HPV特异性T细胞的制备的制作方法
本发明是在国家癌症研究所授予的p50ca097007和po1ca94237的政府支持下完成的。政府拥有本发明的特定权利。
本发明至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和包括癌症医学的医学领域。
背景技术：
人乳头瘤病毒(hpv)是一种dna病毒，可在皮肤或粘膜的角质形成细胞中产生增殖性感染。有超过170种类型的hpv，其中一部分hpv类型具有致癌性，包括可发展成生殖器肿瘤的高风险性传播类型，例如，包括宫颈上皮内瘤变(cin)、外阴上皮内瘤变(vin)、阴茎上皮内瘤变(pin)和/或肛门上皮内瘤变(ain)。当病毒序列整合到宿主细胞的细胞dna中时，出现hpv诱发的癌症。一些hpv“早期”基因，例如e6和e7，充当促进肿瘤生长和恶性转变的致癌基因。
ramos等人(jimmunother2013；36：66-76)描述了一种刺激外周血单核细胞以产生对hpv16e6和e7特异的t细胞的方法。简而言之，所述方法包括用树突细胞对外周血单核细胞刺激，其中细胞在含有或不含有细胞因子il-6、il-7、il-12和il-15的组合的ctl培养基中培养。所述方法还包括第二次刺激,其中共培养物被补充il-2，以及轻微的刺激，其中在il-15存在下每周用载有肽混合物(pepmix)的辅助抗原呈递细胞(例如，b-细胞)进行刺激。该文献教导了细胞因子il-6、il-7、il-12和il-15的组合对于从患者样品中扩增hpv特异性t细胞以获得可检测的t细胞应答是必需的。
本发明减轻了本领域长期以来对治疗hpv相关疾病(例如至少包括与hpv16和hpv18相关的疾病)的需求。
发明概述
本发明的目的是提供关于经修饰以产生免疫性地识别特定靶标的免疫系统细胞的方法和组合物。在一些实施方式中，本发明涉及靶向引起个体免疫应答的生物部分的免疫细胞(包括细胞毒性t淋巴细胞(ctl，也称为细胞毒性t细胞))的发展。在具体的实施方式中，本发明涉及靶向hpv抗原(包括hpv疾病相关抗原)的细胞毒性t细胞的发展。在一些情况下，产生细胞毒性t细胞的混合物，并且在一些情况下，所述混合物靶向不只一种hpv抗原，包括不只一种hpv型的不只一种抗原。
本发明的实施方式涉及向感染hpv或具有hpv相关疾病(例如包括癌症)的个体提供治疗的方法和组合物。“hpv相关疾病”可以是一种由hpv感染引起或加剧的疾病、一种hpv感染是其危险因素的疾病,和/或一种hpv感染与其发作、发展、进展或严重程度正相关的疾病。hpv相关疾病可以是本发明的方法和组合物提供治疗效果(例如，抑制疾病的发展/进展、延迟/预防疾病的发作、减轻疾病症状的严重性、疾病症状的逆转和/或存活率增加)的疾病。本领域技术人员应当清楚的是，本发明的方法和组合物的治疗用途基本上延伸到任何可受益于hpv感染细胞数量减少的疾病/病症。在具体的实施方式中，本发明涉及用于可以靶向hpv相关的(例如，hpv16相关的和/或hpv18相关的)医学病症(包括癌症)并且是其治疗药物的过继性细胞免疫疗法的方法和组合物。
在某些方面，本发明涉及靶向来自hpv(例如hpv16和/或hpv18)的抗原的多个t细胞的开发。本发明提供了用于产生具有特异性针对hpv(例如hpv16和/或hpv18抗原)的t细胞系的方法的显著且非显而易见的改进。
在本发明的一些实施方式中，个体需要本发明的方法和/或组合物。在某些实施方式中，个体已接触过hpv，例如，hpv16和/或hpv18(其存在可能或可能不为个体所知)，或个体疑似已经接触过或存在接触过hpv(例如，hpv16和/或hpv18)的风险。在某些实施方式中，所述个体患有或疑似患有hpv或具有患hpv相关疾病的风险，例如hpv16相关和/或hpv18相关疾病(包括癌症)。
在所述方法的一部分的具体实施方式中，某些hpv(例如hpv16和/或hpv18)抗原以一种或多种肽的形式呈递给抗原呈递细胞(apc)，所述肽跨越一些或全部某些抗原。可以将肽混合物(其可以称为pepmixes)文库中的抗原肽提供给抗原呈递细胞。在本发明的某些方面，有各种pepmix的汇集用于接触apc。表达抗原的apc可以在某些条件下与外周血t细胞接触，以刺激对某些hpv抗原特异性的t细胞。
本发明的一些方面和实施方式涉及hpv特异性t细胞的产生和/或扩增。
在第一方面，本发明提供了一种刺激外周血细胞，优选外周血t细胞的方法，其中所述方法包括在白细胞介素(il)-7和il-15存在下，和在至少一些情况下，il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。根据本发明的各个方面，其中在“存在”给定细胞因子的情况下进行刺激/培养时，可以将相关细胞因子(例如重组和/或外源的细胞因子)添加到刺激/培养物中。当在“不存在”给定细胞因子的情况下进行刺激/培养时，相关细胞因子(例如重组和/或外源细胞因子)将不会被添加到刺激/培养物中。
在一些实施方式中，提供了一种产生用于人乳头瘤病毒(hpv)相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括步骤：在白细胞介素il-7和il-15中的一种或多种存在下，和在至少一些情况下，il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，所述刺激产生可治疗hpv相关疾病的t细胞。
在一些实施方式中，被刺激的外周血t细胞是从对外周血细胞的先前刺激中获得的。所述先前刺激可以包括在il-7和il-15存在下，和在至少一些情况下，il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
因此，在刺激外周血t细胞之前，所述方法可以进一步包括：在il-7和il-15存在下，和在至少一些情况下，il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，以产生外周血t细胞。
在一些实施方式中，所述一种或多种肽包含对应于一种或多种hpv16蛋白的至少部分序列、一种或多种hpv18蛋白的至少部分序列，或一种或多种hpv16蛋白和一种或多种hpv18蛋白的至少部分序列的序列。在一些实施方式中，所述一种或多种肽包含对应于e5、e6、e7、l1和l2蛋白中的一种或多种的序列。在一些实施方式中，所述一种或多种肽可以是肽文库，包括e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和/或l2肽。
在一些实施方式中，所述方法可以产生对hpv或hpv抗原特异的免疫细胞，例如t细胞。在一些实施方式中，所述方法可以扩增存在于对hpv或至少一种hpv抗原特异的外周血t细胞中的t细胞群。可以通过本发明的方法产生的除t细胞之外的免疫细胞包括nk细胞和nkt细胞。
在一些实施方式中，所述抗原呈递细胞是例如活化的t细胞、树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。
在一些实施方式中，在至少il-2不存在下，在il-7和il-15存在下刺激外周血t细胞。在一些实施方式中，在至少il-4不存在下，在il-7和il-15存在下刺激外周血t细胞。在一些实施方式中，在至少il-6不存在下，在il-7和il-15存在下刺激外周血t细胞。在一些实施方式中，在至少il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激外周血t细胞。在一些实施方式中，在至少il-21不存在下，在il-7和il-15存在下刺激外周血t细胞。在一些实施方式中，在il-6和il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激外周血t细胞。
在一些特定实施方式中，本发明第一方面的方法中细胞的刺激在il-6和il-12不存在下进行。
在一些实施方式中，外周血t细胞可以存在于外周血单核细胞群(pbmc)中或从其中获得或分离。细胞群中的pbmc可以是非粘附性pbmc。例如，抗原呈递细胞可以是活化的t细胞、树突细胞、b细胞或pbmc。
在第二方面，本发明提供了一种刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞的方法，其中所述方法包括在il-7和il-15存在下，和任选地在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
在一些实施方式中，提供了一种产生用于人乳头瘤病毒(hpv)相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括步骤：在白介素il-7和il-15中的一种或多种存在下，和任选地在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，所述刺激产生治疗一种或多种hpv相关疾病的t细胞。
在一些实施方式中，所述抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。在特定实施方式中，所述抗原呈递细胞是活化的t细胞。
在一些实施方式中，所述共刺激细胞是选自下组中的一种或多种细胞类型：cd80+细胞、cd86+细胞、cd83+细胞、4-1bbl+细胞、cd40+细胞、ox40+细胞及其组合。所述共刺激细胞可以是cd80+/cd86+/cd83+/4-1bbl+细胞。
在一些实施方式中，对hpv或hpv抗原特异性t细胞的刺激不是第一次刺激步骤。被刺激细胞的t细胞可以是先前刺激(例如，用本发明第一方面的方法)的产物。
在一些实施方式中，所述一种或多种肽包含对应于一种或多种hpv16蛋白的至少部分序列、一种或多种hpv18蛋白的至少部分序列、或一种或多种hpv16蛋白和一种或多种hpv18蛋白的至少部分序列的序列。在一些实施方式中，所述一种或多种肽包含对应于e5、e6、e7、l1和l2蛋白中的一种或多种的序列。在一些实施方式中，所述一种或多种肽可以是肽文库，包括e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和/或l2肽。
在一些实施方式中，所述方法可以产生hpv或hpv抗原特异性t细胞。在一些实施方式中，所述方法可以扩增对hpv或hpv抗原特异的t细胞群。
在一些实施方式中，对hpv或hpv抗原特异性t细胞的刺激包括在il-7、il-15存在下，以及在一种或多种类型的共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞。
在一些实施方式中，在il-2不存在下，在il-7和il-15存在下刺激t细胞。在一些实施方式中，在il-4不存在下，在il-7和il-15存在下刺激t细胞。在一些实施方式中，在il-6不存在下，在il-7和il-15存在下刺激t细胞。在一些实施方式中，在il-7不存在下，在il-7和il-15存在下刺激t细胞。在一些实施方式中，在il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激t细胞。在一些实施方式中，在il-21不存在下，在il-7和il-15存在下刺激t细胞。在一些实施方式中，在本发明第一方面所述的方法中的刺激是在il-6和il-12不存在下进行的。
