嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途的制作方法

背景技术：
：被称为酸脱羧酶类型的蛋白质是一组催化碱性氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸)的脱羧酶反应以产生多胺作为许多微生物中酸应激反应的一部分的酶。大肠杆菌(escherichiacoli)具有一些磷酸吡哆醛-依赖性(plp)-依赖性)酸脱羧酶：cada、ldcc、adia、spea、spec、spef、gada和gadb。所有这些酶在窄ph范围内起作用，并且酶活性在该ph范围之外显著降低(kanjeeetal.,biochemistry50,9388-9398,2011)。先前已经观察到这些plp依赖性脱羧酶二聚化以形成完整的活性位点。在某些情况下，例如cada，二聚体形成十聚体，该十聚体聚集成最佳功能所需的较高分子量蛋白质复合物。抑制较高分子量的蛋白质复合物形成(例如，在最佳ph之外的条件下)导致功能的显著降低(kanjeeetal.,theembojournal30,931-944,2011)。催化赖氨酸转化为尸胺的plp依赖性脱羧酶被称为赖氨酸脱羧酶(例如，cada、ldcc及其同源物)。赖氨酸脱羧酶是特别令人感兴趣的，因为尸胺可以是用于生产各种产物，例如1,5-五亚甲基二异氰酸酯或聚酰胺56的平台化学品。然而，尸胺的产生对宿主细胞有害，因为当尸胺的存在高于一定浓度时，其已被证明对细胞有毒性(qianetal.,biotechnol.bioeng.108,93-103,2011)。因此，在赖氨酸存在下，赖氨酸脱羧酶活性的控制是尸胺以高于宿主细胞可以耐受的浓度过量产生的重要因素。控制对细胞有毒的酶活性的现有技术方法通常涉及使用诱导型启动子来控制编码酶的基因的表达。理想的诱导型启动子系统在不存在诱导物的情况下不表现出基因表达(因此没有酶产生和活性)，并且仅在添加诱导物后才开启基因表达。这种诱导型控制提供了一种将细胞生长期与产生活性对细胞有害的酶分离的过程。细胞完成其生长期后产生有害酶降低了对细胞的毒性作用，因为大多数毒性作用主要抑制细胞生长并且对细胞功能的影响较小。在一些情况下，诱导型启动子具有渗漏(leaky)表达，这意味着即使在不存在诱导物的情况下也存在少量表达。如果细胞对酶的毒性作用极其敏感，则渗漏表达是一个问题。例如，已知某些启动子系统，例如pbad，具有极低的渗漏表达，并且通常用于产生毒性基因(qiuetal.,appl.environ.microbiol.74,7422-7426,2008)。另一种常用的具有低渗漏表达的诱导系统是温度调节的启动子系统，例如pl或pr，其通过温度的相对升高或降低引起基因表达(valdez-cruzetal.,microbialcellfactories9:18,2010；qoronflehetal.,j.bacteriol.174,7902-7909,1992)。只要系统的温度受到严格控制，温度控制的诱导系统也可以具有低渗漏表达。虽然先前的研究集中于控制基因表达以控制毒性酶的活性，但是几乎没有关于直接控制毒性酶的活性的工作，因此即使在其底物存在下其存在也不会影响细胞生长。技术实现要素：本发明部分地基于提供直接控制毒性酶活性的方法，因此即使当酶在其转化为有毒产物的底物存在下产生时也会降低毒性。本文所述的在其底物存在下直接控制酶的活性的组合物和方法也可以避免与启动子的渗漏表达相关的问题。此外，本公开的控制系统允许在生长期间正常进行蛋白质生产。来自大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶cada和ldcc是嗜温酶。因此，当温度超出大肠杆菌生长的最佳温度范围(25℃至55℃)时，酶的稳定性和活性显著降低(lemmonieretal.,microbiology144,751-760,1998)。本公开提供产生赖氨酸并经遗传修饰以表达赖氨酸脱羧酶蛋白质的嗜温微生物(例如，大肠杆菌(e.coli)、谷氨酸棒杆菌(c.glutamicum))，该赖氨酸脱羧酶蛋白质在温度高于55℃时具有最大活性，或在温度低于20℃时具有最大活性，从而提供赖氨酸脱羧酶活性，该活性在与嗜温微生物的生长温度不同的温度最大，从而降低酶活性对生长的毒性副作用。在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰以表达来自嗜冷生物(psychrophile)的赖氨酸脱羧酶的酶的赖氨酸生产嗜温微生物(例如，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌)，该嗜冷生物是一种在20℃以下发挥最佳功能的微生物。嗜冷生物的实例包括carnobacteriumpleistocenium、trichococcuspatagoniensis，以及假单胞菌属(pseudomonas)、沙门菌属(salmonella)、大肠杆菌属(coliforms)、弧菌属(vibrio)和李斯特菌属(listeria)的某些物种。在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰以表达来自嗜热生物(thermophile)的赖氨酸脱羧酶的酶的赖氨酸生产嗜温微生物(例如，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌)，该嗜热生物是一种在55℃以上发挥最佳功能的微生物。嗜热生物的实例包括aeropyrumpernix、caldococcuslitoralis；土芽孢杆菌属(geobacillus)、gracilibacillus属、tepidanaerobacter属、thermosynechoccus属和thermomicrobium属的某些物种；以及产水菌目(aquificales)、热袍菌目(thermotogales)、硫化叶菌目(sulfolobales)、热变形菌目(thermoproteales)、脱硫球菌目(desulfurococcales)、pyrodictiales目、热球菌目(thermococcales)、古球菌目(archaeoglobales)、methanococales目、甲烷杆菌目(methanobacteriales)和甲烷火菌目(methanopyrales)的某些物种。在一些实施方案中，本公开提供了经遗传修饰以表达嗜温酶(例如来自大肠杆菌的cada或ldcc)，或相应的嗜温赖氨酸脱羧酶(例如来自克雷伯菌属(klebsiella)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)或肠炎沙门菌亚属(salmonellaenterica)的cada)的嗜热赖氨酸生产微生物。来自其他嗜温物种的其他cada多肽包括沙雷菌属物种(serratiasp.),wp033635725.1；和raoultellaornithinolytica，yp007874766.1。在一些实施方案中，可以对嗜热宿主细胞进行遗传修饰以表达嗜冷赖氨酸脱羧酶的酶。一旦赖氨酸产生在经修饰以表达嗜温赖氨酸脱羧酶的嗜热宿主中完成，可将温度调节至20℃至55℃之间以启动赖氨酸脱羧酶活性。在其中嗜热宿主被修饰以表达嗜冷赖氨酸脱羧酶的实施方案中，一旦赖氨酸产生完成，可将温度调节至低于约20℃以增加赖氨酸脱羧酶活性。类似地，在其中嗜冷生物是赖氨酸生产宿主的本公开的实施方案中，然后可以使用嗜温酶例如大肠杆菌cada或ldcc或来自另一种嗜温宿主细胞的相应酶作为针对赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质开关(switch)。在嗜冷生物最佳生长所需的低温下(<20℃)，嗜温酶在产生赖氨酸时具有低活性。一旦赖氨酸生产完成，温度便可以改变到20℃至55℃之间的温度，以启动赖氨酸脱羧酶活性。类似地，也可以使用嗜冷宿主中的嗜热酶，其中生长在低于20℃发生，并且催化在高于55℃的温度进行。在另一方面，本发明提供经遗传修饰以表达来自嗜热生物的赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶来自tepidanaerobactersyntrophicus、geobacilluskaustophilus、thermosynechoccuselongatus、或thermomicrobiumroseum。在典型的实施方案中，宿主细胞也经遗传修饰以过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，嗜温宿主细胞是细菌。例如，在一些实施方案中，宿主细胞来自埃希氏菌属(escherichia)、哈夫尼菌属(hafnia)、或棒杆菌属(corynebacteria)。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞是大肠杆菌(escherichiacoli)。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。在再一方面，可以使用根据本发明修饰的宿主细胞的培养物来生产尸胺。因此，在一些方面，该方法包括培养嗜温宿主细胞，其可产生赖氨酸并经遗传修饰以在约20℃至约50℃(例如，约25℃至约42℃)之间的温度表达嗜热赖氨酸脱羧酶，持续足以产生赖氨酸的一段时间；然后孵育宿主细胞，并且温度高于约50℃(例如高于约55℃但低于约110℃)。在一些实施方案中，温度为约55℃至约90℃。在典型的实施方案中，在细胞在较低温度(例如，约20℃至约50℃；或约25℃至约42℃)完成对数生长并进入稳定期之后发生从赖氨酸生产阶段到尸胺生产阶段的转变(即，表征尸胺生产阶段相对于赖氨酸生产阶段的温度升高)。在一些实施方案中，在温度从较低温度向较高温度的转变下，通过发酵中剩余的葡萄糖的量测定嗜热赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，为了使生产率最大化，在葡萄糖转化为赖氨酸之后发生向更高温度的转变。在一个方面，本发明因此提供产生赖氨酸并经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶并过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽的嗜温微生物宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰以包含编码一种或多种赖氨酸生物合成多肽的合成操纵子多核苷酸。在一些实施方案中，修饰宿主细胞以过表达至少六种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，宿主细胞经遗传修饰以包含两种或更多种合成操纵子，所述合成操纵子包含编码至少六种赖氨酸生物合成多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，与未经遗传修饰以表达外源多核苷酸的对应宿主细胞相比，宿主细胞经遗传修饰以表达外源链霉菌属(streptomyces)lysc、大肠杆菌dapab、lysa、asd、aspc和teta多核苷酸以增加赖氨酸的表达。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与seqidno：1-4中的任一个具有至少70％的氨基酸序列相同性，或至少80％、至少85％、或至少90％的序列相同性。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与seqidno：1-4中的任一个具有至少95％的氨基酸序列相同性。在其他实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶包含seqidno：1-4中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，嗜温微生物宿主细胞是细菌。在一些实施方案中，宿主细胞来自埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒杆菌属。在示例性实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌。另一方面，本发明提供一种生产尸胺的方法，该方法包括：(a)在约20℃至约50℃的温度培养如前段所述的嗜温微生物宿主细胞，持续一段足以积累赖氨酸的时间；(b)在步骤(a)之后，在高于约55℃且低于约110℃的温度孵育(a)的培养物。在一些实施方案中，在约25℃至约45℃的温度进行步骤(a)。在其他实施方案中，在约30℃至约40℃的温度进行步骤(a)。在进一步的实施方案中，在约35℃至约39℃的温度进行步骤(a)。在一些实施方案中，在约55℃至约90℃的温度进行步骤(b)。在其他的实施方案中，在约60℃至约75℃的温度进行步骤(b)。