用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种革兰氏阳性菌的检测方法，特别涉及一种用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

致病菌(pathogenicbacteria)是指能引起疾病的微生物。致病菌包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌，致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病，而条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。

基于核酸扩增方式的分子检测方法广泛应用于致病菌的检测，其中荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)通过定量检测微生物dna来确定微生物数量的一种快速、敏感性高的检测方法，但是该方法存在无法区分微生物死活的弊端。由于死菌的dna能稳定并长期存在于污染样本中，其同样可以作为扩展模板被核酸扩增方法所检测到。

叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，pma)的叠氮基团在光作用下脱去-n2，并嵌入dna双链发生共价交联。pma带有正电荷，活细胞完整的细胞膜可以阻止其进入，但可穿入死细胞和膜损伤细胞与dna进行结合，在光诱导作用下可与其dna发生不可逆的共价交联。游离的pma与h2o反应生成羟胺，发生钝化反应，钝化的pma对dna无影响。利用pma这一特性，可以进行活菌检测。

近年来，pma结合pcr对假阳性pcr结果进行鉴别的技术已有报道，尤其是对革兰氏阴性菌(lib,chenjq.2012.real-timepcrmethodologyforselectivedetectionofviableescherichiacolio157:h7cellsbytargetingz3276asageneticmarker.applenvironmicrobiol.78(15):5297-5304.)。而革兰氏阳性菌因细胞壁成分特征，使得pma进入死菌的效率不高。

目前检测致病菌的常见方法有：平板培养法、信使rna检测法。但这些方法操作复杂，耗时较长，信使rna检测具有不稳定性，拷贝数较低，检测灵敏性差，重复性差，同时在提取过程中易被dna污染，容易造成假阳性或假阴性。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种检测试剂，包括：

引物对，包括序列分别如seqidno：2和seqidno：3所示的引物；以及

探针，其序列如seqidno：1所示。

进一步的，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，包括所述的检测试剂。

进一步的，所述的试剂盒还包括pcr扩增反应所需的辅助试剂、叠氮溴化丙锭、tritonx-100。

本发明实施例还提供了一种应用于金黄色葡萄球菌活菌检测方法的产品，包括所述的检测试剂或所述的试剂盒，并且所述的检测方法包括：

提供含有金黄色葡萄球菌的待测样品；

以叠氮溴化丙锭对待测样品进行预处理；

提取经预处理后所获的金黄色葡萄球菌活菌中的核酸；

利用所述的引物对及探针，通过pcr扩增反应对提取到的核酸进行检测，从而实现对待测样品内金黄色葡萄球菌活菌的定性或定量检测。

进一步的，所述的检测方法还包括：先以活性剂对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理，所述活性剂包括能够溶解金黄色葡萄球菌菌壁中脂质的非离子型表面活性剂。

更进一步的，所述的检测方法还包括：先以含有浓度为大于0但小于2wt％的所述非离子型表面活性剂的溶液对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理。

进一步的，所述活性剂为tritonx-100。

更进一步的，所述的预处理包括：将来源于待测样品的金黄色葡萄球菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理。

本发明实施例提供了一种应用于革兰氏阳性菌活菌检测方法的产品，包括针对所述革兰氏阳性菌设计的引物对和探针，并且所述的检测方法包括：

提供含有革兰氏阳性菌的待测样品；

以浓度为大于0但小于2wt％的活性剂的溶液对待测样品进行处理，所述活性剂包括tritonx-100；

将来源于待测样品的革兰氏阳性菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理；

提取经预处理后所获的革兰氏阳性菌活菌中的核酸；

利用所述的引物对及探针，通过pcr扩增反应对提取到的核酸进行检测，从而实现对待测样品内革兰氏阳性菌活菌的定性或定量检测。

与现有技术相比，本发明的检测试剂、试剂盒在应用于检测金黄色葡萄球菌活菌时，具有特异性高、稳定性好等特点，本发明提供的检测方法具有简单、高特异、高灵敏、快速的优点。

附图说明

图1是本发明一典型实施案例中一种金黄色葡萄球菌活菌的检测方法原理图；

图2是本发明一实施案例中牛奶样品内金黄色葡萄球菌活菌的测试结果。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例提供了一种检测试剂，包括：

