用于范可尼贫血患者的基因疗法的制作方法

相关申请

本申请要求2016年9月8日提交的美国临时申请号62/385185和2016年10月24日提交的美国临时申请62/412028的优先权和权益，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及将基因转移至细胞中，所述细胞中一种或多种fanca编码的蛋白质的蛋白质活性减小或没有。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且由此通过引用并入本说明书中。包含序列的文本文件的名称为ropa_002_01wo_st25.txt。该文本文件为46kb，于2017年9月8日创建，并通过efs-web以电子方式提交。

发明背景

范可尼贫血(fa)是一种常染色体隐性遗传疾病(除了互补组fa-b外，其为x-连锁的)，其中患者的中位存活期约为24年(butturinia，等(1994)blood84:1650-1655；kutlerdi，等(2003)blood101:1249-1256)。出生时，这些患者的血细胞计数通常是正常的。大红细胞症通常是在这些患者中首先检测到的血液学异常。这通常随血小板减少症、贫血和全血细胞减少症而进展。在5-10年后在这些患者中通常观察到骨髓衰竭(bmf)，平均血液病发病年龄为7岁。约80％的fa患者将在出生后的头十年中发展出bmf的迹象。根据迄今为止的流行病学研究，如果在发育不良之前没有出现恶性发作，几乎所有fa患者都会在40岁时出现bmf(butturinia，等(1994)blood84:1650-1655；kutlerdi，等(2003)blood101:1249-1256)，这是这些患者死亡的主要原因。

由于fa的复杂临床表现，这些患者的管理主要集中在改善以下综合征：骨髓衰竭(bmf)、髓系白血病(myeloidleukemia)和实体瘤。

目前的治疗包括雄激素，诸如由氟甲睾酮、羟甲烯龙或康力龙组成的雄激素。正如最近由dufour及其同事(dufour,c.和svahn,j.(2008).bonemarrowtransplant41suppl2:s90-95)所综述的，只要这种治疗不在疾病的非常晚期开始，fa患者可对雄激素具有一定反应。约75％的患者对雄激素有反应。与2mg/kg/天泼尼松龙的组合降低了肝毒性的风险。通常，在没有合适的骨髓供体的情况下，当存在一些残留的造血作用时，雄激素可被认为是替代治疗，但不是作为最终的长期治疗。

tischkowitz等指出，尽管在疾病的早期阶段fa患者可能对雄激素有反应，但绝大多数fa患者难以长期接受这些治疗(tischkowitz,m.和dokal,i.(2004).brjhaematol126:176-191)。

在fa的治疗中没有关于造血生长因子的特定指征。然而，已经鉴定了具有fa的特异性症状(贫血和中性粒细胞减少症)的指征的两个药物药理学组：1)促红细胞生成素和2)粒细胞集落刺激因子(g-csf)。几种促红细胞生成素(例如，aranesp、nespo、exjade)被批准用于治疗贫血，g-csf(例如，g-csf类似物诸如非格司亭、生物胃泌素(biogastrin)、neulasta)被批准用于治疗中性粒细胞减少症。虽然已经在有限数量的fa患者中测试了造血生长因子，诸如促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子，但是反应是部分和短暂的(dufour等，2008)。目前，这些治疗并不代表良好的长期选择。对于中性粒细胞减少患者的短期治疗，g-csf可用于急性感染，以增加外周中性粒细胞的数量，增强抗生素。然而，这些药物治疗远非用于fa患者的最终治疗。

目前，该疾病的血液学表现的唯一治愈性治疗是基于同种异体造血移植。虽然移植了来自hla相同的同胞供体的移植物的fa患者的结果总体上令人满意，但仅约20％的fa患者具有hla相同的同胞。虽然这些移植物与较高的发病率和死亡率相关，但很大比例的没有同胞供体的fa患者可以从替代供体移植。在剩余的fa患者中，目前没有替代疗法。

因此，仍然迫切需要fa的有效治疗方案。本发明解决了这种需要和更多需要。

技术实现要素：

本发明的实施方案包括用于增强fanca表达的多核苷酸盒。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含编码密码子优化的人fancacdna的序列，以在转录时增加mrna稳定性。

在一个实施方案中，本发明包括包含多核苷酸序列的表达盒，所述多核苷酸序列按以下5'至3'顺序包含：(a)人磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子序列或其功能同源物或变体；(b)编码人fanca多肽或其功能片段或变体的序列；(c)土拨鼠肝炎病毒调控元件(wpre)rna输出信号序列或其功能变体或片段，其中编码人fanca多肽或其功能片段或变体的序列与pgk启动子序列可操作地连接。在特定的实施方案中，fanca多肽或其功能片段或变体包含seqidno:25所示的序列；编码fanca多肽或其功能片段或变体的序列包含seqidno:8所示的序列；pgk启动子包含seqidno:7的核苷酸序列；和/或wpre元件包含seqidno:23的核苷酸序列。在特定实施方案中，所述盒包含seqidno:24的核苷酸序列的区域。在某些实施方案中，所述盒还包含一个或多个增强子序列、多嘌呤束(polypurinetract)(ppt)或多聚腺苷酸化(polya)信号序列、包装信号序列、截短的gag序列、rev响应元件(rre，中央多嘌呤束(cppt)、中央末端序列(cts)和/或或上游序列元件(use)(任选地来自猿猴病毒40(sv40-use))。

在一个实施方案中，本发明提供了包含多核苷酸序列的表达盒，所述多核苷酸序列包含：a)启动子序列；b)编码多肽的序列；c)核糖核酸(rna)输出信号，其中启动子序列与编码fanca多肽的序列(seqidno:25)可操作地连接，并且任选地，其中a)-c)以5'至3'的顺序存在于表达盒中。在某些实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。在某些实施方案中，编码多肽的序列被密码子优化。在一些实施方案中，编码多肽的序列是人fancacdna的密码子优化形式，其与seqidno:8具有至少85％的同一性。在特定实施方案中，rna输出信号是土拨鼠肝炎病毒(wpre)的突变的转录后调控元件。

在某些实施方案中，突变的wpre是嵌合wpre，其包含与seqidno:23具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，表达盒还包含一个或多个增强子序列。在一些实施方案中，表达盒还包含多嘌呤束(ppt)或多腺苷酸化(polya)信号序列。在一些实施方案中，表达盒还包含以下序列中的一种或多种：i)包装信号序列；ii)截短的gag序列；iii)rev响应元件(rre)；iv)中央多嘌呤束(cppt)；v)中央末端序列(cts)；和vi)上游序列元件(use)，任选地来自猿猴病毒40(sv40-use)。在一些实施方案中，表达盒还包含5'和3'长末端重复序列(ltr)。

在相关实施方案中，本发明提供了包含本文公开的表达盒的重组基因递送载体。在某些实施方案中，重组基因递送载体是病毒或病毒载体。在某些实施方案中，病毒或病毒载体是慢病毒(lv)。

在另一个相关实施方案中，本发明提供了包含本文公开的表达盒或基因递送载体的细胞。在一些实施方案中，细胞是血细胞。在一些实施方案中，细胞是红系细胞(erythroidcell)。在一些实施方案中，细胞是骨髓细胞，例如谱系耗尽的骨髓细胞(lineagedepletedbonemarrowcell)。在特定的实施方案中，细胞是造血干细胞或cd34⁺细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是cd34⁺造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是定型的造血红系祖细胞(hematopoieticerythroidprogenitorcell)。

在一个相关实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含药学上可接受的赋型剂和本文公开的重组基因递送载体或细胞。在本发明的某些方面，提供了药物组合物，其包含本发明的多核苷酸盒和药物赋型剂。在其他实施方案中，药物组合物包含本发明的基因递送载体和药物赋型剂。

提供了用于基因治疗载体组合物(例如病毒载体)的方法和组合物，所述基因治疗性载体组合物包含用于制备药剂的这些基因表达盒，所述药剂可用于动物(特别是人)中的疾病、病症和功能障碍的中枢和靶向基因疗法。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防有此需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者提供本文公开的表达盒、基因递送载体或药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明包括治疗有此需要的受试者的范可尼贫血的方法，其包括向受试者提供本文公开的药物组合物。

在一个相关的实施方案中，本发明包括治疗有此需要的受试者的范可尼贫血的方法，其包括向受试者提供包含表达盒的cd34⁺细胞，其中表达盒包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'至3'顺序包含：(a)人磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子序列或其功能同源物或变体；(b)编码人fanca多肽或其功能片段或变体的序列；(c)土拨鼠肝炎病毒调控元件(wpre)rna输出信号序列或其功能变体或片段，其中编码人fanca多肽或其功能片段或变体的序列与pgk启动子序列可操作地连接。在某些实施方案中，cd34⁺细胞获自受试者。在特定实施方案中，在用以下组合治疗受试者后，从受试者获得cd34⁺细胞：(i)g-csf或非格司亭；(ii)普乐沙福。在特定的实施方案中，用包含表达盒的重组基因递送载体转导cd34⁺细胞。在一个实施方案中，通过使cd34⁺细胞与重组基因递送载体接触约24小时来转导cd34⁺细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗有此需要的受试者的范可尼贫血的方法，其包括：(a)向受试者提供以下组合：(i)g-csf或非格司亭；(ii)普乐沙福，以在受试者体内动员cd34⁺细胞；(b)从受试者获得包含cd34⁺细胞的生物样品，其中所述生物样品任选为外周血或骨髓；(c)从生物样品中制备富含cd34⁺细胞的细胞群；(d)用包含表达盒的重组基因递送载体转导富集cd34⁺细胞的细胞群，所述表达盒按以下列5'至3'顺序包含多核苷酸序列：(i)启动子序列或其功能同源物或变体；和(ii)编码人fanca多肽或其功能片段或变体的序列，其中编码人fanca多肽或其功能片段或变体的序列与pgk启动子序列可操作地连接，其中转导包括使富集cd34⁺细胞的细胞群与慢病毒载体接触约24小时；和(e)向受试者提供由步骤(d)得到的用慢病毒载体转导的细胞群。在某些实施方案中，制备细胞群包括通过正选择、负选择或其组合耗尽红细胞和/或富集cd34⁺细胞。在特定实施方案中，该方法抑制受试者中范可尼贫血的血液学表现的发展、停止其进展和/或逆转其进展。在特定实施方案中，范可尼贫血的血液学表现选自bmf、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血症中的一种或多种。

本发明的其他特征和有利方面将从以下详细描述和权利要求中显而易见并包含在其中。

附图简述

图1是示例性构建体pgk-fanca.wpre*lv的示意图。

图2a显示在不同内部启动子控制下表达fanca的lv的示意图。图2b显示了用图a中所示载体转导的fa-a细胞中fanca的western印迹分析，显示来自经受基因疗法的fa-a小鼠的造血祖细胞的mmc-超敏反应的修正。用pgk_fanca-wpre*或对照sf1-egfplv转导fa-a骨髓(bm)细胞，并将其移植到经辐照的fa-a小鼠中。在移植后7个月，收获bm样品并在递增浓度的丝裂霉素c(mmc)存在的情况下在甲基纤维素中进行培养。

图3示出显示在不同内部启动子控制下表达fanca的慢病毒载体的功能分析的数据。图3a显示了用lv转导的fa-a淋巴母细胞系(lcl)细胞的mmc超敏反应的逆转。显示了3个不同实验的平均值。图3b显示在用载体转导并暴露于丝裂霉素c(mmc)的fa-alcl中恢复形成核fancd2灶。

图4示出显示用pgk-fanca.wpre*lv进行fa基因疗法的体内功效和安全性的数据。图4a显示了该构建体。图4b描绘了其中用fancalv转导来自fa-a小鼠的骨髓(bm)细胞，然后将其移植到经辐照的fa-a受者小鼠中的方法。图4c显示在mmc不存在和存在的情况下在甲基纤维素中培养来自移植的fa-a小鼠的bm样品。

图5显示先前用携带pgk启动子控制下的治疗性fanca基因的慢病毒载体转导的同基因骨髓细胞移植的fanca^-/-小鼠中的原病毒拷贝数。pb＝外周血；bm＝骨髓。

图6示出了显示来自经受利用药品的基因疗法的faa小鼠的造血祖细胞的mmc-超敏反应校正的数据。用pgk_fanca-wpre*或sf1-egfplv转导fa-a骨髓(bm)细胞，并将其移植到经辐照的fa-a小鼠中。在移植后七(7)个月，收获bm样品并在递增浓度的mmc存在的情况下在甲基纤维素中进行培养。

图7描绘了来自三个范可尼贫血患者的冷藏保存的骨髓祖细胞的提高的转导效率。将样品经受由2小时静态预加载后的单个转导周期(16h)(白色条；1xs)组成的标准转导或由3个利用慢病毒载体的转导周期(2h+2h+12h)组成的改进的转导(灰色条；3xd)。

图8显示了wpre序列与在pgk启动子控制下表达fanca的慢病毒载体的功能特性的相关性。图8a：用pgk-fanca和pgk-fanca-wprelv转导的fa-alcl的(mmc)敏感性的逆转。显示了3个不同实验的平均值。图8b：用sffv-fancalv和pgk-fancalv(“expt1”)以及用pgk-fanca和pgk-fanca-wprelv(“expt2”)转导的fa-a造血祖细胞(集落形成细胞，cfc)的mmc敏感性的逆转。白色条＝无mmc；黑条＝10nmmmc。mmc＝丝裂霉素c.

