并且在输注驯化的mnc产物后移除。

将进行针对胰岛细胞胞浆(ica)、胰岛素自身抗体(iaa)、胰岛素瘤相关抗原-2(ia2)、谷氨酸脱羧酶(gad)和胰腺β细胞特异性锌转运蛋白znt8的自身抗体的存在(见表4)的具体测试。

将进行传染病检测(hiv、htlv、hepb、cab、hepcab)。

将按照机构sop进行静脉评估。

混合膳食耐受性测试(mmtt)：mmtt测试应该在早晨在主体空腹时进行。除水外，主体在午夜后不吃任何东西(npo)。可使用仅含有单糖的液体来治疗或预防研究前夜间和早晨的低血糖。对于患有t1dm的主体，在测试开始时的目标葡萄糖水平应该在70和200mg/dl之间。

胰岛素应用：患有t1dm的主体应在测试前一晚服用其常用剂量的胰岛素。使用lantus®或levemir®的主体应按照其正常程序在试验前一晚和/或试验的早晨进行常规注射。接受连续皮下胰岛素输注(csii)的主体应在测试前的晚上继续其通常的基础设置。常用剂量的速效胰岛素类似物将使用直到在测试前一晚的午夜。如果需要在研究开始时达到<150mg/dl的血糖水平，也可以使用小的校正剂量的速效胰岛素类似物直到测试前4小时。在试验的早晨，不给予通常剂量的中性鱼精蛋白锌胰岛素(nph)人胰岛素(rdna来源)和速效胰岛素类似物。

血液采样：在-10、0、15、30、60、90、120、150和180分钟时，将获得血液用于测量血浆葡萄糖、c-肽和胰高血糖素。还将收集用于质量控制的拆分重复样品。在一个手臂插入iv线用于血液采样。

强化剂量：使用的混合膳食将是boosthighproteinnutritionalenergydrink®(mead-johnson)。

mmtt将需要进行180分钟。boosthighproteinnutritionalenergydrink®(mead-johnson)混合膳食的剂量为6kcal/kg(于1kcal/ml=6ml/kg)，在0分钟时给予。剂量应在不超过5分钟内服用。

研究程序-访问2

十名参与者将接受使用包含贴壁uc-sc细胞的生物反应器的单次治疗。

研究程序-访问3

根据表4，在治疗后1个月(±5天)安排随访1，用于临床评估(例如，空腹血糖、c-肽和hba1c)和实验室测试。

研究程序-访问4

根据表4，在治疗后3个月(±5天)安排随访2，用于临床评估(例如，空腹血糖、c-肽和hba1c)和实验室测试。

研究程序-访问5

根据表4，在治疗后6个月(±5天)安排随访3，用于临床评估(例如，空腹血糖、c-肽和hba1c)和实验室测试。

研究程序-访问6

根据表4，在治疗后9个月(±5天)安排随访4，用于临床评估(例如，空腹血糖、c-肽和hba1c；75g-ogtt和mmtt后的c-肽水平)和实验室测试。

研究程序-访问7

根据表4，在治疗后12个月(±5天)安排随访5，用于临床评估和实验室测试。

统计学计划

统计方法

将使用意向治疗方法，其中10名患者接受使用不连续方案的治疗。所有患者都将被纳入安全性分析。

主要功效终点是基线和随访之间c肽分泌的变化。数据的统计分析将使用powerandprecision软件(www.power-analysis.com)通过t检验进行。配对t检验将用于研究基线和随访之间的显著性。使用空腹血糖水平和血浆c肽，及其在口服葡萄糖耐量试验(ogtt)或mmtt后的水平作为参数，我们希望在以0.8ng/ml的效应量、2.5％显著性水平、80％功效(power)、单侧的sce治疗后检测到差异。根据我们的计算，我们需要10名主体以找到这种差异。