在进一步的实施方案中，在约60℃至约70℃的温度进行步骤(b)。另一方面，本发明提供了一种生产尸胺的方法，该方法包括在高于约55℃且低于约110℃的温度在体外反应中将含赖氨酸组合物与嗜热赖氨酸脱羧酶孵育。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶由嗜温微生物表达。在一些实施方案中，将嗜热赖氨酸脱羧酶固定在固体支持物上。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与seqidno：1-4中的任一个具有至少70％的氨基酸序列相同性，或至少80％、至少85％、或至少90％的序列相同性。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶与seqidno：1-4中的任一个具有至少95％的氨基酸序列相同性。在其他实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶包含seqidno：1-4中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，温度高于约55℃且低于约90℃。在其他实施方案中，温度为约60℃至约75℃。在进一步的实施方案中，温度为约60℃至约70℃。附图说明图1显示了大肠杆菌ldcc和cada多肽序列与来自tepidanaerobactersyntrophicus(seqidno：1，由genbankidgaq24853.1编码)、geobacilluskaustophilus(seqidno：2，由genbankidbad75350.1编码)、thermosynechoccuselongatus(seqidno：3，由genbankidbac09418.1编码)和thermomicrobiumroseum(seqidno：4，由genbankidacm05730.1编码)的赖氨酸脱羧酶多肽序列的clustalo(1.2.4)多重序列比对。具体实施方式在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以进行改变。还应该理解此处使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，而并非进行限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物和登录号均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。术语如在本公开的上下文中所使用的，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”是指来自嗜热生物的催化l-赖氨酸的脱羧以产生尸胺的plp依赖性赖氨酸脱羧酶。嗜热赖氨酸脱羧酶在高于约55℃时发挥最佳功能。有助于热稳定性的结构机制描述于，例如vieille&zeikusmicrobiologyandmolecularbiologyreviews,65(1),p.1-43,2001中。嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的特征结构域包括吡哆醛5'-磷酸结合袋和保守结构域：okr_dc_1_c(orn/lys/arg脱羧酶、c-末端结构域；pfam03711；超家族cl27246)。这些酶是本领域已知的。示例性的嗜热赖氨酸脱羧酶包括tepidanaerobactersyntrophicus赖氨酸脱羧酶(genbank登录号gaq24853)、geobacilluskaustophilus赖氨酸脱羧酶(genbank登录号bad75350)、thermosynechoccuselongatus赖氨酸脱羧酶(genbank登录号bac09418)；thermomicrobiumroseum赖氨酸脱羧酶(genbank登录号acm05730)；geobacilluskaustophilis赖氨酸脱羧酶(genbank登录号bad74308)；gracilibacillushalophiles赖氨酸脱羧酶(genbank登录号enh96106)；geobacillusthermoleovorans赖氨酸脱羧酶(genbank登录号aev18557)；ruminiclostridiumthermocellus赖氨酸脱羧酶(genbank登录号adu75593)；caldicellulosiruptorobsidians赖氨酸脱羧酶(genbank登录号adl43096)；parageobacillusgenomesp.1赖氨酸脱羧酶(genbank登录号ezp77891)；和anoxybacillusflavithermus赖氨酸脱羧酶(genbank登录号emt45272)。在一些实施方案中，嗜热赖氨酸脱羧酶来自tepidanaerobactersyntrophicus、geobacilluskaustophilus、thermosynechoccuselongatus或thermomicrobiumroseum；或这种赖氨酸脱羧酶的酶的生物活性变体。生物活性变体包括多肽的等位基因、片段和种间同源物。示例性的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列包括来自以下的赖氨酸脱羧酶：tepidanaerobactersyntrophicus(seqidno：1，由genbankidgaq24853.1编码)、geobacilluskaustophilus(seqidno：2，由genbankidbad75350.1编码)、thermosynechoccuselongatus(seqidno：3，由genbankidbac09418.1编码)和thermomicrobiumroseum(seqidno：4，由genbankidacm05730.1编码)。在一些实施方案中，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”在至少约200、300、或400或更多氨基酸的区域上与天然存在的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列具有至少60％的氨基酸序列相同性，通常至少65％、70％、75％、80％、85％、90％的相同性；常常至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”在序列的长度上与天然存在的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列具有至少90％的相同性；常常至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，“嗜热赖氨酸脱羧酶多肽”在seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4的多肽的长度上具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％，94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。如本文所用的“嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸”是指编码如前段中所述的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸。编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的核酸或多核苷酸是指基因、前mrna、mrna等，包括编码变体、等位基因和片段的核酸。编码seqidno：1、2、3和4的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列的示例性核酸序列分别在seqidno：5、6、7和8中提供。如本文所用，在产生氨基酸衍生物(例如，尸胺)的背景下，术语“增强的”或“改进的”是指与未经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的相同菌株的对照对应微生物相比，由遗传修饰的嗜温微生物产生的氨基酸衍生物的产生增加，该微生物经修饰以在约50℃但低于约110℃的温度表达如本文所述的嗜热赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，对照对应微生物属于相同菌株，但与经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的菌株相比，其经修饰以过表达嗜温赖氨酸脱羧酶。在一个实施方案中，与对照相比，由遗传修饰的微生物产生的氨基酸衍生物(例如，尸胺)改进了至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、200％或更多。可以通过在相同条件下通过测量由经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞和对照细胞的氨基酸衍生物(例如，尸胺)的产生来评估生产的增加，所述相同的条件包括在约50℃和低于约110℃的温度孵育培养物或培养细胞的提取物，例如，持续至少一小时，例如2、3、4、5或6小时的一段时间。举例来说，在一些实施方案中，相比于经修饰以表达嗜温赖氨酸脱羧酶的相同菌株的对照细胞，通过在嗜温条件下(例如，在30°至40℃)培养经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞持续一段时间(例如，过夜，足以产生赖氨酸)，来测试氨基酸衍生物(例如，尸胺)的产生。然后裂解宿主细胞。将来自裂解细胞的上清液的等分试样在嗜热温度(例如，65℃)与赖氨酸-hcl和plp一起孵育4小时至终浓度为160g/l和0.1mm。然后可以测量和比较来自对照细胞和经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的细胞的细胞裂解物的尸胺生产。在实施例部分中提供了示例性测定。当在编号给定氨基酸或多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“参照...编号”，或“对应于”或“参照...确定”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比较时的特定参考序列的残基的编号。例如，变体嗜热赖氨酸脱羧酶多肽序列的位置在当变体多肽以最大比对与参考多肽序列比对时“对应于”参考多肽序列seqidno：1中的位置(或在seqidno：2、3、4或9的参考多肽序列的位置)。关于嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的术语“野生型”、“天然的”和“天然存在的”在本文中用于指具有天然存在的序列的嗜热赖氨酸脱羧酶蛋白质。术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且是指从5'至3'末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。用于本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，但在某些情况下，可以使用可具有替换骨架(包含例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或o-甲基亚磷酰胺键(参见eckstei，oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach,oxforduniversitypress))；带正电的骨架；非离子骨架和非核糖骨架的核酸类似物。核酸或多核苷酸还可包括允许聚合酶正确连读的修饰的核苷酸。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括核酸的有义链和反义链，以及单独的单链或双链体。如本领域技术人员所理解的，单链的描述也定义了互补链的序列；因此，本文描述的序列也提供序列的互补序列。除非另有说明，否则特定核酸序列也隐含地包括其变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。核酸可以是dna(基因组dna和cdna两者)、rna或杂交体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。在本公开的上下文中用于两种核酸或多肽的术语“基本上相同”是指与参考序列具有至少50％序列相同性的序列。百分比相同性可以是从50％到100％之间的任何整数。