本发明涉及一种快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，特别是一种利用流式细胞分选术快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法。
背景技术：
blm解旋酶(blm)是recq家族dna解旋酶中的重要一员，参与了dna复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程，在维持染色体的稳定性中具有重要作用。blm解旋酶的缺失可导致blm综合征。blm综合征(blm’ssyndrome,bs)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，bs患者的临床特征表现为严重的生长迟缓、学习障碍、免疫缺陷等。研究表明，blm解旋酶在睾丸和胸腺中高表达，而且blm基因的突变和高表达与肿瘤发生密切相关，患者易患前列腺癌、结肠癌、肺癌、白血病等疾病。
前列腺癌是欧美国家男性常见的恶性肿瘤，其发病率居所有恶性肿瘤的第二位，我国前列腺癌的发病率远低于西方国家，但由于生活方式西化、人口老龄化及前列腺特异抗原(psa)筛查的普及，近10年来我国前列腺癌的发病率呈直线上升态势。目前对于前列癌的治疗，主要采用睾丸切除的方式，但睾丸切除不能治愈本病，最终将转变为雄激素非依赖性癌，因此至今缺乏前列癌的有效疗法。近些年来关于药物和分子靶标联合治疗癌症的研究越来越被重视，本发明以首次利用分子克隆技术构建blm解旋酶sirna质粒，并转入前列腺癌细胞系pc-3中，为以blm解旋酶为抗癌药物靶标的研究奠定了基础。
传统细胞系的筛选需要在转染后经过多轮抗性筛选和稀释才能得到阳性单克隆，十分费时费力，而且假阳性率很高。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法。本发明具有细胞株获得简单快速，省时省力，假阳性率较低的特点。
本发明的技术方案：一种快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，包括下列步骤:
1)sirna的设计与合成：根据ncbi上blm解旋酶基因的靶序列按照sirna的设计原则，设计合成针对blm解旋酶基因的干扰序列，并在序列两端分别加上bamhi/ecori酶切位点；
2)sirna表达载体的构建：将干扰序列退火并用bamhi和ecori双酶切，纯化回收，与同样经bamhi和ecori双酶切并纯化过的空载体连接构建重组干扰载体；
3)干扰载体的克隆转化：将重组的干扰载体转化到大肠杆菌dh5a，筛选阳性菌落，提取质粒进行双酶切鉴定并送测序，获得blm解旋酶sirna载体，并扩大培养；
4)shrna的转染：将干扰载体通过质脂体介导的转染方式转染前列腺癌细胞系，转染24～48小时后进行分选；
5)利用流式细胞仪进行阳性细胞分选：将荧光蛋白gfp阳性细胞按1个细胞分选到1个孔的方式分选到含全血清培养基的微孔板中；
6)培养分选得到的阳性细胞，提取细胞总rna，设计blm基因引物，实时荧光定量qrt-pcr检测blm基因在mrna水平的表达，选择blm解旋酶沉默表达的细胞株，扩大培养并冻存即可。
前述的快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，步骤1)所述针对blm解旋酶基因的干扰序列，其序列为：
5’-gcttcagcagcggaacataagttcaagagacttatgttccgctgctgaagcttttttg-3’。
前述的快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，步骤2)所述空载体为cmv-copgfp-t2a-puro-h1-mcs载体。
前述的快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，步骤4)中干扰载体通过质脂体介导进行转染时的条件为：细胞密度80％，质粒与质脂体比值1μg：1μl。
前述的快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，步骤6)中实时荧光定量qrt-pcr的引物序列为：
forward：gaatccagaaaccagcacaga
reverse：agcagttcgttcccacaatc。
前述的快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，步骤6)所述前列腺癌细胞系为pc-3细胞系。
本发明的有益效果
本发明通过将shrna、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上荧光蛋白筛选三者结合起来，可以在短时间内获得阳性单克隆，极大地提高sirna干扰blm解旋酶稳定细胞系筛选的工作效率。与传统细胞系筛选方法相比，本发明具有以下优点：
1、本发明首次构建blm解旋酶sirna质粒，并转入前列腺癌细胞系pc-3中，为以blm解旋酶为抗癌药物靶标的研究奠定基础；
2、本发明使用流式细胞仪进行单细胞分选，省去了抗生素筛选的繁琐，从而可以在短时间内获得大量单细胞，另外可保证每一个培养孔中都是单细胞，减少假阳性率，极大节省时间成本；
3、本发明在细胞转染后24～48小时进行分选，这个时间段为转染后blm基因被干扰的最大状态，且可保证细胞在分选以后具有最大存活率，可以得到最佳筛选效果；
4、本发明的适用范围广泛，可以应用于其他细胞系及基因。
附图说明
图1为构建重组载体方法示意图；
图2为重组载体电泳鉴定图；
图3为重组载体双酶切鉴定图；
图4为重组载体测序图；
图5为荧光显微镜下转染重组载体后的pc3细胞图；
图6为流式细胞仪对gfp阳性细胞进行单细胞分选示意图；
图7为pc-3细胞系blm解旋酶干扰沉默后的荧光定量检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
本发明的实施例
一种快速获得sirna干扰blm解旋酶稳定细胞株的方法，方法如下：