用于分析的主体群体

所有符合协议的主体群体都将包含在安全性分析中。主要功效终点是基线和随访之间c肽分泌的变化。

安全性和不良事件-定义

任何符合所有以下标准的事件、经历或结果：

•性质、严重性或频率中的意外(即未描述于研究相关文件中，如irb批准的方案或知情同意书、研究者手册等)。

•与参与研究相关或可能相关(即可能相关的途径，存在意外事件经历或结果可能是由研究中涉及的程序引起的合理可能性)。

•严重(如下文定义)“严重”与对ae应用等级的ctc标准中报告的“严重”不同。

不良事件

不良事件(ae)是在研究过程中严重性发展或恶化的任何症状、体征、疾病或经历。并发疾病或伤害应被视为不良事件。诊断程序的异常结果被认为是不良事件，如果所述异常：

•导致退出研究。

•与严重不良事件相关。

•与临床体征或症状相关。

•导致额外治疗或进一步诊断测试。

•研究者认为具有临床意义。

严重不良事件

不良事件被分类为严重或非严重。严重不良事件是指如下的任何不良事件：

•致命。

•危及生命。

•需要或延长住院时间。

•导致持续或严重残疾或丧失能力。

•先天性异常或出生缺陷。

•重要的医疗事件。

重要的医疗事件是可能不会立即危及生命，但显然具有重大临床意义的事件。它们可能会危害该主体，并可能需要进行干预以防止上述其他严重后果之一。例如，药物过量或滥用，不导致住院患者住院治疗的突然发作，或急诊科的支气管痉挛强化治疗通常被认为是严重的。所有不符合任何严重标准的不良事件均应视为非严重不良事件。

不良事件报告期

必须报告不良事件的研究期通常定义为从开始任何研究程序到研究治疗随访结束的时间段。对于该研究，研究治疗随访定义为在研究治疗施用后30天。严重不良事件应在事件时间起7-10天内向当地irb和fda报告。次要事件可以在年度报告中报告。

预先存在的病况

预先存在的病况是在研究开始时存在的病况。如果在研究期间病况的频率、强度或特征恶化，则应将预先存在的病况记录为不良事件。

一般体检发现

筛查时，任何临床上显著的异常都应记录为预先存在的病况。在研究结束时，任何符合不良事件定义的新的临床显著发现/异常也必须作为不良事件记录并记载。

研究后不良事件

研究者应追踪所有未解决的不良事件，直至事件得到解决，主体失访，或以其他方式解释不良事件。在最后一次预定的访问中，研究者应指示每个主体报告主体或主体的私人医生认为可能合理地与参与本研究相关的任何后续事件。研究者应在主体中断或终止研究参与后，通知研究主办者在任何时间发生(在6个月的随访期间)的可能合理地与本研究相关的任何死亡或不良事件。如果研究者了解到参与本研究的主体发生癌症或随后怀孕的后代的先天性异常，也应通知主办者。

异常实验室值

如果满足以下任一条件，则应将临床实验室异常记录为不良事件：

•实验室异常没有另外被确认异常的重复测试驳倒。

•异常表明疾病和/或器官毒性。

•异常处于需要积极管理；例如改变剂量、停药、更频繁的随访评估、进一步的诊断调查等的程度。

住院、延长住院或手术

除非本协议另有明确规定，否则任何导致住院或延长住院的不良事件均应记录并报告为严重不良事件。如果病况符合不良事件的标准，则任何促成手术的病况都应记录为不良事件。在下列情况下，病况、住院、延长住院、手术均不报告为不良事件：

•用于预先存在的病况的诊断或选择外科手术的住院或延长住院。手术不应该被报告为不良事件，如果存在。

•手术的目的是选择性或诊断性，并且结果是无事的。

•需要住院或延长住院以进行研究的功效测量。

•住院或延长住院用于治疗本研究的目标疾病，除非临床研究者判断入院频率恶化或增加。

记录不良事件

在使用生物反应器装置的闭环治疗和治疗后4年的随访研究期间未见显著的不良事件。基于200名主体中的临床数据，包括华裔和高加索人患者。在治疗过程中，没有参与者经历任何重大不良事件。大多数患者在静脉穿刺期间经历轻度不适并且在单采术期间经历一些手臂酸痛，但不适和酸痛在手术结束后迅速消退。在接受闭环治疗后4年，所有主体均无肿瘤形成和其他安全问题。

在与主体的每次接触中，研究者必须通过特定的询问并且(在适当的情况下)通过检查来寻求关于不良事件的信息。所有不良事件的信息应立即记录在源文件中，并且也应记录在病例报告表(crf)的恰当不良事件模块中。所有明显相关的体征、症状和异常诊断程序结果应记录在源文件中，但应分组在一个诊断下。

