抗PCNA单克隆抗体及其用途的制作方法

本申请要求2016年12月15日提交的美国临时专利申请号62/434,532的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

本发明属于单克隆抗体领域。

背景技术：

nkp44rna的可变剪接产生三种剪接变体，该剪接变体可以通过在受体的细胞质部分中的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的存在来划分。nkp44-1同等型已显示为itim阳性，而nkp44-2和-3同等型为itim阴性。itim介导nkp44-pcna(增殖细胞核抗原)相互作用的抑制性质。

需要开发对nkp44-1与pcna相互作用具有高度特异性，以及具有阻断该相互作用的能力的试剂。

技术实现要素：

本发明提供了具有对于pcna的增加的结合亲和力的单克隆抗体或其抗原结合部分。有利地，本文描述的抗体是中和抗体。本发明进一步提供了组合物、试剂盒和方法，比如用于抗体或其抗原结合部分在治疗与nkp44，特别是nkp44-1相关的疾病中的用途。本发明进一步提供了组合物、试剂盒和方法，比如用于抗体或其抗原结合部分在检测和诊断非核pcna相关疾病，比如癌症中的用途。

根据一个方面，本发明提供了包括三个重链cdr(cdr-h)和三个轻链cdr(cdr-l)的抗体或其抗原结合部分，其中：

cdr-h1包括选自seqidno：1(gfsfni)和seqidno：21(iyamn)的氨基酸序列，

cdr-h2包括seqidno：2(rirsksnnyaty)中所示出的氨基酸序列，

cdr-h3包括seqidno：3(hpnysgfnypfas)中所示出的氨基酸序列，

cdr-l1包括seqidno：4(rssqsivhsngktyfe)中所示出的氨基酸序列，

cdr-l2包括seqidno：5(kvsnrfs)中所示出的氨基酸序列，和

cdr-l3包括seqidno：6(fqgshvpyt)中所示出的氨基酸序列。

根据一些实施方式，抗体或其抗原结合部分的所述cdr-h1包括seqidno：22(gfsfniyamn)中所示出的氨基酸序列或由其组成。

根据一些实施方式，抗体或其抗原结合部分的所述cdr-h2包括seqidno：23(rirsksnnyatyyadsvkd)中所示出的氨基酸序列或由其组成。

根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括可变区重链，该可变区重链包括seqidno：7的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括恒定区重链，该恒定区重链包括seqidno：9的氨基酸序列。

根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括可变区轻链，该可变区轻链包括seqidno：8的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括恒定区轻链，该恒定区轻链包括seqidno：10的氨基酸序列。

根据另一方面，本发明提供了包括三个重链cdr(cdr-h)和三个轻链cdr(cdr-l)的抗体或其抗原结合部分，其中：

cdr-h1包括选自seqidno：11(vyafss)或seqidno：24(sswmn)的氨基酸序列，

cdr-h2包括seqidno：12(riypadgdtn)中所示出的氨基酸序列，

cdr-h3包括seqidno：13(wlramdy)中所示出的氨基酸序列，

cdr-l1包括seqidno：14(kasqnvgtnva)中所示出的氨基酸序列，

cdr-l2包括seqidno：15(sasyrys)中所示出的氨基酸序列，和

cdr-l3包括seqidno：16(qqynsypyt)中所示出的氨基酸序列。

根据一些实施方式，抗体或其抗原结合部分的所述cdr-h1包括seqidno：25(vyafssswmn)中所示出的氨基酸序列或由其组成。

根据一些实施方式，抗体或其抗原结合部分的所述cdr-h2包括seqidno：26(riypadgdtnyngnfrg)中所示出的氨基酸序列或由其组成。

根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括可变区重链，该可变区重链包括seqidno：17的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括恒定区重链，该恒定区重链包括seqidno：19的氨基酸序列。

根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括可变区轻链，该可变区轻链包括seqidno：18的氨基酸序列。根据一些实施方式，所述抗体或其抗原结合部分包括恒定区轻链，该恒定区轻链包括seqidno：20的氨基酸序列。

在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分选自fv、fab、f(ab')2、scfv或scfv2片段。

在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分具有对于pcna的增加的结合亲和力。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分具有阻断pcna和nkp44-1之间的相互作用的能力。

根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体，该药物组合物用于治疗itim相关疾病，或nkp44-1相关疾病或病症，包括但不限于癌症。

根据另一方面，本发明提供了用于治疗患有itim相关疾病，包括但不限于癌症的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。

根据另一方面，本发明提供了用于治疗患有nkp44-1相关疾病，包括但不限于癌症的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方式中，该方法包括使样品与抗膜相关的pcna抗体接触，和检测抗体与膜相关的pcna的结合的步骤。在一些实施方式中，膜相关的pcna水平的增加指示nkp44-1相关疾病或其严重程度。

根据另一方面，本发明提供了检测受试者中的非核pcna(例如，膜相关的pcna)的方法，该方法包括比如通过使非核馏分样品与抗pcna抗体接触并检测非核pcna和抗体之间的结合来检测源自受试者的非核馏分的样品中的pcna水平。

根据另一方面，本发明提供了诊断、预测或确定用于治疗受nkp44-1相关疾病(例如，癌症)折磨的受试者的适合性的方法，该方法包括比如通过使样品与抗pcna抗体接触并检测非核pcna和抗体之间的结合来检测在源自受试者的样品中是否存在pcna，其中样品中pcna的存在指示受试者中的nkp44-1相关疾病。

在一些实施方式中，样品包括非核馏分。在一些实施方式中，抗pcna抗体具有对于非核pcna的增加的结合亲和力。

在一些实施方式中，nkp44-1相关疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症选自：前列腺癌、白血病、肾癌、头颈癌、舌癌和乳腺癌。

根据另一方面，本发明提供了用于检测非核pcna的试剂盒，该试剂盒包括抗体或其抗原结合部分。

本发明的其他特征和优势将从以下详细描述变得显而易见。

附图说明

图1a-1c.nk92细胞系中单个nkp44剪接变体的过表达导致不同的功能。nk92细胞用nkp44/ncr2同等型转导，从而过表达同等型1、2和3(分别nk92-44-1、nk92-44-2和nk92-44-3)。(a)nk92-44-1、nk92-44-2、nk92-44-3细胞系在用helagfp和helagfppcna温育18小时之后的相对ifnγ分泌。(b)免疫突触特异性f-肌动蛋白积聚的相对量化的例子。将效应nk细胞在共焦腔式载玻片上用cfse标记的靶hela细胞共温育，固定和渗透化，并且用鬼笔环肽和dapi染色。显示了nk效应-hela靶相互作用的代表性图像(左图)；对于图像分析(右图)，使用imagej平均阈值算法消除背景荧光噪声。为了忽略源自靶细胞f-肌动蛋白的荧光信号和染色强度的变化；设门的突触f-肌动蛋白mfi除以总接合mfi。(c)与cfse标记的靶hela细胞共温育的野生型(wt)nk92、nk92-44-1、-2和-3细胞系的突触图像的分析(n＝30-40图像/组)；从分析排除了具有过饱和的像素的图像。代表性图在柱状图条下方。

图2a-2d.在用il-2或il-15培养之后，初级外周nk细胞的nkp44剪接变体的表达和功能。从血液分离初级人nk细胞并且在存在il-2或il-15的情况下培养6天。(a)在第0天和第6天，对于cd3^-/cd56⁺设门的细胞的cd16和nkp44表达的基于流式细胞术的分析。(b)在第0天和用il-2或il-15处理6天之后，初级nk细胞中nkp44剪接变体表达的qpcr分析。6天il-2(c)-或il-15(d)-培养的初级人nk细胞的功能；helagfppcna细胞的裂解与用或不用抗nkp44(p44-8mab)阻断的helagfp细胞的裂解的比较。条，±sd。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；非配对的t检验，双尾。

图3a-3f.急性髓细胞白血病(aml)患者中nkp44-1曲线的差的存活。从aml患者获得的骨髓样品的rna-序列分析(tcga数据)：(a)来自所有nkp46⁺aml病例的nkp46⁺nkp44⁺(n＝51)和nkp46⁺nkp44^-(n＝115)患者的比例。(b)具有在tcga数据中记录的“死亡日”信息的nkp46⁺nkp44⁺(n＝36)和nkp46⁺nkp44^-(n＝60)患者的存活；差别不是统计上显著的。(c)nkp46⁺nkp44⁺(n＝51)aml病例中nkp44剪接变体的相对分布。(d)来自总nkp46⁺nkp44⁺(n＝51)aml病例的nkp44剪接变体曲线的百分数。(e)nkp46⁺aml病例的存活，nkp44-1(n＝24)对nkp44-2/3(n＝12)对nkp44^-(n＝60)的曲线。(f)nkp46⁺aml病例的存活，曲线nkp44-1：nkp44-1^高(n＝12)对nkp44-1^低(n＝12)的不同的曲线。重新绘制nkp44-2/3(n＝12)与nkp44^-(n＝60)曲线(来自e)，用于方便比较。

图4a-4c.抗pcnamab阻断肿瘤-介导抑制。在我们的实验室中针对pcna升高mab。(a)在存在滴定浓度的mab14.25的情况下，重组体nkp44与平板结合的重组体pcna的结合。y轴是归一化至没有14.25的nkp44结合(左柱，100％)的nkp44的％结合。在存在用抗pcna抗体或提到的对照migg1预包被的hela细胞的情况下，在平板结合的抗nkp44(b)或抗nkp30(c)上激活的nk92-44细胞的ifnγ分泌。

图5a-5b.描绘了在用于产生本文所述的mabs的程序下轻链琼脂糖凝胶电泳。每个泳道显示用8正向简并引物和反向引物中的每一个扩增的轻链pcr产物(泳道1-8)。

图6a-6c.(a)用于杂交瘤产生的小鼠中免疫程序的示意性表示，(b)用于选择特异性单克隆抗体生产克隆的筛选策略。(c)表示通过选择克隆的细胞培养汤以及通过facs的膜pcna染色，与mbp-pcna结合的nkp44受体的抑制的elisa结果。

图7a-7c.(a)确认重组pcna被14-25-9的特异性识别的蛋白质印迹结果。(b)表示fplc纯化的单克隆抗体14-25-9与mbp-pcna、his-pcna和不相关的蛋白质his-dj1的结合的elisa结果，igg1为同种型对照。(c)显示与pcna结合的nkp44受体被14-25-9的剂量依赖性抑制的elisa结果，以及与商业抗pcnamab克隆pc10的比较。