根据本发明的第一和第二方面所述的方法可以是产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法。细胞的刺激可以产生治疗hpv相关疾病的t细胞。
在第三方面，第一和第二方面的方法可以组合以提供产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括：
刺激外周血细胞，优选外周血t细胞，其中所述方法包括在白细胞介素(il)-7和il-15存在下，和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；
在白细胞介素(il)-7和il-15存在下，和任选地在一种或多种类型的共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
在一些实施方式中，在步骤(ii)之前，可以在il-7和il-15存在下，但共刺激细胞不存在下,和任选地在il-6和/或il-12不存在下，再次刺激从(i)获得的t细胞。根据需要，这种再刺激可以发生一轮、两轮、三轮、四轮、五轮或更多轮。
在一些实施方式中，(i)中使用的抗原呈递细胞是树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。在一些实施方式中，(ii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。在一些实施方式中，(i)中使用的抗原呈递细胞与(ii)中使用的抗原呈递细胞不同，尽管它们在某些情况下可以是相同的。在特定实施方式中，(ii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞。
在一些实施方式中，所述共刺激细胞是选自下组中的一种或多种细胞类型：cd80+细胞、cd86+细胞、cd83+细胞、4-1bbl+细胞、cd40+细胞、ox40+细胞及其组合。所述共刺激细胞可以是cd80+/cd86+/cd83+/4-1bbl+细胞。
在一些实施方式中，在il-2不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-4不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-6不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-21不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-6和il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。
在一些优选的实施方式中，步骤(i)中细胞的刺激是在il-6和il-12不存在下进行的。
在一些实施方式中，步骤(ii)中细胞的刺激是在il-6和il-12不存在下进行的。
因此，在一些实施方式中，提供了一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括：
(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在白细胞介素(il)-7和il-15存在下和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；
(ii)在白细胞介素(il)-7和il-15存在下和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列,其中步骤(ii)被任选地重复一次或多次；和
(iii)在il-7和il-15存在下，和任选地在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(ii)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列,其中步骤(iii)被任选地重复一次或多次。
在一些实施方式中，(i)和(ii)中使用的抗原呈递细胞是树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。在一些实施方式中，(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。在一些实施方式中，(iii)中使用的抗原呈递细胞与(i)和/或(ii)中使用的抗原呈递细胞不同。在优选的实施方式中，(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞。
在优选的实施方式中，(iii)中的刺激是在共刺激细胞的存在下进行的。在一些实施方式中，所述共刺激细胞是选自下组中的一种或多种细胞类型：cd80+细胞、cd86+细胞、cd83+细胞、4-1bbl+细胞、cd40+细胞、ox40+细胞及其组合。所述共刺激细胞可以是cd80+/cd86+/cd83+/4-1bbl+细胞。
在一些实施方式中，在il-2不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-4不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-6不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-21不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。在一些实施方式中，在il-6和il-12不存在下，在il-7和il-15存在下刺激细胞。
在一些实施方式中，步骤(i)中细胞的刺激是在il-6和il-12不存在下进行的。在一些其他实施方式中，步骤(i)中细胞的刺激是在il-6和il-12存在下进行的。
在一些特定实施方式中，步骤(ii)中细胞的刺激是在il-6和il-12不存在下进行的。在一些特定实施方式中，步骤(iii)中细胞的刺激是在il-6和il-12不存在下进行的。
在一些特定实施方式中，本发明的方法用于产生对hpv16和/或hpv18特异的t细胞。在一些特定的实施方式中，本发明的方法用于产生对hpv16相关和/或hpv18相关疾病特异的t细胞。
在一些实施方式中，外周血t细胞可以从已知感染或疑似感染hpv(hpv16、或hpv18、或hpv16和hpv18)的个体中获得。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞可以从已知感染或疑似感染hpv(hpv16、或hpv18、或hpv16和hpv18)的个体中获得。
在一些实施方式中，所述方法中，可以不包括将通过所述方法产生的t细胞与先前与肽文库接触的活化b细胞接触的情况。
在一些实施方式中，抗原呈递细胞对于打算用获得的治疗性t细胞治疗的个体可以是自体的或同种异体的。
在一些实施方式中，所述一种或多种肽包含对应于一种或多种hpv16蛋白的至少部分序列、一种或多种hpv18蛋白的至少部分序列、或一种或多种hpv16蛋白和一种或多种hpv18蛋白的至少部分序列的序列。在一些实施方式中，所述一种或多种肽包含对应于来自hpv16、hpv18、或hpv16和hpv18的e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和/或l2蛋白中的一种或多种的序列。
在本发明的实施方式中，所述肽可以包含对应于hpv蛋白e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和/或l2中的一种或多种的序列。在一些实施方式中，所述肽可以包含对应于一种或多种hpv蛋白的序列，所述hpv蛋白在前病毒整合后表达(例如e1，e2，e3，e4，e5，e6和/或e7)，例如，在感染hpv的细胞中。在一些实施方式中，所述肽可以包含对应于一种或多种转化的hpv蛋白(例如e6和/或e7)的序列。所述肽可以对应于所述hpv蛋白中存在的连续氨基酸序列。所述肽的长度可以是至少或不超过8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸，或者长度为15个氨基酸。所述肽的集合可以形成文库，并且文库中的肽可以以任何适当的长度与其他肽序列重复，例如包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。所述肽可包含对应于以下的序列：a)hpv18e6蛋白和/或hpv18e7蛋白，和/或b)hpv16e6蛋白和/或hpv16e7蛋白。
在本发明的实施方式中，所述hpv可以是hpv16或hpv18，或hpv16和hpv18。在涉及治疗hpv相关疾病的实施方式中，所述疾病可以是癌症，并且所述肽可以包含对应于e6和e7之一或两者的序列。当hpv相关疾病是癌前病变时，所述肽可以包含对应于e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和l2中的一个、一些或全部的序列。
可以分离和/或纯化通过本发明的方法产生的t细胞，例如，从其他细胞中分离/纯化。
在一些实施方式中，将通过本发明的方法产生的治疗有效量的t细胞提供给已经接触hpv或具有hpv相关疾病的个体。在相关方面，提供了通过本发明的方法产生的t细胞用于治疗hpv相关疾病。在另一个相关方面，提供了通过本发明的方法产生的t细胞的用途，用于制备用于治疗hpv相关疾病的药物。
在本发明的一个方面，提供了用于过继性细胞免疫疗法的t细胞，其中所述t细胞是通过本文所述的刺激外周血或t细胞的方法或产生治疗性t细胞的方法获得的、或可由其获得或是其产物，所述过继性细胞免疫疗法包括向受试者施用所述t细胞。
在本发明的一个方面，提供了t细胞在制备用于过继性细胞免疫疗法的药物中的用途，所述过继性细胞免疫疗法包括向受试者施用所述t细胞，其中所述t细胞是通过本文所述的刺激外周血或t细胞的方法或产生治疗性t细胞的方法获得的、或可由其获得或是其产物。
在本发明的一个方面，提供了制备药物组合物、药物或疫苗的方法，所述方法包括根据本文所述的方法刺激外周血或t细胞，或根据本发明的方法产生治疗性t细胞，并将获得的细胞与药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂或赋形剂混合。
待治疗的疾病可以是肿瘤。所述肿瘤可以是癌症。所述癌症可以是hpv阳性癌症，例如hpv16阳性癌症和/或hpv18阳性癌症。
待治疗的个体可以是人。所述个体可以是患者。所述个体可能已经接触hpv，例如hpv16、hpv18、或hpv16和hpv18，或者具有hpv-、hpv16-和/或hpv18-相关疾病。hpv-、hpv16-和/或hpv18-相关疾病可以是肿瘤。所述肿瘤可以是癌症。