必须记录研究期间发生的所有不良事件。应追踪每个事件的临床过程，直至解决，稳定，或直到确定研究治疗或参与不是原因。必须跟进研究期结束时仍在进行的严重不良事件，以确定最终结果。应被记录并立即报告研究期后发生，并被认为可能与研究治疗或研究参与相关的任何严重不良事件。

严重不良事件和意外问题的报告

研究者和协议主办者必须遵守他们所负责的各种实体的不良事件报告时间表、格式和要求，但至少必须报告的事件是如下的那些：

•与研究参与相关，

•预想不到的，和

•严重或涉及主体或其他方面的风险。

如果报告作为叙述提供，则在初始报告时提供的最低必要信息包括：

•研究标识符。

•研究中心。

•主体编号。

•事件的描述。

•发病日期。

•当前状态。

•是否中断研究治疗。

•该事件被归类为严重的原因。

•研究者评估事件与研究治疗之间的关联。

研究者报告：通知研究主办者

任何与研究相关的对主体或他人构成伤害风险的意外问题，以及任何类型的严重不良事件，必须在事件发生24小时内通过电话向研究主办者报告。为了报告此类事件，必须由研究者填写严重不良事件(sae)表格，并在24小时内传真给研究主办者。研究者将在研究现场存档此sae表格的副本。

在随后48小时内，研究者必须以书面叙述形式提供关于严重不良事件或意外问题的进一步信息。这应包括已完成的严重不良事件表格的副本，以及有助于理解事件的任何其他诊断信息。应立即向研究主办者提供关于正在发生的严重不良事件的重要新信息。

研究者报告

对于可报告的死亡，可以通过联系irb主任或副主任向irb提交初始申请。作为初始提交的后续行动，需要ae/意外问题表。

其他可报告事件：

对于临床药物试验，以下事件也可向irb报告：

•任何不良体验，即使没有详细分析，其也代表了严重的意外不良事件，这种事件在没有药物暴露的情况下是罕见的(例如粒细胞缺乏症、肝坏死、stevens-johnson综合征)。

•任何可能导致主办者修改研究者手册、协议或知情同意书，或促使irb采取其他行动以确保对人类主体的保护的不良事件。

•在严重性或频率方面表明研究风险或潜在利益发生变化的信息。例如：

-中期分析表明，参与者具有低于最初预期的对治疗的响应率。

-安全监测表明特定的副作用比最初预期的更严重或更频繁。

-另一项研究发表的论文显示你的研究的一部分没有治疗价值。

•研究方案中使用的药物、装置或生物制品的fda安全标签改变或退市。

•违反保密规定。

•未经前置irb审查而进行协议改变，以消除对研究参与者的明显直接危害。

•当研究此前没有得到依据c部分的批准，并且研究者认为主体最好保留进行研究时，对参与者的监禁。

•当投诉表明意外风险或投诉无法由研究团队解决时，参与者的投诉。

•违反协议(意味着意外或无意偏离irb批准的协议)，即研究者认为其使一个或多个参与者处于增加的风险之下，或影响主体的权利或福利。

不隶属于临床设施研究站点的研究者负责向其当地irb进行安全性报告。研究者有责任遵守其当地irb的报告要求，但必须在不迟于10个工作日向其irb提交所需的报告。irb通知和收据的每份报告和文件的副本将保存在研究者的研究文件中。

