本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种用于检测c－kit基因突变的引物组、试剂盒及方法。
背景技术：
：c-kit基因位于人类染色体4q11-q12，属于第ⅲ类酪氨酸激酶受体。研究表明，c-kit与其配体干细胞因子结合后发生二聚体化及自身磷酸化，进而激活下游信号通路，介导细胞生长、增殖，抑制细胞凋亡等。c-kit基因的突变将导致c-kit受体持续激活，引发细胞增殖失控及凋亡抑制。胃肠间质瘤(gist)是较常见的消化道间叶性肿瘤，研究表明，大多数gist是由c-kit基因突变所致，在gist中c-kit基因突变率约为90％。c-kit基因突变主要发生在近膜区的外显子11(约70％)，然后是外膜区的外显子9(10–15％)，酪氨酸区段的外显子13、17也可以发生突变(分别为1–3％)。另一方面，c-kit基因突变也发生于2-6％的黑色素瘤中，最常见于黏膜黑色素瘤(15-20％)及肢端雀斑样黑色素瘤(10-20％)中。伊马替尼(imatinib)/格列卫(glivec)作为一种特殊的c-kit酪氨酸激酶抑制剂，经fda批准已应用于c-kit突变、转移性和手术难于切除病例的治疗以及部分高度侵袭危险性病例的术后预防性化疗。同时，有相关研究报道，伊马替尼用于治疗c-kit突变或扩增的晚期黑色素瘤患者能取得比较满意的疗效，《中国黑色素瘤诊治指南(2011版)》指出，伊马替尼可用于部分c-kit突变或扩增的晚期黑色素瘤患者的治疗。目前对c-kit基因突变的检测方法主要有定量pcr、sanger测序和dhplc等，sanger测序法被认为是检测基因突变的金标准，但是其检测灵敏度约为15-20％，如果标本中某一个位点是杂合的，其中一个等位基因的含量低于15～20％时，用sanger测序法很难将其检测出来。而肿瘤细胞中c-kit基因突变率是未知的，有些外显子的突变率甚至低于10％。因此，急需提供一种灵敏度高、特异性好的c-kit基因突变检测产品和方法。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种特异性好、准确度高和灵敏度高的用于检测c-kit基因突变的引物组及方法。与此相应，本发明还提供了含有上述引物组的试剂盒以及上述引物组在制备用于检测c-kit基因突变的试剂盒中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测c-kit基因突变的引物组，其包括用于检测c-kit基因外显子9的pcr扩增引物对、用于检测c-kit基因外显子11的pcr扩增引物对、用于检测c-kit基因外显子13的pcr扩增引物对和用于检测c-kit基因外显子17的pcr扩增引物对；其中，所述用于检测c-kit基因外显子9的pcr扩增引物对包括如seqidno:1所示的上游引物和如seqidno:2所示的下游引物；所述用于检测c-kit基因外显子11的pcr扩增引物对包括如seqidno:3所示的上游引物和如seqidno:4所示的下游引物；所述用于检测c-kit基因外显子13的pcr扩增引物对包括如seqidno:5所示的上游引物和如seqidno:6所示的下游引物；所述用于检测c-kit基因外显子17的pcr扩增引物对包括如seqidno:7所示的上游引物和如seqidno:8所示的下游引物。本发明提供的上述引物组，可用于检测c-kit基因外显子9、外显子11、外显子13和外显子17的突变情况；采用该引物组检测c-kit基因突变，特异性好、准确度高。作为本发明所述用于检测c-kit基因突变的引物组的优选实施方式，所述用于检测c-kit基因外显子9的pcr扩增引物对还包括如seqidno:9和seqidno:10所示的巢氏引物；所述用于检测c-kit基因外显子11的pcr扩增引物对还包括如seqidno:11和seqidno:12所示的巢氏引物；所述用于检测c-kit基因外显子13的pcr扩增引物对还包括如seqidno:13和seqidno:14所示的巢氏引物；所述用于检测c-kit基因外显子17的pcr扩增引物对还包括如seqidno:15和seqidno:16所示的巢氏引物。因福尔马林固定、石蜡包埋切片组织(ffpe)在固定过程中会造成组织成分的广泛交联，导致dna被修饰、降解以及断裂等，造成所提取的dna质量较差。采用所述巢氏引物，能进一步增强检测c-kit基因突变的检出率与准确性。作为本发明所述用于检测c-kit基因突变的引物组的优选实施方式，所述引物组还包括如seqidno:17和seqidno:18所示的测序引物。