作为选择标记的减毒谷氨酰胺合成酶的制作方法

文档序号：18188777发布日期：2019-07-17 05:29阅读：361来源：国知局

本申请要求于2016年11月16日提交的新加坡临时申请号10201609619s的优先权，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文。

本发明一般涉及突变或基因工程。具体地，本发明涉及表达载体和使用标记选择含有载体的宿主的方法。

背景技术：

在用于生物生产的稳定细胞系开发领域中，需要选择高产量且同时稳定的细胞。本领域中使用的选择系统的实例为谷氨酰胺合成酶(gs)选择系统。在通常用于稳定细胞系开发的某些细胞中，谷氨酰胺合成酶(gs)已失活。因此，这些细胞不能自行合成谷氨酰胺，且只有在培养基中加入谷氨酰胺后才能存活和生长。因此，gs基因已广泛用于表达载体中作为阳性选择标记。所以，当从培养基中除去谷氨酰胺时，只有已经含有包含gs基因的表达载体的细胞才能存活。此外，除了从培养基中除去谷氨酰胺，为了确保只有高产细胞存活，还需添加gs抑制剂。由于gs活性受到抑制，添加gs抑制剂可增加染色体中表达盒的拷贝数。因此，只有具有较高拷贝数的gs基因的细胞才能在gs抑制剂处理中存活。

利用上述方法，为了最终获得稳定且高产的细胞系，需要分离数百个单克隆以确定其产量。其在去除gs抑制剂后的稳定性也必须经过至少60代的评估。这是一个劳动密集型和费时的过程。

综上所述，为了简化产生稳定细胞系的过程，有必要提供一种替代表达载体，该表达载体包含一种编码替代谷氨酰胺合成酶的多核苷酸。

技术实现要素：

在一方面，提供表达载体，包括编码与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸。在一种实施方案中，该表达载体还包含至少一种编码目标多肽的多核苷酸。在另一种实施方案中，与野生型谷氨酰胺合成酶相比，该活性降低的谷氨酰胺合成酶包含一个或多个突变。在另一种实施方案中，该活性降低的谷氨酰胺合成酶包含在谷氨酸结合区、atp结合区和/或氨结合区中的一个或多个突变。在另一种实施方案中，(i)谷氨酸结合区中的突变为在选自由谷氨酰胺合成酶的以下位置组成的组处的至少一个氨基酸的突变：134、136、196、203、248、249、253、299、319、338和340；或(ii)氨结合区中的突变为在选自由谷氨酰胺合成酶的以下位置组成的组处的至少一个氨基酸的突变：63、66、162和305；或(iii)atp结合区中的突变为在选自由谷氨酰胺合成酶的以下位置组成的组处的至少一个氨基酸的突变：192、255、257、262、333、336和324；其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在另一种实施方案中，该突变为在选自由谷氨酰胺合成酶的以下位置组成的组处的至少一个氨基酸的突变：12、19、63、66、91、116、134、136、160、162、172、176、181、192、194、196、198、199、203、230、248、249、253、255、257、260、262、271、299、305、319、336、338、333、340、324和341，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在另一种实施方案中，该突变为取代。在另一种实施方案中，谷氨酰胺合成酶中的突变选自由谷氨酰胺合成酶的r324c、r341c、d63a、s66a、e134a、e136a、y162a、g192a、e196a、e203a、n248a、g249a、h253a、n255a、s257a、r262a、r299a、e305a、r319a、r324a、y336a、e338a、k333a、r340a和r341a组成的组，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。

在另一种实施方案中，编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸与启动子可操作地连接。在另一种实施方案中，编码目标多肽的至少一个多核苷酸中的仅一个与启动子可操作地连接。在另一种实施方案中，编码与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸不与启动子连接。在另一种实施方案中，目标多肽选自由重组蛋白及其一部分、融合蛋白及其一部分、抗体及其一部分组成的组。在另一种实施方案中，目标多肽为目标抗体的重链和/或目标抗体的轻链。在另一种实施方案中，表达载体包含两个多核苷酸，每个多核苷酸编码目标多肽，其中多核苷酸中的一个编码目标抗体的轻链，且多核苷酸的一个编码相同目标抗体的重链。在另一种实施方案中，编码目标抗体的轻链的多核苷酸与编码相同目标抗体的重链的多核苷酸通过编码内部核糖体进入位点(ires)的多核苷酸分开。在另一种实施方案中，编码目标抗体的重链的多核苷酸与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸通过编码内部核糖体进入位点(ires)的多核苷酸分开。在另一种实施方案中，将编码目标抗体的轻链的多核苷酸与编码相同目标抗体的重链的多核苷酸分开的编码内部核糖体进入位点的多核苷酸为编码野生型内部核糖体进入位点(ires)的多核苷酸，并且其中，将编码目标抗体的重链的多核苷酸与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸分开的内部核糖体进入位点为编码具有降低的翻译效率的内部核糖体进入位点(iresatt)的多核苷酸。

在另一个方面，提供宿主细胞，其包含如本文所述的表达载体。在另一方面，提供制备稳定细胞系的方法，包括：(a)用本文所述的表达载体转化不具有谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；以及(b)在培养基中培养转化的宿主细胞，该培养基选择性地允许待选的转化的宿主细胞增殖，该宿主细胞包含扩增数目的拷贝的载体。

另一方面，提供生产目标多肽的方法，包括：(a)用本文所述的表达载体转化不具有谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；(b)在培养基中培养转化的宿主细胞，该培养基选择性地允许产生目标多肽；以及(c)从(b)的培养基中收集目标多肽。在另一种实施方案中，该培养基为不含谷氨酰胺的细胞培养基。在另一种实施方案中，该方法不包含使用谷氨酰胺合成酶抑制剂，任选地其中谷氨酰胺合成酶抑制剂为甲硫氨酸砜亚胺(msx)。

在另一方面，提供试剂盒，其包含如本文所述的表达载体。在另一种实施方案中，该试剂盒还包含下列中的至少一种：(i)与野生型细胞相比不具有谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；以及(ii)转染培养基或进行转染的装置。在另一种实施方案中，该试剂盒还包含不含谷氨酰胺的细胞培养基。

附图说明

在参考详细描述的同时结合非限制性实施例和附图可以更好地理解本发明，其中:

图1示出了成对的线形图，其描绘了使用以mini池形式用三顺反子mab-gs(seqidno：14)或三顺反子mab-gsatt(r324c)(seqidno：85)转染的chok1gft^-/-gs^-/-细胞产生的抗体的量。图1a描绘了抗体a的实验结果，而图1b描绘了抗体b的实验结果。因此，图1说明了对于抗体a和抗体b的产生，使用三顺反子mab-gsatt(r324c)产生的抗体的量高于使用三顺反子mab-gs产生的抗体的量。

图2示出了成对的柱状图，其描绘了以稳定悬浮池形式用三顺反子mab-gs(seqidno：14)或三顺反子mab-gsatt(r324c)(seqidno：85)转染的chok1gft^-/-gs^-/-细胞产生的抗体滴度(mab滴度)的量。对于初步分析，在无谷氨酰胺的情况下直接对比wtgs系统(即用三顺反子mab-gs转染的chok1gft^-/-gs^-/-细胞)和减毒gs系统(即用mab-gsatt(r324c)转染的chok1gft^-/-gs^-/-细胞)以进行公平对比。因此，wtgs池未用msx处理。图2a描绘了抗体a的实验结果；其证明了使用三顺反子mab-gsatt(r324c)产生的mab滴度的量(标记为mut1、mut2和mut3的数据)比使用三顺反子mab-gs产生的mab滴度的量(标记为wt1、wt2和wt3的数据)高约9.9倍。图2b描绘了抗体b的实验结果；其证明了使用三顺反子mab-gsatt(r324c)产生的mab滴度的量(标记为mut1的数据)是使用三顺反子mab-gs产生的mab滴度的量(标记为wt1、wt2和wt3的数据)的约2.6倍。因此，图2说明了使用三顺反子mab-gsatt(r324c)产生的mab滴度的量高于使用三顺反子mab-gs产生的mab滴度的量。