图9显示galv-tr和vsv-g假型化慢病毒载体转导来自具有egfp-lv的范可尼贫血患者的骨髓的造血祖细胞的功效。

图10显示了携带hpgk启动子的慢病毒载体的低体外转化潜力。图10a：载体的描述。图10b：如以重新涂板频率所测量的转化能力相对于拷贝数的图。

图11是fa-a患者的示例性造血干细胞(hsc)收集和基因治疗试验的描绘。

图12显示了实施例中描述的研究中招募的患者的血液学参数。图12a显示血红蛋白的结果。图12b显示嗜中性粒细胞的结果。图12c显示血小板的结果。图12d显示cd34+细胞的结果。

图13举例说明旨在评估用普乐沙福(mozobil)和非格司亭(也称为g-csf)(neupogene)治疗后范可尼贫血患者中cd34⁺细胞的动员和收集的安全性和功效的fancostem方案ii期研究。患者人数为10人。

图14显示fa-a患者中g-csf/普乐沙福介导的cd34⁺细胞的动员。

图15显示fa-a患者中cfc的g-csf/普乐沙福介导的动员。

图16是g-csf/普乐沙福动员的fa-a患者中收集的cd34⁺细胞的概述。图16a显示fancostem中的cd34⁺细胞收集，图16b显示与先前的研究比较。

图17是显示骨髓(bm)中预测的cd34⁺细胞数与动员的外周血(mpb)中的实际数量之间的比较的图表。

图18是动员的外周血(mpb)fa-acd34⁺细胞的收集和纯化的图表。

图19显示在免疫选择来自健康供体(hd)和fa患者的经动员的外周血(mpb)cd34⁺细胞之前和之后的cd34表达。

图20显示患者fa02005符合fancostem和fancolen研究的标准。图20a显示细胞计数；图20b显示了造血干细胞(hsc)含量与年龄的对比。

图21(a-e)显示在基因疗法之前对患者fa-02005的fa诊断的测试结果。

图22显示fa-a患者02005的细胞制造过程的后续参数。

图23是描绘在患者fa-02005中基因疗法之前和之后2周、4周、6周、2个月、3个月、4个月和5个月的载体拷贝数的图。

图24示出了如通过血红蛋白量所测量的基因疗法之前和之后的第一个未条件化fa-a患者(fa-02005)的追踪。

图25示出了如通过嗜中性粒细胞的量所测量的基因疗法之前和之后的第一个未条件化fa-a患者(fa-02005)的追踪。

图26示出了如通过血小板的量所测量的基因疗法之前和之后的第一个未条件化fa-a患者(fa-02005)的追踪。

图27是患者fa-a02002的血液学演变的图表。

图28显示fa02002被诊断为无嵌合；纯合子fancac.239c>tp.gln99*mmc超敏反应；由fanc弥补。

图29显示患者fa-a02002中的细胞制造过程。

图30显示在患者fa02002中lv转导所需的不同步骤期间健康供体(hd)和fa动员的外周血(mpb)中cd34表达的分析。

图31是描绘患者fa02002中基因疗法之前和之后的载体拷贝数的图。

图32示出了通过血红蛋白的量所测量的输注了冷冻保存的细胞的患者fa-a02002的追踪数据。

图33示出了通过嗜中性粒细胞的量所测量的输注了冷冻保存的细胞的患者fa-a02002的追踪数据。

图34示出了通过血小板量测量的输注冷冻保存细胞的患者fa-a02005的追踪数据。

图35显示使用经验证的条件进行的来自fa-a患者的新鲜的动员的外周血(mpb)cd34⁺细胞的转导。图35a示出了方案。图35b显示来自患者02002的结果的图。图35c显示来自患者02003的结果的图。图35d显示来自患者02004的结果的图。

图36显示nsg小鼠中校正的fa-ampbcd34⁺细胞植入的数据。图36a显示了方案。图36b显示患者02002的结果。图c显示患者02003的结果。图36d显示患者02004的结果。mpb＝动员的外周血。

图37描绘了在nodscidγ(nsg)小鼠中来自患者02002的经校正的fahpc的体内选择。图37a显示方案。图37b是移植前cfc的图。图37c是移植后30天的hcfc的图。

图38是在cmv启动子控制下的编码vsv的包膜g糖蛋白并且携带用于选择目的的卡那霉素抗性基因的5.7kb质粒的图谱。

图39是在cmv启动子控制下的编码hiv-1rev基因并且携带用于选择目的的卡那霉素抗性基因的3.5kb质粒的图谱。

图40是含有在cmv启动子控制下的编码hiv-1结构蛋白和酶促蛋白的hiv-1gag和pol基因的8.8kb质粒的图谱。其包含人β珠蛋白的内含子2(hbb2)、hiv-1rev响应元件(rre)和卡那霉素抗性基因。

图41是11621碱基对的转移盒pccl-sin-cppt/cts-hpgk-hfanca-wpre的图谱。

图42示出fa造血干细胞(hsc)中fanca-lv插入位点的lam-pcr分析。

图43描绘了用于跟踪fanca-lv处理的细胞的lam-pcr结果。图43a描绘了方案，图43b是数据的图表。

图44显示移植了lv校正的hsc的fanca^-/-受者的克隆多样性。图4a显示了方案，图44b显示了数据图。

发明详述

本发明总体上涉及分子生物学和病毒学领域，尤其涉及基因表达盒，以及包含它们的载体，所述载体可用于将编码选择的治疗性构建体(包括例如肽、多肽、核酶和催化性rna分子)的核酸区段递送至选择的脊椎动物的细胞和组织。特别地，这些遗传构建体可用于基因疗法，用于治疗与fanca基因产物失调相关的哺乳动物(特别是人)的疾病、病症和功能障碍。

在某些实施方案中，本发明提供用于对患有范可尼贫血(fa)的受试者进行基因疗法治疗的组合物和方法。特别地，提供了用于拯救fanca基因表达的组合物和方法。本文公开的具体方法涉及慢病毒载体用于将人fanca递送至患有fa特别是fa-a的受试者的造血祖细胞的用途。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践中，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用明确地整体并入本文。在发生矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，本文所述的材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

如本文中所用，“载体”是指大分子或大分子的组合，其包含多核苷酸或与多核苷酸缔合，并且可用于介导多核苷酸向细胞的递送。说明性载体包括例如质粒、病毒载体(例如，逆转录病毒载体，诸如慢病毒载体)、脂质体和其他基因递送媒介物。

术语“lv”是慢病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式。

如本文中所用，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内核苷酸序列。在一些情况下，基因由编码序列(即编码基因产物的序列)组成或基本上由其组成。在其他情况下，基因包含另外的非编码序列。例如，基因可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5'非翻译(5'utr)或“前导”序列和3'utr或“尾部”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文中所用，“治疗性基因”是指这样的基因，当其表达时对其所存在的细胞或组织或表达该基因的哺乳动物赋予有益作用。有益作用的实例包括改善病况或疾病的体征或症状，预防或抑制病况或疾病，或赋予所需特征。治疗性基因包括校正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因。

如本文中所用，转基因是通过载体递送至细胞的基因。

如本文中所用，术语“基因产物”是指多核苷酸序列的所需表达产物，诸如多肽、肽、蛋白质或干扰rna(包括短干扰rna(sirna)、mirna或小发夹rna(shrna))。

如本文中所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸聚合物。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分缀合。

“包含”意指所述元素在例如组合物、方法、试剂盒等中是所需的，但可包括其他元素以形成例如在权利要求范围内的组合物、方法、试剂盒等。例如，“包含”与启动子可操作地连接的编码治疗性多肽的基因的表达盒是除了所述基因和启动子以外还可包括其他元件，例如，多腺苷酸化序列、增强子元件、其他基因、接头结构域等的表达盒

“基本上由......组成”意指对例如针对指定的材料或步骤所描述的组合物、方法、试剂盒等的范围的限制，其不会实质上影响例如组合物、方法、试剂盒等的基本和新颖的特征。例如，“基本上由”与启动子和多腺苷酸化序列可操作地连接的编码治疗性多肽的基因组成的表达盒可以包括另外的序列，例如接头序列，只要它们不实质上影响基因的转录或翻译即可。作为另一个实例，“基本上由”所述序列组成的变体或突变体多肽片段具有所述序列的氨基酸序列加上或减去基于其所源自的全长初始多肽(polypeptide)的序列边界处约10个氨基酸残基，例如比所述边界氨基酸残基少10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基，或者比所述边界氨基酸残基多出1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基。

“由...组成”意指从组合物、方法或试剂盒排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。例如，表达盒“由”与启动子可操作地连接的编码治疗性多肽的基因和转录后调控元件组成的表达盒仅由启动子、编码治疗性多肽的多核苷酸序列和转录后调控元件组成。作为另一个实例，“由”所述序列组成的多肽仅含有所述序列。

如本文中所用，“表达载体”包括如上所述或本领域已知的载体，例如质粒、微环、病毒载体、脂质体等，其包含编码目标基因产物的多核苷酸，并用于实现在期望的靶细胞中表达基因产物。表达载体还包含与编码区可操作地连接的控制元件，以促进基因产物在靶标中表达。控制元件(例如，启动子、增强子、utr、mirna靶向序列等)与和它们可操作地连接以进行表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”。许多这样的控制元件是本领域已知的和可用的，或者可以从本领域可获得的部件容易地构建。

本文中所用，“启动子”包含指导rna聚合酶的结合，从而促进rna合成的dna序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的(意味着在广泛的细胞、组织和物种中具有强活性)，或者是细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性。启动子可以是“组成型的”，意指持续活性，或者是“诱导型的”，意指启动子可因生物或非生物因子的存在或不存在而被激活或失活。还包括在本发明的核酸构建体或载体中的是增强子序列，其可以与启动子序列邻接或不邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达，并且可位于天然基因的5'区域或3'区域。

如本文中所用，“增强子”包括刺激或抑制相邻基因的转录的顺式作用元件。抑制转录的增强子也被称为“沉默子”。增强子可在距离编码序列和转录区下游位置多达数千碱基对(kb)的距离上以任一取向起作用(即，可以与编码序列相关联)。

如本文中所用，“终止信号序列”包括导致rna聚合酶终止转录的任何遗传元件，例如多腺苷酸化信号序列。

如本文中所用，术语“可操作地连接的”或“有效连接的”是指遗传元件例如启动子、增强子、终止信号序列、多腺苷酸化序列等的并置，其中所述元件处于允许它们以预期的方式运行的关系中。例如，如果启动子帮助启动编码序列的转录，则启动子与编码区可操作地连接。只要保持这种功能关系，在启动子与编码区之间可以存在间插残基。

如本文中所用，术语“异源的”意指源自与和其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过遗传工程技术引入源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。作为另一个实例，从其天然编码序列中取出并与天然不与其一起存在的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。因此，例如，包含编码异源基因产物的异源核酸的lv载体是包含通常不包含在天然存在的野生型lv中的核酸的lv载体，并且编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型lv编码的基因产物。

如本文中所用，关于核苷酸分子或基因产物的术语“内源的”是指天然存在于宿主病毒或细胞中或与其相关联的核酸序列，例如基因或遗传元件，或基因产物，例如rna、蛋白质。

如本文中所用，术语“天然的”是指存在于野生型病毒或细胞中的核苷酸序列，例如基因或基因产物，例如rna、蛋白质。

如本文中所用，术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列例如天然多核苷酸或多肽序列的突变体，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％序列同一性。换句话说，变体相对于参考多核苷酸序列例如天然多核苷酸或多肽序列包含至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。例如，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有70％或更高序列同一性，例如，与全长天然多核苷酸序列具有75％或80％或更高同一性，诸如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％同一性的多核苷酸。作为另一个实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更高序列同一性，例如与全长天然多肽序列具有75％或80％或更高，诸如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％同一性的多肽。变体还可包括参考序列(例如天然序列)的变体片段，其与参考序列(例如天然序列)的片段共享70％或更高的序列同一性，与天然序列共享75％或80％或更高的同一性，诸如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％同一性。

如本文中所用，术语“生物活性”和“生物学上有活性”是指归因于细胞中特定生物元件的活性。例如，“免疫球蛋白”、“抗体”或其片段或变体的“生物活性”是指结合抗原决定簇从而促进免疫功能的能力。作为另一个实例，多肽或其功能片段或变体的生物活性是指多肽或其功能片段或变体实现其天然功能(例如，结合、酶活性等)的能力。作为第三个实例，基因调控元件(例如，启动子、增强子、kozak序列等)的生物活性是指调控元件或其功能片段或变体分别调控(即，促进、增强或激活)与其可操作地连接的基因的翻译、表达的能力。

如本文中所用，术语“施用”或“引入”是指将重组蛋白表达的载体递送至受试者的一个或多个细胞和/或器官，或递送给受试者。这种给药或引入可以在体内、体外或离体进行。可通过转染将用于表达基因产物的载体引入细胞中，这通常意味着通过物理手段(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂质转染)、感染(其通常是指通过感染因子即病毒的引入)或转导(其通常是指用病毒稳定感染细胞或通过病毒剂(例如,噬菌体)将遗传物质从一种微生物转移到另一种微生物)将异源dna插入细胞中。

“转化”通常用于指包含异源dna的细菌或表达癌基因并因此已转化为连续生长模式的细胞，诸如肿瘤细胞。用于“转化”细胞的载体可以是质粒、病毒或其他媒介物。

通常，根据用于向细胞中施用、引入或插入异源dna(即，载体)的手段，细胞被称为“转导的”、“感染的”、“转染的”或“转化的”。无论引入异源dna的方法如何，术语“转导的”、“转染的”和“转化的”在本文中可互换使用。

如本文中所用，术语“宿主细胞”是指已用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。培养条件，诸如温度、ph等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。应理解，术语“宿主细胞”是指原始转导、感染、转染或转化的细胞及其后代。

术语“治疗”、“医治”等在本文中用于通常意指获得所需药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状(例如，降低疾病或其症状在受试者中发生的可能性)而言，所述作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良作用而言可以是治疗性的。如本文中所用，“治疗”涵盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。正在发生的疾病的治疗(其中治疗稳定或减轻患者的不期望的临床症状)特别令人感兴趣。理想地在受累组织中完全丧失功能之前进行这种治疗。理想地在疾病的症状阶段期间施用主题疗法，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用主题疗法。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包括但不限于人和非人灵长类动物，包括猿猴和人；哺乳动物运动动物(例如，马)；哺乳动物的农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳动物的宠物(狗、猫等)；和啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明。如本文中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”旨在也包括复数形式。此外，如果术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“拥有(with)”或其变型用于详细说明和/或权利要求中，则此类术语旨在指以与术语“包含(comprising)”类似的方式包含在内的。

术语“约”或“近似”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或多于1个的标准偏差内。或者，“约”可表示给定数值的不超过20％、优选地不超过10％、更优选地不超过5％、仍更优选地不超过1％的范围。可选地，尤其是有关生物系统或方法，该术语可表示在数值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外指明，否则应假设术语“约”对于特定数值而言表示在可接受的误差范围内。

除非另有说明，本发明的实践采用细胞生物学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在诸如以下文献中有充分解释："molecularcloning:alaboratorymanual"，第2版(sambrook等，1989)；"oligonucleotidesynthesis"(m.j.gait，编辑，1984)；"animalcellculture"(r.i.freshney，编辑，1987)；"methodsinenzymology"(academicpress,inc.)；"handbookofexperimentalimmunology"(d.m.weir&c.c.blackwell，编辑)；"genetransfervectorsformammaliancells"(j.m.miller&m.p.calos，编辑，1987)；"currentprotocolsinmolecularbiology"(f.m.ausubel等，编辑，1987)；"pcr:thepolymerasechainreaction",(mullis等，编辑，1994)和"currentprotocolsinimmunology"(j.e.coligan等，编辑，1991)，所述文献中的每一篇都明确地通过引用并入本文。

下面参考用于说明的示例应用来描述本发明的若干方面。应该理解，列出许多具体细节、关联和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到，可没有一种或多种具体细节地实践本发明或以其它方法实践本发明。本发明不限于所例举的行为或事件的顺序，因为一些行为可以不同顺序进行和/或与其它行为或事件同时进行。此外，并非所有列举的行为或事件都是实施根据本发明的方法所需的。

除非另有说明，否则本文使用的所有术语均具有与本领域技术人员对其所理解的含义相同的含义，并且本发明的实践将采用微生物学和重组dna技术的常规技术，其在本领域技术人员的知识范围内。

在某些实施方案中，本公开提供了用于在细胞中表达基因的多核苷酸、多核苷酸盒和表达载体。还提供了药物组合物和使用任何组合物促进基因在细胞中(例如，在个体中)表达，例如以用于治疗或预防疾病的方法。在阅读下面更全面描述的组合物和方法的细节后，本发明的这些和其他目的、有利方面和特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