图8a-8b.(a)来自三个不同细胞系的细胞pcna被14-25-9和pc10的识别，经蛋白质印迹表示。(b)纯化的14-25-9对pcna的亲和力，使用proteon测量。浓度：0-80nm。

图9为显示与商业pc10克隆相比，在活k562细胞系中通过纯化的14-25-9的膜表达pcna识别的facs染色。

图10a-10b呈现了(来自hela细胞)图像流结果，其显示(a)通过14-25-9的主要细胞质pcna的识别，而(b)pc10与核pcna结合。

图11a-11b是人福尔马林固定正常组织和肿瘤组织的荧光免疫组织化学显微照片；用14-25-9和pc10的(a)舌头和(b)头颈的石蜡包埋的活组织切片样品。

图12a-12b为人福尔马林固定的正常组织和肿瘤组织的荧光免疫组织化学显微照片；用14-25-9和pc10的(a)肾和(b)乳腺的石蜡包埋的活组织切片样品。

图13a-13b包括显示被14-25-9mab激活的人nk的照片。(a)在存在14-25-9或作为对照的igg1的情况下，新鲜分离的人nk细胞与来自实体瘤和白血病的不同癌细胞系共温育过夜(hela、du145、721.221和k562)。与作为对照的小鼠igg1相比，用14-25-9温育的nk细胞显示ifn-γ释放的增加。(b)当以1:3的效应和靶比例，与721.221cw6相互作用时，抗pcnamab14-25-9改善了新鲜的初级人nk细胞的裂解活性。

图14为裸小鼠中抵抗异种移植物的体内人nk激活的非限制性实验方案。(左)检查活组织切片/切除的肿瘤的ncr2剪接变体i的归一化表达(rna)(归一化至活组织切片中的免疫部分)+用于pcna的膜定位的ffpe切割的染色，其中使用相同的mab用于处理。(右)患者来源的异种移植(pdx)：将用il-2体外生长的2×10⁶个患者的自体nk(cd56阳性选择)细胞瘤内注射至小鼠中。在相同的麻醉尾静脉中，注射14-25-9mab(10mg/kg)或模拟物。六(6)小时后，切除肿瘤和：部分肿瘤：冷冻用于rna(hing和nkp44剪接变体的qrtpcr；另一部分肿瘤：在macs分离器中消化并且染色单个细胞用于肿瘤细胞上的膜pcna，和nk上的膜hcd107a。

图15为从患者的pbmc分离并且用il-2繁殖的nk细胞的facs染色。用抗人cd56染色(左图)显示了表达中等或高cd56水平的nk细胞的预期表型。nk细胞类型为nkp44表达阳性(右图)。x轴–fl6-amfi，底-10log尺度。

图16为来自收获的和溶解的患者来源的异种移植物，人cd107a的膜表达染色的人nk细胞的facs染色。x轴–fl2-amfi。y轴–fl6-a-mfi。两个轴都为底-10log尺度。

图17为比较pdx内注射的携带pdx的小鼠对与自体nk和用14-25-9处理的iv或对照处理的小鼠的cd107a(nk激活标记)的竖直条图比较。

图18a-18c包括(a)蛋白质印记结果，确认了重组pcna被13-10-1特异性识别(左图)。来自三个不同细胞系的细胞pcna被14-25-9和pc10的识别也被蛋白质印记证实(右图)。(b)图4中显示结果的拷贝，添加有用来自用13-10-1染色的相同实验。(c)人福尔马林固定的免疫组织化学；用13-10-1和pc10的口腔癌的石蜡包埋的活组织切片样品。

图19为显示纯化的13-10-1对于pcna的亲和力的proteon阵列。获得值为：ka＝1.10e⁺⁴(msec¹)；kd＝9.90e^-5(sec¹)；kd＝8.99e^-9m；浓度：0-80nm。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗体片段，该抗体或其抗体片段具有对于pcna的增加的结合亲和力以及阻断pcna与nkp44同等型1的相互作用的能力。

在一些实施方式中，本发明涉及一种抗体或其抗体片段，该抗体或其抗体片段具有对于pcna的增加的结合亲和力以及阻断pcna与itim阳性nkp44的相互作用的能力。

在一些实施方式中，nkp44是具有seqidno：35(mawralhplllllllfpgsqaqskaqvlqsvagqtltvrcqypptgslyekkgwckeasalvcirlvtsskprtmawtsrftiwddpdagfftvtmtdlreedsghywcriyrpsdnsvsksvrfylvvspasastqtswtprdlvssqtqtqscvpptagarqapespstipvpsqpqnstlrpgpaapialvpvfcgllvakslvlsallvwwgdiwwktmmelrsldtqkatchlqqvtdlpwtsvsspvereilyhtvartkisddddehtl)所示的多肽序列的同等型-1nkp44(或可互换地为“天然细胞毒性触发受体2”或“ncr2”)。

在一些实施方式中，本发明涉及分离的抗体或其分离的抗体片段，其具有对于pcna，特别是膜相关的pcna的增加的结合亲和力。

如本文所使用，术语“膜相关的pcna”是指非核pcna。在一些实施方式中，本发明的方法、试剂盒和组合物提供了对于核pcna没有亲和力或具有最低亲和力的抗膜相关的pcna抗体。

在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分具有阻断pcna与nkp44同等型1的相互作用的能力。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分对于pcna与nkp44同等型2和/或nkp44同等型3中的任一种之间的相互作用具有最低影响。

在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分基本上阻断nkp44-pcna相互作用。

在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分基本上增强nk活性，比如在暴露于肿瘤细胞之后。

本发明部分基于阻断nkp44-pcna相互作用的新型抗体的发现。由于本文公开的抗体对阻断与nkp44同等型1(即，itim阳性)的相互作用具有增加的特异性，所以公开的抗体或其片段可用于治疗与nkp44itim+(阳性)相关的疾病，比如癌症。

如本文所描述，本发明的抗pcna抗体可用作其中涉及nkp44同等型1表达或活性的疾病或病症的诊断剂和/或预后剂，疾病或病症比如癌症，并且特别是aml，如本文所证明的。

“抗pcna抗体”、“识别pcna的抗体”或“针对pcna的抗体”是以足够的亲和力和特异性与pcna结合的抗体。在一些实施方式中，如本文所公开的抗pcna抗体具有超过pcna的中和活性。

在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合部分优选地与非核pcna结合，而不是与核pcna结合。作为非限制性实例，如本文使用的本发明的抗体或其抗原结合部分“13-10-1”和“14-25-9”与非核pcna结合，其中kd值分别为8.99e^-9m和3.54e^-8m。

如本文所使用，术语“增加的结合亲和力”和“更高的结合亲和力”是可互换的。在一些实施方式中，与核pcna相比，本发明的抗体或其抗原结合部分对于非核pcna具有更高的结合亲和力。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高10％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高30％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高50％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高75％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高100％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高150％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高250％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高500％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高1,000％。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高1.5倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高2倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高5倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高10倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高50倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高100倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高500倍。在一个实施方式中，如本文所使用的更高的亲和力是高1,000倍。

术语“抗体”(也称为“免疫球蛋白”)以最广泛的意义上使用，并且具体包括单克隆抗体和抗体片段，只要它们展现期望的生物活性。在某些实施方式中，本发明还包含嵌合抗体或人源化抗体的使用。

天然存在的抗体结构的基本单元是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白复合物，该复合物由通过非共价缔合和二硫键连接在一起的两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥(disulfidebridge)。存在五种人抗体类别(igg、iga、igm、igd和ige)，并且在这些类别中，基于结构差异，比如单个抗体分子中的免疫球蛋白单元的数目、单个单元中的二硫桥结构以及链长和序列的差异来识别各种亚类。抗体的类别和亚类是其同种型。

重链和轻链的氨基末端区的序列比羧基末端区域更多样，并且因此称为可变结构域(variabledomain)。抗体结构的该部分赋予抗体的抗原结合特异性。重可变(vh)结构域和轻可变(vl)结构域一起形成单个抗原结合位点，因此基本免疫球蛋白单元具有两个抗原结合位点。认为具体的氨基酸残基在轻链可变区和重链可变结构域之间形成界面(chothia等，j.mol.biol.186，651-63(1985)；novotnyandhaber，(1985)proc.natl.acad.sci.usa824592-4596)。

重链和轻链的羧基末端部分形成恒定结构域(constantdomain)，即ch1、ch2、ch3、cl。虽然在这些结构域(domain)中的多样性要少得多，但是在动物物种之间存在差异，并且进一步，在同一个体内存在几种不同的抗体同种型，每种具有不同的功能。

术语“构架区”或“fr”是指除了本文定义的高变区氨基酸残基以外的抗体可变结构域中的氨基酸残基。如本文所使用的术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体可变结构域中的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基。cdr主要负责结合抗原的表位。已经精确定义了fr和cdr的范围(参见kabat等)。

还可以使用imgt信息系统(www://imgt.cines.fr/)(/v-quest)分析免疫球蛋白可变结构域以鉴定包括cdr的可变区段。参见例如brochet，x.etal,nucl.acidsres.j6:w503-508(2008)。

kabat等还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“kabat编号”系统分配给任何可变结构域序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所使用，“kabat编号”是指由kabat等，u.s.dept.ofhealthandhumanservices，“sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”(1983)所阐述的编号系统。

表1.本发明的抗体的cdr序列的氨基酸序列

“抗原”是能够引发抗体形成被受抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多于一个的表位。上面提到的特异性反应意味着抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不是与其他抗原诱发的大量的其他抗体反应。

根据本发明的术语“抗原决定簇”或“表位”是指与特定抗体特异性反应的抗原分子区。源自表位的肽序列可以单独使用或与载体部分结合使用，应用本领域已知的方法使动物免疫并产生另外的多克隆或单克隆抗体。

本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定的抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链(一条或多条)的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现期望的生物活性(美国专利号4,816,567；和morrisonetal，proc.natl.acad.sci.usa57:6851-6855(1984))。另外，可以进行互补决定区(cdr)移植以改变抗体分子的某些特性，包括亲和力或特异性。在美国专利5,225,539中公开了cdr移植的非限制性实例。