图3示出了散点图，其描绘了使用以下由稳定池产生的抗体滴度(mab滴度)的量：(a)具有野生型gs(wt)作为选择标记的双顺反子表达载体(数据点以菱形示出了)或(b)具有野生型gs(wt)作为选择标记的双顺反子表达载体且其中细胞还用25μm的甲硫氨酸砜亚胺(msx)处理(数据点以正方形表示)，或(c)具有减毒gs(gsatt)作为选择标记的双顺反子表达载体(细胞不用msx处理；数据点以三角形表示)。因此，图3说明用突变体gs(即双顺反子mab-gsatt(r324c))转染的稳定池中的分批培养mab滴度通常比wtgs池(无论wtgs池是否用msx(25μm)处理))的那些高。

图4示出了描绘wtgs和几种gs突变体的gs活性的对比的柱状图。图4描绘了wtgs和gs突变体的gs活性，其已用未转染的chogs^-/-细胞的细胞裂解物消除(blanked)，并使用其荧光素酶活性归一化表达。图4中gs突变体的gs活性表示为wtgs的gs活性的倍数变化。因此，图4示出了gs上的若干位点，当其由任一氨基酸突变为丙氨酸时，会减弱gs活性。

图5示出了条形图，其描绘了来自2个稳定池(顶部：池1，底部：池2)的20个单克隆的稳定性评估，该稳定池用三顺反子mab-gsatt(r324c)(seqidno：85)进行转染。因此，图5说明几乎所有单克隆(超过95％)都高于70％的稳定性水平，其表明超过95％的单克隆是稳定的。

图6示出了描绘表达载体图谱的成对的图形说明。图6a描绘了双顺反子mabgs的表达载体图谱。对应于双顺反子mabgs的全长序列列为seqidno：5。对应于双顺反子mabgs的表达载体图谱的特定区域的序列列为seqidno：6至13。图6b描绘了三顺反子mabgs的表达载体图谱。对应于三顺反子mabgs的全长序列列为seqidno：14。对应于三顺反子mabgs的表达载体图谱的特定区域的序列列为seqidno：15至30。图6c描绘了三顺反子mabgsr324c的表达载体图谱，其为表达减毒谷氨酰胺合成酶的示例性表达载体。对应于三顺反子mabgsr324c的全长序列列为seqidno：85。对应于三顺反子mabgsr324c的表达载体图谱的特定区域的序列列为seqidno：86至101。因此，图6示出了如本文所述的表达载体图谱的实例。

图7示出了四种不同物种的gs蛋白质序列的序列比对的对比，即中国仓鼠的gs蛋白质序列(标记为“xp_003502909-cho”；seqidno：2)、小鼠的gs蛋白质序列(标记为“np_032157-小鼠”；seqidno：3)、大鼠的gs蛋白质序列(标记为“np_058769-大鼠”；seqidno：4)和人的gs蛋白质序列(标记为“np_0025056-人”；seqidno：1)。标为“一致”的行示出了跨所有四种物种保守的氨基酸残基。箭头表示将引入wtgs的点突变的位置。每个位点的典型点突变列于表1中。虚线箭头表示已知的人类先天性疾病突变的位置。因此，图7示出了列出的四种物种中的gs蛋白质序列是高度保守的。中国仓鼠gs蛋白序列与小鼠的序列相似性百分比为97％，中国仓鼠gs蛋白序列与大鼠的序列相似性百分比为96％，及中国仓鼠gs蛋白序列与人的序列相似性为94％。

图8示出了组合的散点图和表，其描绘了使用wtgs和gs突变体作为cho-k1gs^-/-细胞中的选择标记产生的mab滴度的量的对比。对于wt样品，标记为“gswt”的样品未进行msx选择，而标记为“gswt+msx”的样品进行25μmmsx选择。对于gs突变体样品，“gsm1”对应于具有d63a突变位点的gs、“gsm12”对应于具有n248a突变位点的gs、“gsm16”对应于具有s257a突变位点的gs、“gsm19”对应于具有e305a突变位点的gs，以及“r324c”对应于具有r324c突变位点的gs。因此，图8说明使用gs突变体(gsm1、gsm19和r324c)作为选择标记产生的平均mab滴度高于使用wtgs作为选择标记产生的平均mab滴度。

图9示出了成对的柱状图，描绘了使用gswt作为选择标记(如图9a所示)或gsm16(即具有s257a突变位点的gs)作为选择标记(如图9b所示)生成的稳定池的五个随机克隆的稳定性评估。因此，图9示出了五个gswt克隆中只有两个是稳定的(即维持其原始滴度水平的至少70％)，而五个gsm16克隆中有四个是稳定的。

图10示出了对比cho细胞的野生型gs蛋白序列(标记为“gs”；seqidno：2)和cho细胞的伪gs蛋白序列(标记为“psgs”；seqidno：103)的序列比对。伪gs(psgs)为一段基因组dna，其似乎也编码gs蛋白。与野生型gs基因不同，该psgs基因组基因座不含任何介入的内含子序列。伪gs蛋白通常不被表达。伪gs在整个蛋白质中包含若干突变，如比对中所示(使用黑色箭头)。重要的是，psgs蛋白包含2个突变位点，其被鉴定为对gs活性具有减弱作用。这些位点为e305位点(e305k)和位点r341(r341c)，其中后者为先天性患病位点。从cho-k1细胞克隆该psgs基因并测试其gs活性。发现与wtgs相比，psgs蛋白具有最小活性，如图4中的柱状图所示。因此，图10示出了gs上多个残基的突变会减弱gs活性。

具体实施方式

在某些哺乳动物细胞中，特别是中国仓鼠卵巢(cho)细胞中，谷氨酰胺合成酶(gs)已失活。因此，这些细胞不能自行合成谷氨酰胺，且只有在培养基中加入谷氨酰胺后才能存活和生长。因此，gs基因已广泛用于表达载体中作为阳性选择标记。在用于生物生产的稳定细胞系开发领域中，需要选择高产且同时稳定的细胞。通常，当使用gs选择系统时，这通过使用甲硫氨酸砜亚胺(msx)来增加染色体中表达盒的拷贝数来实现，这是由于msx抑制gs活性。只有具有较高拷贝数的gs基因的细胞才能在gs抑制剂处理中存活。目前，需要分离数百个单克隆来确定它们的生产力，并在去除msx后评估其在至少60代以上的稳定性。这是一个劳动密集型和费时的过程。鉴于上述问题，需要提供一种替代表达载体，其包含一种编码谷氨酰胺合成酶的替代多核苷酸。