与使用本文所述程序的参考序列相比，一些实施方案包括至少：50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；优选使用标准参数进行blast，如下所述。如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列在如下所述进行最大对应比对时是相同的，则称两个核酸序列或多肽序列是“相同的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的情况中，术语“相同”或百分比“相同性”是指当在比较窗口进行最大对应比较和比对时(如使用以下序列比较算法或通过人工比对和目检所测量的)，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。对于序列比较，通常一条序列充当参考序列,测试序列与之比较。当利用序列比较算法时，将测试和参考序列都输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，也可指定替代参数。然后，依据程序参数，用序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分比序列相同性。一种可用于确定嗜热赖氨酸脱羧酶多肽是否与seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3或seqidno：4的任一个具有序列相同性的算法是blast算法，其描述于altschul等人，1990，j.mol.biol.215：403-10。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，网址ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。用于进行蛋白质序列比对的示例性软件包括clustalw2和blastp。对于氨基酸序列，blastp程序使用字大小(w)为3，期望阈值(e)为10和blosum62评分矩阵作为默认值(参见henikoff&henikoff，proc.natl.acad.sci.usa89：10915(1989))。在本公开中，通常使用默认参数的blastpalignsequence确定多肽序列相同性。如本文所用，“比较窗口”包括指选自以下的连续位置的任何一个数量的区段：20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在两个序列最佳比对后，可以将一个序列与相同数量连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列最佳比对可以例如通过smith&waterman，adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法进行，通过needleman&wunsch，mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法进行，通过pearson&lipman，proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444(1988)的检索相似性方法进行，通过这些算法的计算机化实现(wisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi中的gap，bestfit，fasta和tfasta)进行，或通过人工比对和目检进行。通常使用默认参数的blastp进行最佳比对。与参考序列基本上相同的核酸或蛋白质序列包括“保守修饰的变体”。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或实质相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，是指实质相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了所述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，可以修饰核酸中的每个密码子(除了aug，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在每个所述序列中。如本文所用的术语“多肽”包括指含有天然存在的氨基酸和氨基酸主链以及非天然存在的氨基酸和氨基酸类似物的多肽。关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到在编码序列中改变单个氨基酸或少量氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列中的各个取代是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致一个氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。以这种方式定义的氨基酸基团的实例可包括：“带电荷/极性组”包括glu(谷氨酸或e)、asp(天冬氨酸或d)、asn(天冬酰胺或n)、gln(谷氨酰胺或q)、lys(赖氨酸或k)、arg(精氨酸或r)和his(组氨酸或h)；“芳香族或环状组”包括pro(脯氨酸或p)、phe(苯丙氨酸或f)、tyr(酪氨酸或y)和trp(色氨酸或w)；以及“脂肪族组”包括gly(甘氨酸或g)、ala(丙氨酸或a)、val(缬氨酸或v)、leu(亮氨酸或l)、ile(异亮氨酸或i)、met(甲硫氨酸或m)、ser(丝氨酸或s)、thr(苏氨酸或t)和cys(半胱氨酸或c)。在每组中，也可以鉴定亚组。例如，带电荷/极性氨基酸组可以细分为亚组，包括：包含lys、arg和his的“带正电荷亚组”；包含glu和asp的“带负电亚组”；和包含asn和gln的“极性亚组”。在另一个实例中，芳香族或环状组可以细分为亚组，包括：包含pro、his和trp的“氮环亚组”；和包含phe和tyr的“苯基亚组”。在另一个实例中，脂肪族组可以细分为亚组，包括：包含val、leu和ile的“大脂肪族非极性亚组”；包含met、ser、thr和cys的“脂肪族微极性亚组”；包含gly和ala的“小残基亚组”。保守突变的实例包括上述亚组内氨基酸的氨基酸取代，例如但不限于：arg取代lys，或反之亦然，使得可以保持正电荷；asp取代glu，或反之亦然，使得可以保持负电荷；thr取代ser，或反之亦然，使得可以保持游离的-oh；和asn取代gln，或反之亦然，使得可以保持游离的-nh2。以下六组各自含有氨基酸，其进一步提供彼此的示例性保守取代。1)ala、ser、thr；2)asp、glu；3)asn、gln；4)arg、lys；5)ile、leu、met、val；和6)phe、try和trp(参见例如creighton，proteins(1984))。在一些实施方案中，保守取代用于产生在谷氨酸残基以外的位点具有取代的cada变体。如本文所用，术语“启动子”是指能够驱动核酸序列在细胞中转录的多核苷酸序列。因此，在本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括顺式和反式作用转录控制元件和调节序列，其参与调节或调控基因转录的时间和/或速率。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、阻遏物结合序列等。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其他生物分子相互作用以进行(打开/关闭、调节、调控等)基因转录。大多数情况下，核心启动子序列位于翻译起始位点的1-2kb内，更常见的是在1kbp内，并且通常位于翻译起始位点的500bp或200bp或更少以内。按照惯例，通常以启动子序列控制的基因编码链上的序列提供启动子序列。在本申请中，启动子通常通过其天然调节表达的基因的名称来指代。用于本发明的表达构建体的启动子用基因名称指代。通过名称指代启动子包括野生型、天然启动子，以及保留诱导表达能力的启动子的变体。通过名称指代启动子不限于特定物种，还包括来自其他物种中相应基因的启动子。本发明中的“组成型启动子”是指能够在细胞中的大多数条件下，例如在不存在诱导分子的情况下启动转录的启动子。“诱导型启动子”在诱导剂分子存在时启动转录。如果多核苷酸源自外来物种，或者如果多核苷酸来自相同物种但在其原始形式上进行修饰，则该多核苷酸对于生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，当称编码多肽序列的多核苷酸与异源启动子可操作地连接时，它意味着编码所述多肽的所述多核苷酸编码序列衍生自一个物种，而所述启动子序列衍生自另一个不同物种；或者，如果两者都衍生自相同物种，则所述编码序列不与所述启动子天然相关(例如是基因工程化的编码序列，例如来自相同物种中的不同基因，或来自不同物种的等位基因)。类似地，如果天然野生型宿主细胞不产生多肽，则该多肽对于该宿主细胞是“异源的”。术语“外源”通常是指不天然存在于野生型细胞或生物体中但通常通过分子生物学技术引入细胞(即工程化以产生重组微生物)的多核苷酸序列或多肽。“外源”多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。术语“内源”是指天然存在的多核苷酸序列或多肽，其可以在给定的野生型细胞或生物体中发现。在这方面，还应注意，即使生物体可包含给定多核苷酸序列或基因的内源拷贝，引入编码该序列的质粒或载体如过表达所编码蛋白质或以其他方式调节所编码蛋白质的表达代表了该基因或多核苷酸序列的“外源”拷贝。本文描述的任何通路、基因或酶可以利用或依赖“内源”序列，其可以一种或多种“外源”多核苷酸序列提供，或以两种提供。如本文所用的“重组核酸”或“重组多核苷酸”是指核酸聚合物，其中以下的至少一种是真实的：(a)核酸序列对于给定的宿主细胞是外源的(即在给定宿主细胞中并非天然发现的)；(b)该序列可以在给定的宿主细胞中天然存在，但是以非天然(例如大于预期)的量存在；或(c)核酸序列包含两个或更多个在自然界中彼此没有相同关系的子序列。例如，对于(c)情况，重组核酸序列可以具有来自无关基因的两个或更多个序列，其被排列以产生新的功能性核酸。术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如dna)区段之间的功能关系。通常，它指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调控dna或rna序列的转录，则所述启动子或增强子序列与所述dna或rna序列可操作地连接。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与所述转录序列是物理地邻近，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列如增强子不需要物理地邻近或不需要位于与其增强转录的编码序列非常接近的位置。术语“表达盒”或“dna构建体”或“表达构建体”是指核酸构建体，当其被引入宿主细胞时，分别导致rna或多肽的转录和/或翻译。在表达转基因的情况下，技术人员将认识到插入的多核苷酸序列不需要是相同的，但可以仅与衍生它的基因的序列基本上相同。如本文所解释的，这些基本上相同的变体在提及特定核酸序列时被特别涵盖。表达盒的一个实例是多核苷酸构建体，其包含编码与启动子(例如其天然启动子)可操作地连接的本发明多肽的多核苷酸序列，其中表达盒被引入异源微生物中。在一些实施方案中，表达盒包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸靶向微生物基因组中的位置，使得所述多核苷酸序列的表达由存在于所述微生物中的启动子驱动。在本发明中使用的术语“宿主细胞”是指微生物并且包括可以是或已经是本发明的任何(一或多个)重组载体或(一或多个)分离的多核苷酸的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的、或有意的突变和/或变化，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或在总dna互补序列上)。宿主细胞包括已经引入了本发明的重组载体或多核苷酸的细胞，所述引入包括通过转化、转染等。术语“分离的”是指基本上或实质上不含有在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”可以指与在其天然存在状态或基因组状态时在其侧翼的序列分离的多核苷酸，例如dna片段，其从通常与该片段相邻的序列取出，例如通过克隆到载体中。例如，如果将多核苷酸克隆到不是自然环境一部分的载体中，或者如果以与其天然存在状态不同的方式人工引入到细胞的基因组中，则认为多核苷酸是分离的。