引物对，包括序列分别如seqidno：2和seqidno：3所示的引物；以及

探针，其序列如seqidno：1所示。

进一步的，所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端标记有荧光报告基团。

本发明实施例还提供了一种试剂盒，包括所述的检测试剂。

进一步的，所述的试剂盒还包括pcr扩增反应所需的辅助试剂、叠氮溴化丙锭、tritonx-100。

本发明实施例还提供了一种应用于金黄色葡萄球菌活菌检测方法的产品，包括所述的检测试剂或所述的试剂盒，并且所述的检测方法包括：

提供含有金黄色葡萄球菌的待测样品；

以叠氮溴化丙锭对待测样品进行预处理；

提取经预处理后所获的金黄色葡萄球菌活菌中的核酸；

利用所述的引物对及探针，通过pcr扩增反应对提取到的核酸进行检测，从而实现对待测样品内金黄色葡萄球菌活菌的定性或定量检测。

进一步的，所述的检测方法还包括：先以活性剂对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理，所述活性剂包括能够溶解金黄色葡萄球菌菌壁中脂质的非离子型表面活性剂。

更进一步的，所述的检测方法还包括：先以含有浓度为大于0但小于2wt％的所述非离子型表面活性剂的溶液对待测样品进行处理，之后进行所述的预处理。

进一步的，所述活性剂为tritonx-100。

更进一步的，所述的预处理包括：将来源于待测样品的金黄色葡萄球菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理。

本发明实施例提供了一种应用于革兰氏阳性菌活菌检测方法的产品，包括针对所述革兰氏阳性菌设计的引物对和探针，并且所述的检测方法包括：

提供含有革兰氏阳性菌的待测样品；

以浓度为大于0但小于2wt％的活性剂的溶液对待测样品进行处理，所述活性剂包括tritonx-100；

将来源于待测样品的革兰氏阳性菌的悬浮液与叠氮溴化丙锭或叠氮溴化丙锭溶液混合，之后进行光照处理；

提取经预处理后所获的革兰氏阳性菌活菌中的核酸；

利用所述的引物对及探针，通过pcr扩增反应对提取到的核酸进行检测，从而实现对待测样品内革兰氏阳性菌活菌的定性或定量检测。

如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

请参阅图1所示，本发明一典型实施方案之中，一种金黄色葡萄球菌活菌的检测方法包括样品的核酸染料孵育处理、光照处理、核酸提取、pcr(例如qpcr)反应等步骤，其原理主要为：如果待测样品中含有目标致病菌的游离核酸或者死菌，那么tritonx-100等活化剂的处理增加了死菌细胞壁的通透性，使得叠氮溴化丙锭(pma)能够高效的与目标致病菌的游离核酸或者死菌相接触，经光照处理使其与核酸稳定结合，同时由于pma不能进入活菌内部，对活菌核酸成分没有影响。而与pma结合后的dna分子不能作为核酸扩增的模板，因此对处理样本提取核酸后的qpcr检测到的信号来自活菌成分，达到对目标致病菌活菌进行定性或定量检测的目的。

并且，前述的检测方法对于其它细菌，特别是革兰氏阳性菌属的活菌检测也是适用的，只需将对应于金黄色葡萄球菌的引物对、探针替换为对应于其它细菌的引物对、探针即可。

如下将结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的解释说明。

本发明的如下实施例所使用的引物对及探针如下：

利用primerpremier5.0软件根据金黄色葡萄球菌全基因组(cp019563.1)序列中保守性强的区域进行设计。

(1)所设计的引物对序列为：saf：5’-ttcgctactagttgctta-3’；sar：5’-gcactatatactgttggatc-3’；

(2)所设计的探针为taqman探针，探针3’末端连接有荧光淬灭基团tamara，5’末端连接有荧光报告基团fam。探针序列为：sap：5’-tcagaaccacttctatttacgccgt-3’

本发明的如下实施例所使用的荧光定量pcr扩增条件如下：

(1)反应体系体积为20μl，具体配比为：

(2)反应程序为：95℃预变性15s，1个循环；95℃变性5s，62℃退火34s，40个循环。

本发明的如下实施例中的金黄色葡萄球菌(如下亦称病原菌)活菌的检测方法包括如下步骤：

(1)预处理：使用tritonx‐100处理样品，增加死菌细胞壁的通透性；

(2)添加染料：加入叠氮溴化丙锭(pma)，使其与病原菌游离核酸或进入死菌内部与其核酸成分结合；

(3)光照处理：对pma处理后的样品进行光照处理，消除病原菌游离核酸或死菌核酸成分对核酸扩增反应的影响；

(4)核酸提取：样品处理完成后，利用细菌dna提取试剂盒提取样品中的核酸；

(5)检测分析：通过qpcr方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物，从而进行定性或定量分析。