本发明的发明人发现了一种替代表达载体，其包含一种编码替代性谷氨酰胺合成酶的多核苷酸，即gsatt系统。本发明需要产生一系列突变的gs基因作为选择标记。突变的gs携带与正常gs相比降低的gs活性。当减毒gs(gsatt)用作在稳定转染的细胞中产生重组生物制剂的选择标记时，只有具有表达载体插入高度转录活性位点的细胞或具有若干拷贝的表达载体插入较低活性位点以补偿gs活性损失的细胞才能在选择中存活。通常，这些细胞中重组生物制剂的产量更高，因为编码重组生物制剂的核苷酸序列也位于高度转录活性位点或因为存在多拷贝的编码重组生物制剂的核苷酸序列。因此，减毒选择标记有助于增加选择严格性并增加在相对少量稳定转染的细胞中鉴定高产菌的机会。另外，由于gsatt标记提供了一致的选择压力，通过使用gsatt系统，可以消除使用谷氨酰胺合成酶抑制剂(如msx)的需要，并且可以提高稳定性，从而节省了产生稳定细胞系的工作量和时间。因此，一方面，本发明提供了表达载体，包括编码与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸。如本文所用，表达载体通常是指设计用于在细胞中表达基因的质粒或病毒。该载体用于将特定的基因导入靶细胞，并可通过调控细胞的多肽合成机制，产生该基因编码的多肽。如本文所用，术语“活性降低”是指与野生型酶相比，突变酶(例如谷氨酰胺合成酶)在合成产物(例如谷氨酰胺)中的能力降低。活性降低的酶的活性为野生型酶活性的约90％、或约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％、或约9％、或约8％、或约7％、或约6％、或约5％、或约4％、或约3％、或约2％、或约1.9％、或约1.8％、或约1.7％、或约1.6％、或约1.5％、或约1.4％、或约1.3％、或约1.2％、或约1.1％、或约1％、或约0.9％、或约0.8％、或约0.7％、或约0.6％、或约0.5％、或约0.4％、或约0.3％、或约0.2％、或约0.1％。在一个实例中，活性降低的酶的活性为野生型酶活性的约1.6％。换而言之，如果认为野生型酶的活性为100％，则与野生型酶的活性相比，突变酶(或活性降低的酶)的活性降低约10％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约98.1％、或约98.2％、或约98.3％、或约98.4％、或约98.5％、或约98.6％、或约98.7％、或约98.8％、或约98.9％、或约99％、或约99.1％、或约99.2％、或约99.3％、或约99.4％、或约99.5％、或约99.6％、或约99.7％、或约99.8％、或约99.9％。在一个实例中，与野生型酶的活性相比，突变酶(或活性降低的酶)的活性降低约98.4％。在一个实例中，与野生型谷氨酰胺合成酶的活性相比，突变的谷氨酰胺合成酶(如r324c突变体、d63a突变体和e305突变体)的平均降低为约98.4％。在一个实例中，与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶或使用本文所述表达载体表达的谷氨酰胺合成酶为重组谷氨酰胺合成酶。如本文所用，术语“重组谷氨酰胺合成酶”是指由活细胞(例如宿主细胞)内的重组dna(例如本文所述的表达载体)的表达产生的多肽(例如谷氨酰胺合成酶)。

在一个实例中，与野生型谷氨酰胺合成酶相比，由本文所述表达载体编码的活性降低的谷氨酰胺合成酶包含一个或多个突变。如本文所用，术语“野生型谷氨酰胺合成酶”是指天然存在的典型形式的谷氨酰胺合成酶。野生型谷氨酰胺合成酶通常包含两个主要结构域，即βgrasp结构域(野生型谷氨酰胺合成酶中第30位氨基酸残基至第104位氨基酸残基)和催化结构域(野生型谷氨酰胺合成酶的134位氨基酸残基至351位氨基酸残基)。如图7中的实例所示，参与atp、谷氨酸或氨结合的氨基酸残基中的若干位于βgrasp结构域或催化结构域内。野生型谷氨酰胺合成酶序列的氨基酸序列列为seqidno：1(野生型人gs序列)、seqidno：2(野生型中国仓鼠gs序列)、seqidno：3(野生型小鼠gs序列)和seqidno：4(野生型大鼠gs序列)。如本文所用，术语“突变”是指分离的核酸中的核苷酸序列变化。核苷酸序列变化包括但不限于错义突变、无义突变、核苷酸替代、核苷酸缺失、核苷酸插入、核苷酸复制、移码突变、重复扩增等。然而，突变不能包括完全使酶(例如谷氨酰胺合成酶)活性失活的突变。携带突变的分离的核酸具有与从相应的野生型群体分离的同源核酸在统计学上不同的核酸序列。在一个实例中，突变可为取代或缺失。本领域技术人员理解，为了表达包含至少一个突变的gs或突变gs，必须改变用于表达野生型gs的多核苷酸的序列。可以使用本领域已知的任何改变多核苷酸序列的方法。在一个实例中，通过定点诱变引入突变。通过确定待突变的靶标并使用适于引入突变的引物(如表2中所示)进行定点诱变。

为了能够获得与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶，必须确定突变的位置。因此，在一个实例中，活性降低的谷氨酰胺合成酶包含在谷氨酸结合区、atp结合区和/或氨结合区中的一个或多个突变。本领域技术人员理解，诸如谷氨酰胺合成酶的蛋白质包含形成多肽链的多个氨基酸残基(也称为蛋白质的一级结构)。由于多肽链中氨基酸残基之间的相互作用，多肽链折叠并形成三维结构(也称为蛋白质的三级结构)。因此，如本文所用的术语“结合区”不一定是指多肽链中连续连接(或彼此相邻)的一系列氨基酸残基。也就是说，作为某一结合区的一部分的氨基酸残基可以在多肽链内彼此远离。然而，那些氨基酸残基实际上可在蛋白质的三维结构中彼此靠近，从而形成结合区。例如，作为氨结合区的一部分的氨基酸残基位于谷氨酰胺合成酶多肽链的63、66、162和305位，作为谷氨酸结合区的一部分的氨基酸残基位于谷氨酰胺合成酶多肽链的134、136、196、203、248、249、253、299、319、338和340位，以及作为atp结合区一部分的氨基酸残基位于谷氨酰胺合成酶多肽链的192、255、257、262、324、333和336位。

如表1中的实例所示，在一个实例中，其中当突变位于谷氨酸结合区时，1个、或至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个或所有氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的134、136、196、203、248、249、253、299、319、338、340等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在一个实例中，其中当突变在谷氨酸结合区中时，一个氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的134、136、196、203、248、249、253、299、319、338、340等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。如表1中的实例所示，在一个实例中，其中当突变位于氨结合区时，1个、或至少1个、或至少2个、或至少3个、或所有氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的63、66、162、305等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在一个实例中，其中当突变位于氨结合区时，一个氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的63、66、162、305等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。如表1中的实例所示，在一个实例中，其中当突变位于atp结合区时，1个、或至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或所有氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的192、255、257、262、333、336、324等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在一个实例中，其中当突变位于atp结合区时，一个氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的192、255、257、262、336、324等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在一个实例中，突变为至少一个氨基酸的突变。

如图7中所示，至少一个氨基酸的突变发生在中国仓鼠(seqidno：2)、小鼠(seqidno：3)、大鼠(seqidno：1)和人(seqidno：1)的野生型gs序列中共有的位置。因此，在一个实例中，1个、或至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个、或至少21个、或至少22个、或所有氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的12、19、63、66、91、116、134、136、160、162、172、176、181、192、194、196、198、199、203、230、248、249、253、255、257、260、262、271、299、305、319、336、338、333、340、324、341等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在一个实例中，一个氨基酸的突变发生在包括但不限于谷氨酰胺合成酶的12、19、63、66、91、116、134、136、160、162、172、176、181、192、194、196、198、199、203、230、248、249、253、255、257、260、262、271、299、305、319、336、338、333、340、324、341等位置，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。本发明的发明人在不受理论约束的情况下，特别选择在上述位置引入一个或多个突变，因为那些位置的氨基酸残基是保守的。此外，它们还参与氨(例如谷氨酰胺合成酶的63、66、162和305位的氨基酸残基)、谷氨酸(例如谷氨酰胺合成酶的134、136、196、203、248、249、253、299、319、338和340位氨基酸残基)或atp(例如谷氨酰胺合成酶的192、255、257、262、324和336位的氨基酸残基)的结合。本发明人惊奇地发现，保守并且参与氨、谷氨酸或atp结合的氨基酸残基可能对gs活性是关键的。