癌症可以是任何一种。在一些实施方式中，所述癌症是宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌或口咽癌。在一些实施方式中，所述癌症可以是hpv相关癌症。“hpv相关癌症”可以是一种由hpv感染引起或加剧的癌症、一种hpv感染是其危险因素的癌症，和/或一种hpv感染与其发病、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。hpv相关癌症可以是本发明的方法和组合物提供治疗效果(例如，抑制癌症的发展/进展、延迟/预防癌症的发作、减少/延迟/预防转移、降低癌症症状的严重程度、减少癌细胞数量、减少肿瘤大小和/或提高生存率)的癌症。在一些实施方式中，所述癌症是hpv相关癌、hpv阳性口咽癌、hpv阳性宫颈癌、hpv阳性肛门癌、hpv阳性外阴癌、鼻咽癌、hpv阳性阴茎癌、任何部位的hpv阳性发育不良、或喉乳头状瘤病。
所述个人或受试者可能已接受、正在接受或将接受额外的癌症治疗。额外的癌症疗法可以是手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法、免疫疗法、或其组合。
个体或受试者可被确定为患有hpv相关癌症或hpv阳性癌症。个体可被确定为患有hpv16相关癌症或hpv16阳性癌症。个体可被确定为患有hpv18相关癌症或hpv18阳性癌症。个体或受试者可以是任何动物或人。个体或受试者优选为哺乳动物，更优选为人。个体或受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人。个体或受试者可以是男性或女性。个体或受试者可以是患者。
根据本发明的涉及细胞刺激步骤的方法可以在体外或离体进行。术语“体外”意在包括在实验室条件下或培养中对材料、生物物质、细胞和/或组织的研究。“离体”是指在生物体外存在或发生的事物，例如在人体或动物体外，其可以是在从生物体取出的组织上(例如整个器官)或细胞中。
在一个实施方式中，有一种刺激外周血细胞的方法，该方法包括在白细胞介素(il)-7和il-15存在下并且在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白的至少部分序列的序列。外周血t细胞可以从对外周血细胞的先前刺激中获得，例如其中所述对外周血细胞的先前刺激包括在il-7和il-15存在下和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。在特定情况下，在刺激外周血t细胞之前，所述方法还包括在il-7和il-15存在下和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，以产生外周血t细胞。
在一个实施方式中，有一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括步骤：在il-7和il-15中的一种或多种存在下，并且在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，所述刺激产生治疗hpv相关疾病的t细胞。外周血t细胞可以从对外周血细胞的先前刺激中获得，例如其中所述对外周血细胞的先前刺激包括在il-7和il-15存在下和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。在特定情况下，在刺激外周血t细胞之前，所述方法还包括在il-7和il-15存在下和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，以产生外周血t细胞。
在本发明所包括的方法的实施方式中，抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞、b细胞或pbmc。外周血t细胞可以存在于外周血单核细胞(pbmc)群中，或者至少在某些情况下从中获得或分离，并且细胞群中的pbmc可以是非粘附性pbmc。当使用时，共刺激细胞可以是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
在一个具体实施方式中，有一种刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞的方法，所述方法包括在il-7和il-15存在下和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
在一些实施方式中，有一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括步骤：在il-7和il-15中的一种或多种存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，所述刺激产生治疗hpv相关疾病的t细胞。
在一个实施方式中，有一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括：(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在il-7和il-15存在下，和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；和(ii)在il-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。在具体的实施方式中，在步骤(ii)之前，可以在il-7和il-15存在下，但共刺激细胞不存在下，再次刺激从(i)获得的t细胞。
在一个实施方式中，提供了一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括：(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在白介素(il)-7和il-15存在下，和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；(ii)在白介素(il)-7和il-15存在下，和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，其中步骤(ii)被任选地重复一次或多次；和(iii)在白介素(il)-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(ii)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，其中步骤(iii)被任选地重复一次或多次。
在本发明的任何方法中，hpv可以是hpv16或hpv18。包含对应于e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和l2中的一个或多个的序列的肽可以被用于本发明的任何方法中。所述肽可包含对应于以下的序列：a)hpv18e6蛋白和/或hpv18e7蛋白，和/或b)hpv16e6蛋白和/或hpv16e7蛋白。在一些情况下，被提供有效量的如本文所述的细胞的个体具有hpv相关疾病，例如癌症，并且所述肽包含对应于e6和e7中的一个或两个的序列。在特定方面，所述一种或多种肽包括长度至少为或不超过8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽，和特别地，所述一种或多种肽包括长度为15个氨基酸的肽。在具体的实施方式中，所述一种或多种肽形成文库，文库中的肽与其他肽的序列重叠11个氨基酸。
在特定的实施方式中，将治疗有效量的通过所述方法产生的t细胞提供给已经接触hpv或具有hpv相关疾病的个体。在具体的实施方式中，hpv相关疾病包括肿瘤。
可以将治疗有效量的通过本发明的方法产生的t细胞提供给已经接触hpv16、hpv18、或hpv16和hpv18、或具有hpv16相关和/或hpv18相关疾病(包括癌症等肿瘤)的个体。
在特定实施方式中，所述癌症是宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、鼻咽癌、喉乳头状瘤病、喉癌、头颈癌或其任何部位的发育异常。
在一些情况下，已经接受和/或将接受本发明细胞的个体也已接受、正在接受或将接受额外的癌症疗法，例如手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法、免疫疗法、或其组合。
在一些方面，已经接受和/或将接受本发明细胞的个体被确定为患有hpv相关癌症，例如hpv16相关癌症或hpv18相关癌症。
以下编号的段落包含本文公开的本发明技术特征的广泛组合的陈述：
1.一种刺激外周血细胞的方法，所述方法包括在白细胞介素(il)-7和il-15存在下并且在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种人乳头瘤病毒(hpv)蛋白的至少部分序列的序列。
2.一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
在il-7和il-15中的一种或多种存在下，和在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于hpv蛋白的一种或多种的至少部分序列的序列，
其中所述刺激产生治疗hpv相关疾病的t细胞。
3.如段落1或2所述的方法，其中外周血t细胞是从对外周血细胞的先前刺激中获得的。
4.如段落3所述的方法，其中所述对外周血细胞的先前刺激包括在il-7和il-15存在下和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
5.如段落1或2所述的方法，其中在刺激外周血t细胞之前，所述方法还包括在il-7和il-15存在下，和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，以产生外周血t细胞。
6.如段落1-7中任一项所述的方法，其中抗原呈递细胞是树突细胞、b细胞或pbmc。
7.如段落1-6中任一项所述的方法，其中所述外周血t细胞存在于外周血单核细胞群(pbmc)中、或从中获得或分离。
8.如段落7所述的方法，其中细胞群中的pbmc是非粘附性pbmc。
9.一种刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞的方法，所述方法包括在il-7和il-15存在下和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
10.一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括步骤：在il-7和il-15中的一种或多种存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列，所述刺激产生治疗hpv相关疾病的t细胞。
11.如段落9或10所述的方法，其中抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞、b细胞或pbmc。
12.如段落9-11中任一项所述的方法，其中所述共刺激细胞是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
13.一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括：