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等可以指不含细胞其他组分的多肽分子，即它与体内细胞物质不相关。本发明采用各种常规重组核酸技术。通常，下文描述的重组dna技术中的命名法和实验室程序是本领域通常采用的。可以获得许多提供进行重组dna操作指导的手册，例如sambrook&russell，molecularcloning，alaboratorymanual(3rded，2001)；和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人,johnwileyandsons,newyork,2009-2016)。本公开某些方面的概述在一个方面，本发明提供经修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的遗传修饰的嗜温宿主细胞。在一些实施方案中，seqidno：1、2、3或4的嗜热赖氨酸脱羧酶；或者如本文所述其中的部分。嗜热赖氨酸脱羧酶多肽嗜热赖氨酸脱羧酶是已知的，并且是如上所述的充分表征的脱羧酶家族的一部分。通过举例说明本发明，提供了来自四种具有非常不同的遗传背景的嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶多肽。四种示例性嗜热生物是tepidanaerobactersyntrophicus(genbankidgaq24853.1)、geobacilluskaustophilus(genbankidbad75350.1)、thermosynechoccuselongatus(genbankidbac09418.1)和thermomicrobiumroseum(genbankidacm05730.1)。由基因编码的多肽序列分别在seqidno：1、2、3和4中提供。来自这四种嗜热生物的赖氨酸脱羧酶的酶和来自大肠杆菌的cada和ldcc的蛋白质序列比对在蛋白质序列中显示微小的相似性(图1)。虽然大肠杆菌cada和ldcc具有69％的序列相同性，但四种嗜热赖氨酸脱羧酶、cada和ldcc之间的序列相同性范围为23.61％至38.44％。嗜热赖氨酸脱羧酶蛋白质序列也显著短于它们的嗜温对应物。示例性的嗜热赖氨酸脱羧酶长度为420至500个氨基酸，而嗜温赖氨酸脱羧酶长度超过700个氨基酸。尽管这六种蛋白质之间共享的总体序列相同性低且它们的大小不同，但仍存在保守结构域和结构基序。首先，在嗜温赖氨酸脱羧酶中发现的氨基酸位置367处的保守赖氨酸残基(用大肠杆菌cada多肽序列(seqidno：9)测定)是保守的。此外，对于结合嗜温酶中的plp重要的七个残基中的四个在四种嗜热酶：s364、h366、t398、s400中也是保守的。此外，对于结合plp(s221和t399)重要的七个氨基酸残基中的两个在嗜热酶的相应位置具有丝氨酸或苏氨酸。对于结合plp(t220)重要的七个氨基酸残基中的最后一个在嗜热酶中也具有丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。此外，对增强plp拉电子(electronwithdrawing)能力重要的三个残基中，有两个是保守的-d330和h245。虽然w333不是保守的，但是其被具有相似极性强度的氨基酸-嗜热多肽序列中的色氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸置换。因此，尽管嗜热和嗜温酶的大小存在显著差异，但在活性位点残基中存在高度保守性。对ppgpp抑制cada重要的氨基酸残基，例如r206、r558、r565和r568在嗜热酶中不是保守的，这表明嗜热对应物不受警报素(alarmone)ppgpp的抑制。在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含前段中描述的保守或半保守残基(seqidno：9的t220、s221、h245、d330、w333、s364、h366、k367、t398、t399和s400，其分别对应于seqidno：1的氨基酸a94、t95、h119、d199、q202、s226、h228、k229、t261、s262和s263)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在seqidno：1的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含上述保守或半保守残基(seqidno：9的t220、s221、h245、d330、w333、s364、h366、k367、t398、t399和s400，其分别对应于seqidno：2的氨基酸t90、s91、h115、d195、h198、s223、h225、k226、t258、t259和s260)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在seqidno：2的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含上述保守或半保守残基(seqidno：9的t220、s221、h245、d330、w333、s364、h366、k367、t398、t399和s400，其分别对应于seqidno：3的氨基酸a56、t57、h81、d161、h164、s189、h191、k192、t224、s225和s226)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在seqidno：3的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。在一些实施方案中，在根据本发明的嗜温宿主细胞中表达的变体嗜热赖氨酸脱羧酶包含上述保守或半保守残基(seqidno：9的t220、s221、h245、d330、w333、s364、h366、k367、t398、t399和s400，其分别对应于seqidno：4的氨基酸s92、t93、h117、d197、w200、s225、h227、k228、t260、t261和s262)，并在长度为400或更多个氨基酸的区域上，或在seqidno：4的多肽的长度上，具有至少60％的氨基酸序列相同性，常常至少65％、70％、75％、80％或85％的相同性；并且通常至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列相同性。编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的核酸可通过许多技术完成嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸序列的分离或生成。在一些实施方案中，寡核苷酸探针和基于本文公开的序列可用于鉴定来自所需细菌物种的cdna或基因组dna文库中的所需多核苷酸。为了生成嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的变体，可以使用合适的引物将所需的取代引入编码天然嗜热赖氨酸脱羧酶序列的多核苷酸序列中。用于鉴定嗜热微生物中的赖氨酸脱羧酶多核苷酸的合适的引物和探针可以通过比较本文提供的序列产生，或基于来自另一细菌的cada多核苷酸序列产生。有关pcr的一般综述，请参阅pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications.(innis,m,gelfand,d.,sninsky,j.andwhite,t.,eds.),academicpress,sandiego(1990)。示例性引物序列显示在实施例部分的引物表中。编码用于本公开的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的核酸序列包括通过使用示例性核酸序列(例如，seqidno：5-8中的任何一个的嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸序列)，通过技术例如杂交和/或序列分析鉴定和表征的基因和基因产物。在一些实施方案中，通过引入与seqidno：5-8中任一个的嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸具有至少60％相同性，或至少70％、75％、80％、85％或90％相同性，或95％相同性或更高的核酸序列来遗传修饰宿主细胞。编码根据本发明的嗜热赖氨酸脱羧酶的核酸序列可另外进行密码子优化以在所需的嗜温宿主细胞中表达。可以采用的方法和数据库是本领域已知的。例如，可以确定与单个基因、一组共同功能或起源的基因、高表达的基因中的密码子使用，整个生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率，相关生物体的聚集蛋白编码区密码子频率或其组合相关的优选密码子。参见例如henautanddanchin的"escherichiacoliandsalmonella,"neidhardt,etal.eds.,asmpres,washingtond.c.(1996),pp.2047-2066；nucleicacidsres.20:2111-2118；nakamuraetal.,2000,nucl.acidsres.28:292)。编码seqidno：1-4的多肽的示例性密码子优化的核酸序列分别在seqidno：5-8中提供。用作本发明中使用的嗜热生物赖氨酸脱羧酶序列来源的嗜热生物可以是任何嗜热微生物，包括但不限于嗜热生物aeropyrumpernix、caldococcuslitoralis；焦球菌属(pyrococcus)、土芽孢杆菌属(geobacillus)、gracilibacillus属、tepidanaerobacter属、thermosynechoccus属和thermomicrobium属的嗜热物种；以及产水菌目(aquificales)、热袍菌目(thermotogales)、硫化叶菌目(sulfolobales)、热变形菌目(thermoproteales)、脱硫球菌目(desulfurococcales)、pyrodictiales目、热球菌目(thermococcales)、古球菌目(archaeoglobales)、methanococales目、甲烷杆菌目(methanobacteriales)和甲烷火菌目(methanopyrales)的嗜热物种。重组载体的制备可以使用本领域熟知的方法制备用于表达嗜热赖氨酸脱羧酶蛋白质的重组载体。例如，编码嗜热赖氨酸脱羧酶的dna序列可以与转录和其他调节序列组合，所述调节序列将指导来自基因的序列在预期的嗜温宿主细胞(例如细菌细胞如蜂房哈夫尼菌、大肠杆菌、或谷氨酸棒杆菌)中的转录。在一些实施方案中，包含表达盒的表达载体还包含与编码多肽的核酸序列可操作地连接的启动子，其中该表达盒包含编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的基因。在其他实施方案中，指导编码赖氨酸脱羧酶多肽的嗜热赖氨酸脱羧酶多核苷酸的转录的启动子和/或其他调节元件对宿主细胞是内源的，并且例如通过同源重组引入包含该基因的表达盒，使得外源基因与内源启动子可操作地连接，并且表达由内源启动子驱动。如上所述，编码嗜热赖氨酸脱羧酶变体多肽的多核苷酸的表达可以许多调节序列(包括启动子，其可以是组成型或诱导型；并且，任选地，如果需要，可以包括阻遏物序列)控制。合适的启动子，特别是在细菌宿主细胞中的实例是从大肠杆菌lac操纵子获得的启动子，和衍生自参与其他糖(例如阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖和麦芽糖)代谢的基因的其他启动子。额外的实例包括启动子，例如trp启动子、bla启动子、噬菌体λpl、tet启动子和t5。另外，可以使用合成启动子，例如tac启动子(美国专利号4,551,433)。启动子的其他实例包括天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(daga)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyl)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amym)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)青霉素酶基因(penp)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因。ausubel和sambrook&russell(同上)中描述了合适的启动子。额外的启动子包括jensen&hammer,appl.environ.microbiol.64:82,1998；shimada,等人,j.bacteriol.186:7112,2004；和miksch等人,appl.microbiol.biotechnol.69:312,2005描述的启动子。