嵌合抗体是分子，其不同部分源自不同的动物物种，比如具有源自鼠mab的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。具有基本上来自人抗体(称为受体抗体)的可变区构架残基和基本上来自小鼠抗体(称为供体抗体)的互补决定区的抗体也称为人源化抗体。嵌合抗体主要用于降低应用中的免疫原性并增加生产的产率，例如，其中鼠mab具有来自杂交瘤的更高产率但在人中具有更高的免疫原性，使得使用人/鼠嵌合mab。嵌合抗体及其制备方法在本领域是已知的(例如pct专利申请wo86/01533、wo97/02671、wo90/07861、wo92/22653和美国专利5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101和5,225,539)。如本文所使用，术语“人源化抗体”是指包括来自人抗体的构架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个cdr的抗体。人源化免疫球蛋白的除了可能的cdr之外的部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。然而，在一些情况下，可以修饰例如构架区中的特定氨基酸残基，以便优化人源化抗体的性能。重要的是，预期人源化抗体与提供cdr的供体抗体结合相同的抗原。进一步的细节参见例如转让给英国医学研究委员会的美国专利号5,225,539。术语“来自受体人免疫球蛋白的构架区”和“源自受体人免疫球蛋白的构架区”和类似的语法表达在本文中可互换用于指具有受体人免疫球蛋白的相同的氨基酸序列的构架区或其部分。

如本文所使用，术语“car-t细胞”和“car-nk细胞”是指对至少一种目的蛋白(例如在用外遗传修饰剂处理后具有增加的表达的免疫原性蛋白)具有特异性并且移植到免疫效应细胞(t细胞或nk细胞)上的工程化受体。在一些实施方式中，car-t细胞具有移植到t细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，car-nk细胞具有移植到nk细胞上的单克隆抗体的特异性。在一些实施方式中，t细胞选自细胞毒性t淋巴细胞和调节性t细胞。

car-t和car-nk细胞及其载体在本领域是众所周知的。这些细胞靶向受体结合的蛋白质并对受体结合的蛋白质具有细胞毒性。在一些实施方式中，car-t或car-nk细胞靶向至少一种病毒蛋白。在一些实施方式中，car-t或car-nk细胞靶向多种病毒蛋白。在一些实施方式中，car-t或car-nk细胞靶向病毒蛋白，该病毒蛋白由于与外遗传修饰剂接触而具有增加的表达。

car-t细胞的构建在本领域中是众所周知的。在一个非限制性实例中，可以制备针对病毒蛋白的单克隆抗体，并且然后构建编码抗体的载体。载体还将包括共刺激信号区。在一些实施方式中，共刺激信号区包含已知t细胞或nk细胞刺激分子的胞内结构域。在一些实施方式中，胞内结构域选自下面的至少一种：cd3z、cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1))、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。在一些实施方式中，载体还包括cd3z信号传导结构域。然后通过例如慢病毒感染将该载体转染到t细胞中。

如本文所使用，术语“免疫治疗剂”是指引发主动免疫应答的任何分子、化合物、溶液或细胞。在一些实施方式中，免疫治疗剂激活免疫系统。在一些实施方式中，免疫治疗剂是靶向癌症的免疫治疗剂。在一些实施方式中，免疫治疗剂引发针对癌症或其细胞的主动免疫应答。在一些实施方式中，免疫治疗剂引发全身免疫应答(generalimmuneresponse)。在一些实施方式中，免疫治疗剂引发针对特定蛋白质、成组蛋白质、转录物或成组转录物的免疫应答。每种可能性代表本发明的单独实施方式。免疫检查点抑制剂将是引发全身免疫应答的免疫治疗剂的非限制性实例。嵌合抗原受体car-t细胞、car-nk细胞或细胞毒素单克隆抗体将是引发针对特定蛋白质的应答的免疫治疗剂的非限制性实例。疫苗是引发针对一组蛋白质或转录物(或甚至单一蛋白质或转录物)的应答的免疫治疗剂的非限制性实例。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自：car-t细胞、疫苗、抗体和免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫治疗剂是car-t细胞、疫苗、胞毒抗体或免疫检查点抑制剂。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，免疫治疗剂结合免疫原性蛋白。在一些实施方式中，免疫治疗剂结合增加的免疫原性蛋白。在这种实施方式中，免疫治疗剂是靶向特定蛋白质(一种或多种)的试剂。在这种实施方式中，免疫治疗剂选自car-t细胞、car-nk细胞、疫苗和细胞毒素单克隆抗体。在一些实施方式中，病毒是内源病毒，并且免疫治疗剂直接结合增加的免疫原性蛋白。

如本文所使用的术语“单克隆抗体”或“mab”是指从基本上均一的抗体群获得的抗体，即，包括该群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，不包括(exceptfor)在单克隆抗体的产生过程中可能出现的可能变体，这种变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上均一的抗体群获得的，并且不应被解释为根据本文提供的方法使用的抗体可以由kohleretal，nature256:495(1975)初次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。还可以使用例如clackson等，nature352:624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。

本发明的mab可以是任何免疫球蛋白类，包括igg、igm、igd、ige或iga。产生mab的杂交瘤可以在体外或体内培养。在体内生产中可以获得高滴度的mab，其中将来自个体杂交瘤的细胞腹膜内注射到原始接触过抗原的balb/c小鼠中以产生包含高浓度的期望的mab的腹水流体。可以使用本领域技术人员众所周知的柱层析方法从这样的腹水流体或从培养上清液纯化同种型igm或igg的mab。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；串联双抗体(tadb)，线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；zapata等，proteineng.8(10)：1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微抗体、单链抗体分子；由抗体片段(例如，包括但不限于db-fc、tadb-fc、tadb-ch3、(scfv)4-fc、二-scfv、二-scfv或串联(二、三)-scfv)形成的多特异性抗体；和双特异性t细胞接合物(bite)。

木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原结合片段(称为“fab”片段，每个“fab”片段具有单个抗原结合位点)和残留的“fc”片段，“fc”片段的名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，该f(ab')2片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

“fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由紧密的、非共价缔合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。它处于vh-vl二聚体具有三个表面的构型中。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单可变结构域(或包括仅三个对抗原特异的高变区的一半fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管该单可变结构域的亲和力低于整个结合位点。

fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链chi结构域的羧基末端添加了包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的几个残基。fab'-sh是本文中fab'的名称，在该fab'中恒定结构域的半胱氨酸残基(一个或多个)带有至少一个游离巯基。f(ab')2抗体片段最初是作为fab'片段对产生的，在该fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”指定为称为κ和λ的两种明显不同的类型之一。

根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体指定为不同的类别。存在五种主要类型的完整抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如iggl、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。将对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为a、δ、e、γ和微。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方式中，fv多肽进一步包括vh和vl结构域之间的多肽接头，该多肽接头使scfv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于scfv的综述，参见pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies,第113卷，rosenburgandmooreeds.，springer-verlag，newyork,第269-315页(1994)。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括与同一多肽链(vh-vl)中的轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体是natl.acad.sci.usa，90:6444-6448(1993)。

术语“多特异性抗体”以最广泛的意义上使用，并且具体涵盖具有多表位特异性的抗体。这种多特异性抗体包括但不限于包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)的抗体，其中vhvl单元具有多表位特异性；具有两个或更多个vl和vh结构域的抗体，其中每个vhvl单元结合不同表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，其中每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段比如fab、fv、dsfv、scfv；双抗体；双特异性双抗体；三抗体；三功能抗体；共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶标(一个或多个)上的两个或更多个不同表位的能力。

可以使用本领域众所周知的方法来制备本发明的单克隆抗体。实例包括各种技术，比如kohler，g.andmilstein，c，nature256：495-497(1975)；kozbor等，immunologytoday4：72(1983)；cole等，monoclonalantibodiesandcancertherapy,第77-96页，alanr.liss，inc.(1985)中的那些。

除了体内产生抗体的常规方法之外，可以使用噬菌体展示技术在体外产生抗体。与常规抗体生产相比，这种重组抗体的产生快得多，并且它们可以针对大量抗原产生。此外，当使用常规方法时，许多抗原被证明是非免疫原性的或剧毒的，并且因此不能用于在动物中产生抗体。此外，重组抗体的亲和力成熟(即，增加亲和力和特异性)是非常简单且相对快速的。最后，可以在一种选择程序中产生大量针对特定抗原的不同抗体。为了产生重组单克隆抗体，可以使用所有基于展示文库的各种方法来产生具有不同抗原识别位点的大的抗体池。这样的文库可以以几种方式来制备：可以通过克隆重链种系基因池中的合成cdr3区来产生合成组库(syntheticrepertoire)，并且因此产生可以从中选择具有各种特异性的重组抗体片段的大的抗体组库。可以使用人的淋巴细胞池作为用于构建抗体文库的起始材料。有可能构建人igm抗体的首次用于实验的组库(naiverepertoire)，并且因此创建具有大量多样性的人类文库。该方法已成功地广泛用于选择大量针对不同抗原的抗体。在众所周知的参考文献currentprotocolsinimmunology，colliganetal(eds.)，johnwiley&sons，inc.(1992-2000),第17章,第17.1节中提供了用于噬菌体文库构建和选择重组抗体的方案。

可以通过本领域已知的任何方法使非人抗体人源化。在一种方法中，将非人互补决定区(cdr)插入人抗体或共有抗体构架序列中。然后可以将进一步的变化引入抗体构架中以调节亲和力或免疫原性。