(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在il-7和il-15存在下和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；和
(ii)在il-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
14.如段落13所述的方法，其中在步骤(ii)之前，可以在il-7和il-15存在，但共刺激细胞不存在下，再次刺激从(i)获得的t细胞。
15.如段落13或14所述的方法，其中(i)中使用的抗原呈递细胞是树突细胞(dc)、b细胞(bb)或pbmc。
16.如第13至15段中任一项所述的方法，其中(ii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞(dc)或b细胞(bb)。
17.如段落13-16中任一项所述的方法，其中所述共刺激细胞是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
18.提供了一种产生用于hpv相关疾病的治疗性t细胞的方法，所述方法包括：
(i)刺激外周血细胞，其中所述方法包括在白细胞介素(il)-7和il-15存在下和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；
(ii)在白细胞介素(il)-7和il-15存在下和任选地在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列,其中步骤(ii)被任选地重复一次或多次；和
(iii)在白介素(il)-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(ii)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列,其中步骤(iii)被任选地重复一次或多次。
19.如段落18所述的方法，其中(i)和(ii)中使用的抗原呈递细胞是dc、bb或pbmc。
20.如段落18或19所述的方法，其中(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞、dc、bb或pbmc。
21.如段落18-20中任一项所述的方法，其中所述共刺激细胞是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
22.如段落1-21任一项所述的方法，其中hpv是hpv16或hpv18。
23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述肽包含对应于e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和l2中的一个或多个的序列。
24.如段落1-23中任一项所述的方法，其中hpv相关疾病是癌症，并且所述肽包含对应于e6和e7之一或二者的序列。
25.如段落1-25中任一项所述的方法，其中所述肽包含对应于以下的序列：
a)hpv18e6蛋白和/或hpv18e7蛋白，和/或
b)hpv16e6蛋白和/或hpv16e7蛋白。
26.如段落1-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肽包含长度为至少或不超过8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的肽。
27.如段落1-26中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肽包含长度为15个氨基酸的肽。
28.如段落1-27中任一项所述的方法，其中所述一种或多种肽形成文库，所述文库中的肽与其他肽的序列重叠11个氨基酸。
29.如段落1-28中任一项所述的方法，其中将治疗有效量的通过所述方法产生的t细胞提供给已经接触hpv或具有hpv相关疾病的个体。
30.如段落29所述的方法，其中hpv相关疾病包括肿瘤。
31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中将治疗有效量的通过所述方法产生的t细胞提供给已经接触hpv16、hpv18、或hpv16和hpv18、或具有hpv16相关和/或hpv18相关疾病的个体。
32.如段落31所述的方法，其中hpv16相关和/或hpv18相关疾病包括肿瘤。
33.如段落31或32所述的方法，其中肿瘤是癌症。
34.如段落33所述的方法，其中所述癌症是宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、鼻咽癌、喉乳头状瘤病、喉癌、头颈癌或其任何部位的发育异常。
35.如段落33或34所述的方法，其中所述个体已经接受、正在接受或将接受额外的癌症疗法。
36.如段落35所述的方法，其中所述额外的癌症疗法是手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合。
37.如段落33至36中任一项所述的方法，其中所述个体被确定为患有hpv相关癌症。
38.如段落33至37中任一项所述的方法，其中所述个体被确定为患有hpv16相关癌症。
39.如段落33至38中任一项所述的方法，其中所述个体被确定为患有hpv18相关癌症。
40.一种用于过继性细胞免疫疗法的t细胞，其中所述t细胞是通过如段落1-39中任一项所述的刺激外周血或t细胞的方法或产生治疗性t细胞的方法获得的、或可由其获得或是其产物，其中所述过继性细胞免疫疗法包括向受试者施用所述t细胞。
41.t细胞在制备用于过继性细胞免疫疗法的药物中的用途，所述过继性细胞免疫疗法包括向受试者施用所述t细胞，其中所述t细胞是通过如段落1-39中任一项所述的刺激外周血或t细胞的方法或产生治疗性t细胞的方法获得的、或可由其获得或是其产物。
42.一种制备药物组合物、药物或疫苗的方法，所述方法包括如权利要求1-39中任一项所述的刺激外周血或t细胞或产生治疗性t细胞，并将获得的细胞与药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂或赋形剂混合。
43.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(1)从受试者中分离t细胞；
(2)产生或扩增对人乳头瘤病毒(hpv)特异性的t细胞群，通过包含以下的方法：在白细胞介素(il)-7和il-15存在下，和在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激所述t细胞，其中抗原呈递细胞预先接触于一种或多种肽，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；和
(3)将产生或扩增的t细胞群施用于受试者。
44.如段落43所述的方法，其中在(2)中刺激的t细胞是从对外周血细胞或t细胞的先前刺激中获得的。
45.如段落43所述的方法，其中在刺激所述t细胞之前，所述方法包括在il-7和il-15存在下和在il-6和/或il-12存在下，用抗原呈递细胞刺激外周血细胞或t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
46.如段落43所述的方法，其中在(2)之后和(3)之前，所述方法包括在il-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(2)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
47.如段落46所述的方法，其中所述共刺激细胞是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
48.如段落43所述的方法，其中在(2)之后和(3)之前，所述方法包括(i)在il-7和il-15存在下，和在共刺激细胞不存在下，再次刺激从(2)中获得的t细胞，和(ii)在il-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激在(i)后获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列。
49.如段落43所述的方法，其中抗原呈递细胞是树突细胞(dc)、b细胞(bb)、或外周血单核细胞(pbmc)。
50.如段落43所述的方法，其中在(1)中，所述t细胞是从外周血单核细胞群(pbmc)中分离的。
51.如段落43所述的方法，其中所述癌症是宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、鼻咽癌、喉乳头状瘤病、喉癌、头颈癌或其任何部位的发育异常。
52.如段落43所述的方法，其中所述癌症是hpv阳性的。
53.如段落43所述的方法，其中所述受试者被确定为患有hpv相关癌症。
54.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(1)从受试者中分离t细胞；
(2)产生或扩增对人乳头瘤病毒(hpv)特异性的t细胞群，通过包括以下的方法：
(i)在白细胞介素(il)-7和il-15存在下，用抗原呈递细胞刺激t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；
(ii)在白细胞介素(il)-7和il-15存在下，和在il-6和/或il-12不存在下，用抗原呈递细胞刺激从(i)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列,其中步骤(ii)任选地被重复一次或多次；和
(iii)在白介素(il)-7和il-15存在下，和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激从(ii)中获得的t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列,其中步骤(iii)任选地被重复一次或多次。
(3)将产生或扩增的t细胞群施用于受试者。
55.如段落54所述的方法，其中(i)中t细胞的刺激是在il-6和/或il-12存在下进行的。
56.如段落54所述的方法，其中(i)和(ii)中使用的抗原呈递细胞是树突细胞(dc)、b细胞(bb)或外周血单核细胞(pbmc)。
57.如段落54所述的方法，其中(iii)中使用的抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞(dc)、b细胞(bb)、或外周血单核细胞(pbmc)。
58.如段落54所述的方法，其中所述共刺激细胞是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
59.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(1)从受试者中分离t细胞；
(2)通过包含以下的方法产生或扩增对人乳头瘤病毒(hpv)特异性的t细胞群：在il-7和il-15存在下和在共刺激细胞存在下，用抗原呈递细胞刺激hpv或hpv抗原特异性t细胞，其中所述抗原呈递细胞先前与一种或多种肽接触，其中所述肽包含对应于一种或多种hpv蛋白的至少部分序列的序列；和