表达载体还可以包含影响编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸表达的额外序列。此类序列包括增强子序列、核糖体结合位点或其他序列例如转录终止序列等。表达编码本发明的嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体(例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体)复制。载体可包含保证自我复制的任何方式。或者，载体可以是这样的载体，当其被引入宿主时，整合到基因组中并与其整合进的(一或多个)染色体一起复制。因此，表达载体可额外含有允许载体整合到宿主基因组中的(一或多个)元件。本发明的表达载体优选含有一个或多个选择标记，其允许容易地选择转化的宿主。例如，表达载体可以包含赋予重组宿主生物体(例如细菌细胞，如大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒杆菌)抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。尽管可以使用任何合适的表达载体掺入所需序列，但容易获得的细菌表达载体包括但不限于：质粒，例如psclo1、pbr322、pbbr1mcs-3、pur、pet、pex、pmr1oo、pcr4、pbad24、p15a、pacyc、puc，例如puc18或puc19，或衍生自这些质粒的质粒；和噬菌体，例如m13噬菌体和λ噬菌体。然而，本领域普通技术人员可以通过常规实验容易地确定任何特定表达载体是否适合于任何给定的宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主细胞中，然后监测载体中包含的序列的存活力和表达。可以使用任何数量熟知的方法将本发明的表达载体引入宿主细胞，包括基于氯化钙的方法、电穿孔或本领域已知的任何其他方法。宿主细胞本发明提供了经遗传修饰的嗜温宿主细胞，其被工程化以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽。相对于不具有一种额外遗传修饰的对照菌株(例如野生型菌株、或没有一种额外遗传修饰的相同菌株的细胞)，本发明的遗传修饰的嗜温宿主菌株通常包含至少一种额外的遗传修饰以增强氨基酸或氨基酸衍生物的产生。“增强氨基酸或氨基酸衍生物产生的额外的遗传修饰”可以是任何遗传修饰。在一些实施方案中，遗传修饰是引入表达参与氨基酸或氨基酸衍生物合成的酶的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含多种修饰，以相对于野生型宿主细胞增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生。在一些方面，嗜温宿主细胞用以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的遗传修饰与修饰宿主细胞以过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽一起进行。本文中使用的术语“过表达”是指与不具有遗传修饰的对应细胞(即没有修饰的相同菌株的细胞)中的多肽量相比较，遗传修饰的细胞(例如，引入了编码赖氨酸生物合成多肽的表达构建体的细胞)中赖氨酸生物合成多肽的量增加。表达水平的增加通常为与对应的未修饰细胞相比，至少5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。未修饰的细胞不需要表达多肽。因此，术语“过表达”还包括其中多肽在不天然表达该多肽的宿主细胞中表达的实施方案。可以通过任何数量的测定来评估多肽表达的增加，包括但不限于测量从编码多肽的基因转录的rna水平、多肽水平和/或多肽活性水平。在一些实施方案中，可以对宿主细胞进行遗传修饰以表达影响赖氨酸生物合成的一种或多种多肽。赖氨酸生物合成多肽的实例包括大肠杆菌基因suca、ppc、aspc、lysc、asd、dapa、dapb、dapd、argd、dape、dapf、lysa、ddh、pntab、cyoabe、gadab、ybje、gdha、glta、succ、gadc、acnb、pflb、thra、acea、aceb、gltb、acee、sdha、mure、spee、speg、puua、puup和ygjg，或来自其他生物体的相应基因。这些基因是本领域已知的(参见例如shah等人,j.med.sci.2:152-157,2002；anastassiadia,s.recentpatentsonbiotechnol.1:11-24,2007)。还参见kind等人,appl.microbiol.biotechnol.91:1287-1296,2011，其综述与尸胺产生有关的基因。编码赖氨酸生物合成多肽的示例性基因如下。在一些实施方案中，可以对宿主细胞进行遗传修饰以减弱或降低影响赖氨酸生物合成的一种或多种多肽的表达。此类多肽的实例包括大肠杆菌基因pck、pgi、dead、cite、mene、poxb、acea、aceb、acee、rpoc和thra，或来自其他生物体的相应基因。这些基因是本领域已知的(参见例如shah等人,j.med.sci.2:152-157,2002；anastassiadia,s.recentpatentsonbiotechnol.1:11-24,2007)。还参见kind等人,appl.microbiol.biotechnol.91:1287-1296,2011，其综述基因减弱以增加尸胺产成。编码多肽(其减弱增加赖氨酸生物合成)的示例性基因如下。编码赖氨酸生物合成多肽的核酸可与编码嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的多核苷酸一起引入宿主细胞中，例如，在单一表达载体上编码，或以多个表达载体同时引入。或者，可以在遗传修饰宿主细胞表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽之前或之后，对宿主细胞进行遗传修饰过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，经工程化以表达嗜热赖氨酸脱羧酶的嗜温宿主细胞经工程化以表达一种或多种包含编码用于赖氨酸产生的蛋白质的多种基因的赖氨酸合成操纵子。这些基因可以掺入多于一个的合成操纵子中，例如，每个操纵子可以包含约3kb的长度。因此，例如，示例性赖氨酸合成操纵子(i和ii)可包括六个基因，例如链霉菌属(streptomyces)lysc、大肠杆菌dapab、lysa、asd、aspc和teta核酸序列，其中每个操纵子包含三个基因。工程化以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的宿主细胞通常是细菌宿主细胞。在典型的实施方案中，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，细菌是肠细菌。在本发明的一些实施方案中，细菌是棒杆菌属(corynebacterium)、埃希氏菌属(escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)、发酵单胞菌属(zymomonas)、希瓦氏菌属(shewanella)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、肠杆菌属(enterobacter)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、cronobacter、欧文氏菌属(erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)、变形杆菌属(proteus)、哈夫尼菌属(hafnia)、耶尔森氏菌属(yersinia)、摩根氏菌属(morganella)、爱德华氏菌属(edwardsiella)或克雷伯氏菌属(klebsiella)分类学纲的物种。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属(shewanella)、哈夫尼菌属(hafnia)或棒杆菌属(corynebacterium)的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(escherichiacoli)。在一些实施方案中，宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)。在一些实施方案中，宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种(bacillussp.)，例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)；或另一芽孢杆菌属物种，例如嗜碱芽孢杆菌(bacillusalcalophilus)、b.amovovorans、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、b.caldolyticus、环状芽孢杆菌(b.circulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、热葡糖苷酶芽孢杆菌(b.thermoglucosidasius)、苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)或b.vulgatis。如本文所述，可以针对增加的赖氨酸或赖氨酸衍生物(例如尸胺)的产生筛选根据本发明修饰的宿主细胞。在一些实施方案中，可以从表达变体多肽的宿主细胞中回收嗜热赖氨酸脱羧酶多肽。在一些实施方案中，可以将回收的变体蛋白固定在固体基质或惰性材料上。产生赖氨酸衍生物的方法。如本文所用，术语“约”在用于修饰温度范围中的数值时表示该数值与该值的合理偏差(例如，在该范围中所述的值以下或以上1°或2°以内)在所述值或范围的预期含义内。经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的嗜温宿主细胞可用于产生赖氨酸或赖氨酸衍生物，例如，尸胺。为了产生尸胺，可以在适于允许多肽表达和编码用于产生赖氨酸的酶的基因表达的条件下培养如本文所述的经遗传修饰以表达嗜热赖氨酸脱羧酶多肽的宿主细胞。使嗜温宿主细胞产生赖氨酸的培养在适合于嗜温宿主细胞生长的温度进行。在一些实施方案中，在约20℃至约50℃的温度培养嗜温宿主细胞。在一些实施方案中，在约25℃至约45℃的温度培养宿主。在一些实施方案中，在约30℃至约42℃或约30℃至约40℃的温度培养嗜温宿主细胞。宿主细胞通常在适于产生赖氨酸的温度培养足够长的时间以使赖氨酸产生完成。在典型的实施方案中，允许细胞生长直至稳定期，此时可以监测培养基中葡萄糖的量。然后将培养物在所需时间(例如，当葡萄糖被最低限度检测时)转变到嗜热赖氨酸脱羧酶有活性的较高温度。如上所述，在适合于嗜温生物生长以产生赖氨酸的温度下培养遗传修饰的宿主细胞，然后在嗜热赖氨酸脱羧酶有活性的温度(例如，在高于约55℃但低于约110℃的温度)孵育宿主细胞。在一些实施方案中，在高于约55℃至约90℃的温度范围培养细胞。在一些实施方案中，在约60℃至约70℃的温度范围培养细胞。根据本发明修饰的嗜温宿主细胞在适于嗜温细胞生长的较低温度培养一段足以累积赖氨酸的时间，然后在适于支持由宿主细胞表达的嗜热赖氨酸脱羧酶活性的温度培养，该培养例如通过降低赖氨酸脱羧酶活性对细胞生长的毒副作用改善赖氨酸的产生。可以使用熟知的技术培养宿主细胞(参见例如实施例部分中提供的示例性条件)。在一些实施方案中，使用非盐(例如硫酸铵或氯化铵)的氮源(例如氨或尿素)培养宿主细胞。然后使用已知技术分离和纯化赖氨酸或赖氨酸衍生物。根据本发明生产的赖氨酸或赖氨酸衍生物例如尸胺，然后可以用于任何已知方法，例如生产聚酰胺。在一些实施方案中，可以使用化学催化剂，或通过使用酶和化学催化剂，将赖氨酸转化为己内酰胺。本发明将通过具体实施例被更详细地描述。提供以下实施例用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到各种非关键参数，其可以被改变或修改以产生基本相同的结果。实施例实施例1：构建编码cada的质粒载体。含有野生型大肠杆菌cada(seqidno：10)(其编码赖氨酸脱羧酶cada(seqidno：9))的质粒载体使用pcr引物cada-f和cada-r从大肠杆菌mg1655k12基因组dna中扩增，使用限制酶saci和xbai消化该质粒，并连接到puc18中以产生质粒pcib60。使用pcr引物cada-f2和cada-r2优化cada基因上游的5'序列以产生pcib71。