本发明涉及药物中间体制备领域，特别是涉及一种四烯物中间体的制备方法。
背景技术：
：甾体化合物具有各种生物活性，它们的应用非常广泛，有些被采用治疗疾病或发展生产，如治疗过敏性疾病的氢化可的松、避孕药黄体酮、利尿剂安体舒通、合成甾体激素的薯蓣皂甙元、强心作用的狄戈辛、蟾毒甙等都是甾体化合物。四烯物中间体可以通过进一步的合成，从而得到在临床中有广泛应用的3TR、氟轻松、曲安奈德等系列药物。四烯物中间体的合成路线中，通常选用其合适的上游中间体，通过生物转化的方法进行，但一般的生物转化方法转化的目标产物收率低，副产物较多。技术实现要素：基于此，有必要提供一种目标产物收率高、副产物较少的四烯物中间体的制备方法。一种四烯物中间体的制备方法，包括以下步骤：用简单诺卡氏菌对第一化合物进行微生物转化得到所述四烯物中间体，所述第一化合物如通式I所示，所述四烯物中间体如通式II所示，通式I和通式II中R为H、卤原子、烷基、烷氧基、羟基或苯基。在其中一个实施例中，所述微生物转化具体包括以下步骤：将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基中；在所述发酵培养基中加入所述第一化合物，经发酵得到发酵液；将所述发酵液分离提取即得所述四烯物中间体。在其中一个实施例中，在所述发酵前还包括以下步骤：在所述发酵培养基中加入聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚和吐温80，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚与所述发酵培养基的质量体积比为0.01g～0.2g:100mL，吐温80与所述发酵培养基的质量体积比为0.01g～0.1g:100ml。在其中一个实施例中，所述第一化合物的粒径大小为100～300目。在其中一个实施例中，所述发酵时的温度为25℃～32℃，搅拌转速为50rpm～300rpm，空气流量为0.1vvm～1.0vvm，罐压为0.01MPa～0.1MPa。在其中一个实施例中，每100mL所述发酵培养基中包含以下质量的组分：葡萄糖0.2g～2.0g、玉米浆0.5g～1.5g、蛋白胨0.3g～1.0g、磷酸二氢钾0.1g～0.3g和消泡剂0.01g～0.2g。在其中一个实施例中，所述第一化合物与所述发酵培养基的质量体积比为1g～10g:100mL。在其中一个实施例中，在将简单诺卡氏菌接种于所述发酵培养基之前还包括以下步骤：将简单诺卡氏菌进行斜面培养和种子培养。在其中一个实施例中，所述分离提取包括以下步骤：将所述发酵液过滤得到滤饼，用甲醇提取并过滤得到滤液，于50～70℃减压浓缩干燥，然后与水混合于50～70℃减压浓缩，降温至10～30℃，离心得到滤饼并烘干。在其中一个实施例中，在所述烘干后还包括以下步骤：将所述烘干得到的固体与甲醇混合，于40～60℃回流1～3小时，然后降温至0～10℃，离心得到滤饼，烘干即得所述四烯物中间体。本发明选用上述通式I所示的第一化合物为底物，并仅使用简单诺卡氏菌(Nocardioidessimplex)进行生物转化，对底物同时进行1,2位脱氢及21位醋酸酯水解，得到四烯物中间体，21位醋酸酯水解能够有效地促进1,2位脱氢，使转化形成的产物中绝大部分都是上述通式II所示的四烯物中间体，还能得到一定量的次要产物，无用副产物的比例很低。提纯后的产品为白色晶体，相对底物重量收率为80％～90％，目标产物收率较高，经过HPLC分析，其纯度≥95％，目标产物与次要产物之和≥99％。得到该四烯物中间体后即可方便地通过进一步的合成反应，轻松获得高纯度的甾体药物，十分适合工业化发酵生产，能够提高生产效率，降低生产成本。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明一实施方式的四烯物中间体的制备方法，包括以下步骤：用简单诺卡氏菌对第一化合物进行微生物转化得到四烯物中间体，第一化合物如通式I所示，四烯物中间体如通式II所示，通式I和通式II中R为H、卤原子、烷基、烷氧基、羟基或苯基。本实施方式选用上述通式I所示的第一化合物为底物，并仅使用简单诺卡氏菌(Nocardioidessimplex)进行生物转化，对底物同时进行1,2位脱氢及21位醋酸酯水解，得到四烯物中间体，21位醋酸酯水解能够有效地促进1,2位脱氢，使转化形成的产物中绝大部分都是上述通式II所示的四烯物中间体，还能得到一定量的次要产物(如通式III所示的第二化合物)，无用副产物(通式IV所示的第三化合物)的比例很低。提纯后的产品为白色晶体，相对底物重量收率为80％～90％，目标产物收率较高，经过HPLC分析，其纯度≥95％，目标产物与次要产物之和≥99％。得到该四烯物中间体后即可方便地通过进一步的合成反应，轻松获得高纯度的甾体药物，十分适合工业化发酵生产，能够提高生产效率，降低生产成本。在一个实施例中，R为H，即第一化合物为如结构式V所示的21-羟基孕甾-4,9(11),16-三烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(2TR)，四烯物中间体为如结构式VI所示的醋酸四烯物脱酯物(以下简称四烯物)。此时次要产物第二化合物为如结构式VII所示的醋酸四烯物，无用副产物第三化合物为如结构式VIII所示的21-羟基孕甾-4,9(11),16-三烯-3,20-二酮(2TR脱酯物)。具体地，微生物转化具体包括以下步骤S1～S3：S1、将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基中；S2、在发酵培养基中加入第一化合物，经发酵得到发酵液；S3、将发酵液分离提取即得四烯物中间体。在一个实施例中，在发酵前还包括以下步骤：在发酵培养基中加入聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)和吐温80，PPE与发酵培养基的质量体积比为0.01g～0.2g:100mL，吐温80与发酵培养基的质量体积比为0.01g～0.1g:100ml。优选地，第一化合物的粒径大小为100～300目。如此，将底物磨成细粉状可以促进底物的溶解，增加与菌体的接触面积，提高转化得到目标产物的效率。在一个实施例中，发酵时的温度为25℃～32℃，搅拌转速为50rpm～300rpm，空气流量为0.1vvm～1.0vvm，罐压为0.01MPa～0.1MPa，发酵时间为24～160小时。