(3)将产生或扩增的t细胞群施用于受试者。
60.如段落59所述的方法，其中所述抗原呈递细胞是活化的t细胞、树突细胞(dc)、b细胞(bb)、或外周血单核细胞(pbmc)。
61.如段落59所述的方法，其中所述共刺激细胞是cd80+、cd86+、cd83+、4-1bbl+、cd40+细胞、ox40+细胞、或其组合。
前面已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点，以便可以更好地理解随后的本发明的详细描述。在下文中将描述本发明的附加特征和优点，其形成本发明权利要求的主体。本领域技术人员应该理解，可以容易地将所公开的概念和具体实施例用作修改或设计实现本发明相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，这种等同构造不脱离所附权利要求中阐述的本发明的要旨和范围。当结合附图考虑时，可以从以下描述中更好地理解被认为是本发明特征的有关其组织和操作方法的新颖特征以及本发明的其它目的和优点。然而，应该清楚地理解到，每幅附图都仅为举例说明和描述的目的而提供，而并不希望被定义为对本发明的限制。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许或明确被避免的。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图通过示例说明本发明的各方面和实施例。其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。
在整个说明书(包括所附权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体例如“包含(comprises)”和“包括有(comprises)”将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤，或整数或步骤组。
附图简要说明
图1a显示了本领域利用某些条件产生hpv16特异性t细胞的方法。图1a是显示斑点形成菌落(sfc)的产量的条形图，()用不含pepmix(阴性)、hpv16e6pepmix(hpv16e6)或hpv16e7pepmix(hpv16e7)的自体dc刺激来自三个hpv相关癌症患者(被鉴定为ocv、hnd和hnc)的pbmc()()()()。对于患者ocv，从左到右的三个条形是neg、hpv16e6和hpv16e7。对于患者hnd和hnc，从左到右的两个条形是hpv16e6和hpv16e7。
图1b显示了本发明的方法，其在某些新条件下，通过在il-7和il-15存在下并且在il-6和il-12不存在的情况下刺激t细胞，产生对hpv16或hpv18特异的t细胞混合物。图1b是显示在刺激来自三个hpv相关癌症患者(鉴定为ocv、pcv和hnd)的pbmc时产生的斑点形成菌落(sfc)的条形图。对于患者ocv，从左到右的五个条形为无肽混合物(neg)、hpv16e6肽混合物(hpv16e6)、hpv16e7肽混合物(hpv16e7)、hpv18e6肽混合物(hpv18e6)和hpv18e7肽混合物(hpv18e7)。对于患者pcd，从左到右的两个条形是hpv16e6和hpv16e7。对于患者hnd，从左到右的四个条形是hpv16e6、hpv16e7、hpv18e6和hpv18e7。
图2是在输注后的时间点，在患者#1中用tgf-β的显性阴性受体(dnrii)转导的输注的hpv刺激的t细胞在体内扩增和持续存在的图表。
图3是显示在输注后的时间点，在患者#2中用tgf-β的显性阴性受体(dnrii)转导的输注的hpv刺激的t细胞在体内扩增和持续存在的图表。
图4显示了患者#2的pet扫描(左侧和中间)和身体检查照片(右侧)。上排：预处理。下排：用本发明产生的hpv刺激的t细胞处理6周后。
发明详述
本申请的范围不限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法和步骤的特定实施方式。
与长期存在的专利法惯例一致，当在本说明书中使用时，与包括权利要求的词语一致的词语“一个(a)”和“一个(an)”表示“一个或多个”。本发明的一些实施方式可以由本发明的一种或多种要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。可预期本文所述的任何方法或组合物可相对于本文所述的任何其他方法或组合物实施。
本发明涉及用于需要hpv特异性t细胞的个体的治疗性t细胞的生产和用途，例如，hpv16和/或hpv18特异性t细胞，包括用于治疗hpv感染和hpv相关的医学病症。在具体的实施方式中，所述方法和组合物可用于治疗与hpv感染间接或直接相关的肿瘤，并且这些肿瘤可以是良性或恶性的。已经将13至18种hpv毒株鉴定为具有高致癌风险，其中12种属于hpv7型(hpv-18、-39、-45、-59、-68)和9型(hpv-16、-31、-33、-35、-52、-58、-67)。hpv6型和11型引起喉乳头状突。
i.hpv抗原和肽混合物(pepmix)的产生
本
技术实现要素：
的方法使用将肽混合物呈递给t细胞的抗原呈递细胞。在接触于外周血t细胞以刺激外周血t细胞之前产生这种“负载的”apc，并且，负载的apc的产生可以由或不由执行外周血t细胞的刺激步骤的个体或实体来执行。因此，在一些实施方式中，将有效量的肽文库提供给apc，作为最终产生治疗性ctl的方法的一部分。在本发明的方法中，在刺激步骤之前，将apc接触于足够量的肽文库。在特定情况下，所述文库包含跨越部分或全部相同抗原的肽的混合物(“pepmixes”)，尽管在一些情况下，所述文库包含跨越一种或多种抗原的部分或全部的肽混合物(pepmix)，并且所述一种或多种抗原可以来自或可以不来自相同的hpv。在特定的实施方式中，用于apc的肽是非天然的，并且它们可以通过或不通过化学合成或或重组方法产生。
在利用来自一种或多种hpv抗原的肽混合物库时，各种肽可以来自给定蛋白质的任何部分，但是在特定情况下，肽总共跨越大部分或全部蛋白质的长度，其中肽的序列至少部分重叠以促进特定抗原的整个所需区域的覆盖。在一些情况下，所述肽跨越肽对应的相应抗原的一个或多个已知表位或结构域的长度。某些区域可以被跨越该区域长度的肽覆盖，例如包括诸如n-末端结构域、c-末端结构域、细胞外结构域或细胞内结构域的区域。
衍生肽的抗原可以是hpv的抗原，其可以是任何种类，但在特定实施方式中，抗原使得它们允许细胞毒性t细胞引起与hpv感染相关的肿瘤，包括癌症。在具体的实施方式中，所述肽衍生自或具有对应于至少一种hpv类型的一种或多种抗原的至少一部分的序列，所述hpv类型包括hpv16和/或hpv18。例如，在晚期宫颈癌中，hpv病毒整合到肿瘤细胞基因组中并且失去除e6和e7之外的所有其他基因，因此在一些情况下这些抗原是被靶向的。在可以治疗的癌症的早期阶段的实施方式中，例如在病毒整合之前，可以使用来自e6和e7以外的抗原的肽，例如e5和l1和l2。然而，鉴于高风险hpv类型的两种原发癌蛋白是e6和e7，在具体实施方式中，肽的序列是从任何hpv的e6和/或e7获得的，特别是hpv16和/或hpv18。来自任何抗原e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和/或l2的肽可用于本公开的方法中。
在一些情况下，肽混合物文库包括对应于来自单一类型hpv病毒的一种或多种抗原的肽，这些肽可能提供或不提供所讨论的整个抗原的序列覆盖。在其他情况下，肽混合物文库包括对应于来自一种以上hpv病毒的一种或多种抗原的肽，并且那些肽可以提供或不提供所讨论的整个抗原的序列覆盖。肽混合物可以富集或不富集对应于一种或多种特定抗原的一个或多个特定区域的肽或对应于一种或多种特定抗原的全部的肽。
本发明中使用的肽混合物(pepmix)可以来自商业上可获得的肽文库，或者可以例如合成产生。可获得的文库的实例包括来自jpttechnologies(斯普林菲尔德，va)或miltenyibiotec(奥本，ca)的文库。例如，本领域技术人员基于已知的hpv16e6、hpv16e7、hpv18e6和hpv18e7序列，将具有足够的信息以能够产生对应于其示例性相应序列的肽。hpv16e6蛋白的序列的实例可以获取于国家生物技术信息中心的
在具体的实施方式中，文库由对应于它们各自的抗原的一定长度的肽组成，尽管在一些情况下文库由具有两种或更多种不同长度的肽的混合物组成。肽可以具有一定长度，并且它们可以以一定量的序列重叠，尽管在一些文库中可能存在重叠长度的变化。在具体的实施方式中，例如，肽的长度为至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多个氨基酸。在具体的实施方式中，例如，长度至少为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸的肽之间存在重叠。在具体的实施方式中，肽的长度为15个氨基酸并且彼此重叠11个氨基酸。不同肽的混合物可包括任何比例的不同肽，但在一些实施方式中，每种特定肽在混合物中以与另一特定肽基本相同的数量存在。尽管肽的序列中抗原的覆盖可以是随机的并且基本上甚至在抗原的给定区域上，在一些实施方式中，文库可以富集一种或多种特定肽，例如已知编码表位或其部分的一种或多种肽。
在具体的实施方式中，例如，特定抗原蛋白的肽混合物包含所有可能的8至10个氨基酸长的hlai类表位。在具体的实施方式中，较长的肽用于覆盖特定肽的所有ii类表位。在某些方面，肽的长度最多为30个氨基酸，重叠25个氨基酸。
ii.产生和使用治疗性t细胞的方法
a.产生治疗性t细胞
在某些方面，本公开涉及免疫细胞的发展，例如细胞毒性t细胞，其靶向来自至少一种hpv病毒的一种或多种抗原。
本文公开的方法可涉及免疫细胞的刺激和/或扩增。所述方法可涉及外周血细胞的刺激和/或扩增，例如外周血单核细胞。所述方法可以包括从免疫细胞群(例如pbmc)内扩增免疫细胞群(例如t细胞群)。例如，通过刺激pbmc群中的t细胞，可以从pbmc群中扩增t细胞群。因此，在本文公开的方法的实施方式中，t细胞的刺激和/或扩增可涉及刺激pbmc群。在一些实施方式中，通过刺激肿瘤浸润淋巴细胞群内的t细胞，可以从肿瘤浸润淋巴细胞群中扩增t细胞群。因此，在本文公开的方法的实施方式中，t细胞的刺激和/或扩增可涉及刺激肿瘤浸润淋巴细胞群。在一些实施方式中，可以从t细胞群(例如异质特异性的t细胞群)内扩增t细胞群，其可能是从血液样本、pbmc群或肿瘤浸润淋巴细胞群中获得的。刺激/扩增可能导致hpv特异性免疫细胞(例如hpv特异性t细胞，如hpv特异性ctl)数量增加()，和/或在刺激/扩增结束时导致细胞群中此类细胞的比例增加。所述方法可涉及t细胞的刺激和/或扩增。细胞可以从待治疗的患者(即自体细胞)或从另一个体(即同种异体细胞)获得。在某些实施方式中，所述方法涉及刺激和/或扩增分离的免疫细胞。也就是说，可以对基本上不含非免疫细胞的细胞群进行特定的方法，例如红细胞。在一些情况下，免疫细胞是分离的pbmc或分离的t细胞。细胞可以从血液样品中获得，例如从患者或个体获得的血液样品。细胞可以从组织样品或活组织检查获得。细胞可以从肿瘤(例如肿瘤浸润淋巴细胞)获得。本文公开的某些方法涉及从获自患者的样品中获得pbmc和/或t细胞的步骤。方法的某些实施方式不涉及从患者或个体获得血液或细胞样品的步骤，而是在先前已获得的样品或细胞上进行。所述方法可以包括处理样品，例如富集样品用于免疫细胞，例如pbmc和/或t细胞。这些方法可包括去除或基本上减少样品中红细胞、血小板、血清和/或血浆的量。这可能导致免疫细胞群基本上不含其他细胞，例如红细胞。本文公开的方法可以对分离的免疫细胞或除其他细胞外的含有免疫细胞的样品进行。