使用引物cat-hindiii-f和cat-ndei-r扩增氯霉素抗性基因cat，并将其克隆到pcib71中的cada后以产生pcib128。实施例2：构建表达来自tepidanaerobactersyntrophicus的赖氨酸脱羧酶多肽的质粒载体。来自t.syntrophicus的赖氨酸脱羧酶(tsldc)的氨基酸序列获自ncbi(genbankidgaq24853.1)。编码tsldc的核酸经密码子优化(seqidno：5)用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(seqidno：1)。根据hooverdm&lubkowskij,nucleicacidsresearch30:10,2002进行密码子优化和dna组装。用pcr引物tsldc-saci-f和tsldc-xbai-r扩增合成的dna产物，用限制酶saci和xbai消化，并连接到puc18中。使用pcr引物tsldc-f和cada-r2优化tsldc基因上游的5'序列以产生质粒pcib370。实施例3：构建表达来自geobacilluskaustophilus的赖氨酸脱羧酶多肽的质粒载体。来自g.kaustophilus的赖氨酸脱羧酶(gkldc)的氨基酸序列获自ncbi(genbankidbad75350.1)。编码gkldc序列的核酸序列经密码子优化(seqidno：6)，用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(seqidno：2)。根据hooverdm&lubkowskij,nucleicacidsresearch30:10,2002进行密码子优化和dna组装。用pcr引物gkldc-saci-f和gkldc-xbai-r扩增合成的dna产物，用限制酶saci和xbai消化，并连接到puc18中。使用pcr引物gkldc-f和cada-r2优化gkldc基因上游的5'序列以产生质粒pcib371。实施例4：构建表达来自thermosynechoccuselongatus的赖氨酸脱羧酶多肽的质粒载体。来自t.elongatus的赖氨酸脱羧酶(teldc)的氨基酸序列获自ncbi(genbankidbac09418.1)。编码teldc序列的核酸序列经密码子优化(seqidno：7)用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(seqidno：3)。根据hooverdm&lubkowskij,nucleicacidsresearch30:10,2002进行密码子优化和dna组装。用pcr引物teldc-saci-f和teldc-xbai-r扩增合成的dna产物，用限制酶saci和xbai消化，并连接到puc18中。使用pcr引物teldc-f和cada-r2优化teldc基因上游的5'序列以产生质粒pcib372。实施例5：构建表达来自thermomicrobiumroseum的赖氨酸脱羧酶多肽的质粒载体。来自t.roseum的赖氨酸脱羧酶(trldc)的氨基酸序列获自ncbi(genbankidacm05730.1)。编码trldc的核酸序列经密码子优化(seqidno：8)，用于在大肠杆菌中异源表达蛋白质(seqidno：4)。根据hooverdm&lubkowskij,nucleicacidsresearch30:10,2002进行密码子优化和dna组装。用pcr引物trldc-saci-f和trldc-xbai-r扩增合成的dna产物，用限制酶saci和xbai消化，并连接到puc18中。使用pcr引物trldc-f和cada-r2优化trldc基因上游的5'序列以产生质粒pcib373。实施例6：在37℃和65℃赖氨酸脱羧酶活性的比较。用质粒pcib71、pcib370、pcib371、pcib372或pcib373转化大肠杆菌bl21。将来自每次转化的单个菌落在37℃的含有羧苄青霉素(100μg/ml)的100mllb培养基中生长过夜。第二天，用弗氏压碎器裂解每个样品。将裂解的样品离心，并将上清液与沉淀物分离，以进行体外实验。将来自每个样品的等量酶在37℃或65℃与赖氨酸-hcl和plp一起孵育4小时至终浓度分别为160g/l和0.1mm。使用nmr对来自每个样品的尸胺生产进行定量，并通过将所产生的尸胺的摩尔量除以加入的赖氨酸的摩尔量来计算产率。各样品的产率列于表1中。表1通过来自大肠杆菌、t.syntrophicus、g.kaustophilus、t.elongatus和t.roseum的赖氨酸脱羧酶的尸胺产生。表1显示野生型嗜温赖氨酸脱羧酶cada(pcib71)与在65℃相比在37℃显示出显著更高的活性。然而，含有来自嗜热微生物(pcib370-373)的赖氨酸脱羧酶的质粒与在37℃相比在65℃显示出更高的活性。即使嗜热赖氨酸脱羧酶在65℃的活性不如嗜温赖氨酸脱羧酶在37℃的活性那么高，但其活性仍然高于嗜温酶在65℃的活性。实施例7：在37℃和65℃赖氨酸脱羧酶稳定性的比较。在37℃和65℃孵育不同时间段后测定赖氨酸脱羧酶的活性，以确定酶是否能够在功能所需的不同温度维持结构完整性。用质粒pcib71、pcib370、pcib371、pcib372或pcib373转化大肠杆菌bl21。将来自每次转化的单个菌落在37℃的含有羧苄青霉素(100μg/ml)的100mllb培养基中生长过夜。第二天，用弗氏压碎器裂解每个样品。将裂解的样品离心，并将上清液与沉淀物分离，以进行体外实验。将来自每个样品的等量酶在37℃孵育20、30和40小时。在特定温度和特定时间段孵育后，将样品在37℃或65℃与赖氨酸-hcl和plp一起孵育4小时至最终浓度分别为160g/l和0.1mm。使用nmr对来自每个样品的尸胺生产进行定量，并通过将所产生的尸胺的摩尔量除以加入的赖氨酸的摩尔量来计算产率。各样品的产率列于表2中。表2在37℃孵育不同时间后，通过不同赖氨酸脱羧酶的尸胺产生。表2显示37℃的嗜温cada稳定性是所测试的六种蛋白质中最低的。在孵育40小时后，其在37℃的活性降低超过50％。与37℃相比，其在65℃的活性也显著下降。来自嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶在37℃都显示出很小的活性，类似于cada在65℃的活性。然而，即使在37℃孵育40小时后，来自嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶在65℃都显示出相对稳定的活性。这表明来自嗜热微生物的赖氨酸脱羧酶的生产和维持可以在37℃进行，而对其在65℃的活性没有太大影响。实施例8：在37℃从共过表达编码嗜热赖氨酸脱羧酶的基因和赖氨酸合成操纵子i和ii的大肠杆菌产生尸胺。用pcib71、pcib370、pcib371、pcib372或pcib373转化cib103-3(来自modifiedmembranepermeabiliypct/cn2015/094121或wo2017079872a1)。将来自每次转化的三个单菌落在37℃的4ml含有4％葡萄糖、0.1％kh2po4、0.1％mgso4、1.6％(nh4)2so4、0.001％feso4、0.001％mnso4、0.2％酵母提取物、0.05％l-甲硫氨酸、0.01％l-苏氨酸、0.005％l-异亮氨酸、四环素(10μg/ml)和羧苄青霉素(100μg/ml)的培养基中生长过夜。第二天，将每种培养物接种到50ml含有0.7％caco3的新鲜培养基中，并在37℃生长72小时，此时测定每种培养物中赖氨酸和尸胺的浓度(表3)。表3通过含有合成操纵子i和ii并在37℃共同产生赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌菌株产生赖氨酸和尸胺。如表3中所示，当宿主细胞在37℃生长时，嗜温赖氨酸脱羧酶cada(pcib103-3，pcib71)在能够产生赖氨酸的宿主中的过表达导致产生尸胺，并有痕量赖氨酸。嗜热赖氨酸脱羧酶(pcib103-3，pcib370-373)的过表达导致赖氨酸积累，并几乎没有产生尸胺，如未过量表达任何赖氨酸脱羧酶(pcib103-3)的对照宿主。实施例9：在65℃从共过表达编码嗜热赖氨酸脱羧酶的基因和赖氨酸合成操纵子i和ii的大肠杆菌产生尸胺。用pcib71、pcib370、pcib371、pcib372或pcib373转化cib103-3。将来自每次转化的三个单菌落在37℃的4ml含有4％葡萄糖、0.1％kh2po4、0.1％mgso4、1.6％(nh4)2so4、0.001％feso4、0.001％mnso4、0.2％酵母提取物、0.05％l-甲硫氨酸、0.01％l-苏氨酸、0.005％l-异亮氨酸、四环素(10μg/ml)和羧苄青霉素(100μg/ml)的培养基中生长过夜。第二天，将每种培养物接种到50ml含有0.7％caco3的新鲜培养基中，并在37℃生长48小时，此时将培养温度升至65℃。将细胞再培养24小时，然后测定每种培养物中赖氨酸和尸胺的浓度(表4)。表4通过含有合成操纵子i和ii并在65℃共同产生赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌菌株产生赖氨酸和尸胺。如表4中所示，当在没有赖氨酸脱羧酶过表达时(pcib103-3)，或者当嗜温cada过表达时，在发酵的最后24小时期间宿主细胞在65℃孵育导致赖氨酸或尸胺产生没有显著变化。然而，在将宿主细胞在65℃孵育一段时间后，嗜热赖氨酸脱羧酶(pcib103-3，pcib370-373)的过表达导致尸胺而不是赖氨酸在发酵培养基中积累。实施例中使用的质粒表实施例中使用的引物序表。名称序列(5’-3’)cada-fggcgagctcacacaggaaacagaccatgaacgttattgcaatattgaatcaccada-rggctctagaccacttcccttgtacgagccada-f2atttcacacaggaaacagctatgaacgttattgcaatattgaatcada-r2agctgtttcctgtgtgaaatcat-hindiii-fggcaagcttgagaaaaaaatcactggatatacccat-ndei-rggccatatgtaagggcaccaataactgcctsldc-saci-fggcgagctcatggagaagcaagagattaacaagtsldc-xbai-rggctctagattagaaatcggttacaacctgaatgtsldc-fatttcacacaggaaacagctatggagaagcaagagattaacaaggkldc-saci-fggcgagctcatgtctcagctcgagacccctcgkldc-xbai-rggctctagattaacgaattggtttgtattctttaatgacgkldc-fatttcacacaggaaacagctatgtctcagctcgagacccctcteldc-saci-fggcgagctcatggaacctctgctgcgtgcteldc-xbai-rggctctagattaaactttgcagatacgcagagteldc-fatttcacacaggaaacagctatggaacctctgctgcgtgctrldc-saci-fggcgagctcatgtctgaagaacagcaacgtrldc-xbai-rggctctagattaggcacgaacgacacggatrldc-fatttcacacaggaaacagctatgtctgaagaacagcaacg示例性核酸和多肽序列：seqidno:1与cada相比，t.syntrophicus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基mekqeinkfsktpliqalkeyekkdslrfhmpghkgrcpkgvfcdikenlfgwdvteipglddfaqpegpikeaqeklsalygadtsyflvngatsgiismmagalsekdkiliprtshksvlsgliltgasaayimperceelgvyaqvepcaitnklienpdikailvtnpvyqgfcpdiarvaeiakergttlladeaqgphfgfskkvpqsagkfadawvqsphkmltsltqsawlhikgnridkerledflhivttsspsyilmasldgtrelieengnsyiekavelaqkaryeinnstvfyapgqeilgkygissqdplhlmvnvscagytgydiekalredfsiyaeyadlcnvyflitfsntledikgllavlshfkplknkvkpcfwikdlpkvalepkkafklpaksvpfkdsagsvskrplvpyppgaplvmpgeiiekehiemineilnsggycqgvtsekfiqvvtdfseqidno:2与cada相比，g.kaustophilus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基msqletplftgllehmkknpvqfhipghkkgagmdpefrafigdnalaidlinisplddlhhpkgmikraqelaaeafgadytffsvqgtsgaimtmvmsvagpgdkiivprnvhksvmsaivfsgatpifihpeidkelgishgitpqavekalrqhpdakgvlvinptyfgiagdlkkivdiahsynvpvlvdeahgvhihfhedlplsamqagadmaatsvhklggsltqssilnvreglvsakhvqailsmltttstsylllasldvarkqlatkgrelidkairladwtrrqineipylycvgeeilgteatydydptkliisvkelgltghdverwlretynievelsdlynilciitpgdtereasllvealrrlskqfshqaekgikpkvllpdipalaltprdafyaetevvpfhesagriiaefvmvyppgipifipgeiiteenlkyietnlaaglpvqgpeddtlqtlrvikeykpirseqidno:3与cada相比，t.elongatus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基mepllralwgtaleqdlselpgldnlaqptgvlaeaqavvaatvgsdrawflvngatggllaallatvgpgdrvlvgrnvhrsviaglvlagakpvylgvgvdpqwglpwpvtrdvvaaglaaypdtkavvlvsptyeglcsplleiaqcvhnhgvplivdeahgshfayhpafpvtalaagadvvvqswhktlgtltqtavlhlkgervsaerlsqalnlvqtsspnywllaalegagvqmaqqgeqiygrllqwvktfewplprwqppgipqdplrltlgtwpigltgfaldellqpqiiaefpsgrsltfclglgttqtmletladrlksvyteychnaplpplaipsipscqepalspreayfcpqrsiplraalneisaetiapyppgiptviagerftesviatlqtlqelgaemvgasdptlqtlrickvseqidno:4与cada相比，t.roseum赖氨酸脱羧酶多肽序列--t.elongatus赖氨酸脱羧酶多肽序列-加下划线的残基是代表性的保守或半保守残基mseeqqrapyleqwlayvdecvipfttpghkqgrgappefvaafgeralaldiphdggtfdahlehdplvaaerlaaalwgardavflvngsttgnlaalltlgrpgqpivvtramhksllaglvlsgarpvyvvpavhpesgilldlppesvaqalaawpdatavalvsptytgvtsdtaelaalchahgvplfvdeawgphlpfhpalpaaaipsgadlavtslhklagsltqtalllmagnlvdqaqlraatamvqttspaaflyasldaarrrlalegeqllartlelaeharrelaaipglevvgpeivagrpgagfdrtrlvvdvqgfgltglevkrilrrdfriaaemadlvsvvflitigdtpetiaalvaafralaadrtrpdcaagrravrallrstgpivagapqamtpreaffapaervpladavgrvaaepvtpyppgipvlapgevvrpevveflqagraagmrfngasdptlatlrvvraseqidno:5t.syntrophicus赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列atggagaagcaagagattaacaagttctctaagaccccgctcatccaagcgctgaaagaatacgagaaaaaggattctctgcgtttccacatgccaggtcacaaaggccgttgtccaaaaggtgttttttgcgatattaaggagaacctgttcggttgggatgttaccgaaatcccgggtctggatgacttcgctcaaccggaaggtccgatcaaggaagcacaggagaaactgtctgcgctgtacggtgccgacacctcctatttcctcgttaatggtgcaacctctggtatcatttctatgatggcgggtgctctgtccgaaaaggacaaaatcctgatcccgcgtaccagccataagagcgtactctctggtctgattctcactggcgcctctgcggcgtacatcatgccggagcgttgcgaagagctgggtgtttacgcacaggtggaaccttgtgccatcaccaacaaactgatcgagaacccggatatcaaagcgattctggttaccaacccagtgtaccagggtttctgcccggacatcgcgcgtgttgcggaaatcgcgaaagaacgcggtaccaccctgctcgcagacgaagcgcaaggcccacatttcggcttttccaagaaagttccgcagtctgcgggtaagttcgcggatgcgtgggttcagtcccctcacaaaatgctgacgagcctgacccaatctgcgtggctgcacatcaagggcaatcgtatcgacaaggaacgtctggaagactttctccacatcgttaccacctcttctccgtcttacatcctcatggcgtctctggacggtacccgcgagctgattgaagaaaacggtaactcctacattgaaaaggcggttgaactggctcagaaagcgcgttatgaaatcaacaactctactgttttctacgcgccaggccaggagattctcggtaaatacggtatttcttctcaggacccgctgcatctgatggttaatgtttcttgcgcgggttacacgggctacgacatcgaaaaagccctgcgtgaggacttttctatctacgccgaatacgcggacctgtgtaacgtttacttcctcattacgtttagcaataccctggaggacattaaaggtctcctcgcggttctgtctcacttcaaaccgctcaaaaacaaagttaaaccgtgcttctggatcaaagacctgccgaaagttgcgctggagccaaagaaggcgttcaaactgccggcgaaatctgtgcctttcaaagattctgctggtagcgtttctaaacgcccgctggttccgtatccgccaggtgcgccactcgtgatgccgggtgagatcattgagaaagagcacatcgagatgattaatgaaattctcaactctggcggctactgccagggtgttacgtctgaaaagttcattcaggttgtaaccgatttctaaseqidno:6g.kaustophilus赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列atgtctcagctcgagacccctctgttcaccggtctgctcgaacacatgaagaaaaacccggtccagtttcacattccaggtcacaagaaaggtgctggtatggaccctgagttccgtgcgtttatcggtgataacgcgctcgcgatcgacctgatcaacatctcccctctcgacgacctccaccacccgaaaggcatgatcaaacgtgcgcaggaactggctgcggaagcgtttggcgcggactacacgttcttcagcgttcaaggcaccagcggtgccatcatgacgatggtaatgtctgttgcgggtccgggcgataagatcatcgtccctcgtaacgttcacaaatctgttatgtctgccatcgttttctctggcgcgacccctattttcatccacccggaaatcgataaggagctgggtattagccacggtattaccccgcaggccgtggagaaagccctgcgtcaacaccctgatgctaaaggcgttctggtaatcaacccgacttatttcggtatcgcgggtgacctcaaaaagatcgttgacatcgcgcactcttataatgtgccggtcctggtagatgaagcgcacggtgttcatattcacttccacgaggacctcccactcagcgcaatgcaggcgggtgcggatatggcggcgacgtccgtgcacaagctgggcggtagcctgactcagtcttccattctgaacgtacgcgaaggtctggtttctgctaaacacgtgcaagcgattctctctatgctgaccaccacttctacctcttatctgctgctggcttccctggacgtagcgcgtaaacagctggcaaccaaaggtcgtgaactcatcgacaaagccatccgcctcgcggattggacccgtcgccagattaacgagatcccgtacctctactgcgtgggtgaagagatcctgggtaccgaagcaacctacgactacgatccgactaaactgatcatcagcgtaaaagaactcggtctcactggccatgacgttgagcgttggctccgtgaaacctacaatatcgaagttgaactgtctgacctctataacatcctctgcatcatcaccccgggtgatactgagcgcgaagcgtctctcctggtggaagcactgcgccgtctgtctaaacaattctcccatcaggccgaaaagggtatcaaacctaaggttctcctgccggatattcctgccctcgccctgacgcctcgtgacgcgttctatgcggaaaccgaagtcgttccgttccatgagtccgccggtcgtatcatcgcggagtttgtaatggtttacccaccgggcatcccaatcttcatccctggcgagattatcactgaggaaaacctgaaatacatcgaaaccaacctggcggctggcctcccggttcagggcccagaagacgacacgctgcagaccctccgtgtcattaaagaatacaaaccaattcgttaaseqidno:7t.elongatus赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列atggaacctctgctgcgtgcgctgtggggtactgcactcgaacaagacctgtctgagctgccgggtctcgataacctggcgcaaccgaccggtgttctcgcagaagcgcaggctgttgttgcggcaactgtaggttctgaccgtgcgtggtttctggttaatggtgcaacgggcggtctcctcgccgcactcctggccaccgtaggtcctggtgatcgtgtgctggttggccgtaatgttcaccgttctgttatcgcaggtctcgttctggcaggtgcaaagccggtttacctgggtgttggtgtagatccgcaatggggtctgccgtggccggtaactcgtgatgtggtagccgctggtctggccgcatatccggacaccaaagcggttgtgctcgtttctccgacgtatgaaggcctgtgcagcccactgctggagatcgcgcaatgcgttcacaaccacggtgtcccgctgatcgttgacgaagcacatggttctcacttcgcgtatcacccagctttcccggtgacggcgctcgctgctggcgctgacgttgtcgtacagtcttggcataaaaccctgggtacgctgacccagacggcggttctccacctcaaaggtgagcgtgtttccgccgaacgtctgtctcaggctctgaacctggttcaaacctcttccccgaactactggctgctcgcagcactggaaggtgcaggcgtccaaatggctcagcagggtgagcagatttacggtcgcctgctccagtgggtaaagaccttcgaatggccactcccgcgttggcagccgcctggcatccctcaggaccctctccgtctcactctgggcacttggcctattggtctgacgggtttcgcgctcgacgaactcctccagccgcagatcatcgcggagttcccgtccggtcgttccctcacgttttgcctcggtctcggtaccacccaaaccatgctcgaaacgctggcggaccgcctgaaatctgtttacaccgaatactgccacaacgcccctctgcctcctctcgcgattccatctatcccgtcttgccaggaacctgctctcagcccgcgtgaagcgtacttctgcccgcagcgctctattccgctccgcgcagctctcaacgaaatctctgcggagaccatcgcgccgtatccaccgggtatcccgaccgtgatcgcgggtgaacgtttcacggaatctgtcatcgcaaccctccagaccctgcaagaactcggtgcagaaatggtcggtgcgagcgaccctacgctgcagactctgcgtatctgcaaagtttaaseqidno:8t.roseum赖氨酸脱羧酶密码子优化的核酸序列atgtctgaagaacagcaacgtgctccgtacctggagcaatggctggcgtacgttgacgagtgcgttatcccgtttaccactccgggtcacaaacaaggtcgcggtgcgccaccggagttcgttgcggcgttcggtgaacgtgcgctcgctctggacattccgcatgacggtggcacctttgacgcgcatctggaacatgacccgctcgttgccgccgaacgtctggctgccgcactgtggggtgcacgcgatgcggtgtttctggttaacggttccaccactggtaacctggcggctctgctcactctcggtcgcccaggtcagccgattgttgttactcgtgccatgcataagagcctgctggcaggtctggtcctgagcggtgctcgccctgtctacgttgtaccggccgtacacccagaatccggtatcctcctcgatctccctccggaatctgttgcgcaggcgctggccgcgtggcctgatgcgacggctgtagctctggtgtccccgacctacactggcgttacctctgacactgctgaactggcagccctctgtcacgctcatggtgttccactgtttgttgatgaagcgtggggtccgcacctcccgttccatccagcactcccagcagcagctattccgtctggtgccgatctggcggttacttctctgcacaaactggcgggttccctcacccaaaccgctctcctcctgatggcaggcaacctcgtagaccaagcccagctgcgtgcagccacggcaatggtgcaaaccaccagccctgcagccttcctgtacgcgtccctggatgctgcccgtcgccgtctcgcgctcgaaggtgaacagctcctcgcacgtactctcgagctggctgagcacgctcgccgtgaactcgccgccatcccgggtctggaggtggtcggtccagaaattgttgcgggtcgtccgggtgccggcttcgatcgtactcgcctcgttgttgacgttcagggtttcggtctgactggcctcgaagtaaagcgtatcctgcgtcgtgacttccgtattgcagctgaaatggcagatctcgtctctgttgttttcctcatcaccatcggtgacaccccagagaccatcgctgccctggtagcagctttccgtgcactcgctgctgaccgtacccgtccagactgtgctgccggtcgtcgtgcagtacgcgccctcctccgttctaccggtccgatcgtcgcgggtgctcctcaggcgatgaccccgcgtgaagctttcttcgctccagctgagcgcgttccgctcgcggatgccgtcggtcgtgttgcagccgagccggttaccccatatccgcctggtattccggtactggccccaggtgaagtggttcgcccggaggtagttgaattcctccaggcaggccgtgccgctggtatgcgtttcaatggcgcgtctgacccgactctggcgaccctccgtgtcgttcgtgcctaaseqidno：9cada多肽序列mnviailnhmgvyfkeepirelhralerlnfqivypndrddllkliennarlcgvifdwdkynlelceeiskmnenlplyafantystldvslndlrlqisffeyalgaaediankikqttdeyintilppltkalfkyvregkytfctpghmggtafqkspvgslfydffgpntmksdisisvselgslldhsgphkeaeqyiarvfnadrsymvtngtstankivgmysapagstilidrnchkslthlmmmsdvtpiyfrptrnaygilggipqsefqhatiakrvketpnatwpvhavitnstydgllyntdfikktldvksihfdsawvpytnfspiyegkcgmsggrvegkviyetqsthkllaafsqasmihvkgdvneetfneaymmhtttsphygivastetaaammkgnagkrlingsieraikfrkeikrlrtesdgwffdvwqpdhidttecwplrsdstwhgfknidnehmyldpikvtlltpgmekdgtmsdfgipasivakyldehgivvektgpynllflfsigidktkalsllraltdfkrafdlnlrvknmlpslyredpefyenmriqelaqnihklivhhnlpdlmyrafevlptmvmtpyaafqkelhgmteevyldemvgrinanmilpyppgvplvmpgemiteesrpvleflqmlceigahypgfetdihgayrqadgrytvkvlkeeskkseqidno：10大肠杆菌cada核酸序列atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgtgaacttcatcgcgcgcttgaacgtctgaacttccagattgtttacccgaacgaccgtgacgacttattaaaactgatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgttatttttgactgggataaatataatctcgagctgtgcgaagaaattagcaaaatgaacgagaacctgccgttgtacgcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacagattagcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagaccactgacgaatatatcaacactattctgcctccgctgactaaagcactgtttaaatatgttcgtgaaggtaaatatactttctgtactcctggtcacatgggcggtactgcattccagaaaagcccggtaggtagcctgttctatgatttctttggtccgaataccatgaaatctgatatttccatttcagtatctgaactgggttctctgctggatcacagtggtccacacaaagaagcagaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtacttccactgcgaacaaaattgttggtatgtactctgctccagcaggcagcaccattctgattgaccgtaactgccacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgatgttacgccaatctatttccgcccgacccgtaacgcttacggtattcttggtggtatcccacagagtgaattccagcacgctaccattgctaagcgcgtgaaagaaacaccaaacgcaacctggccggtacatgctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccgacttcatcaagaaaacactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctcaccgatttacgaaggtaaatgcggtatgagcggtggccgtgtagaagggaaagtgatttacgaaacccagtccactcacaaactgctggcggcgttctctcaggcttccatgatccacgttaaaggtgacgtaaacgaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttctccgcactacggtatcgtggcgtccactgaaaccgctgcggcgatgatgaaaggcaatgcaggtaagcgtctgatcaacggttctattgaacgtgcgatcaaattccgtaaagagatcaaacgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtatggcagccggatcatatcgatacgactgaatgctggccgctgcgttctgacagcacctggcacggcttcaaaaacatcgataacgagcacatgtatcttgacccgatcaaagtcaccctgctgactccggggatggaaaaagacggcaccatgagcgactttggtattccggccagcatcgtggcgaaatacctcgacgaacatggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctgctgttcctgttcagcatcggtatcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgactttaaacgtgcgttcgacctgaacctgcgtgtgaaaaacatgctgccgtctctgtatcgtgaagatcctgaattctatgaaaacatgcgtattcaggaactggctcagaatatccacaaactgattgttcaccacaatctgccggatctgatgtatcgcgcatttgaagtgctgccgacgatggtaatgactccgtatgctgcattccagaaagagctgcacggtatgaccgaagaagtttacctcgacgaaatggtaggtcgtattaacgccaatatgatccttccgtacccgccgggagttcctctggtaatgccgggtgaaatgatcaccgaagaaagccgtccggttctggagttcctgcagatgctgtgtgaaatcggcgctcactatccgggctttgaaaccgatattcacggtgcataccgtcaggctgatggccgctataccgttaaggtattgaaagaagaaagcaaaaaataa序列表<110>上海凯赛生物技术股份有限公司cibt美国公司<120>嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途<130>ibpa17002<160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>482<212>prt<213>tepidanaerobactersyntrophicus<400>1metglulysglngluileasnlyspheserlysthrproleuilegln151015alaleulysglutyrglulyslysaspserleuargphehismetpro202530glyhislysglyargcysprolysglyvalphecysaspilelysglu354045asnleupheglytrpaspvalthrgluileproglyleuaspaspphe505560alaglnprogluglyproilely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