在某些实施方案中，提供了用于制备基因治疗性载体组合物(例如，病毒载体)的方法和组合物，所述基因治疗性载体组合物包含用于制备药剂的这些基因表达盒，所述药剂可用于动物中(尤其是人中)的疾病、病症和功能障碍的中枢和靶向基因治疗。

在一些实施方案中，本发明提供基于含有驱动fancacdna表达的hpgk真核启动子的lv载体的范可尼贫血基因疗法。该治疗性载体可用于转导人造血干细胞(hsc)，随后可将所述细胞移植到患有范可尼贫血的人中。

在某些实施方案中，本发明提供用于范可尼贫血的遗传校正的fancalv载体。总的来说，结果证明了利用设计用于临床应用的lv对fa进行基因疗法的可行性。

所公开的组合物可用于各种研究、诊断和治疗方案，包括多种人疾病的预防和治疗。下面描述本发明的各种组合物和方法。

尽管本文举例说明了特定的组合物和方法，但应理解，许多替代组合物和方法中的任何一种都适用于和适合用于实施本发明。还应理解，可使用本领域中的标准程序进行本发明的表达构建体和方法的评估。

范可尼贫血

范可尼贫血(fa)是一种罕见的遗传性染色体不稳定性综合征，其主要特征在于骨髓衰竭(bmf)和癌症易感性(butturinia等blood.1994；84:1650-1655；kutlerdi等blood.2003；101:1249-1256.)。fa的发病率为百万分之1-5，并且杂合携带者频率据估计为1/300(tamaryh等eurjhaematol.2004；72:330-335)。

fa在遗传上和表型上是异质的。到目前为止，已报告了十三个(13)互补组(fa-a、b、c、d1、d2、e、f、g、i、j、l、m和n)与相应的13种范可尼贫血互补组(fanc)基因：fanca、fancb、fancc、fancd1/brca2、fancd2、fance、fancf、fancg/xrcc9、fanci、brip1/fancj、fancl、fancm/hef和fancn/pablb2中的突变相关联(wangw.natrevgenet.2007；8:735-748)。除fa-b患者(fancb位于x染色体中)的情况外，fa是常染色体隐性遗传。

由fa基因编码的蛋白质参与称为fa/brca途径的生物化学途径(参见wangw.natrevgenet.2007；8:735-748)。已在fa途径中鉴定了13种fa蛋白，其各自参与迄今为止在该途径中表征的三种fa蛋白复合物之一。上游复合物fa核心复合物由八种fa蛋白(fanca、fancb、fancc、fance、fancf、fancg、fancl、fancm)和两种fa相关蛋白(faap24和faap100)集合而成。第二复合体由fancd2和fanci组成，它们在fa-id复合体中共同起作用。由于fa核心复合物的e3连接酶活性(fancl)，fancd2和fanci可被单遍在化(mono-ubiquitinated)，然后加载到染色质上，形成响应dna损伤或复制停滞的大核灶点。最后，单遍在化的fancd2/fanci与下游fa蛋白诸如fancj/brip1、fancn/palb2和fancd1/brca2相互作用，其与参与同源性导向的修复(hdr)的蛋白质诸如brca1和rad51形成稳定的复合物。

fa-a是最常见的fa互补组，其中约50％-80％的fa患者对应于该互补组(casadoja等jmedgenet.2007；44:241-249；levitusm等blood.2004；103:2498-2503；taniguchit,d'andreaad.blood.2006；107:4223-4233)。由于fanca的缺乏或无效表达，不能形成fa核心复合物。这阻止了id复合物的激活，并因此阻止了这些蛋白质向染色质的迁移，从而导致fa细胞的特征性表型。

如d'andrea等(blood.1997；90:1725-1736)所述，fa细胞的特征在于不同的细胞表型，主要与细胞存活、dna修复和基因组稳定性的缺陷相关。

fa主要特征在于先天性异常、骨髓衰竭的发展以及发展急性髓样白血病和某些实体瘤的高风险。平均而言，70％的fa患者存在先天性缺陷。60-70％的fa患者存在骨骼异常(髋部、脊椎侧凸、肋骨)和全身性皮肤色素沉着过度、咖啡斑。大多数患者身材矮小，其中约三分之一患有小眼症(microphtalmia)和肾脏异常。在约30％的fa患者中，未观察到明显的先天性异常(tischkowitzm,dokali.brjhaematol.2004；126:176-191)。

fa患者最重要的临床特征是血液学。骨髓衰竭(bmf)是该疾病的主要特征。其通常出现在5至10岁之间。80％的15岁患者发展了bmf，40岁时bmf的精算风险超过90％(butturini等，1994，kutler等，2003)。血小板减少症或白细胞减少症通常发生在贫血之前。全血细胞减少症通常会随着时间的推移而恶化。中性粒细胞减少症与感染风险的增加有关。

fa患者还易患癌症，主要是急性髓样白血病(aml)和骨髓增生异常综合征(mds)。大多数与fa相关的肿瘤在13岁后发展，平均年龄为23岁。aml的相对风险增加785倍，其中发展aml的fa患者的中位年龄为14岁，40岁时血液恶性肿瘤的累积发生率为30-55％(kutler等，2003；rosenbergps等，blood.2003；101:822-826)。老年fa患者也有发展实体瘤(主要是鳞状细胞癌(scc))的高风险。这些患者发生实体瘤时的中位年龄为26岁，到40岁时，实体瘤的累积发生率为30％(kutler等，2003，rosenberg等，2003)。

由于fa的复杂临床表现，这些患者的管理主要集中于减轻骨髓衰竭(bmf)、髓样白血病和实体瘤的症状。fa患者的每种现有疗法的局限性报道于关于携带fanca基因的慢病毒载体的孤儿药品文献中，所述文献的主办者是关于罕见疾病的ciemat/ciber(bueren,j.(2010).centerforbiomedicalnetworkresearchonrarediseasesrefeu/3/10/822)。

在某些实施方案中，提供了用于制备基因治疗性载体组合物(例如病毒载体)的方法和组合物，所述基因治疗性载体组合物包含用于制备药剂的这些基因表达盒，所述药剂可用于动物中(尤其是人中)的疾病、病症和功能障碍的中枢和靶向基因治疗。

在一些实施方案中，本发明提供了基于含有驱动fancacdna表达的hpgk真核启动子的lv载体的范可尼贫血的基因疗法。该治疗性载体可用于转导人造血干细胞(hsc)，随后可所述造血干细胞移植到患有范可尼贫血的人体中。

在某些实施方案中，本发明提供用于范可尼贫血的遗传校正的fancalv载体。总体而言，结果证明了利用设计用于临床应用的lv对fa进行基因疗法的可行性。

本公开包括基因表达盒(例如，治疗盒)、包含所述基因表达盒的基因转移盒(例如，整合盒)、包含所述基因转移盒的质粒以及包含所述基因转移盒的基因递送载体。基因表达盒、基因转移盒、质粒和基因递送载体包含与启动子序列可操作连接的编码治疗性基因产物的多核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列是dna或rna。在某些实施方案中，基因表达盒是多核苷酸，基因转移盒是多核苷酸，并且载体是病毒，例如慢病毒。

在某些实施方案中，治疗性基因产物是fanca蛋白或其功能片段或变体，任选地野生型人fanca蛋白。

在特定实施方案中，基因表达盒包含启动子区域、编码序列和转录后调控元件。在某些实施方案中，启动子区域包含启动子序列或其功能片段。在一个实施方案中，启动子是人pgk启动子。在一些实施方案中，表达盒还包含rna输出信号。rna输出信号可包含wpre序列。在一些实施方案中，包括缺少任何残留开放阅读框的突变的wpre(schambach,bohne等，2006)以提高治疗性基因的表达水平和稳定性。

本发明的一些实施方案包括用于增强fanca基因产物表达的基因表达盒。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含野生型fancacdna编码序列，或人fancacdna的密码子优化形式，以增加转录后的mrna稳定性。为了优化，可以使用软件，增加gc含量并去除隐蔽剪接位点以避免转录沉默并因此增加转基因表达。或者，可使用本领域已知的任何优化方法。

在本发明的一些方面，提供了药物组合物，其包含本发明的基因递送载体和药物赋型剂。在一些实施方案中，药物组合物包含本发明的基因递送载体和药物赋型剂。

在本发明的一些方面，提供了用于在哺乳动物细胞中表达转基因的方法。在一些实施方案中，该方法包括使一种或多种哺乳动物细胞与有效量的本发明的多核苷酸盒或本发明的基因递送载体接触，其中转基因在所述一种或多种哺乳动物细胞中以可检测的水平表达。在一些实施方案中，该方法包括使一种或多种哺乳动物细胞与有效量的本发明的多核苷酸盒或本发明的基因递送载体接触，其中转基因在一种或多种哺乳动物细胞中以治疗水平表达。在一些实施方案中，该方法是体外的。在其他实施方案中，该方法是体内的。

在本发明的一些方面，提供了用于治疗或预防需要治疗或预防疾病或病症的哺乳动物中的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用有效量的本发明的药物组合物，其中编码序列编码治疗性基因产物。

组合物

在本公开的一些方面，提供了用于在真核细胞中表达fanca转基因的组合物。在某些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是造血干细胞(hsc)。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是造血祖细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是cd34+。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在特定实施方案中，细胞是源自被诊断为患有fa的受试者的人cd34+细胞，并且在用本文公开的基因递送转导cd34+细胞以及其包含公开的基因表达盒后用所述cd34+细胞治疗所述受试者。

在一个具体实施方案中，本公开包括含基因表达盒的慢病毒载体，所述基因表达盒包含编码治疗性fanca蛋白或其功能片段或变体的多核苷酸序列。如本文中所用，与参考序列相比，参考多核苷酸或多肽的功能变体包含一个或多个氨基酸或核酸缺失、添加或取代，并且其至少保留参考多核苷酸或多肽的功能活性的至少50％，至少80％，至少90％或至少99％。如本文中所用，功能片段是参考多核苷酸或多肽的片段，并且其保留参考多核苷酸或多肽的功能活性的至少50％，至少80％，至少90％或至少99％。

在一个实施方案中，慢病毒载体的主链与对应于药品“携带wiscottaldrich综合征蛋白(wasp-lv)”(ref141/2000)的慢病毒载体的骨架相同，尽管对于fa治疗，启动子是人磷酸甘油酸激酶(hpgk)启动子，所述启动子的特征在于与已用于基因疗法的其它启动子相比其在体内的稳定活性和提高的安全性(modlichu,navarros,zychlinskid等insertionaltransformationofhematopoieticcellsbyself-inactivatinglentiviralandgammaretroviralvectors.molther.2009；17:1919-1928；montinie,cesanad,schmidtm等hematopoieticstemcellgenetransferinatumorpronemousemodeluncoverslowgenotoxicityoflentiviralvectorintegration.natbiotechnol.2006；24:687-696.)。

在本公开的一些实施方案中，组合物包含多核苷酸盒。“多核苷酸盒”是指包含通常彼此可操作地连接的两个或更多个功能性多核苷酸序列的多核苷酸序列，例如调控元件、翻译起始序列、编码序列、终止序列等。同样地，就“用于在哺乳动物细胞中表达转基因的多核苷酸盒”而言，其意指在细胞中促进转基因表达的两种或更多种功能性多核苷酸序列(例如启动子、增强子、5'utr、翻译起始序列、编码序列、终止序列等)的组合。基因表达盒和基因转移盒是多核苷酸盒是多核苷酸盒的实例。

在一些实施方案中，本公开的多核苷酸盒在哺乳动物细胞中提供增强的转基因表达。如通过本公开的工作实施例所证明的，本发明人已发现许多在哺乳动物细胞中单独地和协同地提供增强的转基因表达的多核苷酸元件，即与本领域已知的那些相比改进的元件。在某些实施方案中，本公开内容的多核苷酸盒内的两种或更多种功能性多核苷酸序列的排列在哺乳动物细胞中提供了增强的转基因表达。“增强的”意指转基因的表达在携带本公开的多核苷酸盒的细胞中相对于在携带与可比较的调控元件(例如，如本领域中已知的)可操作地连接的所述转基因的细胞中而言得以增加、增强或更强。换句话说，相对于来自不包含本公开的一种或多种优化元件的多核苷酸盒(即，参考对照)的表达，来自本公开的多核苷酸盒的转基因表达得以增加、增强或更强。在某些实施方案中，增强的表达对一种或多种所需的细胞类型具有特异性或限于所述细胞类型。

例如，转基因的表达在包含含有本文公开的启动子的多核苷酸盒的细胞中相较于在携带与不同的启动子(例如，如本领域中已知的)可操作地连接的所述转基因的细胞中而言可得以增强或加强或更强。作为另一个实例，转基因的表达在包含本文公开的增强子序列的多核苷酸盒的细胞中相较于在携带与不同增强子序列可操作地连接的所述转基因的细胞中而言可得以增强或增加、加强或更强。

不希望受理论束缚，细胞中转基因的增强表达据认为归因于细胞中基因产物的更快积累或细胞中更稳定的基因产物。因此，可以以多种方式观察本公开的多核苷酸盒增强转基因的表达。例如，可通过在多核苷酸盒与细胞更早接触(例如，早2天、早7天、早2周、早3周、早4周、早8周、早12周或更早)之后检测转基因的表达来观察增强的(相较于在所述转基因与可比较的调控元件(例如，如本领域中已知的)可操作地连接时检测到的表达)表达。还可将增强的表达观察为每细胞的基因产物量的增加。例如，每哺乳动物细胞的基因产物的量可增加至2倍或更多，例如，增加至3倍或更多，增加至4倍或更多，增加至5倍或更多，或增加至10倍或更多。还可将增强的表达观察为表达可检测水平的由多核苷酸盒携带的转基因的哺乳动物细胞数量的增加。例如，表达可检测水平的转基因的哺乳动物细胞数量可增加至2倍或更多，例如增加至3倍或更多，增加至4倍或增加，增加至5倍或更多，或增加至10倍或更多。

作为另一个实例，与常规多核苷酸盒相比，本发明的多核苷酸可以在更大百分比的细胞中促进转基因的可检测水平；例如，当常规盒可在例如某个区域中在少于5％的细胞中促进可检测水平的转基因表达时，本发明的多核苷酸在该区域中在5％或更多的细胞中促进可检测水平的表达；例如10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多或45％或更多，在某些情况下50％或更多、55％或者更多；60％或更多、65％或更多、70％或更多或75％或更多，例如80％或更多、85％或更多、90％或更多或95％或更多的接触的细胞将表达可检测水平的基因产物。还可将增强的表达观察为细胞的活力和/或功能的改变。

本公开的多核苷酸盒通常包含启动子区域。任何合适的启动子区或其中的启动子序列可用于主题多核苷酸盒中，只要启动子区在真核细胞中促进编码序列的表达即可。在某些实施方案中，启动子区域在哺乳动物细胞中促进编码序列的表达。在一些情况下，启动子是遍在启动子，即其为在广泛的细胞、组织和物种中具有活性的启动子。在其他情况下，启动子是人pgk启动子。