本发明的如下实施例中中待测样品的孵育温度为37℃。

本发明的如下实施例中所采用的pbs缓冲液成分如下：取137mmolnacl、2.7mmolkcl、10mmolna2hpo4和2mmolkh2po4溶于水，调节ph至7.4，用水定容至1l。

实施例1

本实施例采用平板菌落计数对triton-100添加量进行了优化。设计了四个triton-100的添加比例分别为2％，0.5％，0.25％，0.1％(v/v)。结果表明，当tritonx-100添加量为2％时，tritonx-100对金黄色葡萄球菌活菌有杀菌作用。当tritonx-100添加比例不超过0.5％时，tritonx-100不会影响金黄色葡萄球菌活菌数量，结果如表1所示。

表1是经不同浓度tritonx-100处理后的金黄色葡萄球菌活菌数

其中：nc为阴性对照。**表示与阴性对照比较有极显著差异(p<0.01)。

实施例2

本实施例通过qpcr方法对pma浓度进行了优化。设计了五个pma的参考浓度分别为100，40，10，4，1μm。经tritonx-100处理20min后，取相同浓度(1.0×10⁸cfu/ml)的金黄色葡萄球菌活菌和死菌各1ml，首先在无光条件下孵育5min，然后在有光条件下孵育15min。在无光条件下，随着pma浓度的增加，样品ct值有轻微变化。在有光(blu-vsystem,qiagen,germany)条件下，样品ct值显著提高，结果如表2所示。

结合表2中的数据可知，pma结合tritonx-100处理方法对金黄色葡萄球菌活菌的选择性检测更有利。

表2为经不同浓度pma处理后在有光和无光条件下金黄色葡萄球菌活菌检测结果

其中：nc为阴性对照，同一行不同字母的值表示差异显著(p<0.05)。

实施例3

本实施例通过如下试验对牛奶中金黄色葡萄球菌活菌进行了检测验证。将已知数量的金黄色葡萄球菌(死菌、活菌)添加到牛奶中，8000×g离心5min，去除上层液体。菌体沉淀用无菌pbs缓冲液洗涤三次，加入pbs缓冲液和0.5％tritonx-100重悬，37℃孵育20min。向管中加入pma至终浓度为40μm，在无光条件下孵育5min并间隔振荡，然后在有光条件下孵育15min。同时将活菌菌悬液以相同方法处理但不添加pma作为阴性对照。8000×g离心10min，采用tianampbacteriadnakit(tiangenbiotech)试剂盒，按操作说明提取处理后的样品dna。所得dna模板用于qpcr分析。结果显示在不添加pma的阴性对照组中，1.0×10³cfu/ml和1.0×10⁴cfu/ml死菌组的ct值分别为34.86和30.77。在添加pma组中，1.0×10⁴cfu/ml死菌组的ct值达到39.45，表明经pma处理后死菌dna被完全清除，同时也表明本方法能去除死菌dna的菌体数限量为1.0×10⁴cfu/ml。

为了验证qpcr检测金黄色葡萄球菌活菌的灵敏度，将1.0×10⁴cfu/ml终浓度的死菌添加到1ml的牛奶中，然后加入活菌至终浓度为10⁵～10¹cfu/ml。pma-qpcr结果表明最低检出限(lod)为1.0×10²cfu/ml(见图2)。

本发明使用了可特异性识别致病菌基因序列的扩增探针和引物对，因而具有特异性高、稳定性好的特点，本发明提供的检测方法还具有简单、快速、灵敏的优点。

此外，本发明的检测方法还适用于其它革兰氏阳性菌活菌或其它细菌活菌的特异性快速检测，只需要针对目标菌设计特异性扩增引物和识别探针即可实现，这是本案发明人经大量实验后验证的。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南京农业大学

<120>用于金黄色葡萄球菌活菌检测的试剂、试剂盒及应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>1

tcagaaccacttctatttacgccgt25

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>2

ttcgctactagttgctta18

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>3

gcactatatactgttggatc20