另外，本发明还提供了一种用于检测c-kit基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测c-kit基因突变的引物组。本发明的试剂盒，由于其含有特定的pcr扩增引物，将其用来检测c-kit基因突变时，特异性好、准确度高和灵敏度高，对低突变率的样本也能准确检出，可完全满足检测的需要。本发明所述的c-kit基因突变率定义为样本中突变型c-kit基因占总c-kit基因(野生型和突变型c-kit基因的总和)的比例。作为本发明所述用于检测c-kit基因突变的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括dna提取试剂、dna聚合酶、缓冲溶液和琼脂糖凝胶。其中，dna提取试剂可通过购买dna提取试剂盒得到，例如，ffpe组织dna提取试剂盒。再者，本发明还提供了上述引物组在制备用于检测c-kit基因突变的试剂盒中的应用。最后，本发明还提供了一种用于非疾病的诊断和治疗的c-kit基因突变的检测方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品中的dna；(2)以步骤(1)提取的dna为模板，以上述引物组为引物进行pcr扩增；(3)采用电泳分析步骤(2)pcr扩增的产物，并对产物进行回收；(4)用测序引物进行sanger测序，并分析测序结果。作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)采用ffpe组织dna提取试剂盒提取待测样品中的dna。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明提供了一种新的用于检测c-kit基因突变的引物组，其可用于检测c-kit基因外显子9、外显子11、外显子13和外显子17的突变情况。本发明提供的引物组是发明人经过大量实验和探索得来的，检测c-kit基因突变准确度高，同时能大大提高检测的灵敏度，使低突变率的样本也能准确检出，避免出现假阴性结果；(2)本发明提供的引物组具有很好的特异性，制备得到的测序模板中无任何非特异性条带，可直接用于后续的测序，不需要对测序模板进行纯化处理，简化了实验步骤。附图说明图1为c-kit基因外显子9、11、13和17扩增的电泳分析结果图；图2为c-kit基因外显子9部分扩增序列的sanger测序图；图3为c-kit基因外显子11部分扩增序列的sanger测序图；图4为c-kit基因外显子13部分扩增序列的sanger测序图；图5为c-kit基因外显子17部分扩增序列的sanger测序图。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。下述实施例中，所用到试剂的来源为：dna聚合酶(包含缓冲液、mgcl2)，商品名：q5tm热启动超保真2×mastermix(货号：m0494l)，生产商：neb，贮存条件：-15～-25℃；琼脂糖，商品名：regularagaroseg-10(货号:111935)，生产商：biowest，储存条件：室温；sizestandards，商品名：marki/ii(货号：md101-02/md102-02)，生产商：tiangen，贮存条件：长期储存于-15～-25℃保存；工作液于2～8℃保存。下述实施例中，所用到的设备如下表1所示：表1仪器设备实施例1本发明用于检测c-kit基因突变的引物组的一种实施例，本实施例所述用于检测c-kit基因突变的引物组如表2所示。表2引物序列注：引物中有a代表nest-pcr第一轮扩增引物，有b代表nest-pcr中的巢氏引物。采用表1的引物能够特异地扩增相应的外显子片段。进一步地，本实施例所述用于检测c-kit基因突变的引物组还包括下述测序引物：tgtaaaacgacggccagt(上游引物，seqidno:17所示)和caggaaacagctatgacc(下游引物，seqidno:18所示)。实施例2本发明用于检测c-kit基因突变的试剂盒的一种实施例，本实施例所述用于检测c-kit基因突变的试剂盒包括实施例1所述用于检测c-kit基因突变的引物组、dna提取试剂、dna聚合酶、缓冲溶液、mgcl2和琼脂糖凝胶；其中，dna提取试剂来源于ffpe组织dna提取试剂盒；琼脂糖凝胶的配制方法为：称取足量的琼脂糖，放入200ml的锥形瓶，加入一定量的tae缓冲液(1×)，在微波炉(smc，j180)中以中高火加热3min或煮沸至溶液清亮，室温冷却至约65℃，倒入另一专用的100ml锥形瓶，加入丫啶橙3～5μl，倒胶，插入齿梳，室温冷却10-15min后即可得到琼脂糖凝胶；所采用的50×tae缓冲溶液的配制方法为：混合242gtris、57.1ml冰乙酸和100ml0.5mol/ledta(ph8.0)，加ddh2o定容至1l，配制成50×tae缓冲溶液，再进行稀释，得到1×tae缓冲溶液。