启动子和增强子元件可以是组织特异性的或阶段特异性的。例如，组织特异性启动子或增强子优先驱动一种或多种特定细胞类型中的表达(或更高水平的表达)。细胞类型的实例包括但不限于：造血干细胞、长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、造血cd34+细胞和cd34+群内的任何簇分化亚群。阶段特异性启动子或增强子优选在细胞周期或发育的一个或多个特定阶段期间驱动表达(或更高水平的表达)。这些包括但不限于β-珠蛋白基因座控制区、血影蛋白启动子和红细胞特异性启动子。

在一些实施方案中，多核苷酸包含一个或多个增强子。增强子是本领域已知的增强转录的核酸元件，并且可位于与它们所调控的基因相关的任何位置，例如上游、下游、内含子内等。任何增强子元件都可用于本公开的多核苷酸盒和基因治疗性载体中，只要其在与启动子组合使用时增强基因的表达即可。

待在细胞中表达的编码序列可以是任何多核苷酸序列，例如，编码基因产物例如多肽或基于rna的治疗剂(sirna、反义rna、核酶、shrna等)的基因或cdna。编码序列对于与其可操作地连接的启动子序列可以是异源的，即不与其天然地可操作地结合。或者，编码序列对于与其可操作地连接的启动子序列是内源性的，即与该启动子天然结合的。基因产物可以在哺乳动物细胞中内在地起作用，或者其可以外在地起作用，例如其可被分泌。例如，当转基因是治疗性基因时，编码序列可以是编码所需基因产物或其功能片段或变体的任何基因，所述基因产物或其功能片段或变体可用作治疗疾病或病症的治疗剂。在各种优选实施方案中，转基因编码人fanca，即seqidno:25。

在本发明的一个实施方案中，对转基因编码序列进行修饰或“密码子优化”以通过用更频繁表示的密码子替换不频繁表示的密码子来增强表达。编码序列是编码用于翻译的氨基酸的mrna序列的一部分。在翻译过程中，61个三核苷酸密码子中的每一个被翻译成20种氨基酸之一，导致遗传密码的的简并性或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种以不同的频率利用编码同一氨基酸的trna(每个携带反密码子)。当基因序列含有不常被相应trna表示的密码子时，核糖体翻译机器可能减慢，阻碍高效翻译。通过对特定物种的“密码子优化”可以提高表达，其中可改变编码序列以编码同一蛋白质序列，但利用被高度表示的，和/或被高度表达的人蛋白质利用的密码子(cid-arregui等，2003；j.virol.77:4928)。在本发明的一个方面，修饰转基因的编码序列以用在灵长类动物中频繁表达的密码子取代在哺乳动物或灵长类动物中不常表达的密码子。例如，在一些实施方案中，由转基因编码的编码序列编码与上文或本文公开的序列编码的多肽具有至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少95％序列同一性，至少98％同一性，至少99％同一性的多肽，其中编码序列的至少一个密码子在人中具有比上文或本文公开的序列中的相应密码子更高的trna频率。

在本发明的另外的实施方案中，修饰转基因编码序列以通过终止或除去不编码所需转基因的开放阅读框(orf)来增强表达。开放阅读框(orf)是遵循起始密码子并且不含终止密码子的核酸序列。orf可以是正向或反向取向的，并且与目标基因相比可以是“框内”或“框外”的。此类开放阅读框具有在表达盒中在目标基因旁表达的潜力，并且可能导致不希望的副作用。在本发明的一个方面，通过进一步改变密码子使用来修饰转基因的编码序列以除去开放阅读框。这通过消除起始密码子(atg)以及以相反取向或在orf框外引入终止密码子(tag、taa或tga)，同时保留氨基酸序列并维持目标基因中高度利用的密码子(即，避免频率<20％的密码子)来完成。在本发明中，转基因编码序列可通过密码子优化和去除非转基因orf中的任一种或使用两者来优化。对于本领域普通技术人员显而易见的是，优选在密码子优化后除去或最小化非转基因orf，以除去在密码子优化期间引入的orf。

在一些实施方案中，多核苷酸盒包含：

(i)磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子序列或其功能变体或片段；

(ii)编码人fanca蛋白或其功能片段或变体的序列；和：

(iii)土拨鼠肝炎病毒(wpre)序列的转录后调控元件。

在一些实施方案中，多核苷酸盒包含：

(i)人磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子序列；

(ii)编码人fanca蛋白的序列；和：

(iii)突变型wpre序列。

在一些实施方案中，多核苷酸盒包含：

a)5'ltr，任选地经修饰的5'ltr；

b)cppt序列；

c)pgk启动子序列，任选地人pgk启动子序列；

d)编码人fanca蛋白的序列，任选地cdna序列或经密码子优化的序列；

e)突变型wpre序列；和

f)3'ltr，任选地经修饰的3'ltr。

在一个实施方案中，经修饰的wpre被称为wpre*。wpre*是缺乏开放阅读框的经修饰的wpre(参见，例如，schambach等，2006genether.13：641-645)。

在某些实施方案中，基因转移盒包含一种或多种另外的元件，例如选自以下的一种或多种元件：5'ltr、3'ltr、cppt、cts、rre、增强子序列和包装信号。

rre序列提高了基因转移的效率。在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，rre序列包含以下任何序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

(aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcct(seqidno:1)；或

包含seqidno:24的核苷酸2649-2882或由其组成的序列。

逆转录病毒前导区含有包装信号(ψ)，其参与将逆转录病毒基因组包装到病毒衣壳中。lv载体据认为在该区域需要约300bp的gag基因。目前，这种gag序列已经减少到仅40bp(图65)。在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，ψ序列是hiv-1ψ序列或ψ序列包含以下任何序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

ctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtc(seqidno:2)；或

包含seqidno:24的多核苷酸2031-2156或由其组成的序列。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，截短的hiv-15'ltr包含以下任何序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

gggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca(seqidno:3)；或

包含seqidno:24的多核苷酸1586-9495或由其组成的序列。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，hiv-1自失活3'ltr包含以下任何序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

tggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca(seqidno:4)；或

包含seqidno:24的多核苷酸9262-9495或由其组成的序列。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，人巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子包含以下任何序列、其功能片段或与以下任何序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

gtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct(seqidno:5)；或

包含seqidno:24的多核苷酸1586-1789或由其组成的序列。

已看到促进整合前复合物的核转位的cppt与参与反转录酶分离的cts一起提高了病毒滴度(zennou等，2000；follenzi等，2000)。在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，hiv-1的中心多嘌呤束和中心终止序列(cppt/cts)包含以下任何序列、其功能片段或与以下任何序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

ttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaatttt(seqidno:6)；

tttaaaagaaaaggggggattggggggt(seqidno:12)；或

包含seqidno:24的核苷酸3378-3495或由其组成的序列。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，人磷酸甘油酸激酶1(hpgk)启动子包含以下任何序列、其功能片段或与以下任何序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

ggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccag(seqidno:7)；或

包含seqidno:24的核苷酸3541-4051或由其组成的序列。

由于大多数fa患者属于fa-a互补组(casado等，2007，levitus等，2004，taniguchi等，2006)，在特定实施方案中，编码的治疗性基因产物是fanca，尽管本公开设想了其他互补组的fa蛋白也可以被递送，并因此在本文公开的表达盒中编码，例如代替fanca。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，编码fanca的多核苷酸序列是人fancacdna序列，其包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

atgtccgactcgtgggtcccgaactccgcctcgggccaggacccagggggccgccggagggcctgggccgagctgctggcgggaagggtcaagagggaaaaatataatcctgaaagggcacagaaattaaaggaatcagctgtgcgcctcctgcgaagccatcaggacctgaatgcccttttgcttgaggtagaaggtccactgtgtaaaaaattgtctctcagcaaagtgattgactgtgacagttctgaggcctatgctaatcattctagttcatttataggctctgctttgcaggatcaagcctcaaggctgggggttcccgtgggtattctctcagccgggatggttgcctctagcgtgggacagatctgcacggctccagcggagaccagtcaccctgtgctgctgactgtggagcagagaaagaagctgtcttccctgttagagtttgctcagtatttattggcacacagtatgttctcccgtctttccttctgtcaagaattatggaaaatacagagttctttgttgcttgaagcggtgtggcatcttcacgtacaaggcattgtgagcctgcaagagctgctggaaagccatcccgacatgcatgctgtgggatcgtggctcttcaggaatctgtgctgcctttgtgaacagatggaagcatcctgccagcatgctgacgtcgccagggccatgctttctgattttgttcaaatgtttgttttgaggggatttcagaaaaactcagatctgagaagaactgtggagcctgaaaaaatgccgcaggtcacggttgatgtactgcagagaatgctgatttttgcacttgacgctttggctgctggagtacaggaggagtcctccactcacaagatcgtgaggtgctggttcggagtgttcagtggacacacgcttggcagtgtaatttccacagatcctctgaagaggttcttcagtcataccctgactcagatactcactcacagccctgtgctgaaagcatctgatgctgttcagatgcagagagagtggagctttgcgcggacacaccctctgctcacctcactgtaccgcaggctctttgtgatgctgagtgcagaggagttggttggccatttgcaagaagttctggaaacgcaggaggttcactggcagagagtgctctcctttgtgtctgccctggttgtctgctttccagaagcgcagcagctgcttgaagactgggtggcgcgtttgatggcccaggcattcgagagctgccagctggacagcatggtcactgcgttcctggttgtgcgccaggcagcactggagggcccctctgcgttcctgtcatatgcagactggttcaaggcctcctttgggagcacacgaggctaccatggctgcagcaagaaggccctggtcttcctgtttacgttcttgtcagaactcgtgccttttgagtctccccggtacctgcaggtgcacattctccacccacccctggttcccagcaagtaccgctccctcctcacagactacatctcattggccaagacacggctggccgacctcaaggtttctatagaaaacatgggactctacgaggatttgtcatcagctggggacattactgagccccacagccaagctcttcaggatgttgaaaaggccatcatggtgtttgagcatacggggaacatcccagtcaccgtcatggaggccagcatattcaggaggccttactacgtgtcccacttcctccccgccctgctcacacctcgagtgctccccaaagtccctgactcccgtgtggcgtttatagagtctctgaagagagcagataaaatccccccatctctgtactccacctactgccaggcctgctctgctgctgaagagaagccagaagatgcagccctgggagtgagggcagaacccaactctgctgaggagcccctgggacagctcacagctgcactgggagagctgagagcctccatgacagaccccagccagcgtgatgttatatcggcacaggtggcagtgatttctgaaagactgagggctgtcctgggccacaatgaggatgacagcagcgttgagatatcaaagattcagctcagcatcaacacgccgagactggagccacgggaacacattgctgtggacctcctgctgacgtctttctgtcagaacctgatggctgcctccagtgtcgctcccccggagaggcagggtccctgggctgccctcttcgtgaggaccatgtgtggacgtgtgctccctgcagtgctcacccggctctgccagctgctccgtcaccagggcccgagcctgagtgccccacatgtgctggggttggctgccctggccgtgcacctgggtgagtccaggtctgcgctcccagaggtggatgtgggtcctcctgcacctggtgctggccttcctgtccctgcgctctttgacagcctcctgacctgtaggacgagggattccttgttcttctgcctgaaattttgtacagcagcaatttcttactctctctgcaagttttcttcccagtcacgagatactttgtgcagctgcttatctccaggccttattaaaaagtttcagttcctcatgttcagattgttctcagaggcccgacagcctctttctgaggaggacgtagccagcctttcctggagacccttgcaccttccttctgcagactggcagagagctgccctctctctctggacacacagaaccttccgagaggtgttgaaagaggaagatgttcacttaacttaccaagactggttacacctggagctggaaattcaacctgaagctgatgctctttcagatactgaacggcaggacttccaccagtgggcgatccatgagcactttctccctgagtcctcggcttcagggggctgtgacggagacctgcaggctgcgtgtaccattcttgtcaacgcactgatggatttccaccaaagctcaaggagttatgaccactcagaaaattctgatttggtctttggtggccgcacaggaaatgaggatattatttccagattgcaggagatggtagctgacctggagctgcagcaagacctcatagtgcctctcggccacaccccttcccaggagcacttcctctttgagattttccgcagacggctccaggctctgacaagcgggtggagcgtggctgccagccttcagagacagagggagctgctaatgtacaaacggatcctcctccgcctgccttcgtctgtcctctgcggcagcagcttccaggcagaacagcccatcactgccagatgcgagcagttcttccacttggtcaactctgagatgagaaacttctgctcccacggaggtgccctgacacaggacatcactgcccacttcttcaggggcctcctgaacgcctgtctgcggagcagagacccctccctgatggtcgacttcatactggccaagtgccagacgaaatgccccttaattttgacctctgctctggtgtggtggccgagcctggagcctgtgctgctctgccggtggaggagacactgccagagcccgctgccccgggaactgcagaagctacaagaaggccggcagtttgccagcgatttcctctcccctgaggctgcctccccagcacccaacccggactggctctcagctgctgcactgcactttgcgattcaacaagtcagggaagaaaacatcaggaagcagctaaagaagctggactgcgagagagaggagctattggttttccttttcttcttctccttgatgggcctgctgtcgtcacatctgacctcaaatagcaccacagacctgccaaaggctttccacgtttgtgcagcaatcctcgagtgtttagagaagaggaagatatcctggctggcactctttcagttgacagagagtgacctcaggctggggcggctcctcctccgtgtggccccggatcagcacaccaggctgctgcctttcgctttttacagtcttctctcctacttccatgaagacgcggccatcagggaagaggccttcctgcatgttgctgtggacatgtacttgaagctggtccagctcttcgtggctggggatacaagcacagtttcacctccagctggcaggagcctggagctcaagggtcagggcaaccccgtggaactgataacaaaagctcgtctttttctgctgcagttaatacctcggtgcccgaaaaagagcttctcacacgtggcagagctgctggctgatcgtggggactgcgacccagaggtgagcgccgccctccagagcagacagcaggctgcccctgacgctgacctgtcccaggagcctcatctcttctga

(seqidno:8)。

本公开包括包含本文所述的表达盒或转移盒的质粒。在特定的实施方案中，质粒是pccl-pgk-fanca-wpre*(图41；seqidno:24)。

在某些实施方案中，本公开包括细胞，例如包装细胞或包装细胞系，例如293细胞，其包含本文公开的质粒。在特定实施方案中，细胞包含图38-41中所示的质粒。

在某些实施方案中，本文公开的转移盒或质粒还包含一个或多个另外的元件，例如cmv启动子和/或增强子、sv40polya序列、复制起始点，例如sv40ori序列，或本文公开的任何元件。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的特定实施方案中，人cmv增强子包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg(seqidno:9)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的特定实施方案中，猿猴病毒40(sv40)poly(a)信号包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

aacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta(seqidno:10)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的特定实施方案中，sv40复制起始点包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

atcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcc(seqidno:11)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的dnef信号包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

gaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggac(seqidno:13)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的特定实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的kanr序列包含以下序列或由以下序列组成：

atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggcggcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgtccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggcgacgacgggcgttccttgcgcggctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgtctatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccacggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccgtctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttccttgtgctttacggtatcgccgcgcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga(seqidno:14)