在生产t细胞的方法中，外周血t细胞最初可以用已接触于一种或多种跨越至少一种hpv抗原的部分或全部的肽的apc刺激。可以将抗原肽提供给肽混合物文库中的apc，并且可以将多个pepmix文库提供给相同的apc集合。在一些实施方式中，所述集合包括免疫显性抗原和亚显性抗原。
在本发明的实施方式中，产生治疗性t细胞，并且可以被提供给具有hpv感染的个体或具有间接或直接由hpv感染产生的hpv相关医学病症的风险的个体。在产生治疗性t细胞的方法中，在某些条件下，外周血t细胞与apc混合，所述apc载有跨越部分或全部一种或多种抗原的肽库，例如，包括hpv16和/或hpv18抗原的部分或全部，包括e6和/或e7。在具体的实施方式中，对于刺激步骤，t细胞存在于pbmc群中。
在一些实施方式中，在某些步骤中使用的apc可以是树突细胞(dc)。产生dc的方法是本领域熟知的，例如，参见ramos等人，同上。可通过cd14选择从pbmc分离单核细胞，并在含有800u/ml粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和1000u/ml白细胞介素的dc的2mm丙氨酰-谷氨酰胺培养基中培养5天。gm-csf和il-4可在第3天补充。在第5天，dc在含有10ng/ml白细胞介素-1β(il-1β)、100ng/ml白细胞介素6(il-6)、10ng/ml前列腺素e2、800u/mlgm-csf和1000u/mlil-4的dc培养基中成熟。可以通过流式细胞术评估dc的成熟度以检测cd80、cd83、cd86和hla-dr的上调。
在一些实施方式中，在某些步骤中使用的apc是活化的t细胞。活化的t细胞可以是用从静脉切放的血液中分离的一部分自体pbmc产生的多克隆t细胞(t-apc)。可以通过在用抗cd3和抗cd28抗体包被的细胞培养板中培养来激活细胞。然后在il-2存在下培养细胞并扩增2周。扩增的t-apc可以冷冻保存以备后用。在用t-apc刺激前2-3天(例如，对于第3个刺激周期和任选的后续刺激)，将冷冻保存的细胞解冻并在抗cd3和抗cd28抗体包被的细胞培养板中再刺激。在刺激当天，收获t-apc细胞并用hpve6/e7肽脉冲，然后以1：1的比例加入hpv刺激的t细胞培养物中。
在一些实施方式中，在某些步骤和/或方法中使用的apc可以是b-母细胞(bb)。例如，可以从患者的自体pbmc产生b细胞。通过与表达辐射的同种异体cd40l的mrc5上皮细胞系共培养激活pbmc内的b淋巴细胞，并在含有100u/mlil-4和1微克/ml环孢菌素a的培养基中扩增。
在一些实施方式中，有一种产生t细胞的方法，所述t细胞靶向来自hpv16和hpv18之一或两者的至少一种抗原，这通常通过使多个pbmc与多个装载肽的apc接触来实现，所述肽来自对应于一种或多种特定hpv16和/或hpv18病毒抗原的肽文库。在具体的实施方式中，两个细胞群的接触使t细胞扩增。在具体的实施方式中，刺激步骤在一种或多种特定细胞因子的存在下发生，所述细胞因子可以是哺乳动物(例如鼠、人)或人细胞因子。在某些实施方式中，所述一种或多种细胞因子是il-7和il-15，但在替代实施方式中，细胞因子选自il-15、il-7、il-21、il-12、il-6、il-4及其组合。在具体的实施方式中，所述方法的一个或多个步骤不在il-2、il-4、il-6、il-7、il-12和/或il-21存在下发生，尽管可选地，可以使用il-2、il-4、il-6、il-7、il-12和/或il-21。提及的细胞因子的存在是指存在外源添加的细胞因子，即排除细胞培养物中存在或分泌的任何细胞因子。在一些实施方式中，所述肽进一步定义为在序列上重叠以跨越hpv抗原的部分或全部的肽。例如，在某些方面，肽重叠至少10个，特别是11个氨基酸，在一些实施方式中，所述肽的长度为至少12个或更多个氨基酸，特别是15个氨基酸。
细胞培养物中所包含的适当量或浓度的给定细胞因子的选择是在本领域普通技术人员的能力范围内的。举例来说，以下是某些白细胞介素的列表和可以使用的适当浓度的实例：
白细胞介素6(il-6)：50至150ng/ml，约50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml或150ng/ml之一；
白细胞介素7(il-7)：5至15ng/ml，约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml或15ng/ml之一；
白细胞介素12(il-12)：5至15ng/ml，约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml或15ng/ml之一；
白细胞介素15(il-15)：5至15ng/ml，约5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml或15ng/ml之一。
下表1提供了本发明方法的某些实施方式的实例。
表1：方法中因素的实例
因此，在具体的实施方式中，将t细胞群(其中细胞群可包含基本上所有t细胞或其中t细胞群在另一细胞群内，例如在pbmc内)接触于apc群体以产生具有特定特征的t细胞系，至少包括：a)靶向hpv16e6和/或e7的有效性和/或靶向hpv18e6和/或e7的有效性；b)多克隆；c)th1偏差；或d)其组合。产生的t细胞系可以产生有效靶向hpv7型(hpv-18、-39、-45、-59、-68)和9型(hpv-16、-31、-33、-35，-52、-58、-67)，以及6型和11型，这可能是肽混合物针对任何一种或多种下列抗原的结果：e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、l1和/或l2。
在一些情况下，t细胞被刺激多次，并且不同的刺激步骤可能会或可能不会使细胞群接触相同的条件。在具体实施方式中，第一次刺激的条件与后续刺激不同，所述后续刺激包括第二刺激和/或第三刺激。在具体的实施方式中，所述法的第一刺激步骤利用载有肽混合物的dc或载有肽混合物的pbmc的apc，并且利用il-7和il-15。所述刺激步骤可任选地重复一次或多次。
在所述方法的某些实施方式中，在外周血t细胞(或pbmc)初始接触于肽混合物或apc后第8天和第10天之间，在第8天、第9天或第10天可能会再次刺激pbmc，但不会更晚，然后可以在第15天、第16天或第17天进行随后的再刺激。
在第一刺激步骤之后的刺激步骤中(包括第一刺激步骤的可选重复)，将在第一次刺激后(可以在异质细胞群中)获得的所得t细胞接触于负载肽混合物的dc或载有肽混合物的pbmc和/或自体活化的t细胞。在第一和第二刺激步骤之后的刺激中，将第二次或后期刺激后(可以存在于异质细胞群中)获得的t细胞接触于肽混合物-自体活化的t细胞。可以在任何刺激步骤中使用的共刺激细胞包括至少表达cd86、4-1bb、cd83、cd40、ox40和/或cd80的细胞。在特定情况下，共刺激细胞可以是k562细胞。
在一些实施方式中，在所述方法的步骤中，修饰培养物中的细胞。在具体的实施方式中，修饰细胞以含有表达基因产物的多核苷酸，所述基因产物使细胞对特定目的或功能有效或更有效，例如，有效或更有效地靶向特定靶标和/或增强t细胞介导的细胞毒性的功能，和/或修饰以抵抗肿瘤抗原特异性细胞免疫，。
在一些实施方式中，修饰细胞以表达某种非天然受体，其允许t细胞有效或更有效地靶向期望的靶细胞，例如表达某种抗原的靶细胞。可以修饰细胞以表达嵌合抗原受体(car)、αβt细胞受体等。在方法的特定时间点期间，可以修饰细胞以表达表达载体(可以是病毒(包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等)或非病毒)，例如，在培养的第2天和第5天之间引入载体。在一些实施方式中，细胞在每次刺激后约3天内暴露于表达载体，但在这种情况下，修饰发生在具有较少长期潜力的更多分化的t细胞中(在特定情况下是理想的)。
在具体的实施方式中，修饰细胞以表达靶向癌抗原的car，如epha2、her2、gd2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、5t4、8h9、αvβ6整合素、b细胞成熟抗原(bcma)b7-h3、b7-h6、caix、ca9、cd19、cd20、cd22、κ轻链、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd123、cd138、cd171、cea、cspg4、egfr、egfrviii、egp2、egp40、epcam、erbb3、erbb4、erbb3/4、fap、far、fbp、胎儿achr、叶酸受体α、gd2、gd3、hla-aimagea1、hla-a2、il11ra、il13ra2、kdr、λ噬菌体、lewis-y、mcsp、间皮素、muc1、muc16、ncam、nkg2d配体、ny-eso-1、黑色素瘤特异性抗原、psca、psc1、psma、ror1、sp17、存活素、tag72、tem1、tem8、vegrr2、癌胚抗原、hmw-maa、vegf受体，和/或与肿瘤细胞外基质一起存在的其他示例性抗原，例如，通过基因组分析和/或肿瘤的差异表达研究鉴定的纤连蛋白、肌腱蛋白或肿瘤的坏死区域和其他肿瘤相关抗原或可作用突变的癌胚变体。
在一些实施方式中，修饰细胞以抵抗肿瘤抗原特异性细胞免疫，例如由转化生长因子β(tgf-β)介导的。例如，可以修饰细胞以表达tgf-β的显性负性受体(dnrii)，例如，如foster等人所述(用显性阴性tgf-β受体转导的ebv特异性t淋巴细胞的抗肿瘤活性，jimmunother，2008；31：500-505，通过引用并入本文)。这可以包括用逆转录病毒表达载体转染细胞，所述逆转录病毒表达载体编码通过去除免疫原性血凝素标签而修饰的显性负性tgf-βii型受体(dnrii)。已显示这种修饰的t细胞在tgf-β分泌性肿瘤存在下，相对于未修饰的t细胞具有功能优势，包括增强的抗肿瘤活性(foster等，同上)。
与现有技术方法相比，本发明的方法可以提高病毒特异性t细胞群的扩增速率。可以通过技术人员熟知的方法分析t细胞群的扩增速率。方法包括在一个或多个时间点测定t细胞的数量。例如，可以在进行本发明的方法之后测定t细胞的数量，并且与该方法开始时的t细胞的数量进行比较；然后计算t细胞数量扩大的倍数。
也可以通过在一段时间内分析t细胞的细胞分裂来测定扩增速率。可以分析给定t细胞群的细胞分裂，例如，通过体外分析3h-胸苷的引入或通过cfse稀释实验，例如fulcher和wong，immunolcellbiol(1999)77(6)：559-564中所述，该文献通过引用整体并入本文。