实施例3本发明c-kit基因突变的检测方法的一种实施例，本实施例所述c-kit基因突变的检测方法采用了实施例2所述试剂盒，具体的方法步骤如下：1.dna提取：采用ffpe组织dna提取试剂盒提取待测样品中的dna；2.以表2中的引物组为引物，取出q5tm热启动超保真2×mastermix，ddh2o，室温融化后，短暂离心，配制如表3所示的pcr扩增体系(扩增体系中加入dmso的主要目的是增加特异性扩增；表3中的模板为步骤3加入)；震荡混匀，短暂离心后，分装23.0μl至每个pcr反应管；表3pcr反应体系3.向分装好的pcr反应管中加入2.0μl(6.25～200ng)的模板，盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心后于pcr仪上进行巢氏pcr扩增；巢氏pcr第一次扩增的程序如表4所示；待第一次扩增完后，向分装好的第二次扩增的pcr反应管中加入2.0μl第一次扩增的产物，按照表5的程序进行第二次扩增。表4第一次pcr扩增程序表5第二次pcr扩增程序4.采用电泳分析步骤3巢氏pcr扩增的产物；a琼脂糖凝胶的配制：称取足量的琼脂糖，放入200ml的锥形瓶，加入一定量的tae缓冲液(1×)，在微波炉(smc，j180)中以中高火加热3min或煮沸至溶液清亮，室温冷却至约65℃，倒入另一专用的100ml锥形瓶，加入丫啶橙3～5μl，倒胶，插入齿梳，室温冷却10-15min后即可使用；b点样和电泳：吸取2μl步骤3巢氏pcr扩增的产物，混合1μl6×上样缓冲溶液，在样品中间孔加入5μlmarki/ii；盖上电泳槽盖，以150v电泳15min，电泳完后于凝胶成像系统中拍照保存。c-kit基因外显子9,11,13,17扩增的电泳分析结果如图1所示。由图1可见，采用本发明的引物组扩增结果特异性高，无非特异性扩增条带产生。5.回收目标pcr产物。6.采用abi3500xlgeneticanalyzer进行sanger测序，并分析测序结果。c-kit基因外显子9的sanger测序结果如图2(外显子9缺失突变)所示，c-kit基因外显子11的sanger测序结果如图3所示，c-kit基因外显子13的sanger测序结果如图4所示，c-kit基因外显子17的sanger测序结果如图5所示。实施例4本检测方法引物特异性本发明引物是发明人经过大量的实验和探索得到的，具有很好的特异性，同时使用经优化的体系和扩增条件分别对检测样本进行扩增。样本扩增结果见图1，结果显示，扩增结果特异性高，无任何非特异性扩增条带产生；测序结果显示，扩增片段与参考序列吻合(见图2～5，仅显示部分结果)。从图2～5可以看出，该样本c-kit基因外显子11检测到突变，突变命名为：c.1705_1728del(p.v569_l576del)。实施例5本发明检测方法对样本量的需求本发明采用sanger测序检测c-kit基因突变，根据dna输入量的检测结果显示，在dna量输入范围3.125～200ng/reaction间，可保证突变样本检测结果一致(见表6-1)。表6-1不同dna输入量检测结果实施例6本发明检测方法的精密度本实施例进行了人员间、不同时间、不同仪器、同一标本不同孔间的对比实验，以考察本发明检测方法的精密度。本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。考察的具体方法为：在不同dna输入量下，分别对同一标本进行三次不同孔间重复检测(实验结果如表6-1所示)以及不同实验人员和不同实验仪器的重复检测(实验结果如表6-2所示)；并采用本发明的检测方法对21例不同标本的c-kit基因进行三次不同孔间重复检测(实验结果如表6-3所示)。表6-1、表6-2和表6-3，各表结果均显示一致，本发明的检测方法的精密度为100％。表6-2不同人员和仪器检测结果表6-3不同样本检测结果实施例7本发明检测方法的准确度为验证本发明检测方法检测样本时的准确度，本实施例利用实施例2所述试剂盒和实施例3所述检测方法对21例已知c-kit基因突变的样本进行检测，结果如表7所示。表7已知c-kit基因突变的样本检测结果由表7可知，本发明试剂盒和检测方法对c-kit基因突变检测准确率高达100％，可准确检出样本中的c-kit基因突变，同时不会造成误检和漏检。实施例8为验证本发明检测方法在检测样本时的灵敏度，本实施例利用实施例2所述试剂盒和实施例3所述检测方法对10例已知c-kit基因突变率的样本进行检测，结果如表8所示。