1)sirna的设计合成：根据ncbi上blm解旋酶基因的靶序列按照sirna的设计原则从转录aug起始密码子开始，搜寻下游aa序列，记录跟每个aa3’端相邻的19个核苷酸作为候选的sirna靶位点；按照以上设计原则合成针对blm解旋酶基因的dna模板，其序列为bamhi酶切位点、21nt正义链、9nt成环结构、21nt反义链、rna酶iii转录终止位点(6个t)、ecori酶切位点,阴性对照序列为为bamhi酶切位点、21nt打乱顺序正义链、9nt成环结构、21nt打乱顺序反义链、rna酶iii转录终止位点(6个t)、ecori酶切位点；模板序列和阴性对照经blast比对均确认与blm解旋酶以外的已知人类基因无同源性；
2)载体选用cmv-copgfp-t2a-puro-h1-mcs(mirzip)，该载体上携带有gfp绿色荧光标记，如该载体成功转染进细胞中，细胞会发出绿色荧光，将合成的干扰序列片段退火并用bamhi和ecori双酶切,然后经琼脂糖凝胶纯化与同样经bamhi和ecori双酶切并纯化过的空载体连接构建重组干扰载体(见图1)；
3)干扰载体的克隆转化：将连接好的目的载体轻轻加入至100μl感受态细胞中冰浴30min，每隔5min轻轻晃动离心管一次，42℃水浴90s，冰浴20min，每管加入400μllb液体培养基(无amp)于37℃，220r/min震荡1h，涂布于含有amp的固体培养基上37℃培养过夜，次日挑取单菌落于含有amp的lb液体培养基中，37℃，220r/min震荡12-16h，扩大培养；
对rnai载体的鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳对构建的rnai载体进行鉴定，挑取单菌落摇菌提取质粒，将提取的重组质粒于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果在8000bp处出现重组质粒条带，由于质粒为环状的所以有拖带现象(图2),为进一步确认质粒,分别用bamhi和ecori将质粒双酶切后,电泳结果表明,在约7800bp处出现空载体的片段(图3)；
对构建的rnai载体进行测序鉴定：将鉴定为阳性的克隆菌液进行测序，dna测序结果显示，所构建的两个干扰载体及一条阴性对照均含有所设计的目的片段，其序列与设计的靶向寡核苷酸序列完全一致(图4)，进一步证实目的片段已正确插入载体，干扰blm解旋酶基因重组载体构建成功；
pc-3细胞的培养：从液氮罐中迅速取出冻存的pc-3人前列腺癌细胞细胞株，于电热恒温水浴锅37℃迅速解冻，在超净台内将含有细胞的冻存液转移至2ml无菌离心管中，1000rpm离心5min细胞群沉淀管底弃培养基，使用含有10％血清、100μl/ml卡那霉素、100μl/ml氨苄霉素的dmem/f12培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中置于二氧化碳培养箱中，在37℃、5％co2的培养条件下培养，适时利用荧光倒置显微操作系统观察培养的细胞，待pc-3细胞密度达到80％-90％即可传代，弃去原培养基，5ml1×pbs清洗两次，600μl0.25％胰蛋白酶消化，待细胞变圆，轻轻拍打细胞瓶侧壁，迅速加入10mldmem/f12完全培养基终止消化，分瓶后放入二氧化碳培养箱(37℃、5％co2)继续培养；
4)重组载体转染pc-3细胞：当培养的细胞密度长至80％左右时，便将细胞原有的培养基弃去，使用pbs清洗细胞，使用胰酶将细胞消化下来铺至24孔细胞培养板中，每孔500μl含有pc-3细胞的培养基，待细胞贴紧板底后开始转染，具体步骤如下：使用ultrospec2100pro紫外分光光度计测出提出的质粒浓度，根据质粒浓度分设五个转染梯度，取0.8μg,1.0μg,1.25μg,1.5μg和2.0μg质粒分别用50μlopti-mem稀释，每孔取lipofectaminetm2000转染试剂2μl分别用50μlopti-mem稀释，将稀释好的质粒和转染试剂一同室温孵育5min，然后分别将每个梯度稀释好的质粒逐滴滴加到稀释好的转染试剂中，室温孵育20min，将每孔细胞弃去原培养基，pbs清洗一遍，加入500μlopti-mem，孵育好后向每孔细胞中加入100μl转染复合液，每组梯度设四个重复孔；
转染效率的检验：重组载体、阴性对照及空载体转染pc-3细胞后分别在24h及48h后在荧光倒置显微镜下观察细胞发光情况,发现被转染后的细胞发出绿色荧光(图5),表明构建的重组载体成功转入pc-3细胞中，根据细胞发光情况的不同，发现质粒浓度与转染试剂浓度比值为1μg：1μl时细胞发光最强，因此后续转染实验均以此比例进行；
5)分选单细胞：转染24-48h后，丢弃大部分培养基上清，留约200ul培养基于管义，用移液器轻轻吹打混匀，再加400ul新鲜培养基混匀后转移至流式管中，为获得稳定的单克隆细胞，通过流式细胞仪将gfp阳性单细胞分选至已经加有150ul新鲜培养基的96孔细胞培养板中，流式细胞仪对gfp阳性细胞进行单细胞分选如图6所示，黑色方框中的细胞代表gfp阳性细胞群，培养7天后，将单克隆转移至48孔细胞培养板中继续扩大培养并做后续分析；
转染后提取细胞总rna进行荧光定量pcr反应检测blm解旋酶基因沉默情况：采用trizol法提取转染细胞总rna,利用试剂盒进行逆转录；将逆转录生成的cdna稀释相同倍数使每组浓度至大约10ng/μl,之后进行实时荧光定量pcr检测，利用primer5.0软件设计blm上下游引物，扩增片段大小约100bp，以β-actin基因为内参基因,设计上下游引物，扩增片段大小为300bp左右，扩增条件为：95℃预变性3min,95℃变性10s,57℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环；每次循环后于95℃收集荧光信号,将产物从55℃升温至95℃,温度每升高0.5℃读1次荧光值,每组设4个复孔,实验重复4次以上,以β-actin作为参照,计算ct均值,应用相对定量法δδct进行定量分析(图7)；
6)将已验证的单克隆细胞株扩大培养、冻存液氮保种即可。