此外，本发明人还惊奇地发现，本文列出的氨基酸位置对gs的活性是至关重要的，以致这些重要位点的取代会减弱gs活性。在一个实例中，谷氨酰胺合成酶中的突变包括但不限于谷氨酰胺合成酶的r324c、r341c、d63a、s66a、e134a、e136a、y162a、g192a、e196a、e203a、n248a、g249a、h253a、n255a、s257a、r262a、r299a、e305a、r319a、r324a、y336a、e338a、k333a、r340a和r341a，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。在一个实例中，为了降低其活性，通过使用丙氨酸(a)取代或替换某些氨基酸来突变谷氨酰胺合成酶。在不受理论约束的情况下，选择丙氨酸(a)来取代或替换某些氨基酸残基，因为丙氨酸(a)消除了β碳以外的氨基酸残基的侧链，并且其不产生极端的静电或空间效应。因此，本领域技术人员认识到，为了降低谷氨酰胺合成酶活性可以使用不具有极端静电和/或空间效应的任何氨基酸残基进行某些氨基酸残基的取代或替换。在一个实例中，谷氨酰胺合成酶中的突变(其中某氨基酸被丙氨酸替换)包括但不限于谷氨酰胺合成酶的d63a、s66a、e134a、e136a、y162a、g192a、e196a、e203a、n248a、g249a、h253a、n255a、s257a、r262a、r299a、e305a、r319a、r324a、y336a、e338a、k333a、r340a和r341a，其中谷氨酰胺合成酶具有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4所示的氨基酸序列。

为了使本文所述的表达载体能够表达活性降低的谷氨酰胺合成酶，需要启动子。如本文所用，术语“启动子”是指多核苷酸序列(例如dna序列)，其定义了rna聚合酶转录基因的起始位置。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5'末端。因此，在一个实例中，在如本文所述的表达载体中，编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸与启动子可操作地连接。在一个实例中，启动子位于编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸的5'方向。如本文所用，术语“可操作地连接”意指两个多核苷酸以使得每个多核苷酸可以发挥其预期功能的方式连接。在一个实例中，可操作地连接的两个多核苷酸通过长度高达10bp、或高达20bp、或高达30bp、或高达40bp、或高达50bp、或高达60bp、或高达70bp、或高达80bp、或高达90bp、或高达100bp、或高达110bp、或高达120bp、或高达130bp、或高达140bp、或高达150bp的多核苷酸接头连接。在一个实例中，这两个多核苷酸都可以被转录，转录产物可以被翻译成多核苷酸。

如上所述，本文所述的表达载体可用于产生稳定细胞系，该细胞系可产生目标多肽。为了表达目标多肽，还需要启动子。因此，在一个实例中，编码目标多肽的至少一个多核苷酸中的每一个与启动子可操作地连接。在一个实例中，启动子位于编码目标多肽的至少一个多核苷酸中的每一个的5'方向。本领域技术人员知晓，可能需要一个以上的启动子来表达一个以上的多肽。因此，在一个实例中并且如例如图6a中所示，在本文所述的表达载体中，与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸连接的启动子不同于与编码目标多肽的至少一个多核苷酸连接的启动子。

此外，如图6b和6c所示，在本文所述的表达载体中，编码目标多肽的至少一个多核苷酸中仅一个与启动子可操作地连接。在一个实例中，启动子位于编码目标多肽的一个多核苷酸的5'方向，所述多核苷酸与启动子可操作地连接。在一个实例中，编码与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸不与启动子连接。

如上所述，使用本文所述的表达载体产生的稳定细胞系可用于表达目标多肽。因此，在一个实例中，本文所述的表达载体还包含至少一个编码目标多肽的多核苷酸，例如重组基因产物。如本文所用，术语“目标多肽”是指非宿主细胞固有的，并可以使用本文所述的表达载体在宿主细胞中适量表达的多肽。因此，由表达载体编码的目标多肽的非限制性实例包括但不限于重组蛋白及其一部分、融合蛋白及其一部分、抗体及其一部分等。可以使用本文描述的表达载体表达由多肽形成的任何类型的抗体。在一个实例中，该抗体为单克隆抗体。在一个实例中，由表达载体编码的单克隆抗体为抗体ga101(在本公开中也称为“抗体a”)。在一个实例中，由表达载体编码的单克隆抗体为利妥昔单抗(在本公开中也称为“抗体b”)。本领域技术人员知晓，抗体通常包含轻链和重链。如本文所用，术语“轻链”是指抗体或免疫球蛋白的更短或更小的多肽亚基，而术语“重链”是指抗体或免疫球蛋白的更长或更大的多肽亚基。因此，在一个实例中，由本文所述的表达载体编码的目标多肽为目标抗体的重链。在一个实例中，由本文所述的表达载体编码的目标多肽为目标抗体的轻链。如本文所述的目标抗体的重链和轻链均可由一个表达载体表达。因此，在一个实例中，如本文所述的表达载体包含两个多核苷酸，每个多核苷酸编码目标多肽，其中多核苷酸中的一个编码目标抗体的轻链，且多核苷酸的一个编码相同目标抗体的重链。

如图6中所示，在如本文所述的表达载体中，编码目标抗体轻链的多核苷酸与编码相同目标抗体重链的多核苷酸通过内部核糖体进入位点分开。如本文所用，术语“内部核糖体进入位点”或“ires”是指表达载体(例如多顺反子、双顺反子或三顺反子表达载体)中的多核苷酸序列，当其转录成mrna时，被认为直接募集核糖体，而不需要在之前由核糖体扫描mrna的未翻译区域。ires通常用于引导双顺反子mrna的第二顺反子的表达。如本文所用，术语“多顺反子表达载体”是指由多个顺反子、多个片段组成的表达载体，其编码多个多肽。因此，多顺反子表达载体可以转录为mrna，该mrna可以同时表达两个或多个单独的多肽。因此，双顺反子表达载体为包含两个顺反子的表达载体，并且由双顺反子表达载体转录而来的mrna可以同时表达两个单独的多肽。三顺反子表达载体为包含三个顺反子的表达载体，并且由三顺反子表达载体转录而来的mrna可以同时表达三个单独的多肽。

发明人发现，本文所述的表达载体表达目标抗体的轻链和重链的能力不受编码目标抗体轻链和重链的多核苷酸的位置的负面影响。综上所述，一般认为，含ires的载体中多核苷酸的表达水平受到多核苷酸相对于ires的位置的影响。第一多肽(即由位于ires之前的多核苷酸编码的多肽)将具有比由位于ires之后的多核苷酸编码的第二多肽更高的表达水平。因此，在一个实例中，在如本文所述的表达载体中，编码目标抗体轻链的多核苷酸在编码相同目标抗体重链的多核苷酸的5'方向上。在另一个实例中，在如本文所述的表达载体中，编码目标抗体重链的多核苷酸在编码相同目标抗体的轻链的多核苷酸的5'方向上。