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体的rrng终止子(来自大肠杆菌(e.coli)核糖体rnarrng操纵子的转录终止子(albrechtsen等，1991))包含以下序列或由以下序列组成：

gcattggcgcagaaaaaaatgcctgatgcgacgctgcgcgtcttatactcccacatatgccagattcagcaacggatacggcttccccaacttgcccacttccatacgtgtcctccttaccagaaatttatccttaa(seqidno:15)

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的ori(高拷贝数cole1/pmb1/pbr322/puc复制起始点)包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

ttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaa(seqidno:16)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的cap结合位点包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：taatgtgagttagctcactcat(seqidno:17)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的大肠杆菌lac启动子包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：tttacactttatgcttccggctcgtatgttg(seqidno:18)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的lac操纵子包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：ttgtgagcggataacaa(seqidno:19)

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的t3启动子(噬菌体t3rna聚合酶的启动子)包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：aattaaccctcactaaagg(seqidno:20)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的t7启动子(噬菌体t7rna聚合酶的启动子)包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：cctatagtgagtcgtatta(seqidno:21)。

在本文所述的任何转移盒、质粒或载体的一些实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的f1ori(f1噬菌体复制起点)包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：acgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaatt(seqidno:22)。

如本文所论述的，本发明的多核苷酸盒可包含rna输出信号。示例性rna输出序列包括但不限于wpre。通过以不依赖于转基因、启动子和载体的方式增加rna稳定性，wpre显著增加靶细胞中的转基因表达(zuffrey等，1999)。然而，其可以表达源自参与肝癌的whvx基因的截短的60个氨基酸的蛋白质(kingsman等，2005)。因此，大多数临床前方案和临床试验包括wpre元件的突变形式(zanta-boussif等，2009)。另一方面，已经看到在sin-lv载体中使用两个sv40-use元件在抑制转录通读方面比wpre序列更高效(schambach等，2007)。更确切地说，本文公开的wpre是嵌合wpre，其携带来自由axelschambach进行修饰的wpre的589个核苷酸(核苷酸1-589)(wo2008136670a2；[5])和来自以前的wpre的88个核苷酸(核苷酸590-677)(zuffrey等，1999)。本文公开的数据显示该嵌合wpre比以前的wpre更好地起作用。嵌合wpre序列包含以下序列、其功能片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成：

cgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg(seqidno:23)。

在特定实施方案中，突变的wpre序列包含wpre*或由其组成，所述wpre*对应于seqidno:24的核苷酸8502-9178，或者与seqidno:24的该区域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性。

本领域技术人员将容易理解本文公开的或本领域已知的元件的其他组合。

另外，如本领域普通技术人员将认识到的，多核苷酸盒可任选地含有其他元件，包括但不限于促进克隆的限制性位点和特定基因表达载体的调控元件。

在本发明的一些方面，主题多核苷酸盒用于将基因递送至细胞，例如以测定基因对细胞活力和/或功能的影响，治疗细胞病症等。在各种实施方案中，通过转导将病毒载体递送至细胞可以在体外、离体或体外进行。因此，在本发明的一些方面，在哺乳动物细胞中提供转基因表达的组合物是基因递送载体，其中基因递送载体包含本公开的多核苷酸盒，例如基因转移盒。

用于将多核苷酸序列递送至哺乳动物细胞的任何方便的基因递送载体包括在本公开的基因递送载体中。例如，载体可包含单链或双链核酸，例如，单链或双链dna。例如，基因递送载体可以是dna，例如裸dna，例如质粒、小环等。载体可包含单链或双链rna，包括rna的修饰形式。在另一个实例中，基因递送载体可以是rna，例如mrna或经修饰的mrna。

作为另一个实例，基因递送载体可以是源自以下病毒的病毒载体：例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(lv)、疱疹病毒、甲病毒或逆转录病毒，例如，莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、弗林德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)或劳氏肉瘤病毒(rsv)。虽然下面更详细地描述了包括lv的使用的实施方案，但预期普通技术人员将理解，本领域的类似知识和技能也可以用于非lv基因治疗性载体。

在一些实施方案中，基因递送载体是自限性lv。在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的具体实施方案中，转移盒是本公开的pccl-sin-cppt/cts–hpgk-hfanca-wpre(图41)，其包含以下序列或与seqidno:24具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列或由所述序列组成。seqidno:24对应于图41的pccl-pgk-fanca-wpre*质粒。

在一个实施方案中，通过慢病毒载体(lv)递送fanca基因。本文描述的fancalv利用自失活慢病毒载体(lv)。在一个实施方案中，fancalv包含人磷酸甘油酸(pgk)基因的启动子。与已在临床中使用的γ-逆转录病毒载体(该载体具有强病毒启动子)相比，该载体的安全性质得到了显著改善。

在某些实施方案中，慢病毒载体是pgk-fanca.wpre*lv，其包含图1中描绘的基因转移盒，所述基因转移盒包含seqidno:24中公开的序列。pgk-fanca-wpre*lv基因表达盒部分包含人pgk启动子、fancacdna的编码序列和wpre*；并且对应于seqidno:24的核苷酸3541至9178。pgk-fanca-wpre*lv转移盒部分从约5'ltr(u5)至约3'ltr(u5)包含图41中所示的序列。关于seqidno:24，seqidno:24的核苷酸1586-1789包含人cmv立即早期启动子。seqidno:24的核苷酸2031-2156包含hiv1psi包装信号。seqidno:24的核苷酸2649-2882包含hiv1rre元件。seqidno:24的核苷酸3378-3495包含hivcppt/cts元件。seqidno:24的核苷酸3541-4051包含hpgk启动子。seqidno:24的核苷酸4078-8445包含人fanca-acdna。seqidno:24的核苷酸8502-9178包含突变的wpre元件。seqidno:24的核苷酸9262-9495包含hivδu3'ltr。

在另一个实施方案中，慢病毒载体含有以下元件：

(i)源自初始pcclsin-cppt-hpgk-egfp-wpre的慢病毒载体的骨架(dull等，1998；j.virol72(11),9873-9880)。pccl骨架利用异源cmv-hiv5'ltr在生产细胞中获得高水平的病毒rna转录。这种异源ltr使得构建体不依赖于使用hivtat蛋白产生rhiv颗粒的需要，因此其是一种安全特征。如(zufferey等，jvirol,1998)中所述，3'ltr的u3区含有400bp缺失，其赋予载体以自身失活性质；

(ii)在人pgk启动子控制下的编码fanca蛋白(1455aa)的人fanca基因的cdna(4368bpgenbank登录号：x_99226或如本文所公开的)。与已用于基因疗法的其他启动子相比，该启动子的特征在于其体内稳定的活性和提高的安全性；以及

(iii)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)的突变形式，其在编码x蛋白的序列的3'区域和schambach等(genetherapy,2006；13,641-645)描述的任何残留orf或wpre*中缺失。

可使用标准方法产生包封本公开的多核苷酸盒的基因治疗性载体。例如，在lv病毒体的情况下，可将根据本发明的lv表达载体引入生产细胞，然后引入lv辅助构建体，其中所述辅助构建体包括能够在生产细胞中表达并且弥补lv载体中不存在的lv辅助功能的lv编码区。然后将辅助病毒和/或另外的载体引入生产细胞，其中辅助病毒和/或另外的载体提供能够支持高效lv病毒产生的辅助功能。然后培养生产细胞以产生lv。这些步骤使用标准方法进行。在特定的实施方案中，图38-41中描绘的质粒用于产生基因递送载体。

可以使用用于产生用于递送主题多核苷酸盒的病毒颗粒的任何合适方法，包括但不限于以下实施例中描述的那些。可以制备适于有效转导哺乳动物细胞的任何浓度的病毒颗粒，用于在体外或体内接触哺乳动物细胞。例如，病毒颗粒可以以每毫升10⁸个载体基因组/ml或更高，例如，5x10⁸个载体基因组/ml、10⁹个载体基因组/ml、5x10⁹个载体基因组/ml,10¹⁰个载体基因组/ml,5x10¹⁰个载体基因组/ml、10¹¹个载体基因组/ml、5x10¹¹个载体基因组/ml、10¹²个载体基因组/ml、5x10¹²个载体基因组/ml、10¹³个载体基因组/ml、1.5x10¹³个载体基因组/ml、3x10¹³个载体基因组/ml、5x10¹³个载体基因组/ml、7.5x10¹³个载体基因组/ml、9x10¹³个载体基因组/ml、1x10¹⁴个载体基因组/ml、5x10¹⁴个载体基因组/ml或更多个载体基因组或更高的浓度配制，但通常每毫升不超过1x10¹⁵个载体基因组/ml。

在制备主题lv组合物中，可以使用任何用于产生lv病毒体的宿主细胞，包括例如哺乳动物细胞(例如293细胞)、昆虫细胞(例如sf9细胞)、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中lvrep和cap基因稳定地保持在其中lv载体基因组得以稳定地维持和包装的宿主细胞或生产细胞中。示例性包装和生产细胞源自sf-9细胞、293细胞、a549细胞或hela细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制lv载体。

在某些实施方案中，本发明包括含有本文公开的基因表达盒、基因转移盒或基因递送载体的细胞。在相关的实施方案中，用包含本文公开的表达盒的基因递送载体转导细胞，或者所述细胞将本文公开的表达盒整合到细胞的基因组中。

在某些实施方案中，细胞是用于产生病毒基因递送载体的细胞，例如包装细胞。

在其他实施方案中，细胞是待递送至受试者以向受试者提供由表达盒编码的基因产物的细胞。因此，在某些实施方案中，细胞对待治疗的受试者是自体的，或者获自待治疗的受试者。在其他实施方案中，细胞对于待治疗的受试者是同种异体的，或者获自除待治疗的受试者以外的供体。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在某些实施方案中，细胞是血细胞、红细胞、造血祖细胞、骨髓细胞，例如谱系耗尽的骨髓细胞、造血干细胞(例如cd34+)或定型的造血红细胞祖细胞。在特定的实施方案中，细胞是cd34+细胞，其获自待用在其被本文公开的基因递送载体转导后的细胞治疗的受试者。在特定的实施方案中，细胞是获自被诊断为患有fa的受试者的cd34+fa细胞。

本发明包括药物组合物，其包含本文所述的多核苷酸盒、基因递送载体或细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋型剂。主题多核苷酸盒、基因递送载体或细胞可以与药学上可接受的载体、稀释剂和试剂组合，所述载体、稀释剂和试剂可用于制备通常安全、无毒和期望的制剂，并且包括灵长类动物可接受的赋型剂。此类赋型剂可以是固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下，可以是气态的。此类赋型剂、载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可将补充的活性化合物掺入制剂中。用于制剂的溶液或悬浮液可包括无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物诸如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；防止聚集的去垢剂诸如tween20；和用于调节张力的化合物诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节ph。在特定的实施方案中，药物组合物是无菌的。

适用于本发明的药物组合物还包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。

无菌溶液可通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分中的一种或其组合(如果需要的话)一起掺入到适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上面列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其另外的所需成分的粉剂。

在一个实施方案中，用将保护基因盒或表达载体免于从体内快速消除的载体制备组合物，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。所述材料也可商购获得。

以单位剂型配制口服、眼用或肠胃外组合物对于方便剂量的施用和一致性是特别有利的。如本文所用的单位剂型是指作为单位剂量供待治疗的受试者使用的物理上分离的单位；每个单位含预定量的活性化合物，该量经计算与所需药物载体相结合产生所需的治疗效果。本发明的单位剂型的说明书由活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及配制这种用于治疗个体的活性化合物的技术中固有的限制规定并且直接取决于其。

药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如注射器，例如预充式注射器)中。

本发明的药物组合物包括任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或在向动物(包括人)施用时能够(直接或间接)提供生物活性代谢产物或其残留物的任何其他化合物。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物活性并且不对其赋予不期望的毒理学作用的盐。多种药学上可接受的盐是本领域已知的并且描述于例如“remington’spharmaceuticalsciences”，第17版，alfonsor.gennaro(ed.),markpublishingcompany,easton,pa,usa,1985(和其最近的版本)、“encyclopaediaofpharmaceuticaltechnology”，第3版，jamesswarbrick(编辑),informahealthcareusa(inc.),ny,usa,2007以及j.pharm.sci.66:2(1977)中。另外，关于合适的盐的综述，参见stahl和wermuth的handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse(wiley-vch,2002)。

药学上可接受的碱加成盐可用金属或胺诸如碱金属和碱土金属或有机胺形成。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括n-n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见，例如，berge等，“pharmaceuticalsalts,”j.pharmasci.,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与足量的所需碱接触以以常规方式产生盐来制备。可通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸来再生游离酸形式。游离酸形式在某些物理性质(诸如在极性溶剂中的溶解度)稍微不同于它们各自的盐形式，但在其他方面，对于本发明的目的而言，盐与它们各自的游离酸等同。

可将主题多核苷酸盒、基因递送载体，例如重组病毒(病毒体)或细胞(例如，用本文公开的基因递送载体转导的)掺入药物组合物中，用于向哺乳动物患者(特别是灵长类动物等，更特别地人)施用。可将主题多核苷酸盒、基因递送载体，例如，病毒体或细胞配制在无毒的、惰性的、药学上可接受的含水载体中，优选ph范围为3-8，更优选范围为6-8。此类无菌组合物将包含溶解在当复原时具有可接受的ph的水性缓冲液中的载体或病毒体，所述载体或病毒体含有编码治疗性分子的核酸。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的本文公开的细胞、载体或病毒体与药学上可接受的载体和/或赋型剂的混合物，所述载体和/或赋型剂是例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其他蛋白质。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、葡聚糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和乙二醇。优选地，该制剂在4℃下稳定至少六个月。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和普通技术人员已知的其他缓冲液，诸如good等(1966)biochemistry5:467描述的那些。其中包含在腺病毒载体递送系统中的肿瘤抑制基因的药物组合物的缓冲液的ph可以在6.5至7.75，优选7至7.5，最优选7.2至7.4的范围内。

在某些实施方案中，可将病毒载体配制成任何合适的单位剂量，包括但不限于1x10⁸个载体基因组或更多，例如，1x10⁹个、1x10¹⁰个、1x10¹¹个、1x10¹²个或1x10¹个载体基因组或更多，在某些情况下，1x10¹⁴个载体基因组，但通常不超过4x10¹⁵个载体基因组。在一些情况下，单位剂量最多约为5x10¹⁵个载体基因组，例如，1x10¹⁴个载体基因组或更少，例如1x10¹³个、1x10¹²个、1x10¹¹个、1x10¹⁰个或1x10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下1x10⁸个载体基因组或更少，并且通常不少于1x10⁸个载体基因组。在一些情况下，单位剂量是1x10¹⁰至1x10¹¹个载体基因组。在一些情况下，单位剂量是1x10¹⁰至3x10¹²个载体基因组。在一些情况下，单位剂量是1x10⁹至3x10¹³个载体基因组。在一些情况下，单位剂量是1x10⁸至3x10¹⁴个载体基因组。在一个实施方案中，该范围是约5x10¹⁰至约1x10¹¹个载体基因组。在一些实施方案中，该范围是约1x10⁹至约1x10¹⁰个载体基因组。