在一个实施例中，每100mL发酵培养基中包含以下质量的组分：葡萄糖0.2g～2.0g、玉米浆0.5g～1.5g、蛋白胨0.3g～1.0g、磷酸二氢钾0.1g～0.3g和消泡剂0.01g～0.2g。优选地，发酵培养基的pH为6.5～7.5。优选地，第一化合物与发酵培养基的质量体积比为1g～10g:100mL。在一个实施例中，在将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基之前还包括以下步骤：将简单诺卡氏菌进行斜面培养和种子培养。具体地，斜面培养包括以下步骤：挑取简单诺卡氏菌菌种接种于斜面培养基上，于26～33℃倒置培养2～4天，培养结束后可置于4℃下保存备用。可选地，每100mL斜面培养基中包括以下质量的组分：牛肉膏0.2g～0.5g、蛋白胨0.2g～0.8g和琼脂2g～3g，pH为6.5～7.5。具体地，种子培养包括以下步骤：将上述斜面培养后的诺卡氏菌于无菌条件下用接种环刮下，接种入液体培养基中，一支斜面(约1×109～1×1010菌体数量)接种于100mL液体培养基，接种后在恒温摇床上培养，培养条件为温度26～33℃，转速为120～250rpm，培养时间为16～48小时。可选地，每100mL种子培养的液体培养基中包括以下质量的组分：葡萄糖0.2g～2.0g、玉米浆0.5g～1.5g、蛋白胨0.3g～1.0g、磷酸二氢钾0.1g～0.3g和消泡剂0.01g～0.2g，pH为6.5～8.0，培养基于121℃灭菌30分钟。在一个实施例中，将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基具体包括以下步骤：于无菌条件下，每100mL发酵培养基中加入1～20mL经上述种子培养得到的培养液，培养条件为温度26～33℃，转速为50～300rpm，培养时间为10～48小时。优选地，每100mL发酵培养基中加入1×109～2×1010菌体数量。优选地，在将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基后，取发酵培养基稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值大于0.4时向发酵培养基中加入第一化合物。在一个实施例中，分离提取包括以下步骤：将发酵液过滤得到滤饼，用甲醇提取并过滤得到滤液，甲醇的用量为底物质量的4～12倍，于50～70℃减压浓缩干燥，然后与水混合于50～70℃减压浓缩，水的用量为底物质量的4～8倍，降温至10～30℃，离心得到滤饼并烘干。进一步地，在烘干后还包括以下步骤：将烘干得到的固体与甲醇混合，甲醇的用量为固体的质量的2～6倍，于40～60℃回流1～3小时，然后降温至0～10℃，离心得到滤饼，烘干即得四烯物中间体。以下为具体实施例。实施例1于10升发酵罐内装入6升发酵培养基，接种100mL经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.4×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速180rpm，培养时间16小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.58。将120g的2TR、4.8g的PPE和1.2g的吐温80加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速200rpm，空气流量0.2～0.3vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表1所示：表1名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.56％6.81％0.15％93.25％转化完成后将发酵液灭活过滤，得滤饼210g，用720mL甲醇提取并过滤得到滤液，滤饼再用少量甲醇淋洗收集淋洗液与滤液合并，于50℃减压浓缩干燥至糊状，加入720mL水，于50℃减压浓缩干燥，置换出其中的甲醇，然后降温至30℃以下离心烘干，即得粗品108克。将粗品加入到216mL甲醇中，升温至40℃回流2小时，然后降温至0℃，离心过滤并用少量冷甲醇淋洗，滤饼烘干得102g白色固体，用HPLC分析，结果如表2所示：表2名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.05％3.1％0.02％96.63％对比例1于10升发酵罐内装入6升发酵培养基，接种100mL经过种子培养所得的简单节杆菌(Arthrobactersimplex)种子液(菌体浓度：2.5×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速180rpm，培养时间16小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.55。将120g的2TR、4.8g的PPE和1.2g的吐温80加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速200rpm，空气流量0.2～0.3vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表3所示：表3名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物其他副产物目标产物纯度18.12％73.68％0.56％3.65％2.16％对比例2于10升发酵罐内装入6升发酵培养基，接种100mL经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.5×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速180rpm，培养时间16小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.50。将120g的2TR脱酯物、4.8g的PPE和1.2g的吐温80加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速200rpm，空气流量0.2～0.3vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表4所示：表4名称2TR脱酯物目标产物纯度47.52％52.13％实施例2于10升发酵罐内装入6升发酵培养基，接种100mL经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：3.2×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速180rpm，培养时间16小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.45。