还如例如图6中所示，编码目标抗体的多核苷酸位于编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸的上游或5'方向。那些多核苷酸通过内部核糖体进入位点(ires)分开。因此，在一个实例中，在如本文所述的表达载体中，编码目标抗体重链的多核苷酸与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸通过内部核糖体进入位点分开。在另一个实例中，在如本文所述的表达载体中，编码目标抗体轻链的多核苷酸与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸通过内部核糖体进入位点分开。如本文所用，术语“与......分开”是指编码多肽的多核苷酸的位置不紧邻编码另一多肽的另一多核苷酸。在编码两种不同多肽的两种多核苷酸之间，存在编码其他序列(例如编码内部核糖体进入位点或ires)的多核苷酸。

此外，如图6b和6c所示，如本文所述的表达载体可包含一个以上的内部核糖体进入位点(ires)。因此，在一个实例中，将编码目标抗体轻链的多核苷酸与编码相同目标抗体重链的多核苷酸分开的内部核糖体进入位点不同于将编码目标抗体的轻链/重链的多核苷酸与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸分开的内部核糖体进入位点。当如本文所述的表达载体包含多于一个内部核糖体进入位点(ires)时，该内部核糖体进入位点可以为多种类型并且可以具有不同的翻译效率。因此，在一个实例中，在本文所述的表达载体中，将编码目标抗体轻链的多核苷酸与编码相同目标抗体重链的多核苷酸分开的内部核糖体进入位点为野生型内部核糖体进入位点，并且其中，将编码目标抗体的轻链/重链的多核苷酸与编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸分开的内部核糖体进入位点为具有降低的翻译效率的内部核糖体进入位点。如图6b和6c所示，野生型内部核糖体进入位点表示为“ires”，而具有降低的翻译效率的内部核糖体进入位点表示为“iresatt”。如本文所用，术语“具有降低的翻译效率的内部核糖体进入位点”或“iresatt”是指ires，其中其3'区域已经被修饰，使得与野生型ires相比其翻译效率降低。

此外，本领域技术人员知晓，大多数哺乳动物mrna的3'末端是多腺苷酸化的或与形成多聚a尾巴(poly(a)tail)的多个腺嘌呤连接。多聚a尾巴对于大多数mrna的存活、转运、稳定性和翻译是必需的。为了提供多聚a尾巴，表达载体必须包含一个或多个多腺苷酸化信号。当提供多于一种多腺苷酸化信号时，该多腺苷酸化信号可位于编码多肽的每组多核苷酸序列的3'末端。因此，在一个实例中，如本文所述的表达载体在编码目标多肽的至少一个多核苷酸的每一个的3'末端包含一个多腺苷酸化信号，及在编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸的3'末端包含一个多腺苷酸化信号。如图6a所示，表达载体包含两个多腺苷酸化信号，其中一个信号位于编码目标抗体的重链的多核苷酸的3'末端，及其中另一个信号位于编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸的3'末端。在另一个实例中，如本文所述的表达载体仅在编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸的3'末端包含一个多腺苷酸化信号。如图6b和6c所示，表达载体仅包含一个多腺苷酸化信号，其位于编码活性降低的谷氨酰胺合成酶的多核苷酸的3'末端。

如上所述，为了使用活性降低的谷氨酰胺合成酶作为选择标记产生稳定细胞系，将如本文所述的表达载体插入或并入(incorporated)宿主细胞中。因此，一方面，本发明提供包含本文所述表达载体的宿主细胞。在插入或并入本文所述的表达载体之前，该宿主细胞不具有任何谷氨酰胺合成酶活性或该宿主细胞具有最小量的谷氨酰胺合成酶活性。如本文所用，术语“最小量的谷氨酰胺合成酶活性”是指谷氨酰胺合成酶活性的量，其不允许宿主细胞在不存在l-谷氨酰胺添加的情况下生长和/或存活。在将本文所述的表达载体插入或并入宿主细胞后，产生活性降低的谷氨酰胺合成酶。因此，包含本文所述表达载体的宿主细胞将具有谷氨酰胺合成酶活性，但所述宿主细胞的谷氨酰胺合成酶活性将低于野生型细胞的谷氨酰胺合成酶活性。

本领域技术人员理解，可以使用在插入或掺入本文所述的表达载体之前不具有谷氨酰胺合成酶活性的任何类型的宿主细胞。在一个实例中，该宿主细胞可从任何细胞(例如哺乳动物或酵母细胞)制备，该细胞通常具有编码野生型或突变型或减毒谷氨酰胺合成酶的基因并且其中所述基因已被敲除。如本文所用，术语“敲除”是指已经被失活并因此不能表达目标蛋白质的基因。其中敲除谷氨酰胺合成酶编码基因的细胞丧失其谷氨酰胺合成酶活性，并且在不插入或并入本文所述表达载体的情况下其不能在无谷氨酰胺的环境中存活。因此，所述细胞适合作为本公开的宿主细胞。在一个实例中，包含本文所述表达载体的宿主细胞为哺乳动物细胞。可用作本文所述表达载体的宿主细胞的哺乳动物细胞的非限制性实例包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞系、人胚肾293(hek293)细胞系、源自小鼠的细胞系、源自大鼠的细胞系、源自人的细胞系等。在一个实例中，包含本文所述表达载体的宿主细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞系。在一个实例中，包含本文所述表达载体的宿主细胞为chok1gft^-/-gs^-/-细胞系或chok1gs^-/-。如本文所用，术语“gft”代表gdp岩藻糖转运蛋白。如本文所用，符号“^-/-”是指细胞缺乏某些酶的事实。例如，gft^-/-表示细胞缺乏gdp岩藻糖转运蛋白(gft)，以及gs^-/-表示细胞缺乏谷氨酰胺合成酶(gs)。在一个实例中，包含本文所述表达载体的宿主细胞为酵母细胞。可用作本文所述表达载体的宿主细胞的酵母细胞的非限制性实例包括但不限于衍生自酿酒酵母的细胞系等。

除了提供替代表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞外，如图9中所示，本发明的发明人还提供了制备稳定细胞系的替代方法。因此，在另一个方面，本发明提供了制备稳定细胞系的方法，其包括：(a)用本文所述的表达载体转化具有最小量谷氨酰胺合成酶活性或无谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；(b)在培养基中培养转化的宿主细胞，该培养基选择性地允许待选的转化的宿主细胞增殖，该宿主细胞包含扩增数目的拷贝的载体。另一方面，本发明提供了制备稳定细胞系的方法，其包括：(a)用本文所述的表达载体转化不具有谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；(b)在培养基中培养转化的宿主细胞，该培养基选择性地允许待选的转化的宿主细胞增殖，该宿主细胞包含扩增数目的拷贝的载体。如本文所用，术语“稳定细胞系”是指包含本文所述表达载体的细胞，所述表达载体能够可持续表达目标多肽。

此外，如例如图2所示，本发明的发明人还提供了用于生产目标抗体多肽的替代方法。因此，在另一方面，本发明提供了生产目标多肽的方法，其包括：(a)用本文所述的表达载体转化具有最小量谷氨酰胺合成酶活性或无谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；(b)在培养基中培养转化的宿主细胞，该培养基选择性地允许产生目标多肽；以及(c)从(b)的培养基中收集目标多肽。另一方面，本发明提供了生产目标多肽的方法，其包括：(a)用本文所述的表达载体转化不具有谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；(b)在培养基中培养转化的宿主细胞，该培养基选择性地允许产生目标多肽；以及(c)从(b)的培养基中收集目标多肽。从细胞培养基中收集目标多肽可以使用本领域已知的任何方法进行。从培养基中收集目标多肽的方法的非限制性实例包括但不限于尺寸排阻色谱法、疏水作用色谱法、离子交换色谱法、自由流电泳法、亲和色谱法、免疫亲和色谱法、高效液相色谱法等。