主办者报告：通知fda

如果本协议是根据fdaind进行的，则研究监管主办者(即ind持有者)有责任向fda报告某些不良事件或意外问题。

研究主办者需要以加急方式向fda报告某些研究事件。这些不良事件的书面通知称为ind安全性报告。以下描述了报告时间表和相关事件类型的安全性报告要求：

•在7个自然日内

任何研究事件，其：

-与研究药物的使用相关联

-意外的，

-致命或危及生命，和

•在15个自然日内

任何研究事件，其：

-与研究药物的使用相关，

-意外的，和

-严重的，但不致命或危及生命，或-

-之前的不良事件，即最初未被视为可报告但后来发现符合报告标准(在事件被视为可报告后的15个自然日内报告)。

从实验室动物的测试的任何发现，其：

-表明对人类主体的重大风险，包括致突变性、致畸性或致癌性的报告。

主办者还需要在ind安全性报告中鉴定与类似不良事件相关的所有先前报告，并根据先前报告分析当前事件的重要性。

报告流程

不良事件可以在fda表格3500a上或以叙述形式提交。如果以叙述形式提供，则提供的最小信息如上所述。

主办者报告：通知参与的研究者

研究有责任在书面的ind安全性报告中通知所有参与的研究者与药物使用相关的任何严重和意外相关的不良事件，以及实验室动物的试验的任何表明对人类主体的重大风险的发现。此外，主办者还需要在ind安全性报告中鉴定关于类似不良事件的所有先前报告，并根据先前报告分析当前事件的重要性。

揭盲程序

如果对于主体的医疗管理至关重要，可因严重和意外事件而打破盲态，或者可提供关于治疗的关键安全性信息，其可以对正在进行的试验具有影响(例如，监测，知情同意)。在那些被认为必要的罕见情况下，必须采取措施来揭示相关患者的治疗分配。要报告此类事件，必须填写严重不良事件(sae)表格。为此，研究者必须告知主办者其治疗未混合的所有主体。揭盲将是每周7天，每天24小时；在24小时内通过电话或传真通知主办者，然后在48小时内书面叙述事件。

停止规则

在这项单臂研究中，其中所有患者将接受一个剂量的相同实验治疗，评估治疗安全性和功效。因此，如果主要安全性终点和功效终点已经实现，和/或确认治疗安全且有效，则可以通过停止规则来终止该试验的进行，该规则规定了试验将结束的环境以及随后将采取的行动。

医疗监测

首席研究员有责任在他/她的地点监督研究的安全性。这种安全性监测将包括如上所述的不良事件的仔细评估和适当报告，以及现场数据和安全性监测计划的构建和实施(见审计，监测和检查)。医疗监测将包括定期评估严重不良事件的数量和类型。

内部数据和安全性监测委员会或dsmp

新协议的初步审查在于由机构审查委员会(irb)审查新的试验，以确保每项试验，无论主办或支持，都包含适当的数据和安全性监测计划。数据和安全性监测委员会(dsmb)负责监测临床设施研究者编写的所有研究者发起的试验(iit)，无论联邦、机构或行业支持如何。这包括单点iit，以及由临床设施研究者协调的多中心iit和主要研究者的数据管理和现场协调，并包括在该设施进行的所有临床试验阶段。临床设施的dsmb成员为临床医生、生物统计学家、生物伦理学家和研究科学家。在适当情况下，建议使用外部/独立dsmb进行试验(例如，高风险，多中心)。

一旦确定试验适合由内部dsmb进行监测，dsmb就有责任继续审查和监测研究。我们的dsmb审查和监督已写入irb批准的用于此类试验的协议。dsmb通过揭盲分析审查以下信息，提供研究进度和安全性的监督：

•1)累计率和累计保留。

•2)不良事件(ae)和严重不良事件(sae)的频率和严重性。

•3)响应率，在适当的情况下。

•4)与试验相关的新信息，即公布的科学报告或可能影响主体安全性或伦理问题的其他发展。

•5)将影响其持续性的研究的预期风险/收益比率的任何变化。

•6)协议偏差和违规。

•7)与任何研究者或研究人员的严重错误或潜在不当行为相关的事项，即违反保密规定、研究舞弊。

•8)主体投诉。

•9)利益冲突。

dsmb审查试验时间表在研究开始时经irb批准确定。协议所需的dsmb审查频率(即6个月，每年)由prms管理员记录并跟踪，以便在计划的dsmb会议之前从研究团队索取适当的dsmb提交文档。向首席研究员(pi)和临床研究协调员(crc)提供表格用于向dsmb提交所需文件。

数据处理和记录保存

保密

关于研究主体的信息将根据1996年的healthinsuranceportabilityandaccountabilityact(hipaa)的要求进行保密和管理。这些法规要求签署的主体授权通知主体以下内容：