在一些情况下，可以使用感染复数(moi)测量药物组合物的单位剂量。moi意指载体或病毒基因组对可向其递送核酸的细胞的比率或倍数。在某些情况下，moi可以是1x10⁶。在某些情况下，moi可以是1x10⁵-1x10⁷。在某些情况下，moi可以是1x10⁴-1x10⁸。在一些情况下，本公开的重组病毒至少约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸moi。在一些情况下，本公开的重组病毒为1x10⁸至3x10¹⁴moi。在一些情况下，本公开的重组病毒至多约1x10¹,1x10²,1x10³,1x10⁴,1x10⁵,1x10⁶,1x10⁷,1x10⁸,1x10⁹,1x10¹⁰,1x10¹¹,1x10¹²,1x10¹³,1x10¹⁴,1x10¹⁵,1x10¹⁶,1x10¹⁷和1x10¹⁸moi。在一些实施方案中，该范围为约20至约400moi。

在一些方面，药物组合物的量包含约1x10⁸至约1x10¹⁵个重组病毒，约1x10⁹至约1x10¹⁴个重组病毒，约1x10¹⁰至约1x10¹个重组病毒，或约1x10¹¹至约3x10¹²个重组病毒。

方法

如下文更详细讨论的，在本文中统称为“主题组合物”的主题多核苷酸盒和基因递送载体可用于在动物细胞(例如，哺乳动物或人)中表达转基因，例如fanca。例如，主题组合物可用于研究，例如，以测定基因对细胞活力和/或功能的作用。作为另一个实例，主题组合物可用于医学中，例如以治疗诸如fa的病症。因此，在本发明的一些方面，提供了用于在细胞中表达基因的方法，该方法包括使细胞与本公开的组合物接触。在一些实施方案中，接触在体外进行。在一些实施方案中，接触在体内进行，即，向受试者施用主题组合物。

对于其中将哺乳动物细胞在体外或体内与包含主题多核苷酸盒的主题多核苷酸盒或基因递送载体接触的情况，细胞可以来自任何哺乳动物物种，例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠、松鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛、灵长类动物、人。细胞可来自已建立的细胞系，或者其可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，指的是源自受试者并且允许在体外生长有限数量的培养传代(即，分裂)的细胞和细胞培养物。例如，原代培养物是可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次但不足以经历危机阶段的培养物。通常，本发明的原代细胞系在体外维持少于10次传代。

本发明的实施方案包括用病毒递送载体(例如，含有人fanca基因的lv载体)转导的哺乳动物细胞(例如，cd34+细胞)。另外，本发明包括转导哺乳动物细胞(例如，本文所述的人造血干细胞或其他细胞)转导哺乳动物细胞的方法，其包括使细胞与本文公开的或包含本文所述的表达盒的基因递送载体(例如lv载体)接触。在某些实施方案中，细胞先前获自待治疗的受试者或获自另一供体。在特定实施方案中，受试者被诊断患有范可尼贫血，并且用包含编码fanca编码区或cdna的表达盒的lv转导细胞。应当理解，所公开的方法，例如用于将fanca基因产物(例如，使用fancacdna序列)递送至受试者的那些方法也可用于治疗范可尼贫血。在特定实施方案中，转导的细胞是获自患有fa的受试者获得的细胞群，一旦它们被转导，就用所述细胞治疗所述受试者。细胞可获自骨髓或血液。在某些实施方案中，用药剂治疗患有fa的受试者以动员干细胞，然后从受试者抽取血液，除去红细胞，并选择cd34+细胞。选择后，然后转导细胞。在特定实施方案中，在使用前将转导的细胞储存或冷冻，而在某些实施方案中，在转导后立即或不久(例如在1小时、2小时或4小时内)将它们提供给受试者。

在某些实施方案中，当用本文公开的基因递送载体转导细胞时，使细胞与基因递送载体接触约30分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约12小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时。在一些实施方案中，将细胞转导少于60小时、少于48小时、少于36小时或少于24小时。

可向受试者细胞提供主题多核苷酸盒或包含所述主题多核苷酸盒的基因递送载体1次或多次，例如，1次、2次、3次或多于3次，并且在每次接触事件之后允许细胞与一种或多种药剂一起孵育一段时间(例如16-24小时)，在该时间后用新鲜培养基更换培养基，并进一步培养细胞。接触细胞可以在任何培养基中和在促进细胞存活的任何培养条件下进行。培养物可含有细胞所响应的生长因子。如本文所定义的，生长因子是能够通过对跨膜受体的特异性作用促进细胞在培养物或完整组织中的存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。

通常，提供有效量的主题基因递送载体或包含所述主题多核苷酸盒的转导细胞以在细胞中产生转基因的表达。如本文其他地方所论述的，有效量可以根据经验来容易地确定，例如，通过检测转基因产物的存在或水平，通过检测对细胞活力或功能的影响等来测定。通常，主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体的作用量将在细胞中促进比相同量的本领域已知的多核苷酸核更多的表达。通常，相对于来自参考多核苷酸盒或对照多核苷酸盒(例如，如本领域中已知的)的表达，表达将增强2倍或更多，例如3倍、4倍或5倍或更多，在某些情况下为10倍、20倍或50倍或更多，例如100倍。

对于其中将使细胞与主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体在体内接触的情况，受试者可以是任何哺乳动物，例如，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛或灵长类动物。在另外的优选实施方案中，灵长类动物是人。在另外的实施方案中，细胞是cd34+细胞。

本公开的方法和组合物可用于例如范可尼贫血的治疗。

在一些实施方案中，主题方法产生治疗益处，例如，预防病症的发展，停止病症的进展，逆转病症的进展等。例如，在一个实施方案中，病症是bmf。在一个实施方案中，所述病症是血小板减少症。在另一个实施方案中，所述疾病是白细胞减少症。在一个实施方案中，所述病症是全血细胞减少症。在一个实施方案中，所述病症是中性粒细胞减少症。在另一个实施方案中，所述病症是贫血症。在一些实施方案中，主题方法包括检测已经实现治疗益处的步骤。普通技术人员将理解，这种治疗功效的测量在改动后将适用于特定疾病，并且将认识到用于测量治疗功效的适当检测方法。

在另一个实施方案中，本发明包括治疗有此需要的受试者的疾病的方法，包括向受试者提供有效量的用在细胞中表达治疗性基因产物的基因递送载体(例如，病毒载体)转导的细胞。在特定实施方案中，细胞对受试者是自体的。在某些实施方案中，细胞是红系细胞，例如造血干细胞或定型的造血红细胞祖细胞。在一些实施方案中，细胞是骨髓细胞，例如谱系耗尽的骨髓细胞。在特定实施方案中，该方法用于治疗fa，并且病毒载体是包含本文公开的表达构建体的lv，所述表达构建体包含与fanca基因cdna或编码序列可操作地连接的人pgk启动子，和本文公开的突变的wpre。在特定实施方案中，例如通过静脉内注射将细胞肠胃外提供给受试者。

在另一个实施方案中，本发明包括在有此需要的受试者中治疗fa的方法，其包括向受试者提供有效量的用lv载体转导的自体cd34+干细胞，所述lv载体在细胞中表达fancacdna，其中lv载体包含与fancacdna或编码序列可操作连接的人pgk启动子，和本文公开的突变的wpre序列。在特定实施方案中，细胞是造血干细胞或定型的造血红细胞祖细胞，例如骨髓细胞。在特定实施方案中，将细胞经肠胃外例如通过静脉内注射提供给受试者。

使用主题转基因的转基因表达预期是稳健的。因此，在一些情况下，可在施用后两个月或更短时间，例如在主题组合物施用后4周、3周或2周或更短时间，例如在主题组合物施用后1周观察到转基因的表达(例如，如通过测量基因产物的水平，通过测量治疗功效等所检测的)。预计转基因的表达也会随着时间的推移而持续存在。因此，在一些情况下，可在主题组合物施用后两个月或更长时间，例如4个月、6个月、8个月或10个月或更长时间，在一些情况下1年或更长时间，例如2年、3年、4年或5年，在某些情况下超过5年，观察到转基因的表达(例如，如通过测量基因产物的水平，通过测量治疗功效等所检测的)。

在某些实施方案中，该方法包括检测转基因在细胞或受试者中的表达的步骤，其中相对于不包含本公开的一种或多种改进的元件的多核苷酸盒的表达而言，表达得以增强。通常，相对于来自参考多核苷酸盒(即对照多核苷酸盒，例如，如本领域中已知的)的表达而言，表达将增强至2倍或更多，例如3倍、4倍或5倍或更多，在某些情况下10倍、20倍或50倍或更多，例如100倍，如通过例如更早的检测、更高水平的基因产物、对细胞的更强功能影响等所证明的。

通常，如果主题组合物是包含本公开的主题多核苷酸盒的lv，实现变化的有效量将为约1x10⁸个载体基因组或更多，在一些情况下1x10⁹个、1x10¹⁰个、1x10¹¹个、1x10¹²个或1x10¹³个载体基因组或更多，在某些情况下，1x10¹⁴个载体基因组或更多，并且通常不超过1x10¹⁵个载体基因组。在一些情况下，被递送的载体基因组的量至多为约1x10¹⁵个载体基因组，例如，1x10¹⁴个个载体基因组或更少，例如1x10¹³个、1x10¹²个、1x10¹¹个、1x10¹⁰个或1x10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下为1x10⁸个载体基因组，并且通常不少于1x10⁸个载体基因组。在一些情况下，被递送的载体基因组的量是1x10¹⁰个至1x10¹¹个载体基因组。在一些情况下，被递送的载体基因组的量是1x10¹⁰个至3x10¹²个载体基因组。在一些情况下，被递送的载体基因组的量是1x10⁹个至3x10¹³个载体基因组。在一些情况下，被递送的载体基因组的量是1x10⁸个至3x10¹⁴个载体基因组。

在一些情况下，可以使用感染复数(moi)测量待施用的药物组合物的量。在一些情况下，moi可以指载体或病毒基因组相对于可向其递送核酸的细胞的比率或倍数。在一些情况下，moi可以是1x10⁶。在一些情况下，moi可以是1x10⁵-1x10⁷。在一些情况下，moi可以是1x10⁴-1x10⁸。在一些情况下，本公开的重组病毒至少为约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸moi。在一些情况下，本公开的重组病毒为1x10⁸至3x10¹⁴moi。在一些情况下，本公开的重组病毒至多为约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸moi。

在一些方面，药物组合物的量包含约1x10⁸至约1x10¹⁵个重组病毒颗粒，约1x10⁹至约1x10¹⁴个重组病毒颗粒，约1x10¹⁰至约1x10¹³个重组病毒颗粒，或约1x10¹¹至约3x10¹²个重组病毒颗粒。

可以向哺乳动物施用适合于提供适当的细胞转导以赋予所需效果或治疗疾病的任何总数的病毒颗粒。在各种优选实施方案中，注射至少10⁸个、5x10⁸个、10⁹个、5x10⁹,10¹⁰,5x10¹⁰个、10¹¹个、5x10¹¹个、10¹²个、5x10¹²个、10¹³个、1.5x10¹³个、3x10¹³个、5x10¹³个、7.5x10¹³个、9x10¹³,1x10¹⁴个病毒颗粒，或5x10¹⁴个病毒颗粒或更多，但通常不超过5x10¹⁵个病毒颗粒。可对哺乳动物或灵长类动物的眼睛施用任何合适数量的载体。在一个实施方案中，该方法包括单次施用；在其他实施方案中，在如主治临床医生认为适当的一段时间内进行多次施用。在一些实施方案中，在单次施用(24小时转导)中需要至少2x10⁸vg/ml的5x10⁵个细胞/ml，以产生高转导效率。个体剂量通常不小于对受试者产生可测量的效果所需的量，并且可基于主题组合物或其副产物的吸收、分布、代谢和排泄(“adme”)的药代动力学和药理学来确定，从而基于组合物在受试者内的分配来决定。这包括施用途径以及剂量量的考虑。剂量的有效量和/或给药方案可凭经验根据测定，根据安全性以及按比例放大(escalation)和剂量范围试验、个别医生-患者关系以及体外和体内测定(诸如本文所述和实施例中举例说明的那些)来容易地确定。

在一些实施方案中，患者通过输注接受的细胞剂量将是从转导过程获得的剂量。在各种优选的实施方案中，将至少约1x10¹个、1x10²个、1x10³个、1x10⁴个、1x10⁵个、1x10⁶个、1x10⁷个、1x10⁸个或更多个cd34+细胞/kg患者体重输注到患者体内。在一些实施方案中，将1x10⁶个至4x10⁶个cd34+细胞/kg患者体重输注到患者体内。在其他实施方案中，将3x10⁵个至4x10⁶个cd34⁺细胞/kg患者体重输注到患者体内。在一些实施方案中，将细胞以单剂量输注到患者体内。在其他实施方案中，细胞将以多个剂量输注到患者体内。可在转导过程完成后立即输注转导的细胞。

一旦整合，治疗性蛋白质(例如，人fanca蛋白质)由细胞表达。转导的fa细胞被遗传校正，因此能够通过fancd2和fanci的单遍在化激活fa途径。这些蛋白质迁移到dna损伤区域，并与其他dna修复蛋白质合作，促进这些细胞中dna的修复，如健康细胞中所发生的那样。

如实施例中进一步详细描述的，关于来自人fa患者的bm样品的临床前体外数据已经显示fancalv校正这些细胞表型的功效。

因此，本发明提供了治疗fa的血液学表现的方法。在一个实施方案中，fa的血液学表现选自bmf、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血症中的一种或多种。在特定实施方案中，血液学表现是骨髓衰竭(bmf)，其在大多数fa患者的儿科年龄中出现。在一个实施方案中，血液学表现是血小板减少症。在另一个实施方案中，血液学表现是白细胞减少症。在一个实施方案中，血液学表现是全血细胞减少症。在一个实施方案中，血液学表现是中性粒细胞减少症。在另一个实施方案中，血液学表现是贫血。在一个实施方案中，血液学表现是bmf、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血症中的两种或更多种的组合。

fancalv不直接治疗可在疾病的更晚期阶段产生的实体瘤。然而，通过造血基因疗法治疗的fa患者的血液学状态的改善也可改善针对实体瘤发展的免疫监视。因此，间接抗肿瘤作用也可作为利用fancalv治疗fa患者的结果产生。

为了获得fa的成功基因治疗，从受试者收集“足够”数量的造血干细胞(hsc)是有益的。

在一个实施方案中，从骨髓样品中获得或收集hsc。在一个实施方案中，骨髓样品耗尽了红细胞。在一些实施方案中，骨髓样品耗尽cd16+白细胞。在一些实施方案中，洗涤耗尽技术后剩余的细胞。在另一个实施方案中，将非特异性igg加入洗涤的细胞中。在一些实施方案中，非特异性igg是flebogamma。随后，可从洗涤的细胞中选择cd34+细胞。在一个实施方案中，cd34+细胞选自骨髓样品。cd34+细胞的选择方法可以是正选择、负选择或其组合。