如本文所用，术语“转化”是指细胞直接从其周围摄取和并入外源遗传物质而发生的遗传变化。因此，术语“转化宿主细胞”是指将外源遗传物质(例如本文所述的表达载体)引入或接触宿主细胞的行为。因此，术语“转化的宿主细胞”是指其中已插入或并入了外源遗传物质(例如本文所述的表达载体)的宿主细胞。具有本文所述表达载体的宿主细胞的转化可以使用本领域已知的任何方法进行。在本文所述方法的一个实例中，允许待选的包含扩增数目的拷贝的载体的转化的宿主细胞的培养基为不含谷氨酰胺的细胞培养基。在本文所述方法的一个实例中，转化的宿主细胞在无谷氨酰胺条件下培养。不希望受理论束缚，当宿主细胞在无谷氨酰胺条件下培养时，未插入本文所述表达载体的宿主细胞或未并入本文所述表达载体的宿主细胞将不能在无谷氨酰胺的条件下存活和/或增殖。本发明人还惊奇地发现，当减毒gs(gsatt)或与野生型谷氨酰胺合成酶相比活性降低的谷氨酰胺合成酶用作在稳定转染的细胞中产生目标抗体多肽的选择标记时，只有具有表达载体插入高度转录活性位点的细胞或具有若干拷贝的表达载体插入较低活性位点以补偿gs活性损失的细胞才能在选择中存活。因此，与野生型gs用作选择标记时不同，可能不需要使用gs抑制剂选择细胞(即选择野生型gs拷贝数较高的细胞)。因此，在一个实例中，本文描述的方法不包含使用谷氨酰胺合成酶抑制剂。未用于本文所述方法的谷氨酰胺合成酶抑制剂可包括本领域已知的任何谷氨酰胺合成酶抑制剂。在一个实例中，未在本文所述方法中使用的谷氨酰胺合成酶抑制剂为甲硫氨酸砜亚胺(msx)。

本发明人惊奇地发现，使用减毒gs作为选择标记提供了优于使用野生型gs(wtgs)作为选择标记的优点。如图3中所示，用突变体gs转染的分批培养稳定池中的mab滴度的量通常高于用msx(25μm)处理的那些wtgs池。平均倍数增加约9倍。其高于现有技术中观察到的wtgs和wtgs加msx之间的2倍增加。

更重要的是，使用减毒gs作为选择标记可提高生产稳定性。先前已经开发出通过突变减弱其他选择标记如新霉素磷酸转移酶ii和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因以提高生产滴度。然而，那些其他选择标记的减弱仍然需要使用药物来提高产量。药物的使用在稳定的细胞系生成过程中引起问题，其中需要对药物去除进行稳定性测试。通常通过分离数百个克隆并测量其超过60代(2至3个月)的产量来测试生产的稳定性。这是一个劳动密集型和费时的过程。另一方面，本文所述的表达载体(即包含编码减毒突变体gs的多核苷酸的表达载体)的使用模拟了通过gs抑制剂(如msx药物)对gs活性的抑制。由于突变gs不断地作为选择压力，生产稳定性会得到提高。因此，突变gs在稳定性测试中产生优势。

在另一方面，本发明提供包含本文所述表达载体的试剂盒。在一个实例中，包含本文所述表达载体的试剂盒还包含以下中的至少一种：(i)与野生型细胞相比不具有谷氨酰胺合成酶活性的宿主细胞；以及(ii)转染培养基或进行转染的装置。在一个实例中，如本文所述的试剂盒还包含细胞培养基。在一个实例中，该细胞培养基不含谷氨酰胺。在一个实例中，如本文所述的试剂盒还包含不含谷氨酰胺的细胞培养基。

除非上下文另有明确规定，如在本申请中所使用的，单数形式“一”，“一个/种”和“该/所述”包括复数指代。例如，术语“表达载体”包括多种表达载体，包括其混合物和组合。

如本文所用，术语“增加”和“减少”是指与整个群体中存在的相同性状或特征相比，群体子集中所选性状或特征的相对变化。因此，增加表示正值的变化，而减少表示负值的变化。如本文所用，术语“变化”还指分离的群体子集的所选性状或特征与整个群体中的相同性状或特征相比的差异。但是，这个术语无可见差异的估值。

如本文所用，在某些陈述值的上下文中，术语“约”是指所述值的+/-5％，或所述值的+/-4％、或所述值的+/-3％、或所述值的+/-2％、或所述值的+/-1％、或所述值的+/-0.5％。

在整个此公开内容中，某些实施方案可以范围形式被公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所公开范围的不可改变的限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述已经明确公开了1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单独数，例如，1、2、3、4、5和6。无论该范围宽度如何，皆适用此方式。

此处示例性地描述的本发明可在缺少本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下进行适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地阅读而不受限制。另外，本文所用术语和表达用于描述而非限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但是应该认识到，在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施例具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文所公开的本发明的可选特征、修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。

本发明已经在本文中宽泛地和上位地描述。落入通用公开内容中的每个较窄种类和下位组也构成本发明的一部分。这包括具有从该类中排除任何主题的附带条件或者负面限制的本发明的一般性描述，在不论所排除的物质是否被本文所具体列举。

其他实施方案在所附权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员子组的形式描述。

实验部分

材料和方法

生成三顺反子mabgs载体。

从cho细胞cdna文库扩增gs基因。通过标准克隆方法用gs基因替换三顺反子dhfr载体的dhfr基因。所用引物为：

gssmaup(seqidno：31)：

gtgtgacccgggagatgaggatcgtttcgcatggccacctcagcaagttcccacttg；以及

gsbstbilp(seqidno：32)：

gaattcttcgaattagtttttgtattcgaagggctcgtcgcc。

商业合成mab重链和轻链，随后按以下方向克隆至三顺反子gs载体的cmv启动子后的区域：轻链-ires-重链-iresattgs。

生成双顺反子mabgs载体。

将invitrogen的pcdna3.1(+)用作载体骨架。将全长重链和轻链克隆至载体的mcs中作为双顺反子构建体：轻链-ires-重链。用wtgs构建体替换sv40启动子后的新霉素基因。用于从三顺反子mabgs载体扩增gs基因的引物为：

gssmasv4up(seqidno：33)：

gtgctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcggccaccatggccacctcagcaagttcccacttgaac；以及

gsbstbisv4lp(seqidno：34)：

ggtcatttcgaaccccagagtcccgcttagtttttgtattggaagggctcgtcg。

生成gs-ires-荧光素酶构建体(gs-luc)。

将gs基因克隆至pcdna3.1(+)载体的mcs区域。在gs基因之后克隆ires构建体，然后克隆萤火虫荧光素酶基因。该gs-ires荧光素酶表达盒用于评估gs活性，其中荧光素酶活性用于归一化gs表达水平。