通过本发明的方法实现的扩增速率的改善可以通过进行本发明的方法，并将该方法中的t细胞的扩增与可比较的控制方法(例如，根据ramos等人的方法(jimmunother2013；36：66-76))进行比较来确定。
在一些实施方式中，本发明的方法中t细胞群的扩增速率是可比较的对照方法中扩增速率的至少1.001倍、1.002倍、1.003倍、1.004倍、1.005倍、1.006倍、1.007倍、1.008倍、1.009倍、1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍之一。
扩增速率可以是病毒特异性t细胞群的，或总t细胞群的。
本发明的方法产生/扩增的病毒特异性t细胞可至少保留与现有技术方法产生/扩增的病毒特异性t细胞相同的功能特性。也就是说，加快的扩增速率不会对扩增的t细胞的功能特性产生负面影响。
例如，在所述方法产生/扩增病毒特异性t细胞群的实施方式中，t细胞对感染或包含/表达病毒肽的细胞显示出与现有技术方法扩增的病毒特异性t细胞相似的细胞毒性。
可以分析扩增的t细胞的细胞毒性，例如通过用呈递病毒肽的apc培养扩增的t细胞群，其中所述t细胞在不同的效应子(即t细胞)与靶标(即apc)比例下具有特异性，并测定apc的特异性裂解。例如，可以通过测定hpv转化的lcl细胞在不同效应物与靶标比例下的特异性裂解来分析hpv特异性ctl群的细胞毒性。
b.使用治疗性t细胞
在某些实施方式中，将通过本发明的方法产生的细胞提供给需要的个体用于治疗医学病症，包括由病毒感染引起的病症，或靶向没有可检测到或已经表现出医学病症的症状的病毒感染。如本文所用，“治疗”或“正在治疗的”包括对疾病或病理状况的症状或病状的任何有益或期望的作用，并且可以甚至包括所治疗的疾病或病症(例如癌症)的一种或多种可测量标记物的最小减少。治疗可任选地涉及疾病或病症的症状的减轻或改善，或疾病或病症的进展的延迟。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。
在本发明所涵盖的方法中，治疗性t细胞用于治疗由单一非hpv病毒直接或间接引起的病毒相关疾病，或以其他方式提供给对单一非hpv病毒呈血清反应阳性的个体。在其他情况下，治疗性t细胞用于治疗由一种以上病毒直接或间接引起的病毒相关疾病，或以其他方式提供给对一种以上病毒呈血清反应阳性的个体。在治疗性t细胞的集合中，每个t细胞及其后代对来自一种病毒的一种抗原中的仅一种肽具有特异性，并且在产生治疗性t细胞集合时，例如一种扩增一个t细胞克隆群，它们一起对例如每种病毒抗原中的多个表位具有多特异性。
在本发明的至少一些方法中，将治疗有效量的本文产生的ctl施用于个体，例如，已知患有或疑似患有或易患有hpv16和/或hpv18相关疾病的个体。在具体的实施方式中，细胞通过注射施用，例如静脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹膜内注射等。在一些实施方式中，所述ctl进一步定义为多克隆cd4+和cd8+ctl。pbmc可以是个体的同种异体的或可以是个体自体的。
在某些情况下，肿瘤用本发明的细胞治疗，并且肿瘤可以是良性的、恶性的或可导致癌症的癌前病变。因此，可以在癌前病变阶段和/或在病变变为恶性后用本发明的方法产生的细胞治疗个体。个体可能患有早期或晚期癌症，并且技术人员知道产生细胞的方法可以针对这样的不同癌症阶段定制，例如通过利用来自与早期vs晚期癌症相关的抗原的肽用于apc。在具体的实施方式中，癌症可以是原发性的、转移性的、复发性的、难治性的等。
在某些情况下，可导致癌症的癌前病变可用本发明方法产生的细胞治疗，例如宫颈、外阴、阴道、阴茎、喉、口咽、肛门，以及其他上呼吸消化区域的癌前病变。因此，可以在癌前病变阶段和/或在病变变为恶性后用本发明的方法产生的细胞治疗个体。可用本发明的方法产生的细胞治疗的hpv相关医学病症包括至少生殖器区发育异常、宫颈上皮内瘤形成、外阴上皮内瘤形成、阴茎上皮内瘤形成、肛门上皮内瘤形成、宫颈癌、肛门癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、生殖器癌、口咽癌、鼻咽癌、口腔乳头状瘤和其他上呼吸消化道病变。
在某些情况下，可以在施用细胞之前确定与癌症相关的血清型，尽管在某些情况下血清型未确定。在具体的实施方式中，hpv16特异性或hpv18特异性细胞分别对hpv16或hpv18阳性的肿瘤具有活性，尽管在一些情况下与不同的hpv血清型存在交叉反应性。交叉反应的能力可能已知或可能未知，并且在某些情况下，例如，hpv16感染或hpv16相关医学病症的个体被施用hpv18特异性t细胞，反之亦然。在这种情况下，个体可以用对血清型特异的细胞进行治疗，其中不知道个体是否具有该血清型，但由于交叉反应性，细胞仍然具有治疗效果。
在所述方法的刺激步骤的apc载有hpv16和hpv18肽混合物的情况下，通过这些apc扩增的t细胞的施用结果由个体是否已经接触所讨论的病毒来确定。例如，如果个体感染hpv18而不感染hpv16，则只有hpv18特异性t细胞会响应，这是因为感染最初会刺激t细胞响应hpv18。那些t细胞将在个体中扩增，然后变成记忆t细胞，并且其数量将高于从未被激活的例如hpv16特异性t细胞。
被治疗的个体可能已知患有癌症、疑似患有癌症，或有患癌症的风险(例如个人或家族病史；性活跃，包括性滥交；和/或具有遗传倾向，包括一个或多个特异的标记物)。被治疗的个体可能存在hpv病毒，但尚无任何hpv相关的医学病症的有害症状。个体可能患有良性或恶性肿瘤。个体可能患有早期或晚期癌症，并且本领域技术人员知道产生细胞的方法可以针对这样的不同癌症阶段定制，例如通过利用来自与早期vs晚期癌症相关的抗原的肽用于apc。在具体的实施方式中，hpv相关疾病是口腔或生殖器区域的恶性癌症。在具体的实施方式中，癌症可以是原发性的、转移性的、复发性的、难治性的等。由于任何种类的性行为或任何形式的亲密身体接触，个体可能感染hpv16和/或hpv18。
可以用本发明所涵盖的细胞治疗hpv感染的任何阶段。用本发明的方法治疗患有已确定的hpv相关癌症的个体包括原位癌(阶段0)、阶段i、阶段ii、阶段iii或阶段iv(其可通过mri、ct扫描、pet扫描等)。另外，也可以治疗患有癌前病变(发育异常)的个体。
在一些实施方式中，将本发明的方法产生的细胞一次或多次施用给需要的个体。不同施用之间的时间间隔可以是任何合适的持续时间，包括1-7天、1-4周、1-12个月或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。在某些情况下，可以在约一年内多次输注。在向个体施用一次以上细胞的情况下，细胞所靶向的抗原可以是或可以不是与早期施用中使用的细胞靶向的相同抗原。例如，在第一次施用细胞时，细胞可以靶向hpv18e6，而在另一次施用细胞时，细胞靶向hpv18e7，反之亦然。例如，在变得难治的癌症中可能需要额外的施用。可以结合一种或多种其他类型的癌症治疗并使用额外的刺激。
在某些情况下，任选地通过本领域任何合适的方法确定个体患有hpv。因为hpv不能在细胞培养物中培养，所以可以利用hpv感染诊断方法，例如利用pcr进行dna测试、southern印迹杂交和/或原位杂交，并且这些方法可以与或不与例如阴道镜检查、醋酸试验、活检、体检和/或巴氏涂片联合使用。
在具体的实施方式中，向男性个体提供有效量的通过本发明的方法产生的细胞以靶向与其感染的hpv，并且在这种情况下，所述个体此后感染另一个个体(例如通过性活动的女性个体)的机会降低。在接触本发明的方法的细胞之前，可以确定或不确定男性个体感染hpv。在某些情况下，如果一个人显示感染了致癌hpv，那么值得用细胞治疗他以消除他的风险。如果细胞有效，它们也会减少他将病毒传播给伴侣的机会。
在具体的实施方式中，个体是免疫受损的(例如，其可以定义为其免疫系统抵抗感染性疾病或癌症的能力受损或完全不存在的个体)。在具体的实施方式中，所述免疫功能受损的个体已经进行了干细胞移植(包括造血干细胞移植)、已经进行过器官移植和/或已经接受过一种或多种癌症治疗，包括例如化疗或放射治疗。在某些情况下，个体已经患有或遗传了免疫缺陷障碍。在一些实施方式中，向由于其疾病和/或其治疗而免疫受损的人提供了本发明的方法和/或组合物。
医学治疗方法可以包括通过改善、治疗或预防人受试者中的恶性肿瘤的方法来治疗癌症，其中该方法的步骤有助于或增强免疫系统以根除癌细胞。这些方法可包括施用本发明所述的细胞，其引发活性(或实现被动)免疫应答以破坏癌细胞。治疗方法可任选地包括将生物佐剂(例如白细胞介素、细胞因子、卡介苗(bacilluscomette-guerin)、单磷酰脂质a等)与用于治疗癌症的常规疗法(例如化学疗法、放射疗法或外科手术)组合共同施用。治疗方法可包括施用本发明的组合物作为疫苗，其通过激活免疫系统以预防或破坏癌细胞生长而起作用。医学治疗方法还可以涉及体内、离体和过继性免疫疗法，包括使用自体和/或异体细胞或永生化细胞系的那些。
iii.药物组合物
根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于向个体施用的组合物。在一个具体实施方式中，所述药物组合物包含含有治疗性免疫细胞的组合物，用于肠胃外、透皮、腔内、动脉内、鞘内或静脉内施用或直接注射入肿瘤，例如癌症。特别是将药物组合物通过输注或注射施用于个体。合适的组合物的施用可以通过不同方式，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部或皮内施用进行。
本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域熟知的，包括磷酸盐缓冲溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过众所周知的常规方法配制。这些药物组合物可以合适的剂量施用给受试者。
剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如在医学领域中众所周知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。施用的具体剂量可以是2×107细胞/体表面积m2至1×1010细胞/体表面积m2。可以通过定期评估来监测进展情况。
本发明的组合物可以局部或全身施用。在一个优选的实施方式中，药物组合物皮下施用，甚至在更优选的实施方式中静脉内施用。肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐溶液和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(ringer‘sdextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉注射的载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白质载体，例如，血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。可以设想，除了本发明中描述的细胞之外，本发明的药物组合物可以还包含其他生物活性剂，这取决于药物组合物的预期用途。