表8检测结果标本号突变类型突变率本发明检测结果ckit-022外显子910％外显子9突变阳性ckit-023外显子98％外显子9突变阳性ckit-024外显子911％外显子9突变阳性ckit-025外显子133％外显子13突变阳性ckit-026外显子915％外显子9突变阳性ckit-027外显子171.5％外显子17突变阳性ckit-028外显子134％外显子13突变阳性ckit-029外显子99.5％外显子9突变阳性ckit-030外显子913.8％外显子9突变阳性ckit-031外显子172％外显子17突变阳性由表8可知，本发明试剂盒和检测方法具有很高的灵敏度，对于低至1.5％的c-kit基因突变也能准确检出。综上，本发明引物是发明人经过大量实验和探索得到的，在设计时充分考虑了巢式引物之间的相互配合关系，例如退火温度之间的关系，第一轮扩增引物和第二轮扩增引物本身以及相互之间是否形成二级结构等多种因素后，经过反复的实验摸索，最终得出具有灵敏度好，特异性高优点的引物组。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>广州金域医学检验集团股份有限公司广州金域医学检验中心有限公司<120>一种用于检测c-kit基因突变的引物组、试剂盒及方法<160>18<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1aaagtatgccacatcccaagtg22<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<400>2actgatatggtagacagagcctaa24<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ccagagtgctctaatgactg20<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4ctgttatgtgtacccaaaaagg22<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gacatcagtttgccagttgt20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6tgttttgataacctgacagac21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7tggttttcttttctcctccaa21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tgcaggactgtcaagcagag20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tttcctagagtaagccaggg20<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10tggtagacagagcctaaacatc22<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<400>11gtgctctaatgactgagacaataat25<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12acccaaaaaggtgacatgga20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13catcagtttgccagttgtgc20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14acacggctttacctccaatg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15tctcctccaacctaatagtg20<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列<400>16ggactgtcaagcagagaat19<210>17<211>18<212>dna<213>人工序列<400>17tgtaaaacgacggccagt18<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列<400>18caggaaacagctatgacc18当前第1页12