在一些实施方式中，如本文所描述的抗体是中和抗体。如本文所讨论的，“中和”被定义为本发明的抗体对nkp44-pcna相互作用的减少。

在一些实施方式中，中和抗体包括：抗体、抗体片段、fab和f(ab′)2、单结构域抗原结合重组片段和天然纳米抗体。

在一些实施方式中，本发明提供了编码本发明的抗体的核酸序列。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的轻链可变结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：27)：tgacattgtgatgactcagtctcaaaaaatcatgtccacatcagtaggagacagggtcagcgtcacctgcaaggccagtcagaatgtgggtactaatgtagcctggtatcaacagaaaccagggcaatctcctaaagtactgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcagcatcagcaatgtgcagtctgaagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacagctatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的轻链恒定结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：28)：cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttaga。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的重链可变结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：29)：gagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaggcttctgtctacgcattcagtagttcctggatgaactgggtgaagcagaggcctggaaagggtcttgagtggattggacggatttatcctgcagatggagatactaactacaatgggaacttcaggggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagtctgacatctgaggactctgcggtctacttctgtgcaagatggttacgggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的重链恒定结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：30)：gccaaaacaacataccccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的轻链可变结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：31)：tgatgttgtgatgacccaaactccgctctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaagacctattttgaatggtaccttcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagaattcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的轻链恒定结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：32)：cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的重链可变结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：33)：aagctggtggagtctggtggaggattggtgcagcctacagggtcattgaaactctcatgtgtaacctctggattcagtttcaatatctacgccatgaactgggtccgccaggctccaggaaagggtttggaatgggttgctcgcataagaagtaaaagtaataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagacagattcaccatctccagagatgattcagaaagcatgctctatctccaaatgaacaacttgaaaactgaggacacagccatgtattactgtatgagacaccccaattactccggctttaactacccgtttgcttcctggggcccagggactctggtcactgtctctgca。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体包括由dna序列编码的重链恒定结构域，该dna序列包括下述核酸序列(seqidno：34)：gccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagccagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgaaaccccgggaggagcagatcaacagcactttccgttcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacaaacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga。

在一个实施方式中，如本文所描述的抗体由dna分子编码，该dna分子包括与本文所描述的dna序列具有至少75％同一性的dna序列。在一个实施方式中，如本文所描述的抗体由dna分子编码，该dna分子包括与本文所描述的dna序列具有至少80％同一性的dna序列。在一个实施方式中，如本文所描述的抗体由dna分子编码，该dna分子包括与本文所描述的dna序列具有至少85％同一性的dna序列。在一个实施方式中，如本文所描述的抗体由dna分子编码，该dna分子包括与本文所描述的dna序列具有至少90％同一性的dna序列。在一个实施方式中，如本文所描述的抗体由dna分子编码，该dna分子包括与本文所描述的dna序列具有至少95％同一性的dna序列。

如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括dna和rna。

编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于从被认为具有多肽mrna并以可检测的水平表达其的组织制备的cdna文库。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地从人组织制备的cdna文库中获得。编码多肽的基因也可以从基因组文库中获得或通过已知的合成程序(例如，自动化核酸合成)获得。

例如，多核苷酸可以编码整个免疫球蛋白分子链，比如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(vh)，而且还包括重链恒定区(ch)，该重链恒定区(ch)通常包含三个恒定域：ch1、ch2和ch3；和“铰链”区。在某些情况下，恒定区的存在是期望的。

可以由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，比如单结构域抗体(“dab”)、fv、scfv、fab'和chi，并且已经切除了ck或cl结构域。由于微抗体比常规抗体小，它们应该在临床/诊断用途中实现更好的组织穿透，但是它们是二价的，它们应该保持比单价抗体片段(比如dab)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有规定，否则本文所使用的术语“抗体”不仅包括完整的抗体分子，而且还包括上面讨论的类型的抗原结合抗体片段。存在于编码的多肽中的每个构架区可以包括相对于相应的人受体构架的至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体构架区，构架区总共可包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。考虑到包括所公开的蛋白质产物的各个氨基酸的性质，技术人员将认识到一些合理的取代。可以基于例如所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行氨基酸取代，即“保守取代”。

合适地，可以分离和/或纯化本文描述的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸是分离的多核苷酸。

如本文所使用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合或其任何语法变型是条件术语，该条件术语明确排除，但是仅排除本领域普通技术人员众所周知的“天然存在的”，或者是可能在任何时候，由法官或行政或司法机构确定或解释为“天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合的那些形式。

治疗和诊断方法

如本文所使用，术语“治疗”是指试图改变所治疗个体的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理学过程中进行。期望的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的病理后果、降低疾病进展的速度、改善疾病状态、缓解或改善预后。术语“治疗”还可以包括影响培养中的细胞或组织的离体程序。

如本文所使用，术语“受试者”是指个体或患者，该个体或患者是脊椎动物，例如哺乳动物，尤其包括人。

如本文所定义，抗原分子与被抗体的结合导致阻断所述抗原的活性。本文使用的术语“阻断”可以与“衰减”、“抑制”、“降低”和“减少”互换。

在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于2％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于5％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于10％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于25％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于50％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于75％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于90％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低大于95％。在本文描述的方法的一些实施方式中，阻断是降低99％。

如本文所定义，“生物样品”是指来自任何动物的物理样本。在另一个实施方式中，生物样品由哺乳动物获得。在另一个实施方式中，生物样品由人获得。在另一个实施方式中，在本领域技术人员的能力范围内很好地获得生物样品。生物样品包括但不限于生物流体(biologicalfluid)，比如血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳汁、全血、尿液、脑脊液、唾液、痰液、眼泪、汗液、粘液和组织培养基，该组织培养基包括组织提取物比如均质组织和细胞提取物。在另一个实施方式中，生物样品是活组织切片(biopsy)。在另一个实施方式中，生物样品是切除的肿瘤。在另一个实施方式中，生物样品包括本领域技术人员已知的处理的组织切片。本文使用的术语样品和生物样品是可互换的。

如本文所定义，非核馏分是指除细胞核以外的任何组织或细胞提取物。在一个实施方式中，非核提取物包括细胞质。在一个实施方式中，非核提取物包括细胞器。在一个实施方式中，非核提取物包括线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、外来体等。在一个实施方式中，非核提取物包括细胞膜或其片段。在一个实施方式中，非核提取物包括蛋白质。在一个实施方式中，非核蛋白质包括细胞质和外周蛋白。在一个实施方式中，非核提取物包括可溶性分子。在一个实施方式中，非核提取物包括膜相关分子。在一个实施方式中，膜相关分子是细胞膜的组成部分，跨越或接近细胞膜。

在一些实施方式中，为了产生分子的非核分布，以本领域技术人员已知的标准方式将细胞区室或细胞器均质化。在一些实施方式中，使用不同的分馏程序来富集分子馏分。在一个实施方式中，获得的分子越过几个分馏塔。在一个实施方式中，分馏塔采用串联或并联使用的各种检测器来产生器官、细胞、细胞区室或细胞器的分子分布。

如本文所使用，术语“疾病”是指将受益于抗体治疗的任何病症。

在一个实施方式中，本发明涉及用于治疗、诊断、预测或确定治疗患有癌症，特别是aml的受试者的适合性的方法。

如本文所使用，“癌症”或“恶性肿瘤前期(pre-malignancy)”是与细胞增殖相关的疾病。癌症的非限制性类型包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和生殖细胞肿瘤。在一个实施方式中，癌是指源自上皮细胞的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。在一个实施方式中，肉瘤是指源自间充质细胞的肿瘤，包括但不限于葡萄状肉瘤(sarcomabotryoide)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤。在一个实施方式中，淋巴瘤是指源自离开骨髓并倾向于在淋巴结中成熟的造血细胞的肿瘤，包括但不限于霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤和免疫增生性疾病。在一个实施方式中，白血病是指源自离开骨髓并且倾向于在血液中成熟的造血细胞的肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病和成人t细胞白血病。在一个实施方式中，胚细胞瘤是指源自未成熟前体细胞或胚胎组织的肿瘤，包括但不限于肝母细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾母细胞瘤、成神经细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。在一个实施方式中，生殖细胞瘤指源自生殖细胞的肿瘤，包括但不限于生殖细胞瘤型或精原细胞瘤型生殖细胞瘤(ggct，sgct)，以及非生殖细胞瘤型或非精原细胞瘤型生殖细胞瘤(nggct，nsgct)。在一个实施方式中，生殖细胞瘤或精原细胞瘤包括但不限于生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。在一个实施方式中，非生殖细胞瘤或非精原细胞瘤是指纯的和混合的生殖细胞肿瘤，包括但不限于胚胎癌、内胚窦瘤、绒毛膜癌、泪室癌(tearoom)、多胚胎瘤、性腺母细胞瘤和畸胎癌。

在一些实施方式中，本发明的单克隆抗体可用于疾病的诊断、检测、分期和治疗。在一些实施方式中，本发明的单克隆抗体可用于人类疾病的诊断、检测、分期和治疗。在一些实施方式中，本发明的单克隆抗体可用于癌症的诊断、检测、分期和治疗。

在一个实施方式中，本发明的单克隆抗体及其片段是人源化的或完全人类的。

在一些实施方式中，本发明提供了诊断或治疗受试者的恶性肿瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的治疗缀合物，该治疗缀合物包括本发明的单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段，其中本发明的单克隆抗体或其片段或抗体融合蛋白或其片段与至少一种诊断和/或治疗剂结合，并且然后配制在药学上合适的赋形剂中。

单克隆抗体用于体外诊断的用途是本领域技术人员众所周知的。例如，参见carlsson等，bio/technology7(6)：567(1989)。例如，单克隆抗体可用于检测来自活组织切片样品的组织中肿瘤相关抗原的存在。使用比如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定和荧光免疫测定等技术，单克隆抗体还可用于测量临床流体样品中肿瘤相关抗原的量。肿瘤靶向单克隆抗体和毒素的缀合物可用于在体内选择性杀死癌细胞(spalding，bio/technology9(8)：701(1991)；goldenberg，scientificamericanscience&medicine1(1)：64(1994))。例如，实验动物模型中的治疗研究已证明携带细胞毒性放射性核素的抗体的抗肿瘤活性。

本文还描述了靶向包括抗体组分的诊断或治疗缀合物的癌细胞，该抗体组分包括本发明的任何抗体的单克隆抗体或其片段，或抗体融合蛋白或其片段，其中该抗体组分与至少一种诊断剂或至少一种治疗剂结合。在一个实施方式中，诊断缀合物是光活性诊断剂/检测剂。在一个实施方式中，诊断缀合物是超声可检测剂。在一个实施方式中，诊断缀合物是mri造影剂。在另一个实施方式中，诊断剂/检测剂是能量在20和4,000kev之间的放射性核素。