iv.联合疗法
在涉及针对hpv抗原产生的ctl的本发明的某些实施方式中，本发明的用于临床方面的方法与在增生过度性疾病的治疗中有效的其它制剂如抗癌剂合用。“抗癌”剂能够例如通过杀死癌细胞，对受试者的癌症产生负面影响，包括诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速度、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展、或增加患有癌症的受试者的寿命。更普遍地，将会以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供这些其它组合物。这可以通过使癌细胞与单一组合物或包含两种药剂的药物制剂接触，或通过使癌细胞同时与两种不同的组合物或制剂接触来实现，其中，一种组合物包括所述表达构建体，而另一种包括所述第二种制剂。在其他情况下，细胞和第二组合物的施用可以是分开的，并且可以具有单独的施用途径和/或载体。
肿瘤细胞对化学疗法和放射疗法的耐药性是临床肿瘤学中的主要问题。目前癌症研究的一个目标是通过将其与其他疗法相结合，找到提高化疗和/或放疗疗效的方法。在本发明的上下文中，预期细胞疗法类似地可以与化学治疗、放射治疗和/或免疫治疗干预配合施用。
或者，本发明的疗法可以在其他药剂治疗之前或之后，以数分钟至数周、数月或数年的间隔进行。在将其他药剂和本发明单独应用于个体的实施方式中，通常可确保在每次递送时间之间的有效时期并不造成药效过期，因此，该制剂和本发明的疗法将仍然能发挥对该细胞的有益的组合效应。在这种情况下，预期可使该细胞接触两种治疗，且两种治疗的时间间隔为约12至24小时内，更优选在约6至12个小时内。在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，然而，每次施用之间的时间间隔为几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(2、3、4、5、6、7或8周)。
预期将根据需要重复该治疗周期。还预期各种标准疗法以及手术干预可以与本发明的细胞疗法组合应用。
可以与由本发明的方法产生的细胞结合使用的hpv相关癌症治疗(作为实例)的实例包括至少以下：1)手术(肿瘤切除、颈淋巴结清扫术、锥形切除术、子宫切除术等)；2)药物治疗，可能包括
v.本发明的试剂盒
本文所述的任何组合物可包含在试剂盒中。一个非限制性实例中，肽混合物文库可以包含在试剂盒中，可以在试剂盒中提供任何类型的细胞，和/或可以在试剂盒中提供用于操作肽混合物和/或细胞的试剂。试剂盒中可包括细胞因子或产生它们的装置(例如编码它们的载体)。可以包括细胞培养试剂和/或装置。组分被提供于合适的容器装置中。
在一个实施方式中，试剂盒可以包含容器，所述容器包含通过本发明方法获得的一定量t细胞，所述t细胞被配制用于施用于受试者(例如通过与合适的载体、赋形剂、稀释剂或佐剂混合)，优选通过输注，更优选地在自体过继细胞免疫疗法的方法中通过输注施用。所述试剂盒可以保持在预定的温度，例如，低于约4℃、低于约-2℃或低于约-50℃。试剂盒可以进一步包括用于储存和/或运输试剂盒和/或用于施用t细胞的说明书。
试剂盒可包含适当等分的本发明组合物。试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可位于且优选地适当等分于所述容器装置中。当试剂盒中存在一种以上组分时，该试剂盒一般还将含有第二、第三或其他额外的容器，额外的组分可单独位于这些容器中。然而，组分的各种组合可包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳组分的装置，密封以用于商业销售。这类容器可包括例如注射成模或吹模成型的塑料容器，其中保留了所需小瓶。
然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过加入适当的溶剂来重构所述粉末。预期亦可将该溶剂提供于另一容器装置中。
在某些情况下，试剂盒中可以包含检测hpv感染的试剂和/或装置。实例包括拭子、刮刀、细胞刷、载玻片、盖玻片、细胞学样品收集容器等。用于hpv感染或癌症的其他药物可以包括在试剂盒中，例如贝伐单抗、博莱霉素、拓扑替康盐酸盐、或其组合。
实施例
提供以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案。然而，它们绝不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1
生产治疗性t细胞
在本发明的一些实施方式中，有一种可以快速生成t细胞的单方制剂的机制，所述t细胞包括多克隆(例如，cd4+和cd8+)ctl，其对来自一种或多种可被证明致命的人乳头瘤病毒的各种抗原具有一致的特异性。本公开易于适应临床实施，并且可以用作“现成的”hpv抗病毒剂。所述方法和组合物易于适应临床实施，并且可用作个体的安全有效的hpv抗病毒剂。
在具体的实施方式中，在存在或不存在特异性辅助细胞因子的情况下，用载有跨越e6/e7的肽混合物[由11个氨基酸(aa)重叠的15聚体肽库()]的单核细胞衍生的树突细胞刺激外周血t细胞。用载有肽混合物的活化b细胞母细胞进一步扩增所得的t细胞系。从8/16宫颈癌和33/52口咽癌患者中成功地重新激活和扩增(>1200倍)e6特异性/e7特异性t细胞。
在所述方法的具体实施方式中，细胞因子白细胞介素(il)-6、il-7、il-12和il-15的存在对于方法是有用的。生产的t细胞系具有多克隆性、多t细胞亚群表示(包括记忆区室)和th1偏向的理想特征，并消除e6/e7靶标。该公开内容已经表明，可以从患有hpv16相关癌症的患者中稳健地生成hpv16e6/e7定向t细胞系。因为该技术可扩展且符合良好生产程序，这些品系可用于hpv16癌症患者的过继性细胞免疫治疗，也可用于hpv18癌症患者。
用于产生hpv16的t细胞的已知方法在图1a中示出，显示了3种hpv相关癌症患者的结果(在仅载有hpv16-肽混合物的dc刺激pbmc后获得的细胞系中获得的γifnelispot测定)。在图1b中，除了第三个体之外，还显示了其中2个患者的结果，其结果也在图1a中示出。图1b显示了通过负载hpv16-肽混合物和hpv18-肽混合物的dc刺激pbmc后获得的细胞系的γifnelispot测定的结果。可检测到针对hpv16和hpv18抗原的反应性(并非所有患者都具有针对两种血清型的反应性)。
转向方法的细节，在某些情况下，dc装载有hpv16-e6/e7和hpv18-e6/e7肽混合物文库。在这种情况下，细胞系能够识别hpv16和hpv18e6和e7抗原(例如，而不是仅hpv16抗原)。在至少某些情况下，t细胞的扩增发生在il-7和il-15的存在下，而不是il-2。在所述方法的条件中，在每个刺激和扩增步骤中，il-7和il-15可以存在或不存在。在一些实施方式中，用dcs初始产生/扩增后hpv特异性t细胞的扩增不是在il-15存在下用载有肽混合物的自体b母细胞完成的，而是在共刺激细胞(cd80/cd86/cd83/4-1bbl)和il-7和il-15的存在下，利用载有肽混合物的自体多克隆活化t细胞完成的。采用这些条件，t细胞以更快的速率扩增，至少是通过已知方法获得的量的10倍，并且成功证明在3轮刺激后发生并且没有丧失特异性。
表2中提供了使用已知方法对3名hpv相关癌症患者进行细胞扩增的倍数的总结。
表3中显示了使用本公开的新方法的3个hpv相关癌症患者的细胞扩增的倍数的总结。3轮刺激后的扩增的倍数平均比使用已知方法高约50倍。特异性被保持(在#1中说明)。
实施例2
hpvt细胞扩增的流程
hpv刺激的t细胞(hpvst)首先被hpve6/e7肽脉冲的自体树突细胞(dc)以pbmc：dc为10-20：1的比例激活，并在含有il-6(100ng/ml)、il-7(10ng/ml)、il-12(10ng/ml)、il-15(10ng/ml)的培养基中培养8天(例如，根据ramos等人描述的第一刺激步骤，(jimmunother2013；36：66-76))。
第9天的第二次刺激步骤，在含有il-7(10ng/ml)和il-15(100ng/ml)的培养基中，使用肽脉冲的dc以pbmc：dc为5-10：1的比例进行。
然后进行随后的每周刺激/扩增步骤，在存在相同数量的经照射的同种异体k562-cs共刺激细胞的情况下，以及在含有il-7(10ng/ml)和il-15(100ng/ml)的培养基中，使用hpve6/e7肽脉冲自体t-apc以1：1的比例获得所需数量的hpvst。使用从静脉切放的血液中分离的一部分自体pbmc产生多克隆t细胞(t-apc)。通过在用抗cd3和抗cd28抗体包被的细胞培养板中培养来激活细胞。然后培养细胞在il-2存在下扩增2周。扩增的t-apc可以冷冻保存以备后用。在使用t-apc进行hpvst再刺激(hpvst再刺激及其后的第3个循环)之前2-3天，将冷冻保存的细胞解冻并在抗cd3和抗cd28抗体包被的细胞培养板中再刺激。在hpvst再刺激当天，收获t-apc细胞并用hpve6/e7肽脉冲，然后以1：1的比例加入正在培养的hpvst培养物。
实施例3
hpvsts在人类患者中的体内扩增和持续性
用tgf-β()显性阴性受体(dnrii)转导从实施例2获得的hpvst[参见foster等，用显性阴性tgf-β受体转导的ebv特异性t淋巴细胞的抗肿瘤活性。jimmunother.2008；31：500-505]。
将hpvst给予两名患者并测试体内扩增和持久性。患者#1患有广泛转移性口咽癌并且已经停止了先前的治疗。患者#2患有口咽癌转移到颈部并接受伴随的尼沃单抗(nivolumab)治疗，而没有事先对单独的尼沃单抗(nivolumab)的反应。
通过dnrii基因的qpcr评估输注的hpvst的体内扩增和持续性，所述qpcr在从患者的外周血分离的pbmc中进行检测。图2和图3中的数据点显示了输注hpvst后的关键输注后间隔。
在患者#1中观察到进行性扩张(图2)。在患者#2中，尽管扩张受限(图3)，但在6周时达到峰值，同时再次输注hpvst，患者具有部分临床反应。hpvst输注后6周，与治疗前基线相比，患者#2通过pet扫描和体格检查显示疾病负担减少(图4)。
尽管已经详细描述了本发明及其优点，但应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的要旨和范围的情况下，可以进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法和步骤。本领域普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，目前存在或稍后开发的执行基本相同功能的过程、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤，或者实现与本文描述的对应实施例基本相同的结果可以根据本发明来使用。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。
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