在另一个实施方案中，hsc获自外周血。在一个实施方案中，外周血样品耗尽了红细胞。在一些实施方案中，血液样品耗尽了cd16+白细胞。在一些实施方案中，洗涤耗尽技术后剩余的血细胞。在另一个实施方案中，将非特异性igg加入洗涤的细胞中。在一些实施方案中，非特异性igg是flebogamma。随后，可从洗涤的细胞中选择cd34+细胞。在一个实施方案中，cd34+细胞选自外周血样品。cd34+细胞的选择方法可以是正选择、负选择或其组合。

在本发明的一些实施方案中，hsc是在动员后从受试者获得的。可通过用导致干细胞从骨髓移动到血液中的药物或化合物治疗受试者来实现动员。可以收集和储存干细胞。在一些实施方案中，通过用g-csf(非格司亭)治疗受试者来实现动员。在其他实施方案中，通过用普乐沙福治疗受试者来实现动员。在另外的其他实施方案中，通过用非格司亭与普乐沙福的组合治疗受试者来实现动员。(图11和图14)

在一个实施方案中，施用至少1至4x10⁶个cd34⁺校正的细胞(例如，fanca转导的hsc)/千克患者体重以恢复非条件化fa患者的造血功能。在一些实施方案中，在转导后立即将转导的细胞输注或施用于患者。(图11)在其他实施方案中，在输注或施用于患者之前，将转导的细胞冷冻。(图11)

来自fa患者的hsc的遗传校正，随后这些细胞的自体移植(造血基因疗法)，对于fa患者，特别是那些缺乏hla相同的同胞的患者来说是很好的替代方案。在一个实施方案中，造血基因疗法对于缺乏hla相同的同胞的患者是优选治疗方案。在另一个实施方案中，造血基因疗法对于具有hla相同的同胞的患者是优选治疗方案。

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因为fa-a是fa患者中频率最高的互补组(casado等，2007，taniguchi等，2006)，表达fanca基因和/或egfp标记基因的载体是实施例的焦点；然而，其他fanca基因可用于类似地治疗其他互补组。

实施例

实施例1

fanca慢病毒载体。

由于lv相较于rv的更安全的整合模式(gonzalez-murillo等，2008；modlich等，2009；montini等，2006；mitchellrs,beitzelbf,schroderar等plosbiol.2004；2:e234；montinie等jclininvest.2009；119:964-975；schroderar等cell.2002；110:521-529)，其目的是将lv开发为校正fa细胞表型的治疗性载体(gonzalez-murillo等，2009)。另外，由于最近的研究表明，具有高效内部启动子的lv也可以反式激活邻近的基因(modlich等，2009)，所以lv被认为在临床中用作治疗效果和反式激活邻近基因的风险之间的折衷。因此，目的是定义可以是治疗性的fanca表达的阈值水平，以限制由驱动治疗性基因表达的增强子/启动子产生的基因反式激活的风险。首先在fa-alcl中体外验证fancalv的功效，然后在fa-a患者的原发性bm样品中验证fancalv的功效，最后在fa-a的小鼠模型中体内验证fancalv的功效。

为此目的，构建了在不同启动子：vav、pgk、cmv和sffv启动子控制下表达fanca的lv。图1是该药品的示意图。图2a显示了在不同内部启动子控制下表达fanca的lv的示意图。另外，我们还研究了转录后wpre元件在fanca的表达水平和lv的治疗功效方面的影响。最初，用嵌合galv-tr包膜包装所有lv。常规地获得1-2x10⁶tu/ml的滴度，并且以1-2tu/细胞的估计的moi进行转导。图2b显示了转导的fa-a细胞中的fanca的western印迹分析。

为了测定每种载体赋予的fancamrna水平，用30nmmmc选择转导的fa-a淋巴母细胞细胞系(lcl)5天。在选择过程之后，转导的fa-alcl含有每细胞0.81个至3.04个拷贝的各自lv(表1)。将用egfp-lv转导的未选择的fa-alcl和来自健康供体(hd)的lcl用作对照。

在用不同lv转导的lcl中测定总fancamrna水平以及每lv拷贝数的相对fancamrna水平(表1)。与在hdlcl中观察到的fancamrna水平相比，在用vav-fanca和pgk-fancalv转导的fa-a细胞中观察到相似水平的fancamrna/拷贝。cmv-fanca和更显著地sffv-fancalv赋予超生理水平的fancamrna/拷贝(分别为3.6倍和5.6倍)。具有wpre或突变的wpre*序列的pgk-fancalv(schambach等，2006)与没有wpre的pgk-lv相比使fancamrna水平升高至2.3-2.6倍。与其他研究(schambach等，2006；zanta-boussifma,charriers,brice-ouzeta等validationofamutatedpresequenceallowinghighandsustainedtransgeneexpressionwhileabrogatingwhv-xproteinsynthesis:applicationtothegenetherapyofwas.genether.2009；16:605-619；zuffereyr,donelloje,tronod,hopetj.woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelementenhancesexpressionoftransgenesdeliveredbyretroviralvectors.jvirol.1999；73:2886-2892)一致，wpre或wpre*序列的插入显著升高了用pgk-fancalv转导的细胞中的fancamrna水平。由于野生型wpre元件编码可介导致瘤作用的肝炎病毒x蛋白的c末端截短形式(bouchardmj,schneiderrj.theenigmaticxgeneofhepatitisbvirus.jvirol.2004；78:12725-12734.2004；kingsmansm,mitrophanousk,olsenjc.potentialoncogeneactivityofthewoodchuckhepatitispost-transcriptionalregulatoryelement(wpre).genether.2005；12:3-4)，缺乏任何残留开放阅读框的具有突变的wpre*序列的lv(schambach等，2006)被认为更适合临床用途。

表1用表达fanca的慢病毒载体转导的fa-alcls中的fanca表达水平。

*为了估计每拷贝fanca的fancamrna和fanca蛋白的水平，在健康供体lcl中考虑了2个拷贝的基因组fanca。

为了测试在蛋白质水平上是否证实fancamrna表达的差异，使用表1中所示的样品进行western印迹分析(图2b)。正如通过fancamrna测定所做的那样，fanca蛋白质值不仅与蛋白质加载量相关，而且还与在每个转导的fa-lcl中测定的前病毒拷贝数相关。与在hd-lcl中测定的fanca水平/拷贝相比，除sffv-fancalv外，所有测试的fanca-lv赋予了基本上正常水平的fanca/拷贝。在这种情况下，相对fanca水平/拷贝为hd-lcl中确定的水平的3.4倍。用抗fancd2重新染色的western印迹显示，虽然用对照载体转导的fa-alcl不能单遍在化fancd2，但用任一类型的fanca-lv转导的fa-alcl均表达非遍在化以及单遍在化形式的fancd2，与这些细胞中的功能性fa途径一致。

当将fa-alcl中由不同lv赋予的fanca表达水平与在健康供体(hd)lcl(具有两个fanca拷贝)中观察到的那些进行比较时，我们得出结论：除在sffv-lv(其将赋予超生理水平的fanca)的情况外，每细胞两个lv拷贝的插入可导致生理水平的治疗性蛋白。获得该拷贝数可符合fa患者的临床试验要求，其中可能需要至少50％的转导效率，因为这些患者的bm中存在少量的祖细胞(gonzalez-murillo等，2009,jacome等，2006，kelly等，2007；largheroj,marolleaujp,soulierj等hematopoieticprogenitorcellharvestandfunctionalityinfanconianemiapatients.blood.2002；100:3051)。

为了分析不同的表达fanca的lv的治疗功效的可能差异，测定每种载体校正fa-a淋巴母细胞细胞系(lcl)的mmc-超敏反应的效率。为此目的，用不同的lv(图3a)转导fa-alcl，然后暴露于递增浓度的mmc。此后，测定转导细胞的活力。如图3a所示，所有测试的fanca-lv同样高效地恢复fa-alcl的超敏反应。类似地，所有载体在mmc处理的细胞中促进核fancd2灶点的产生(图3b)，与用任一种fanca-lv转导的fa-a细胞中的功能性fa途径一致。

实施例2小鼠模型研究

为了评估来自fa患者的bm样品的重新注入(repopulating)特性，无论是否经遗传修正，若干组已将来自fa患者的bm细胞移植到免疫缺陷小鼠中。然而，在任何情况下都没有报道显著的移植物，最可能是因为这些患者的bm中存在的造血祖细胞和hsc的数量减少。

为了评价药物的体内作用，使用了在fanca基因中含有缺失的fa-a的小鼠模型。与fa患者相反，这些动物不会发展明显的血液学缺陷。然而，他们的bm祖细胞对mmc高度敏感(rio等，2002)，在fa患者中也同样如此。因此，为了确定fancalv(图4a)是否在体内稳定地校正来自fa-a小鼠的hsc的表型，用fancalv转导来自fa-a小鼠的bm细胞，然后移植到受辐照的fa-a受者中(图4b)。为了评估在经遗传修正的细胞移植后造血祖细胞的表型是否得到校正，将来自移植的fa-a小鼠的bm样品在mmc不存在和存在的情况下于甲基纤维素中培养(图4c)。确认治疗盒整合的附加数据示于图42-44中。线性扩增介导的(lam)pcr是将不同整合载体的整合位点检索到基因组中的方法。产生从载体的已知序列开始并延伸通过未知侧翼基因组的pcr产物，并对其进行测序以鉴定载体整合在基因组内的位置。图42表示fa造血干细胞(hsc)中fanca-lv插入位点的lam-pcr分析。图43描绘了用于跟踪fanca-lv处理的细胞的lam-pcr结果。图44显示移植了lv校正的hsc的fanca-/-受者的克隆多样性。

移植后1个月后，在这些动物中观察到正常的血液学计数，显示lv没有明显的毒性。此时，每细胞的前病毒fanca拷贝数在0.5至10个拷贝/细胞之间变化(在移植后3个月和6个月观察到类似的结果)(图5)。为了评估在经遗传修正的细胞移植后造血祖细胞的表型是否得以校正，将来自移植的fa-a小鼠的bm样品在mmc不存在和存在的情况下于甲基纤维素中培养。

如图6所示，与sf1-egfplv对照相比，在经历用fancalv进行的基因疗法的fa小鼠的造血祖细胞中观察到mmc-超敏反应的显著校正。用pgk_fanca-wpre*或对照sf1-egfplv转导fa-a骨髓(bm)细胞，并将其移植到经辐照的fa-a小鼠中。在移植后7个月，收获bm样品并将其在递增浓度的丝裂霉素c(mmc)存在的情况下于甲基纤维素中培养。

因此，这些数据表明fancalv可以在体内移植后逆转来自fa-a小鼠的造血祖细胞的表型。在安全方面，用先前用fancalv转导的bm细胞移植的30只小鼠中没有一只发展骨髓增生性疾病或白血病的症状(移植后1年获得的数据)。

实施例3.用慢病毒载体高效转导琮复古fa患者的新鲜造血祖细胞

因为先前显示fa冷冻保存的造血干细胞(hsc)的转导与新鲜移植物的转导相比效率较低(jacome等，2009)，因此进行了优化冷冻保存的fabm样品的转导效率的努力。如图7所示，进行三个转导周期相较于单个转导周期后获得的值显著增加facfc的转导效率(分别为45.7±4.2％对13.5±5.1％)。将样品进行标准转导(其由在2小时的静态预加载后的单个转导周期(16h)组成)(白色条；1xs)或改进的转导(其由3个利用慢病毒载体的转导周期(2h+2h+12h)组成)(灰色条；3xd)。

实施例4.pgk-fanca-wpre*慢病毒载体高效地校正来自fa-a患者的骨髓祖细胞的表型

由于其中fanca由pgk启动子驱动的lv的功效，并且基于先前显示稳定性的研究(follenzia等natgenet.2000；25:217-222)和携带pgk启动子的lv的低遗传毒性性质(modlich等，2009,montini等，2006,montini等，2009)，使用不含任何wpre元件或具有wpre或wpre*序列的pgk-fancalv，在lcl中以及来自fa-a患者的骨髓细胞中进行进一步的实验。如图8a所示，所有这三种载体在fa-alcl对mmc的超敏反应中赋予相同的逆转。

为了比较sffv-fanca和pgk-fancalv校正来自fa-a患者的造血祖细胞的表型的功效，如最近所述(jacome等，2009)，转导来自fa-a患者的红细胞耗尽的bm样品。如最近所述(gonzalez-murillo等，2009)，将红细胞耗尽的bm细胞在预加载有lv上清液的平板中转导16小时。14天后，对10nmmmc不存在和存在的情况下生长的集落数进行评分，以确定对药物产生抗性的祖细胞的比例。

如图8b所示，当用egfp-lv转导样品时，在mmc存在的情况下几乎不产生集落。与该观察结果相反，用sffv-fanca和pgk-fancalv转导fa-abm细胞允许在没有mmc的培养物中集落的生长评分为26％和38％。将具有wpre和wpre*序列的pgk-fancalv的功效与不含wpre的pgk-fancalv进行比较。如图8b所示，所有三种lv均介导对mmc的高水平和相似水平的保护。尽管转录后调控元件wpre*(schambach等，2006)的插入对于提高pgk-fancalv的功效不是必需的，但该元件将提供冗余元素以在患者中维持长期治疗水平的异位fanca。

综上所述，在这些研究中获得的数据强烈表明pgk-fanca-wpre*lv赋予足够水平的fanca表达以校正fa-a患者的造血表型。这些结果以及显示pgk-lv的稳定性(follenzi等，2000)和安全性质(modlich等，2009，montini等，2006，montini等，2009)和突变的wpre*转录后元件(schambach等，2006)的功效的先前观察，强化了pgk-fanca-wpre*lv可构成用于fa-a患者的基因疗法的高效且安全的载体。

实施例5.galv-tr和vsv-g包装的慢病毒载体转导来自fa患者的造血祖细胞的功效的分析

因为lv可用galv-tr和vsv-g包膜进行假型化，所以进行了新的实验，在该实验中在优化条件下用在两种包膜中假型化的egfp-lv转导来自fa患者的未选择的骨髓细胞。

对于galv-tr假型化的lv，进行两个利用非浓缩lv(估计滴度：2x10⁵ius/ml；估计moi：2iu/细胞)的转导周期。

对于vsv-g假型化的lv，利用浓缩和纯化的lv(估计滴度：10⁸iu/ml；估计的moi：50iu/细胞)进行一个转导周期。

如图9所示，在两种条件下获得了来自fa患者的造血祖细胞的类似转导，表明制造上的妥协可决定用于包装的最佳包膜。

实施例6.安全性研究

以相对于拷贝数的重铺板频率测量图10a中所示的慢病毒载体的转化潜力。如图10b所示，与具有病毒启动子的载体(其为已用于x1-scid和cgd临床试验的载体)的转化能力相比，对应于pgk-fanca-wpre*lv(pgk衍生的慢病毒载体)的慢病毒骨架的转化潜力显著降低。