此外，本发明包括诊断受试者中的癌症的方法。在一些实施方式中，通过施用在药学上合适的赋形剂中配制的诊断有效量的诊断缀合物，并检测所述标记来完成诊断。本发明的单克隆抗体或衍生的融合蛋白或其片段可以与诊断剂/检测剂缀合，或者不与诊断剂/检测剂缀合，但是在施用诊断剂/检测剂之前、同时或之后施用。在一个实施方式中，合适的非放射性诊断剂/检测剂是适用于磁共振成像(mri)、x射线、计算机断层扫描(ct)或超声的造影剂。在另一个实施方式中，当与本发明的抗体一起使用时，磁性成像剂包括例如与包括2-苄基-dtpa及其一甲基和环己基类似物的金属螯合物组合络合的非放射性金属，比如锰、铁和钆。参见2001年10月10日提交的u.s.ser.no.09/921,290，其全部内容通过引用结合于此。

在一些实施方式中，本发明中预期的造影剂，比如mri造影剂，包括但不限于钆离子、镧离子、镝离子、铁离子、锰离子或其他相当的标记(comparablelabel)、ct造影剂和超声造影剂。在另一个实施方式中，顺磁离子适用于本发明。在一个实施方式中，顺磁离子包括铬³⁺、锰²⁺、铁³⁺、铁²⁺、钴²⁺、镍²⁺、铜²⁺、钕³⁺、钐³⁺、镱³⁺、钆³⁺、钒²⁺、铽³⁺、镝³⁺、钬³⁺和铒³⁺，其中钆是特别优选的。在另一个实施方式中，在其他背景比如x射线成像中有用的离子包括但不限于镧³⁺、金³⁺、铅²⁺，并且特别是铋³⁺。在另一个实施方式中，金属也可用于诊断剂/检测剂，包括用于磁共振成像技术的那些。在一个实施方式中，这些金属包括但不限于：钆、锰、铁、铬、铜、钴、镍、镝、铼、铕、铽、钬和钕。在另一个实施方式中，向抗体组分加载放射性金属或顺磁离子可能需要使抗体与具有长尾的试剂反应，该长尾连接有多个(amultiplicityof)螯合基团以结合离子。在一个实施方式中，这种尾可以是聚合物，比如聚赖氨酸、多糖或具有可以结合螯合基团的侧基的其它衍生化或可衍生的链，螯合基团比如例如乙二胺四乙酸(edta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、卟啉、多胺，冠醚、双缩氨基硫脲、多肟和已知可用于此目的的类似基团。

在一些实施方式中，缀合的诊断剂是不透射线的和造影剂(contrastmaterial)。在一个实施方式中，这些不透射线的诊断剂用于增强x射线和计算机断层扫描，并且包括碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。在另一个实施方式中，具体化合物包括钡、泛影葡胺(diatrizoate)、乙碘油(ethiodizedoil)、柠檬酸镓(galliumcitrate)、碘卡酸(iocarmicacid)、碘西他酸(iocetamicacid)、碘达胺(iodamide)、胆影酸(iodipamide)、碘沙酸(iodoxamicacid)、碘古酰胺(iogulamide)、碘海醇(iohexol)、碘帕醇(iopamidol)、碘番酸(iopanoicacid)、碘普西酸(ioprocemicacid)、碘西法酸(iosefamicacid)、碘丝酸(iosericacid)、碘砜葡胺(iosulamidemeglumine)、iosemeticacid、碘酞硫(iotasul)、碘替酸(iotetricacid)、异泛影酸(iothalamicacid)、碘曲西酸(iotroxicacid)、碘克沙酸(ioxaglicacid)、羟泛影酸(ioxotrizoicacid)、碘泊酸盐(ipodate)、葡甲胺(meglumine)、甲泛葡胺(metrizamide)、甲泛影酸(metrizoate)、丙碘酮(propyliodone)和氯化亚铊(thallouschloride)。

在一些实施方式中，缀合的诊断剂是荧光剂。在另一个实施方式中，荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、肾造影剂(renographin)、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。在一个实施方式中，罗丹明和荧光素通常经由异硫氰酸酯中间体连接。在一个实施方式中，荧光标记的抗体具体用于流式细胞术分析。

在一些实施方式中，本发明的抗体、融合蛋白及其片段可以通过将抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记。在一个实施方式中，化学发光标记化合物包括但不限于鲁米诺，异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯等。

在一些实施方式中，生物发光化合物可用于标记本发明的抗体及其片段。在一个实施方式中，生物发光标记化合物包括但不限于荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。

根据另一方面，本发明提供治疗患有疾病的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的针对nkp44同等型1或其任何片段的至少一种抗体、融合蛋白及其片段。

术语“治疗有效量的”是指以必须的剂量和持续时间段有效实现期望的治疗或预防结果的量。确切的剂型和方案将由医师根据患者的病情来确定。

药物组合物

本发明还预期了用于人类医学用途的包括识别pcna的至少一种抗体作为活性剂的药学制剂，该药学制剂用于制备用于治疗、诊断或预防本文描述的各种病症的治疗组合物。

在这种药物和药物制剂中，活性剂优选地与一种或多种药学上可接受的载体(一种或多种)和任选的任何其他治疗成分一起使用。在与制剂的其他成分相容并且对其接受者不过度有害的意义上，载体(一种或多种)必须是药学上可接受的。活性剂以如上所述的有效实现期望的药理学效果的量，并且以适合于实现期望的日剂量的量提供。

典型地，将包括抗体的抗原结合部分的本发明的分子悬浮在无菌盐水溶液中，用于治疗用途。可选地，可以配制药物组合物以控制活性成分(包括抗体的抗原结合部分的分子)的释放或延长其在患者体系中的存在。许多合适的药物递送系统是已知的，并且包括例如可植入的药物释放系统、水凝胶、羟甲基纤维素、微胶囊、脂质体、微乳液、微球等。通过使用聚合物来复合或吸附根据本发明的分子可以制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质以及硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酐共聚物的基质。根据本发明的分子即抗体或抗体片段从这种基质中的释放速率取决于该分子的分子量、基质内的分子数量和分散颗粒的大小。

本发明的药物组合物可以通过任何合适的方式施用，比如口服、局部、鼻内、皮下、肌内、静脉内、动脉内、关节内、病灶内或胃肠外。通常，静脉内(i.v.)、关节内、局部或胃肠外施用将是优选的。

对于本领域普通技术人员将显而易见的是，根据本发明的分子的治疗有效量将尤其是取决于施用方案、施用分子的单位剂量(无论该分子是否与其他治疗剂组合施用)、患者的免疫状态和健康状况、施用分子的治疗活性和治疗医师的判断等。

尽管本发明的分子(抗体或其片段)的合适剂量根据施用途径、分子类型(多肽、多核苷酸、有机分子等)、患者的年龄、体重、性别或病情而变化，并且最终应由医生确定，但是在口服施用的情况下，每日剂量通常可以在每kg体重约0.01mg至约500mg之间，优选地约0.01mg至约50mg之间，更优选地约0.1mg至约10mg之间。在胃肠外施用的情况下，每日剂量通常可以在每kg体重约0.001mg至约100mg之间，优选地约0.001mg至约10mg之间，更优选地约0.01mg至约1mg之间。每日剂量可以例如以每日1-4次个体施用的典型方案施用。其他优选的施用方法包括每kg体重约0.01mg至约100mg的关节内施用。在例如goodmanandgilman's：thepharmacologicalbasesoftherapeutics,第8版，pergamonpress，1990；andremington'spharmaceuticalsciences,第17版.，mackpublishingco.，easton，pa.，1990中描述了实现有效量的各种考虑因素。

组合化学疗法的合适给药方案是本领域已知的，并且描述于例如saltz等procasco1999，18，233a和douillard等，lancet2000，355，1041-7。

如众所周知的，将本发明的分子作为活性成分溶解、分散或混合在赋形剂中，该赋形剂是药学上可接受的并且与活性成分相容。合适的赋形剂是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。其他合适的载体是本领域技术人员众所周知的。此外，如果需要，该组合物可以包含少量辅助物质，比如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂。

根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的治疗有效量的本发明的多肽和药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一些实施方式中，药物组合物有助于化合物向生物体的施用。

在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以以本发明的多肽或其类似物或其衍生物的药学上可接受的盐的形式配制。在另一个实施方式中，药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，比如源自无毒的无机酸或有机酸比如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的那些盐，比如源自无毒的无机碱或有机碱比如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

如本文所使用，术语“载体”是指与治疗化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这种药物载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂、或ph缓冲剂，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还设想了抗菌剂比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；和用于调节肌肉弹性的试剂，比如氯化钠或葡萄糖。按本文提供的药物组合物的重量计，载体可以总计占约0.1％至约99.99999％。

如本文所使用，术语“药学上可接受的”意指适合施用于受试者，例如人。例如，术语“药学上可接受的”可以表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，更具体是人。

在另一个实施方式中，本发明的组合物采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、药膏、泡沫、糊剂、缓释制剂等的形式。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以与传统的粘合剂和载体，比如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶一起配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，比如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在e.w.martin的remington'spharmaceuticalsciences"中描述了合适的药物载体的实例，在此其内容通过引用并入本文。这种组合物将包含治疗有效量的本发明的多肽，优选地基本上为纯化的形式，连同合适量的载体，以便向受试者提供合适的施用形式。

根据本发明的一个实施方式，药物组合物包含0.1％-95％的本发明的多肽(一种或多种)，其衍生物或类似物。根据本发明的另一个实施方式，药物组合物含有1％-70％的多肽(一种或多种)衍生物或其类似物。根据本发明的另一个实施方式，待施用的组合物或制剂可以包含一定量的多肽(一种或多种)、其衍生物或类似物，根据本发明的实施方式，该量可以有效地治疗正在接受治疗的受试者的病症或疾病。

本发明的实施方式涉及呈现为单位剂型并且通过药学领域众所周知的任何方法制备的本发明的多肽、其衍生物或类似物。在本发明的一个实施方式中，单位剂型是片剂、胶囊、锭剂、薄片、贴剂、安瓿、小瓶或预填充的注射器的形式。此外，可任选地使用体外试验来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中待使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或不适的性质，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可从源自体外或体内动物模型测试生物测定或系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。

根据一个实施方式，本发明的组合物以药物组合物的形式施用，该药物组合物包括本发明的至少一种活性组分(嵌合多肽)和药学上可接受的载体或稀释剂。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以单独施用或与任何常规的口服、胃肠外或经皮剂型一起施用。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括至少一种抗癌剂，比如化疗剂。在一些实施方式中，药物组合物用于与抗癌疗法联合施用，抗癌疗法比如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法或外科手术。