•谁可以访问该信息以及原因。

•谁将使用或公开该信息。

•研究主体撤销其使用其phi的授权的权利。

在主体撤销收集或使用phi的授权的情况下，研究者通过法规保留使用在撤销主体授权之前收集的所有信息的能力。对于已经撤销对于收集或使用phi的授权的主体，应尝试获得在其安排的研究期结束时至少收集至关重要状态(即主体存活)的许可。

源文件

源数据是重建和评估试验所必需的临床试验中的所有信息、临床发现的原始记录、观察结果或其他活动。源数据包含在源文件中。这些原始文件和数据记录的示例包括：医院记录、临床和办公室图表、实验室记录、备忘录、主体日记或评估清单、药房配药记录、自动化仪器记录的数据、经过验证认证为准确且完整的复印件或抄本、微缩胶片、照相底片、缩微胶卷或磁性介质、x光片、主体文件和记录，其保存在药房、实验室和参与临床试验的医疗技术部门。

病例报告表

研究案例报告表(crf)是用于该研究的主要数据收集工具。必须记录crf上要求的所有数据。必须解释所有缺失的数据。如果由于未执行过程或未询问问题而将crf上的空格留空，请写入“n/d”。如果该项目不适用于个案，请写入“n/a”。所有项目应以黑色墨水清晰打印。如果出现任何输入错误，要纠正此类错误，请绘制穿过错误输入的一条直线并在其上方输入正确的数据。所有这些改变必须签名并注明日期。不要擦掉或用修正液遮盖错误。要澄清难以辨认或不确定的条目，请在项目上方打印说明，然后对其进行签名并注明日期。

记录保留

研究者有责任在最近批准其国家的上市申请后至少2年保留研究必要文件，且直到在其国家没有待决或预期的上市申请，或自研究产物的临床研发正式中断已过去至少2年。如果与主办者达成协议，这些文件应保留更长的时间。在这种情况下，主办者有责任告知研究者/机构何时不再需要保留这些文件。

研究监测、审计和检查

研究监测计划

本研究将根据监测计划进行监测。

研究者将为此类监测活动分配足够的时间。研究者还将确保监测人员或其他合规或质量保证审查员能够访问所有上述与研究相关的文件和研究相关设施(例如药房、诊断实验室等)，并有足够的空间进行监测访问。

在最后一个主体的案例报告表格完成后，将结束访问，研究关闭并且审查irb/iec并且所有监管问题都已得到解决。本次访问将解决以下问题：已完成并恰当提交所有crf，获得监测患者日志的副本，维护和保留研究记录。

总之，监测人员将在研究的成功进行中发挥重要作用。通过与提供培训和支持的监测人员公开有效的沟通加强监测人员与现场工作人员之间的关系，以确保参与者的权利和安全以及数据质量和遵守监管机构的所有适用法规。

审计和检查

研究者将允许irb、主办者、政府监管机构以及临床设施合规和质量保证小组对所有研究相关文件(例如，源文件、法规文件、数据收集工具、研究数据等)进行与研究相关的监测、审计和检查。研究者将确保检查适用的与研究相关的设施(例如药房、诊断实验室等)的能力。

作为研究者参与本研究意味着接受政府监管机构和适用的大学合规和质量保证办公室的潜在检查。

伦理考量

本研究将根据goodclinicalpractice的美国和国际标准(fda标题21第312部分和internationalconferenceonharmonization指南)、适用的政府法规和机构研究政策和程序进行。

本协议和任何修正案将提交给适当组成的独立伦理委员会(ec)或机构审查委员会(irb)，与当地法律规定一致，以正式批准研究行为。ec/irb关于研究进行的决定将以书面形式提交给研究者，并且在本研究开始之前将向主办者提供该决定的副本。研究者应该向主办者提供ec/irb成员及其附属机构的清单。

本研究的所有主体将被提供描述该研究并为主体提供足够的信息的知情同意书，以就其参与本研究做出知情决定。

虽然已经参考其具体实施方案描述了所述发明，但是本领域技术人员应当理解，可以做出多种改变并且可以替换等同方案，而不背离本发明的真实精神和范围。此外，对于本发明的客观精神和范围，可以进行很多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤或多个步骤。所有这样的修改都意欲落入所附权利要求书的范围内。