将180g的2TR、4.8g的PPE和1.2g的吐温80加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速200rpm，空气流量0.2vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表5所示：表5名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.66％4.62％0.45％94.15％转化完成后将发酵液灭活过滤，得滤饼350g，用1080mL甲醇提取并过滤得到滤液，滤饼再用少量甲醇淋洗收集淋洗液与滤液合并，于70℃减压浓缩干燥至糊状，加入1080mL水，于70℃减压浓缩干燥，置换出其中的甲醇，然后降温至30℃以下离心烘干，即得粗品165克。将粗品加入到330mL甲醇中，升温至60℃回流2小时，然后降温至10℃，离心并用少量冷甲醇淋洗，滤饼烘干得154g白色固体，用HPLC分析，结果如表6所示：表6名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.07％3.1％0.03％96.22％实施例3于1000升发酵罐内装入600升发酵培养基，接种10L经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.6×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速150rpm，培养时间24小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.56。将12kg的2TR、0.48kg的PPE和0.12kg的吐温80加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速150rpm，空气流量0.2vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表7所示：表7名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.46％3.82％0.55％94.55％转化完成后将发酵液灭活过滤，得滤饼14.5kg，用100L甲醇提取并过滤得到滤液，滤饼再用少量甲醇淋洗收集淋洗液与滤液合并，于60℃减压浓缩干燥至糊状，加入100L水，于60℃减压浓缩干燥，置换出其中的甲醇，然后降温至30℃以下离心烘干，即得粗品10.7kg。将粗品加入到22L甲醇中，升温至50℃回流2小时，然后降温至10℃，离心并用少量冷甲醇淋洗，滤饼烘干得10.3kg白色固体，用HPLC分析，结果如表8所示：表8名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.02％2.9％0.02％96.81％实施例4于10升发酵罐内装入6升发酵培养基，接种100mL经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：3.3×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速180rpm，培养时间16小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.43。将120g的21-羟基孕甾-16-α甲基-4,9(11),16-四烯-3,20-二酮-21-醋酸酯、4.8g的PPE和1.2g的吐温80加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速200rpm，空气流量0.2vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表9所示：表9转化完成后将发酵液灭活过滤，得滤饼206g，用1080mL甲醇提取并过滤得到滤液，滤饼再用少量甲醇淋洗收集淋洗液与滤液合并，于70℃减压浓缩干燥至糊状，加入1080mL水，于70℃减压浓缩干燥，置换出其中的甲醇，然后降温至30℃以下离心烘干，即得粗品105克。将粗品加入到330mL甲醇中，升温至60℃回流2小时，然后降温至10℃，离心并用少量冷甲醇淋洗，滤饼烘干得103g白色固体，用HPLC分析，结果如表10所示：表10实施例5于10升发酵罐内装入6升发酵培养基，接种100mL经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.1×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速180rpm，培养时间16小时。取样稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，OD值为0.47。将120g的2TR加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速200rpm，空气流量0.2vvm，罐压0.05Mpa，转化72小时后取样送HPLC分析，结果如表11所示：表11名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度1.72％5.61％3.56％89.10％转化完成后将发酵液灭活过滤，得滤饼220g，用1080mL甲醇提取并过滤得到滤液，滤饼再用少量甲醇淋洗收集淋洗液与滤液合并，于70℃减压浓缩干燥至糊状，加入1080mL水，于70℃减压浓缩干燥，置换出其中的甲醇，然后降温至30℃以下离心烘干，即得粗品110克。将粗品加入到330mL甲醇中，升温至60℃回流2小时，然后降温至10℃，离心并用少量冷甲醇淋洗，滤饼烘干得101克白色固体，用HPLC分析，结果如表12所示：表12名称底物醋酸四烯物2TR脱酯物目标产物纯度0.05％1.75％1.57％96.35％以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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