关于用pgk-fanca-wpre*lv转导的bm细胞移植的小鼠的体内研究，已经移植了30只小鼠，并且到目前为止(移植后长达1年)没有移植的动物发展骨髓增生性病症或白血病的症状。

实施例7.药品

fanca慢病毒载体是第三代自身失活的rhiv1衍生的载体，其编码在人pgk启动子控制下并且在转录后水平上受缺少x蛋白orf的突变的wpre调节的人fancacdna(参见图1、图41和seqidno:24)。这种fanca慢病毒载体与先前在fa基因疗法中使用的γ-逆转录病毒载体相比具有几个有利方面，特别是尽管有有利于保持造血干细胞的多谱系潜力的短的预激活方案，但仍能转导细胞的能力。

为了产生治疗性慢病毒载体，用为载体的包装提供了所有所需辅助蛋白质的三种另外的质粒(参见图38-40)转染的293t细胞将包括pgk-fanca-wpre*药品(图41)的最终包装。

pgk-fanca-wpre*lv治疗盒包含人pgk启动子、fancacdna的编码序列和wpre*增强子，并包含seqidno:24的核苷酸3541至9178。转移盒的区域包含人cmv立即早期启动子、hiv包装序列、ga和rre元件、治疗盒和hiv自身失活3'ltr，其中治疗盒包含人pgk启动子、fancacdna的编码序列，并且wpre*增强子由seqidno:24的核苷酸1586-9495编码。

seqidno:24的核苷酸1586-1789包含人cmv立即早期启动子。seqidno:24的核苷酸2031-2156包含hiv1psi包装信号。seqidno:24的核苷酸2649-2882包含hiv1rre元件。seqidno:24的核苷酸3378-3495包含hivcppt/cts元件。seqidno:24的核苷酸3541-4051包含hpgk启动子。seqidno:24的核苷酸4078-8445包含人fanca-acdna。seqidno:24的核苷酸8502-9178包含突变的wpre元件。seqidno:24的核苷酸9262-9495包含hivδu3'ltr。

实施例8.临床研究fancostem

在美国，已在fa-a和fa-c患者中进行了两项基因治疗试验，其显示没有临床功效(liu,j.m.等(1999).engraftmentofhematopoieticprogenitorcellstransducedwiththefanconianaemiagroupcgene(fancc).hum.genether.10:2337-2346；kelly,p.f.等(2007).stemcellcollectionandgenetransferinfanconianaemia.molther15:211-219)。通过各种优化可以显著提高上述试验的功效。两项临床试验可相继进行，以确定收集和纯化足够数量cd34⁺细胞用于未来临床应用(fancostem)的方法的可行性，以及可平行进行以评估基因疗法在具有fa互补组a(fa-a)(fancolen)(参见图11)的患者中的安全性和功效。

用于fancostem的主要纳入标准是这样的患者，其具有af的诊断(通过使用二环氧丁烷或丝裂霉素c的染色体不稳定性测试证实的)、年龄>1岁并且以下参数中的至少一个应该高达：1)血红蛋白：8.0g/dl，2)中性粒细胞：750/mm³，3)血小板：30,000/mm³。招募了10名患者，筛选出9名患者，其中2名失败(嵌合体患者(mosaicpatient))。图12显示了招募的患者的血液学参数。七(7)名患者用g-csf和普乐沙福治疗。动员方案使用g-csf(neupogen；12μg/kg/12小时)和普乐沙福(mozobil；240μg/kg体重/天)的施用。使用短的离体转导方案，用pgk-fanca-wpre*lv在gmp条件下转导动员的外周血(mpb)cd34+细胞(图13)。虽然两名15岁和16岁的患者未达到外周血中cd34+细胞的阈值水平，但可在5名年龄在3-5岁之间的患者进行单采血液成分术。在这些患者中，cd34+细胞/kg的中位数为6.6x10^6(范围：1.6x10^6至7.6x10^6)。cd34+细胞选择后，cd34+细胞数/kg为2.0x10^6(范围：8.5x10^5至5.1x10^6)。在任何随访时间长达2.5年的接受治疗的患者中均未检测到与动员方案相关的严重不良事件。

图14显示了fa-a患者中g-scf/普乐沙福介导的cd34+细胞的动员，图15显示了fa-a患者中g-scf/普乐沙福介导的集落形成细胞(cfc)的动员。图16a显示fancostem中的cd34+细胞的收集，图16b显示与先前研究的比较。

图17显示了骨髓(bm)中预测的cd34+细胞数对比动员的外周血(mpb)中的实际数之间的比较。图18是g-scf/普乐沙福动员的fa-a患者中的cd34+细胞的收集的概述。选择后cd34+的数量与第0天bm中cd34⁺细胞数/μl相关(数据未显示)。

图19描绘了在从健康供体(hd)和fa患者免疫选择mpbcd34+细胞之前和之后的cd34表达。

从这些数据中，我们得出：与其他临床研究相比，迄今为止在用非格司亭(g-csf)和普乐沙福治疗的患者中观察到cd34+细胞的收集的明显改善，并且似乎只有疾病早期的fa患者适合临床相关数量的hsc的收集。

实施例9.临床研究fancolen

第二平行临床试验(fancolen)旨在评估基因疗法在fa互补组a(fa-a)(fancolen)患者中的安全性和有效性。为了通过输注经基因校正的自体hsc来恢复fa患者的造血功能，开发了优化的载体和转导方案。具体而言，这是评估用具有fanca基因(孤儿药)的慢病毒载体转导的自体cd34+细胞的输注对范可尼贫血亚型a患者的安全性和有效性的i/ii期临床试验。

主要纳入标准是这样的患者，其被诊断为fa-a、年龄>1岁年并且以下参数中的至少一个应低于以下的阈值：1)血红蛋白：8.0g/dl；2)中性粒细胞：1,000/mm³；3)血小板：50,000/mm³。

更具体的受试者纳入标准包括1)互补组fa-a的患者；2)以下参数中的至少一个必须低于指示的值：血红蛋白：8.0g/dl；中性粒细胞：750/mm³；血小板：30.000/mm³；3)最小年龄：1岁；4)最大年龄：21岁；5)lansky指数>60％；6)轻度器官功能障碍；7)根据现行法律提供知情同意；8)转导细胞的数量：至少3x10⁵个纯化的cd34⁺细胞/kg的患者体重；9)育龄妇女必须在基线访问时具有阴性尿妊娠测试，并在参加试验期间接受使用有效的避孕方法。

受试者排除标准包括1)具有hla相同的家族供体的患者；2)骨髓增生异常综合征或白血病的证据，或在骨髓抽吸分析中预测这些病况的细胞遗传学异常。该评估应在患者进入临床试验前两个月通过有效研究进行；3)患者有血液学改善的体细胞镶嵌的症状的证据；4)研究者的意见认为受试者不适合参加研究的任何伴随疾病或病况；5)根据国家癌症研究所(nci)的标准，预先存在的感觉或运动障碍>＝2级；6)孕妇或哺乳期妇女。

施用途径：患者通过静脉内输注接受用治疗性载体转导的细胞。

细胞剂量：通过输血接受的细胞剂量是从转导获得的，在3x10⁵个与4x10⁶个纯化的cd34⁺细胞/kg的患者体重之间。

低于3x10⁵个cd34⁺细胞/kg极不可能从转导细胞产生患者移植物，特别是考虑到该临床试验最初将输注无条件患者。在williams博士(kelly等，2007)进行的范可尼贫血患者的基因疗法试验中，2名患者(faagt1001和1003)中输注的细胞数分别为4.5x10⁵和3.25x10⁵个有核细胞/kg的患者体重。在两名患者中，均观察到hb和血小板计数的短暂增加，但未能证明转基因的相关存在。与其中细胞用γ-逆转录病毒载体转导4天的drwilliams的试验不同，在该临床试验中，细胞用更有效的慢病毒载体转导，转导将进行最多48小时，即比之前的方案中使用的4天短得多。鉴于此，我们认为3x10⁵纯化的cd34⁺细胞/kg的患者体重是该试验的合理下限。

4x10⁶个纯化的cd34⁺细胞/kg的患者体重的上限不基于限制输注细胞数量的需要，因为更多数量的细胞增加了移植的可能性。相反，4x10⁶个纯化的cd34⁺细胞/kg的患者体重的限制来自于从范科尼贫血患者中动员和收集超过该数量的细胞的困难，所述范科尼贫血患者的特征在于其骨髓中cd34+细胞计数减少(jacome等，2009)。

给案方案：将用治疗性载体转导的细胞以单剂量输注给患者。这有两个主要原因：1)迄今为止进行的所有造血基因治疗试验均使用单次输注转导细胞进行(naldini，2011)。根据该以前的经验，我们不打算改变这个参数。2)与输注相同剂量的分次相比，单次输注所有转导的细胞将增加存在更大移植物的可能性。

招募期：在3年的时间内招募患者。由于fa-a亚型患者在fa患者群体中最常见(西班牙fa患者中约80％对应于该互补组(casado等(2007))，因此构建的治疗性载体具有fanca基因。因此，在fa患者当中，只有那些属于fa-a亚型的患者才能参与本研究。该补充组中的任何患者(儿童或成人)，只要他们满足规定的纳入和排除标准，均纳入本研究。

将在临床试验中评估的初级变量和(如果有的话)次级变量的具体描述包括1)初级变量：a)确定范可尼贫血亚型a患者中与用治疗性慢病毒载体转导的自体cd34⁺细胞的输注相关的毒性。b)确定范可尼贫血亚型a患者中与输注用治疗性慢病毒载体的自体cd34⁺细胞相关的移植程度。2)次级变量：确定范可尼贫血亚型a患者中与输注用治疗性慢病毒载体转导的自体cd34⁺细胞相关的临床反应。

用具有fanca基因(孤儿药)的慢病毒载体离体转导来自范可尼贫血亚型a(fa-a)患者的骨髓的cd34⁺细胞和/或在外周血(新鲜和/或冷冻保存的)中动员的cd34⁺细胞(图11)。在细胞转导后，患者接受这些经遗传校正的干细胞的输注以恢复造血功能。

评估：在开始治疗之前评估患者，获得事先知情同意。在输注经遗传校正的细胞之前一个月中通过标准体格检查(包括体重和身高)、外周血细胞计数、基础生物化学和骨髓抽吸进行评估。

经遗传校正的cd34+细胞的转导和输注：用治疗性慢病毒载体离体转导纯化的cd34⁺细胞群。在细胞转导后，进行产品质量控制评估，将等分试样冷冻保存用于进一步研究，并制备产品用于输注至患者中。

如果在两名输注了可接受数量的转导细胞(在其中在体外培养中在至少7天后检测到至少0.3个拷贝的载体/细胞的等分试样中，至少100万个输注的细胞/kg的体重)的患者中，在输注后6个月，在骨髓或外周血中未观察到至少0.1个拷贝载体/细胞，随后的患者将在细胞输注之前经历条件化过程。

对于有资格进行任何类型的调件化的患者，必须有合适的方法来挽救与转导细胞的条件化和可能的植入失败相关的潜在的骨髓发育不良。挽救方法包括一个单位的来自半相合供体的脐带血或造血细胞。将静脉输注细胞。

患者通过输注接收的细胞剂量是从转导过程获得的在3x10⁵个cd34⁺细胞/kg的患者体重与4x10⁶个cd34⁺细胞/kg的患者体重之间的细胞剂量。

将细胞以单剂量输注到患者体内。

在转导过程完成后立即输注转导细胞。

输注的产物由cd34⁺细胞的悬浮液组成，所述cd34⁺细胞被包装在无菌袋中，用于ciemat的clinistemgmp实验室输注。

招募期：从输注第一位患者起3年。

随访期：从输注转导细胞起两年。然而，在临床试验之外对患者进行监测，为期10年。

将对外周血和骨髓样品进行转导细胞的移植物的监测。

输注后前72小时：在此期间，每8小时记录生命体征，并且每24小时监测(电解质谱、血液学、肾和肝功能)重要器官功能。

随后如表2中所示进行以下检查。

表2.

被诊断患有fa并且属于互补组fa-a的患者将包括在该研究中。如果已通过利用具有fanca基因的载体的转导证明细胞表型校正或者如果已证明该基因中的双等位基因致病突变，则考虑患者。

患者fa02005符合图20中概述的fancostem和fancolen的标准。图21描绘了在基因治疗之前显示患者fa-02005的fa诊断的测试，图22显示了患者fa-02005的细胞制造过程的随访。图23显示了基因治疗前和基因治疗后2周、4周、6周、2个月、3个月、4个月和5个月的患者fa02005中的载体拷贝数。在基因治疗之前和之后对第一个未经条件化的fa-a患者进行随访，显示了患者fa02005(4岁)的血红蛋白(图24)、中性粒细胞(图25)和血小板(图26)。

对于患者fa02002，血液学进化示于图27中，诊断示于图28中，细胞制造过程的随访示于图29中。图30显示在患者fa-02002的lv转导所需的不同步骤期间健康供体和fampb中的cd34表达的分析。图31显示了基因治疗之前和基因治疗之后2周、4周、6周患者fa02002中的载体拷贝数。显示了对患者fa02002(输注有冷冻保存的细胞)的血红蛋白(图32)、中性粒细胞(图33)和血小板(图34)的随访。

这两个患者的数据支持患者输注了大量经基因校正的动员的外周血(mpb)cd34+细胞的结论。在两名接受治疗的患者中均未观察到严重不良事件。在gt后15天至5个月，在治疗的患者中检测到约1-5个拷贝/1000个外周血细胞的基因标记水平，随着时间的推移适度升高。与先前试验中在gt后3周检测到的最高值(3拷贝/10^5个细胞；kelly等2007)相比，这些病毒拷贝数高至约100倍。

实施例6.来自fa-a患者的新鲜mpbcd34⁺细胞的转导

用治疗性载体对来自用g-csf/普乐沙福方案治疗的患者的动员的外周血(mpb)cd34+样品的小等分试样进行的短转导显示在17％与45％之间的转导效率(图35)。将这些样品的小等分试样移植到用1.5gy条件化的nsg小鼠中。大多数移植的样品植入nsg小鼠中(1-10％的bm细胞是hcd45+/mcd45-)(图36)。此外，在移植小鼠中观察到校正的cd34⁺fa-a细胞的明显选择优势(图37)。

这些结果显示转导的fa-ampbcd34⁺细胞植入到nsg小鼠中，并且在nsg受者小鼠中发生经校正的人fa-a重新注入细胞的体内增殖优势。

序列表

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tecnologicas

fundacioninstitutodeinvestigacionsanitariafundacion

jimenezdiaz

centrodeinvestigacionbiomedicaenred

fundacionparalainvestigacionbiomedicahospitalinfantil

universitarioninojesus

bueren,juana.

rio,paula

navarro,susana

sevilla,julian

segovia,josecarlos

ganzalez,africa

casado,joseantonio

guenechea,guillermo

<120>用于范可尼贫血患者的基因疗法

<130>ropa-002/01wo329592-2007

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<213>土拨鼠肝炎病毒

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<213>人工序列

<220>

<223>实验室内制备的转移盒pccl-sin-cppt/cts-hpgk-hfanca-wpre

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