如本文所使用，术语“施用(administering)”、“施用(administration)”和类似术语是指在合理的医学实践中以向受试者递送包含活性剂的组合物的方式以便提供治疗效果的任何方法。

根据目的组织的位置，本发明的多肽可以以适合于将多肽提供到目的组织内的细胞的任何方式施用。因此，例如，可以将包含本发明的多肽的组合物引入例如全身循环中，全身循环将肽分布到目的组织。可选地，可以将组合物局部施用于目的组织(例如，连续输注或单次(bolus)注射或泵送到组织内，施加于皮肤表面的全部或部分等)。

在一些实施方式中，包括嵌合多肽的药物组合物经由口服、直肠、阴道、局部、鼻、眼、经皮、皮下、肌内、腹膜内或静脉内施用途径施用。药物组合物的施用途径将取决于待治疗的疾病或病症。合适的施用途径包括但不限于胃肠外注射，例如皮内、静脉内、肌内、病灶内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其他注射方式。尽管通过其他途径施用的肽的生物利用度可能低于通过胃肠外注射施用的肽，但是通过使用合适的制剂，可以设想通过经皮、口服、直肠、阴道、局部、鼻、吸入和眼部治疗方式来施用本发明的组合物是可能的。此外，可能期望的是通过包括心室内和鞘内注射的任何合适的途径引入本发明的药物组合物；可以通过例如连接到容器(reservoir)的心室内导管来促进心室内注射。还可以通过使用例如吸入器或喷雾器来采用肺部施用。

对于局部施用，可以将本发明的肽、其衍生物、类似物或片段与药学上可接受的载体组合，以便基于期望的活性递送有效的剂量。载体可以是例如药膏、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、垫(pad)或凝胶棒的形式，但不限于其。

对于口服应用，药物组合物可以是片剂或胶囊的形式，该片剂或胶囊可以包含任何下列成分，或类似性质的化合物：粘合剂，比如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；崩解剂，比如海藻酸、原始凝胶(primogel)或玉米淀粉；润滑剂比如硬脂酸镁；或助流剂比如胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的物质之外，它可以包含液体载体比如脂肪油。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位物理形式的各种其他物质，例如糖、虫胶或其他肠溶剂的包衣。本发明的片剂可以进一步是膜包衣的。

出于胃肠外施用的目的，可以使用芝麻油或花生油或丙二醇水溶液，以及相应的水溶性盐的无菌水溶液。如果需要，可以适当地缓冲这种水溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。

根据一些实施方式，本发明的嵌合多肽，其衍生物或类似物可以在控释系统中递送。在另一个实施方式中，输注泵可用于施用肽，比如例如用于将胰岛素或化学疗法(chemotherapy)递送至特定器官或肿瘤的输注泵。在另一个实施方式中，本发明的肽与可生物降解的、生物相容的聚合物植入物组合施用，其在选定的位点处在受控的时间段内释放肽。优选的聚合物材料的实例包括但不限于聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯、其共聚物和共混物(参见，medicalapplicationsofcontrolledrelease，langerandwise(eds.)，1974，crcpres.，bocaraton，fla.，在此其内容通过引用以它们的整体并入)。在又另一个实施方式中，控释系统可以放置在治疗靶标附近，因此仅需要一部分全身剂量。

当前描述的肽，其衍生物或类似物也可以包含在人工产生的结构中，比如脂质体、iscoms、缓释颗粒和增加血清中的肽或多肽的半衰期的其它媒介。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。与当前描述的肽一起使用的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，该脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，比如胆固醇。脂质的选择通常由考虑因素比如血液中的脂质体大小和稳定性来决定。各种方法可用于制备脂质体，如在例如coligan，j.e.等，currentprotocolsinproteinscience，1999，johnwiley&sons，inc.，newyork中所综述的，并且还参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。

该组合物还包括将活性物质并入聚合物化合物，比如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂中或之上，或并入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球中。这种组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在一个实施方式中，本发明提供了组合制剂。在一个实施方式中，“组合制剂”具体定义了“成套试剂盒(kitofparts)”，其意义在于如上定义的组合配合物(partner)可以独立给药或通过使用与不同量的组合配合物的不同的固定组合，即同时地，同时发生地、分开地或顺序地。在一些实施方式中，然后例如可以将成套试剂盒的部分同时施用或按时间顺序交错施用，即在不同时间点并且对于成套试剂盒的任何部分具有相同或不同的时间间隔。在一些实施方式中，可以在组合制剂中施用组合配偶体(partner)的总量的比例。在一个实施方式中，组合制剂可以变化，例如，以便应对待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，其中不同的需要可能是由于具体疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或体重引起的，如本领域技术人员可以容易地得出的。

在一个实施方式中，应当理解，与用每种药剂(agent)本身治疗相比，本发明的肽可以与另外的活性剂一起提供给个体，以实现改善的治疗效果。在另一个实施方式中，对与组合疗法相关的不良副作用采取措施(例如，补充剂的给药和选择)。

在一个实施方式中，取决于待治疗的病症的严重程度和反应性，给药可以是单次或多次施用，治疗过程持续数天至数周或直至引起治愈或达到疾病状态的减少。

在一些实施方式中，肽以治疗上安全且有效的量施用。如本文所使用，术语“安全且有效的量”是指当以当前描述的方式使用时足以产生期望的治疗反应而没有与合理益处/风险比相称的过度不良副作用(比如毒性、刺激或过敏反应)的组分的量。在另一个实施方式中，治疗有效量的多肽是体内可测量的预期生物效应所必需的多肽的量。施用的实际量、施用的速率和时间过程将取决于正在治疗的病症的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量、时间等的决定由全科医生或专科医生负责，并且通常考虑待治疗的不适、个体患者的病症、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。技术和方案的实例可以在remington：thescienceandpracticeofpharmacy，21sted.，lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，pa.，(2005)中找到。在一些实施方式中，最初可以从体外试验估计有效量或剂量的制剂。在一个实施方式中，可以在动物模型中配制剂量，并且这种信息可以用于更准确地确定人体中的有用剂量。

在一个实施方式中，本文描述的活性成分的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物或实验动物中的体外标准制药程序来确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。在一个实施方式中，剂量根据使用的剂型和利用的施用途径而变化。在一个实施方式中，确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医生基于患者的病情选择。[参见例如fingl等，(1975)“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”,第一部分，第1章]。

包含当前描述的多肽作为活性成分的药物组合物可根据常规药物配制(compounding)技术来制备。参见例如remington'spharmaceuticalsciences,第18版，mackpublishingco.，easton，pa.(1990)。还参见remington：thescienceandpracticeofpharmacy,第21版，lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，pa.(2005)。

在一个实施方式中，制备包括本发明的制剂的组合物，该制剂在相容的药物载体中配制，将该组合物置于合适的容器中，并标记用于治疗指示的病症。

在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置比如fda批准的试剂盒中，该包装或分配器装置包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装(blisterpack)。在一个实施方式中，包装或分配器装置附有施用(administration)说明书。在一个实施方式中，包装或分配器适应与容器相关联的通知，该容器为由调控药物的制备、使用或销售的政府机构规定的形式，该通知反映了该机构批准该组合物或人或兽医施用的形式。在一个实施方式中，这种通知由美国食品和药物管理局标记用于处方药的批准或批准的产品插页的标签。

以下实施例旨在阐明如何制备和使用本发明的化合物和方法，并且决不应将其解释为限制。尽管现在将结合本发明的具体实施方案来描述本发明，但是显然许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和宽的范围内的所有这样的修改和变化。

实施例

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组dna技术。这些技术在文献中有透彻的解释。参见例如，"molecularcloning：alaboratorymanual"sambrook等，(1989)；"currentprotocolsinmolecularbiology"第i-iii卷ausubel，r.m.，ed.(1994)；ausubel等，"currentprotocolsinmolecularbiology"，johnwileyandsons，baltimore，maryland(1989)；perbal，"apracticalguidetomolecularcloning"，johnwiley&sons，newyork(1988)；watson等，"recombinantdna"，scientificamericanbooks，newyork；birren等(eds)"genomeanalysis：alaboratorymanualseries",第1-4卷，冷泉港实验室出版社，newyork(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所阐述的方法；"cellbiology：alaboratoryhandbook",第i-iii卷cellis，j.e.，ed.(1994)；"cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique"byfreshney，wiley-liss，n.y.(1994)，thirdedition；"currentprotocolsinimmunology"第i-iii卷coliganj.e.，ed.(1994)；stites等(eds)，"basicandclinicalimmunology"(8thedition)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishellandshiigi(eds)，"strategiesforproteinpurificationandcharacterization–alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)；"monoclonalantibodies：methodsandprotocols".vincentossipow，nicolasfischer.humanapress(2014)；"monoclonalantibodies：methodsandprotocols".maheralbitar.springerscience&businessmedia(2007),其全部通过引用被并入。遍及该文档提供了其他一般参考文献。

材料和方法

重组人pcna生产

在rosetta^tm2(de3)细胞中使用pet-28或pmal-c2x载体来产生重组人pcna(hpcna)。通过热休克将包含pcna的mrna序列的质粒转化到rosetta^tm2细胞中，并在lb+kan+cp琼脂平板上生长。在设定为37℃和250rpm的培养箱振荡器中使新鲜的转化细菌菌落在5mllb+kan+cp中生长过夜。第二天，将细菌细胞(cell)以1：100稀释到500mllb+kan+cp(以丢弃死细胞)中并生长至0.6-0.8(λ＝650nm)的o.d。加入异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)以诱导pcna(0.5mm)，并将细胞在26℃下进一步温育4小时(hpcna)。然后将细胞离心，并将沉淀用溶液a(20mmtris-hclph8.0，0.5mnacl，20mm咪唑)再悬浮，超声处理6次(20秒，间隔40秒)并通过0.45μm(sartoriusstedimbiotech)过滤器筛分，然后加载到his-tag或amyloseresin珠上。使用重力流动柱，用“hispur^tmni-nta树脂”珠试剂盒(thermo-scientific；结合容量每毫升沉降树脂，≤60mg的来自细菌源的28kda6×his标记的蛋白质)根据试剂盒的方案，进行his标记的蛋白质的纯化。使用直链淀粉树脂珠进行mbp标记的蛋白质的纯化(catalog#e8035s)。