生成伪gs构建体

从cho-k1细胞的基因组dna扩增伪谷氨酰胺合成酶基因(psgs基因)的编码序列。然后将psgs基因克隆至gs-luc构建体中(如上所述)以替换原始gs基因以形成psgs-ires荧光素酶的表达盒。按照如下所述进行该构建体的gs活性测定。

gs活性测定。

将粘附的cho-k1gs^-/-细胞在含有10％fbs的dmem中于37℃、5％co2培养箱中培养。通过ltx转染试剂(invitrogen)用各种gs/gsm-luc构建体转染细胞。转染后24小时用reporter裂解缓冲液(promega)收获细胞，并根据荧光素酶测定试剂盒(promega)的实验方案测定其荧光素酶活性。使用标准gs活性测定法测定gs活性，由此在500nm处测定通过gs催化由谷氨酰胺和羟胺生成的谷氨酰基异羟肟酸酯。简言之，将细胞裂解物上清液与100mm咪唑-hcl(ph7)、50mml-谷氨酰胺、0.4mmmncl2、62.5mm羟胺(ph7)和62.5mm羟胺(ph7)和10mm砷酸钠至终体积250μl，在37℃振荡孵育45分钟。加入250μlfecl3试剂(0.37mfecl3、0.67mhcl、0.2mtca)终止反应。通过以10000rpm离心5分钟除去沉淀物，并使用分光光度计在500nm测量上清液的吸光度。gs的活性相对于荧光素酶水平归一化。

gs基因的诱变。

通过设计具有特定突变的引物来实现特定位点的诱变。靶向的位点(如下表1所示)在人gs和中国仓鼠gs之间是保守的。使用下表2中列出的引物进行三顺反子mabgs/双顺反子mabgs/或gsluc载体的quikchange定点诱变反应。进行测序以确保实现突变。

表1：gs突变位点的说明

表2：gs突变的引物列表

注：

命名为“r324c”和“r341c”的引物引入点突变，其中在氨基酸324位和341位的精氨酸(r)突变为半胱氨酸(c)。

命名为“r324a”和“r341a”的引物引入点突变，其中在氨基酸324位和341位的精氨酸(r)突变为丙氨酸(a)。

命名为“gsm##”的引物引入点突变，其中氨基酸残基突变为丙氨酸(a)。“gsm##”上的数字对应于表1中标题为“名称”的列。例如，命名为gsm1的引物对应于引入d63a突变的引物(即点突变，其中氨基酸63位的天冬氨酸(d)突变为丙氨酸(a))等等。

命名为“up”或“fp”的引物为正向引物。命名为“lp”的引物为反向引物。

细胞培养、转染和稳定池产生。

将悬浮cho-k1gs^-/-细胞在hyclonepfcho培养基与cdcho培养基以1：1比例(50/50)混合的培养基培养，并在37℃、8％co2振荡培养箱中孵育。向50/50培养基中补充0.05％的pluronicf-68酸和6mml-谷氨酰胺。通过电穿孔(lonzasg试剂盒)在以下条件下用三顺反子/双顺反子mabgs/gsm构建体转染细胞：具有5ugdna的1000万个细胞。转染后两天，将转染的细胞置于不含l-谷氨酰胺的选择下直至其存活率恢复至90％以上。然后对回收的池进行分批培养以测量igg产生水平。使用具有iggc测定试剂的浊度计测量igg水平。

实验结果

用三顺反子mab-gs或三顺反子mab-gsatt(r324c)转染cho-k1gft^-/-gs^-/-——mini池形式。

gs基因在位点r324突变至c(gsatt)(其对应于该酶的谷氨酸结合区)。将三顺反子载体中编码抗体基因和gsatt选择标记的载体(hosc等，2012)与相同形式的野生型gs进行对比。在cho-k1-gft^-/-gs^-/-细胞中进行稳定生产水平的对比。对两种不同抗体的稳定产量进行了测定。

对每种构建体进行转染，每次转染含有5μgdna的1×10⁷个细胞。测试两种不同的抗体-抗体a和b。转染后三天，将wtgs和gsatt转染子的小等分试样各自以2000个细胞/孔接种至96孔板的50/50培养基(cdcho/hyclone)，该50/50培养基不含l-谷氨酰胺选择培养基。将细胞在2周后传代一次，并再培养2周进行过度生长测定。收集上清液，并使用抗人抗体作为捕获剂以elisa形式评估其od读数。收集wtgs和gsatt的od读数并列于图1中。总体而言，对于ga101和利妥昔单抗二者，gsattmini池都示出了出比wtgs更高的抗体生产水平。

用三顺反子mab-gs或三顺反子mab-gsatt(r324c)转染chok1gft^-/-gs^-/-——稳定悬浮池形式。

每个构建体进行三次转染(每次转染含有5μgdna的1×10⁷个细胞)。测试两种不同的抗体-抗体a和b。在不含l-谷氨酰胺的50/50培养基(cdcho/hyclone)中选择转染子池直至其恢复。恢复后，进行分批培养以确定生产力。在进行分批培养之前，wtgs和gsatt池分别平均恢复约3.5周和6.5周。

抗体a的实验结果如图2a所示。具有gsatt选择标记(mut1-3)的所有3个池示出了出比野生型gs(wt1-3)显着更高的mab滴度水平。gsatt池的滴度平均比wtgs池高9.9倍。抗体b的实验结果如图2b所示。抗体b-gsatt的两个池未存活。剩余的池(mut1)示出了出比3个wt池的平均值多至少2.6倍的滴度。基于图2a和2b所示的结果，使用gsatt可以增强cho细胞中2种不同抗体的稳定生产。

当gs上的若干新位点突变为丙氨酸时，其会减弱gs活性。

制备gs构建体、测量gs活性以及测量荧光素酶活性的方法描述于材料和方法部分。图4表示归一化至wtgs活性的gs活性的实际百分比。在荧光素酶归一化之前，用未转染的cho-k1gs^-/-细胞裂解物消除gs活性。通过其荧光素酶活性相应地归一化各gs构建体的表达变化。注意到gs活性测定对于非常低的gs活性可能不够灵敏，使得已知的r342c和r341c突变体具有接近空白水平的活性。然而，可以清楚地观察到由不同突变引起的减弱。该结果为两个独立实验的代表。

使用gs突变体选择的产生mab的克隆的稳定性评估。

来自用三顺反子mabgs构建体转染的2个稳定池的20个单克隆的稳定性评估。在12周(约60代)中测量这些单克隆的mab生产，以评估这些克隆的稳定性。将第12周的mab滴度除以第0周的mab滴度以获得倍数变化。通常，70％以上的稳定性水平定义为稳定克隆的可接受稳定水平。该图示出了除了稳定池2的克隆17(68％)之外，几乎所有单克隆都高于70％基准。这是具有所需稳定性水平的克隆的相对高百分比(>95％)。该结果支持使用减毒的gs作为选择标记的优点，因为选择压力始终存在。从含有r324c突变的池中分离单个克隆。

使用野生型(wt)gs和gs突变体作为选择标记产生的mab滴度的对比。

将选择标记掺入表达抗体a的三顺反子载体中，并转染至cho-k1gs^-/-细胞中。通过从培养基中除去l-谷氨酰胺进行选择。对于gswt+msx，从不含l-谷氨酰胺的培养基中回收后，然后将稳定池进行25μmmsx选择。生成的每个稳定池的批次培养滴度表示为图中的数据点，如图8所示。

使用gswt或gsm16作为选择标记产生的稳定池的5个随机克隆的稳定性评估。

使用三顺反子载体中的gswt(野生型gs)或gsm16(具有s257a突变位点的gs)选择标记产生表达ga101的cho-k1gs^-/-细胞的稳定池。将每个池的五个随机克隆按比例放大以在不含msx和l-谷氨酰胺的生长培养基中进行稳定性评估。每4周测量一次分批培养滴度。如图9所示，结果示出了5个gswt克隆中只有2个是稳定的(即维持其原始滴度水平的至少70％)，而5个gsm16克隆中有4个是稳定的。