通过表面等离子共振的抗体的动力学分析

proteon^tmxpr36蛋白质相互作用阵列系统(bio-rad)用于测量单克隆抗体14-25-9对his标记的重组体pcna的亲和力。对于该试验，采用htg芯片和proteonmanagerversion3.1.0.6(bio-radlaboratories)。在使用edc/s-nhs胺偶联程序将芯片激活之后，用his标记的重组体pcna和作为对照的his标记的il-2，以30μl/min的流速，在不同的流式细胞中，进行配体固定过程。以40μl/min的流速，注入不同的分析物(14-25-9)浓度(100–0nm)，每次随后使用50mmnaoh，将表面再生。使用二价结合模型，分析数据。

细胞系和细胞培养

使用下述细胞系：a549，人肺腺癌(美国模式培养物集存库ccl-185)；hela，人子宫颈腺癌(atccccl-2)；mda-mb-435，人黑素瘤(https://www.atcc.org/products/all/htb-129.aspx)(atcchtb-129)；k562，人慢性骨髓性白血病(atccccl-243)和721.221cw6，稳定的721.221(mhci型-阴性人b细胞系)转染子，其表达如先前产生的hla-c分子(jexpmed.1996sep1；184(3):913-22)。将细胞在补充10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem或rpmi-1640(gibco，lifetechnicolgies)培养基中培养。将人nk细胞白血病衍生的nk-92细胞系(atcccrl-2407)用flag标记的nkp44构建体反转录病毒转导，以生产nk-92-nkp44细胞系。如先前描述进行反转录病毒转导。接着，将稳定的nk-92-nkp44细胞系在补充10％马血清、10％fbs、0.2mm肌醇(sigma)、0.1mmβ-巯基乙醇(sigma)、20μm叶酸(fisherscientific)、100iu/ml的重组体人il-2(peprotech)和1％青霉素/链霉素(lifetechnologies)的α-mem培养基(gibco，life技术)中培养。

初级人nk细胞的分离和培养

使用rosettesep人nk细胞富集混合物(cocktail)试剂盒(stemcelltechnologies)，经来自内格夫机构审查委员会的ben-gurion大学的事先批准，在它们的知情同意下，从健康的志愿者供体的外周血液进行人初级天然杀伤细胞分离。在纯化之后，将细胞在补充10％热灭活的来自健康供体的人血浆、1mm丙酮酸钠、2mml-谷氨酰胺、1×mem非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素、10mmhepes(lifetechnologies)和300iu/ml人il-2(peprotech)的cellgro干细胞无血清生长培养基(cellgenix)中培养。

用于ifn-γ分泌试验的elisa

将成对的纯化的和生物素化的抗人ifn-γ抗体(biolegend)用于ifn-γ分泌试验的夹心elisa。在4℃下，将96孔u-底平板(nunc)预包被在na2hpo4缓冲液(0.1m，ph9)中稀释的0.5μg/ml抗人nkp30mab(r&dsystems)或仅仅缓冲液，18小时。将肿瘤细胞用1×pbs、抗小鼠igg1或不同浓度的14-25-9mab(在研究中，使用初级nk细胞为2、5和10μg/ml，并且当nk-92-nkp44细胞系时，为10、20和30μg/ml)温育。接着，在37℃、5％co2培养箱中，将它们用初级人nk细胞或nk-92-nkp44在先前包被的96孔u-底平板中共培养(效应物:靶比例1:3)18小时。温育后，将来自每个孔的上清液转移至先前包被0.25μg/ml纯化的抗人ifn-γ的96孔平板elisa板的相应孔中，温育并且使用0.25μg/ml生物素化的抗人ifn-γ捕获。使用hrp标记的链霉抗生物素(jacksonimmunoresearch)和tmb基板(dako)在多平台elisa读数器中，将捕获的ifn-γ量化。

基于流式细胞术的nk细胞-介导裂解试验

如在ifn-γ分泌试验中，羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺基酯染色的(celltrace^tmcfse细胞增殖试剂盒，thermo)肿瘤细胞初始用1×pbs，抗小鼠igg1或不同浓度的14-25-9mab温育，并且然后用接触过抗原的初级人nk细胞或nk-92-nkp44细胞在预包被0.5μg/ml抗人nkp30mab或缓冲液的96孔u-底平板中共培养4小时(37℃，5％co2)。试验分析基于下述设门策略：cfse阳性肿瘤细胞进行生/死区分(按照pi阴性或阳性染色)。特定细胞毒性的百分数计算如下(journalofimmunologicalmethods2001253:177–187)：

实施例1

nkp44-1作为免疫检查点具有独特的作用

之前的报道已经显示了肿瘤表达的pcna，通过与nk受体ncr2/nkp44相互作用，可被癌细胞用于抑制nk活性。为了评估每个nkp44剪接变体的作用，将nk92细胞用编码三个nkp44剪接变体的每一个的cdna转染。三个nk92转染子(即，nk92-44-1，nk92-44-2和nk92-44-3)的剪接变体曲线的qpcr分析显示了在所有三个中，转染的剪接变体的显性表达。

通过共培养(靶)细胞的pcna的过表达抑制了nk92-44-1细胞的ifnγ分泌，但是不抑制nk92-44-2和nk92-44-3细胞的ifnγ分泌(图1a)。发明人接下来探索了pcna受损的和pcna响应性nk功能表型是否可影响对于形成稳定裂解的免疫突触必要的细胞骨架重排。在每个nkp44剪接变体-转染的nk92细胞系中检查稳定裂解的免疫突触形成。将nk92wt(亲本)、nk92-44-1、nk92-44-2和nk92-44-3(效应)细胞与表达单独cfp或cfp-pcna融合蛋白的hela细胞共温育，并且评估在免疫突触处f-肌动蛋白的相对积聚(图1b、c)。令人吃惊地发现，nkp44-1剪接变体的过表达导致在nk92-44-1细胞与pcna过表达靶细胞的相互作用中免疫突触处f-肌动蛋白积聚的相对量显著的降低(-22.6％±3.9％)(图1c)。相反，与对照wtnk92效应细胞比较，剪接变体2和3-转染的nk92细胞未显示f-肌动蛋白积聚的显著的降低(分别+6.9％和+4.6％)(图1c)。

为了进一步测试在初级nk细胞中的该发现，将人nk细胞从外周血单核细胞(pbmc)中分离并且在存在il-2或il-15的情况下培养6天。的确，通过流式细胞术，在静息cd3-/cd56+/cd16+和cd3-/cd56+/cd16-初级nk细胞的表面上未检测到nkp44，但是在存在il-2或il-15的情况下上调了nkp44(图2a)。总nkp44mrna的qpcr分析揭示了与nkp44蛋白质表面表达类似的结果。当通过qpcr进一步检查nkp44剪接变体的分化表达时，nkp44-1和nkp44-3都明显被上调，但是nkp44-2表达仍然低。然而，nkp44-1剪接变体与nkp44-3相比，被更高度上调(图2b)。

在pcna过表达系统模型中，与对照hela细胞相比，il-2激活的初级nk细胞展现出对于pcna-过表达的hela靶细胞更低的裂解活性(图2c，helagfp对helagfppcna)。对于il-15培养的初级nk细胞，也观察到相同的功能结果(图2d，helagfp对helagfppcna)。两种现象与用il-2或il-15培养初级nk之后，nkp44-1剪接变体表达显性相关(图2b)。这些发现指示导致癌症靶细胞的抑制裂解的初级nk细胞的受损的功能表型可与nkp44-1显性表达相关。

实施例1显示了nkp44-1的高表达与外周nk细胞的受损的功能表型相关，指示nkp44-1作为免疫检查点的作用。

实施例2

急性髓细胞白血病(aml)中nkp44-1曲线的差的存活

为了进一步探索nkp44-1在癌状态中的生理学作用，对于从保藏在癌症基因组图谱(tcga)中的aml患者的外周血液样品获得的rna-seq数据进行回顾性分析。通过首先使用nk细胞-特异性受体，nkp46(即总nkp46)的表达，过滤用于存在nk细胞的外周血液样品，分析具有rna-seq数据的173个外周血液样品。173个病例中的164为nkp46阳性并且被选自用于进一步分析。从164个nkp46阳性病例中，31％的为nkp44阳性(即总nkp44；图3a)。

其后，通过比较nkp46+nkp44+和nkp46+nkp44-组，检查nkp44表达对aml患者的存活的贡献。仅仅60例的nkp46+nkp44-和36例的nkp46+nkp44+具有保藏在tcga中的“死亡日”数据。没有发现nkp46+nkp44+和nkp46+nkp44-病例组中的百分数存活之间的区别(图3b)。

为了进一步研究nkp44在aml相关的发病率中的作用，分析nkp44同等型的表达，因为ncr2mrna可剪接成三个不同的剪接变体：nkp44-1、-2和-3。

nkp44剪接变体在nkp46+nkp44+样品中的基于相对rnaseq的表达详述在图3c中。个体aml患者证实了广谱的nkp44剪接变体表达，范围为单个nkp44剪接变体表达至混合剪接变体表达曲线。几乎三分之二的nkp46+nkp44+病例仅仅表达nkp44-1剪接变体(图3d)。因此，nkp46+nkp44-1+-仅仅视为具有nkp44-1曲线的样品，而nkp44-2/3曲线限定为包括所有其他nkp46+样品，无论它们是否单独表达nkp44-2或nkp44-3，或连同表达nkp44-1。nkp46+nkp44-样品定义为具有nkp44阴性曲线。

图3e显示了nkp44-1曲线组的存活明显低于nkp44阴性和nkp44-2/3曲线组。为了更好地表征nkp44-1表达水平和aml患者的存活的相关性，将nkp44-1曲线进一步分成nkp44-1高(表达的上半部)和nkp44-1低(表达的下半部)曲线。发明人接着绘制nkp44-1高、nkp44-1低、nkp44-2/3和nkp44阴性曲线的aml病例的百分数存活。nkp44-1低、nkp44-2/3和nkp44阴性曲线的百分数存活未显著不同。然而，携带nkp44-1高曲线的患者组证实了显著更低的存活率(图3f)。