序列表

<110>新加坡科技研究局

<120>作为选择标记的减毒谷氨酰胺合成酶

<130>9869sg4731

<150>10201609619s

<151>2016-11-16

<160>103

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<210>1

<211>373

<212>prt

<213>人

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<211>373

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<213>中国仓鼠

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<211>373

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<213>小鼠

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<211>373

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<213>大鼠

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370

<210>5

<211>8201

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>双顺反子mabgs

<400>5

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gatggtactggagaaggactgcgctgcaaaacccgcaccctggactgtgagcccaagtgt4740

gtagaagagttacctgagtggaattttgatggctctagtacctttcagtctgagggctcc4800

aacagtgacatgtatctcagccctgttgccatgtttcgggaccccttccgcagagatccc4860

aacaagctggtgttctgtgaagttttcaagtacaaccggaagcctgcagagaccaattta4920

aggcactcgtgtaaacggataatggacatggtgagcaaccagcacccctggtttggaatg4980

gaacaggagtatactctgatgggaacagatgggcacccttttggttggccttccaatggc5040

tttcctgggccccaaggtccgtattactgtggtgtgggcgcagacaaagcctatggcagg5100

gatatcgtggaggctcactaccgcgcctgcttgtatgctggggtcaagattacaggaaca5160

aatgctgaggtcatgcctgcccagtgggaattccaaataggaccctgtgaaggaatccgc5220

atgggagatcatctctgggtggcccgtttcatcttgcatcgagtatgtgaagactttggg5280

gtaatagcaacctttgaccccaagcccattcctgggaactggaatggtgcaggctgccat5340

accaactttagcaccaaggccatgcgggaggagaatggtctgaagcacatcgaggaggcc5400

atcgagaaactaagcaagcggcaccggtaccacattcgagcctacgatcccaaggggggc5460

ctggacaatgcccgtcgtctgactgggttccacgaaacgtccaacatcaacgacttttct5520

gctggtgtcgccaatcgcagtgccagcatccgcattccccggactgtcggccaggagaag5580

aaaggttactttgaagaccgccgcccctctgccaattgtgacccctttgcagtgacagaa5640

gccatcgtccgcacatgccttctcaatgagactggcgacgagcccttccaatacaaaaac5700

taagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgag5760

atttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacg5820

ccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaact5880

tgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata5940

aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatc6000

atgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc6060

ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagt6120

gtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgc6180

ccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcgg6240

ggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgct6300

cggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatcca6360

cagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagga6420

accgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatc6480

acaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccagg6540

cgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggat6600

acctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggt6660

atctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttc6720

agcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacg6780

acttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcg6840

gtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttg6900

gtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccg6960

gcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaa7020

aaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacg7080

aaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcc7140

ttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctg7200

acagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcat7260

ccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctg7320

gccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaa7380

taaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctcca7440

tccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgc7500

gcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggctt7560

cattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaa7620

aagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttat7680

cactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgct7740

tttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccga7800

gttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaag7860

tgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttga7920

gatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttca7980

ccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataaggg8040

cgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatc8100

agggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatag8160

gggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc8201

<210>6

<211>588

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cmv启动子

<400>6

gttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60

gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120

ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180

ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240

atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300

cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360

tattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggat420

agcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgt480

tttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc540

aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctc588

<210>7

<211>729

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>抗体ga101的轻链(lc1-729)

<400>7

atggacatgagggtccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggctctcaggtgcc60

agatgtgacattgtaatgacacagaccccactctccctgcccgtcacccctggagagccg120

gcctccatctcctgcaggtctagtaagagcctcctgcatagtaatggaatcacctatttg180

tactggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatcagatgtctaat240

ctggtgtccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactg300

aaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcgcccaaaacctagag360

ctgccctacactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgtaccgtggcggcgcca420

tctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtg480

tgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgcc540

ctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctac600

agcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcc660

tgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagag720

tgttagtag729

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>野生型内部核糖体进入位点

<400>8

atgataatatggccacaacc20

<210>9

<211>1407

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>抗体ga101的重链(hc1329-2747)

<400>9

atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctctttttagaggtgtccagtgtcag60

gtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctccgtgaaggtctcc120

tgcaaggcctctggatacgccttctcctactcttggatcaactgggtgcgacaggcccct180

ggacaagggctcgagtggatgggacggatcttccctggcgatggtgacacagactacaac240

ggcaagttcaagggcagagtcaccatcaccgccgacaagtccacgagcacagcctacatg300

gaactgagcagcctgagatctgaggacacggccgtctattactgtgcacgaaacgtgttc360

gatggctattggctggtgtactggggccaggggaccctggtcaccgtcagcagcgctagc420

accaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcaca480

gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcatggaac540

tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactc600

tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatc660

tgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatct720

tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtca780

gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc840

acatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtg900

gacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg960

taccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtac1020

aagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcc1080

aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgacc1140

aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg1200

gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac1260

tccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcag1320

gggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag1380

agcctctccctgtctccgggtaaatga1407

<210>10

<211>232

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpa)

<400>10

tgtgccttctaggcggccgcttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttcc60

ttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcg120

cattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggg180

gaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg232

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sv40启动子

<400>11

ctgtggaatgtgtgtca17

<210>12

<211>1122

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>谷氨酰胺合成酶(gs);来自cho细胞的野生型谷氨酰胺合成酶

<400>12

atggccacctcagcaagttcccacttgaacaaaaacatcaagcaaatgtacttgtgcctg60

ccccagggtgagaaagtccaagccatgtatatctgggttgatggtactggagaaggactg120

cgctgcaaaacccgcaccctggactgtgagcccaagtgtgtagaagagttacctgagtgg180

aattttgatggctctagtacctttcagtctgagggctccaacagtgacatgtatctcagc240

cctgttgccatgtttcgggaccccttccgcagagatcccaacaagctggtgttctgtgaa300

gttttcaagtacaaccggaagcctgcagagaccaatttaaggcactcgtgtaaacggata360

atggacatggtgagcaaccagcacccctggtttggaatggaacaggagtatactctgatg420

ggaacagatgggcacccttttggttggccttccaatggctttcctgggccccaaggtccg480

tattactgtggtgtgggcgcagacaaagcctatggcagggatatcgtggaggctcactac540

cgcgcctgcttgtatgctggggtcaagattacaggaacaaatgctgaggtcatgcctgcc600

cagtgggaattccaaataggaccctgtgaaggaatccgcatgggagatcatctctgggtg660

gcccgtttcatcttgcatcgagtatgtgaagactttggggtaatagcaacctttgacccc720

aagcccattcctgggaactggaatggtgcaggctgccataccaactttagcaccaaggcc780

atgcgggaggagaatggtctgaagcacatcgaggaggccatcgagaaactaagcaagcgg840

caccggtaccacattcgagcctacgatcccaaggggggcctggacaatgcccgtcgtctg900

actgggttccacgaaacgtccaacatcaacgacttttctgctggtgtcgccaatcgcagt960

gccagcatccgcattccccggactgtcggccaggagaagaaaggttactttgaagaccgc1020

cgcccctctgccaattgtgacccctttgcagtgacagaagccatcgtccgcacatgcctt1080

ctcaatgagactggcgacgagcccttccaatacaaaaactaa1122

<210>13

<211>130

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sv40pa终止子序列(sv40pa)

<400>13

acttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaa60

ataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctt120

atcatgtctg130

<210>14

<211>7985

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>三顺反子mabgs

<400>14