实施例2显示nkp44-1曲线指示诊断患有aml的患者差的存活。

实施例3

用抗pcnamab操纵基于ncr2的免疫检查点

产生能够抑制nkp44/ncr2与pcna结合的抗pcnamab，以尝试阻断基于ncr2-同等型1的免疫检查点。用重组体pcna免疫小鼠，将脾细胞与骨髓瘤对应物融合，并且然后筛选结合pcna阳性并抑制nkp44与pcna的结合的菌落。

仅有两个克隆能够阻断nkp44-pcna相互作用：13.10(30％阻断)和14.25(55％阻断，图4a)。阻断效力与这些mab在暴露于肿瘤细胞后增强nk功能的能力直接相关(图4b、c)。注意，nk细胞用抗-nkp44(不阻断nkp44-pcna相互作用)或用抗-nkp30预激活。在两种情况下，以1：2的et比添加几种癌细胞系(例如hela)抑制nk功能。添加这些抗pcnamab将nk功能增强至高于初级刺激的水平(图4b、c)。这表明靶癌细胞具有抑制性激活信号，并且如果抑制信号(例如pcna)被阻断，则癌细胞介导的nk激活信号有助于nk功能。

实施例4

测序抗pcna单克隆抗体的轻链和重链

使用tri试剂(sigmacat.t9424,lot.bcbq3717v)从杂交瘤细胞沉淀中提取rna。在通过琼脂糖凝胶电泳可视化提取的rna完整性后，使用具有随机引物和oligodt的superscript第一链合成系统(invitrogencat.11904-018,lot.1404272)将rna用于cdna制备。使用分别靶向恒定区和可变区的引物通过pcr反应从编码区扩增重链。使用靶向可变区的n末端序列的简并正向引物和靶向相应恒定区的反向引物，通过pcr反应从编码区扩增轻链(图5a-b)。通过琼脂糖凝胶电泳可视化pcr产物，并且从凝胶中提取相应的条带并进行测序分析。使用bigdyev1.1chemistry，根据sop11-001在abi3730x1遗传分析仪上进行测序，并产生测序文件(ab1和seq)。当通过pcr反应未获得条带时，设计新引物以扩增重链和轻链的相关区域，并如上所述测序。使用imgt数据库和/或expasy工具分析重链和轻链的dna序列以产生相应的蛋白质序列。

具体实施方式的前述描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，通过应用当前知识，其他人可容易地修改和/或改编对这些具体实施方式的各种应用，而无需过度实验且不背离一般概念，并且因此在所公开的实施方式的等同物的含义和范围内应当理解这些改编和修改。应该理解，本文采用的措辞或术语是出于描述的目的而非限制性的。用于执行各种公开的功能的装置、材料和步骤可以采用各种替代形式而不背离本发明。

实施例5

产生针对膜pcna的特异性单克隆抗体

杂交瘤技术被用于产生针对膜pcna的特异性单克隆抗体。根据(图6a)中显示的示意图，用cfa中的his-pcna(人)以及ifa进行5只c57bl6小鼠的免疫。在免疫计划期间，在第43天，从每只小鼠检查抗pcna多克隆抗体的血清滴度，并根据它们的血清抗体的最高滴度选择其中两种。然后从这两只小鼠收获脾细胞并与sp2/0细胞融合以产生杂交瘤(图6a)。为了筛选感兴趣的抗体，采用两种方法，一种是在elisa中抑制nkp44受体与mbp-pcna的结合，和第二种是通过facs识别癌细胞表面pcna。从总共384个pcna阳性杂交瘤中，命名为14-25-9的克隆(简写为，14-25-2-9)显示出两种筛选的阳性结果(图1b-c)。使用相同的方法产生第二种单克隆抗体13-10-1，显示出与pcna相当的结合能力(图18和19)。

实施例6

表征14-25-9mab的pcna的结合能力

与无关蛋白his-dj1(图7a-b)相比，elisa和蛋白质印迹用于显示14-25-9mab与重组his和mbp标记的pcna的显著结合。通过蛋白质印迹识别来自几种癌细胞系的内源性pcna显示14-25-9与商业抗pcnamab(克隆pc10)类似地结合(图8a)。使用proteon测定14-25-9对pcna的结合亲和力，并且发现kd值为3.54e^-08m(图8b)。在14-25-9或pc10与嵌合nkp44受体ig的共温育中，仅14-25-9显示nkp44受体ig与pcna结合的强烈抑制(图7c)。14-25-9的抑制是剂量依赖性的，10μg/ml显示出最高的抑制。

实施例7

通过14-25-9mab的细胞表面pcna识别

进行下述实验，以检测14-25-9mab特异性识别细胞表面pcna的能力。数个肿瘤细胞系例如，k562在facs中的表面染色显示14-25-9识别的细胞表面pcna，其中商业克隆pc10几乎不显示表面染色(图9)。当在'imagestream'实验中检查pcna的细胞内分布时，发明人观察到14-25-9主要识别细胞质pcna而pc10识别hela细胞的核pcna(图10)。

实施例8

14-25-9mab识别来自癌组织的非核pcna，但是不识别来自患者匹配的非癌组织的非核pcna

mab14-25-9也显示结合来自癌症患者的福尔马林-固定链烷烃包埋的(ffpe)人活组织切片样品中的非核(细胞质-膜)pcna。相反，pc10显示主要结合那些样品中的核pcna。注意到，在来自相同患者的相同组织的匹配的非癌样品中，14-25-9未显示染色，而pc10在较小程度上染色核pcna。对于人舌头和头颈癌(图11)和肾和乳腺癌(图12)，使用来自ffpe阻断的切片的荧光免疫组织化学观察到该结果。

实施例9

14-25-9mab对人nk细胞作用于癌细胞的能力的影响

为了测试14-25-9mab激活人nk细胞的能力，进行下述实验。在存在14-25-9或igg1(作为对照)的情况下，将新鲜分离的人nk细胞与来自实体瘤和白血病的不同的癌细胞系(hela、du145、721.221和k562)共温育，过夜。与14-25-9温育的nk细胞与小鼠igg1相比，显示出ifn-γ释放的增加(图13a)。当与主要721.221cw6以1:3的效应子和靶比例相互作用时，抗pcnamab14-25-9也显示出能够改善新鲜初级人nk细胞的裂解活性(图13b)。

实施例10

14-25-9对于激活针对抗肿瘤的nk细胞的体内作用

对于体内验证14-25-9的活性，使用免疫低下nod/scid小鼠。使患者衍生的异种移植物(pdx)在那些小鼠中生长并且同时患者的自体cd56+nk细胞在培养物中体外生长。当pdx可测量时，进行肿瘤内注射自体nk并且同时经尾静脉注射14-25-9(图14)。注射的人nk细胞包含两种cd56^中等和cd56^高细胞(如预期的)并且为nkp44^阳性(图15)。6小时之后，收获pdx，从设门的cd56^阳性人nk细胞分析溶解和人cd107a表达(图16中的实施例)。通过至尾静脉的14-25-9接种激活pdx中的人nk细胞，可通过与未处理的小鼠比较，看到cd107a表达的增加(图17)。

尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，显然，许多可选方案、修饰和变型对于本领域技术人员是显而易见的。因此，旨在涵盖落在所附的权利要求的精神和宽范围内的所有这种可选方案、修饰和变型。

序列表

<110>国家生物技术研究所公司

<120>抗pcna单克隆抗体及其用途

<130>nibn-p-18-pc

<150>us62/434,532

<151>2016-12-15

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<220>

<223>合成

<400>19

alalysthrthrtyrproproservaltyrproleualaproglyser

151015

alaalaglnthrasnsermetvalthrleuglycysleuvallysgly

202530

tyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasnserglyserleuser

354045

serglyvalhisthrpheproalavalleuglnseraspleutyrthr

505560

leuserserservalthrvalproserserthrtrpprosergluthr

65707580

valthrcysasnvalalahisproalaserserthrlysvalasplys

859095

lysilevalproargaspcysglycyslysprocysilecysthrval

100105110

progluvalserservalpheilepheproprolysprolysaspval

115120125

leuthrilethrleuthrprolysvalthrcysvalvalvalaspile

130135140

serlysaspaspprogluvalglnphesertrpphevalaspaspval

145150155160

gluvalhisthralaglnthrglnproargglugluglnpheasnser

165170175

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180185190

asnglylysgluphelyscysargvalasnseralaalapheproala

195200205

proileglulysthrileserlysthrlysglyargprolysalapro

210215220

glnvaltyrthrileproproprolysgluglnmetalalysasplys

225230235240

valserleuthrcysmetilethraspphepheprogluaspilethr

245250255

valglutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyrlysasnthr

260265270

glnproilemetaspthraspglysertyrphevaltyrserlysleu

275280285

asnvalglnlysserasntrpglualaglyasnthrphethrcysser

290295300

valleuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulysserleuser

305310315320

hisserproglylys

325

<210>20

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>20

argalaaspalaalaprothrvalserilepheproproserserglu

151015

glnleuthrserglyglyalaservalvalcyspheleuasnasnphe

202530

tyrprolysaspileasnvallystrplysileaspglysergluarg

354045

glnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspserlysaspser

505560

thrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlysaspglutyrglu

65707580

arghisasnsertyrthrcysglualathrhislysthrserthrser

859095

proilevallysserpheasnargasnglucys

100105

<210>21

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>21

iletyralametasn

15

<210>22

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>22

glypheserpheasniletyralametasn

1510

<210>23

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

<400>23

argileargserlysserasnasntyralathrtyrtyralaaspser

151015

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<210>24

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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15

<210>25

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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valtyralaphesersersertrpmetasn

1510

<210>26

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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argiletyrproalaaspglyaspthrasntyrasnglyasnphearg

151015

gly

<210>27

<211>322

<212>dna

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<220>

<223>合成

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tgaagacttggcagagtatttctgtcagcaatataacagctatccgtacacgttcggagg300

ggggaccaagctggaaataaaa322

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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ggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaag120

tggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggac180

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cgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaag300

agcttcaacaggaatgagtgttaga325

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<211>312

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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<210>30

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成

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<210>31

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<220>

<223>合成

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<212>dna

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<220>

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<210>33

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<212>dna

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<220>

<223>合成

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<213>人工序列

<220>

<223>合成

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gtgcacacagctcagacgaaaccccgggaggagcagatcaacagcactttccgttcagtc540

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aaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtc720

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<210>35

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<400>35

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151015

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202530

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354045

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argproseraspasnservalserlysservalargphetyrleuval

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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275