本发明涉及一种微生物发酵产物的分离纯化方法，尤其是涉及一种液-液-液三相溶剂体系萃取分离天然产物的方法及其应用。
背景技术：
在微生物发酵生产次级代谢产物如红霉素，头孢菌素等的过程中，底物中常加入大豆油、棉籽油等作为缓慢利用碳源。发酵周期结束后，该部分油常常不能被完全利用，残留于微生物发酵产物中，为后续目标化合物分离纯化带来较大困难。目前除油方法有热碱法，有机溶剂法，表面活性剂法，絮凝剂沉降法等。上述多用于含油废水、覆油机械部件的除油等，若直接用于微生物发酵产物，轻则引入杂质，降低收率，重则导致化合物结构发生改变。
溶剂萃取法的原理是根据目标化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来作为一种经典天然产物分离方法。溶剂萃取法因其装置设备简单，操作简便，容易放大，回收率高，样品无污染等优势，在天然产物的提取中应用广泛。同时，该方法也具有分离选择性较差等缺点，制约了其在天然产物分离纯化中的应用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种分离选择性好、目标化合物回收效率高的液-液-液三相溶剂体系萃取分离天然产物的方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种液-液-液三相溶剂体系萃取分离天然产物的方法，包括以下步骤：
（1）根据待提取目标化合物选取至少4种溶剂；
（2）按照不同比例混合步骤（1）中选取多种溶剂，充分振荡混合配置成三相溶剂体系；
（3）将一定量的待提取天然产物粗提物充分溶解于步骤（2）中配置好的三相溶剂体系中，待三相溶剂体系分相完毕后，上、中、下三相各取定量样品由hplc检测其中目标化合物的含量；
（4）根据步骤（3）中的各相中目标化合物的含量综合各相体积，得出目标化合物在各相中的分配比；
（5）将一定量待提取天然产物粗提物中的同种油加入三相溶剂体系中，充分振荡溶解静置后精确分为三相，40℃减压蒸至无明显体积减少时，称量每相重量；
（6）将步骤（5）中等量同种油40℃减压蒸至无明显体积减少时，称量重量；
（7）根据步骤（5）中各相蒸干重量明确油的分布，根据根据步骤（4）各相目标化合物的含量明确其富集位置，依据油最大化分配于一相中，目标化合物最大化富集于另一相的要求，筛选出最适三相溶剂体系；
（8）采用步骤（7）筛选得到的三相溶剂体系对微生物发酵产物萃取1-2次，同时完成除油及目标化合物富集。
上述方法应用于微生物发酵产物中巴弗洛霉素a1的分离纯化，其分离纯化方法具体步骤如下：
（1）巴弗洛霉素a1萃取
将正己烷、乙酸乙酯、乙腈和水按体积比7：3：5：5的比例混合配制成三相溶剂体系；将微生物发酵产物巴弗洛霉素a1粗提物按质量体积比1g：200ml的比例溶解于三相溶剂体系中进行萃取，振荡充分溶解，萃取稳定后分成上中下三层；再将上相组分按质量体积比1g：120ml的比例溶解于三相溶剂体系中进行萃取，合并两次萃取所得中相组分，制得中相浸膏；
（2）巴弗洛霉素a1分离纯化
a.将正己烷、乙腈和水按体积比15：9：11的比例混合，然后剧烈震荡充分混合后静置分层，完全分层之后将上下两相分装在干净试剂瓶中，在超声波清洗机中超声15min脱气待用；
b．将150mg中相浸膏溶于14ml由正己烷、乙腈和水按体积比15：9：11混合成的溶液中，震荡30s后用滤纸过滤后，取滤液得到中相浸膏溶液样品待用；
c．开启高速逆流色谱系统，按50ml/min的速度泵入步骤（2）a得到的上相组分作为固定相，将色谱系统正转，转速800rpm时以5ml/min的速度泵入步骤（2）a得到的下相组分作为流动相；待流出下相时，停泵等待进样；
d．取步骤（2）b得到的中相浸膏溶液样品进样，高速逆流色谱分离采用头-尾洗脱模式，247nm波长下检测，采用步骤（2）a得到的下相作为洗脱剂以3ml/min的流速进行洗脱，同时开启谱图检测，收集83min到105min之间的洗脱组分，将洗脱组分于40℃蒸干后，得到纯度为95.91%的巴弗洛霉素a1。
本发明原理为：选择多种极性不同的有机溶剂，充分混合静置后成为具有三相的混合溶剂体系。其中每一相都具有不同的极性范围。将待处理的微生物发酵产物充分溶解于该三相溶剂体系中，粗提物中的残留油脂具有较小的极性，分配于同样极性较小的上相中；目标化合物分布于中等极性的中相，微生物发酵中的大极性杂质分配于下相混合溶剂中。根据混合溶剂三相之间以及待处理微生物发酵产物中残留油脂、不同化合物之间的极性差异，达到目标化合物的定向分离。目标化合物可能有部分分配于上相中，可通过对一次萃取得到的上相粗提物进行二次同溶剂体系萃取，以提高收率。混合溶剂三相的极性范围可通过不同溶剂种类及配比的选择进行微调。本发明具体流程步骤如图1所示。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种液-液-液三相溶剂体系萃取分离天然产物的方法及其对微生物发酵产物中巴弗洛霉素a1分离纯化的应用，该方法多种不同极性溶剂混合配置三相溶剂系统，以该溶剂系统对含油天然产物粗提物进行萃取，使产物中残余的油和目标化合物一次即可分配于溶剂系统不同的两相中，从而达到除油、富集目标化合物的目的，易于后续精细分离。优点如下：
（1）不同于常规化合物分离，本发明的三相溶剂萃取除油方法在化合物精细分离纯化之前置入一步三相溶剂萃取步骤，仅两步简单萃取、分液，即得到富集了粗提物中96.4%的巴弗洛霉素a1，去除了99.5%的残油。
（2）此外，经过高速逆流色谱简单分离，105min即可完成精细分离纯化，收集的巴弗洛霉素a1纯度为95.91%。
（3）溶剂萃取操作简单，分离条件温和，没有常规的固液层析粗分步骤，粗提物中油脂去除率高，除油同时不影响目标化合物的收率，大大提高了目标化合物的回收率。同时，本方法操作简便，设备需求要求低，易于放大，回收率高，分离条件较温和。
附图说明
图1为本发明巴弗洛霉素a1分离纯化方法的工艺流程图；
图2为本发明具体实施例中巴弗洛霉素a1粗提物hplc图谱；
图3为本发明具体实施例中中相浸膏高速逆流色谱分离图谱；
图4为本发明具体实施例中分离纯化后巴弗洛霉素a1的hplc图谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
一种液-液-液三相溶剂体系萃取分离天然产物的方法，包括以下步骤：
（1）根据待提取目标化合物选取至少4种溶剂；
（2）按照不同比例混合步骤（1）中选取多种溶剂，充分振荡混合配置成三相溶剂体系；
（3）将一定量的待提取天然产物粗提物充分溶解于步骤（2）中配置好的三相溶剂体系中，待三相溶剂体系分相完毕后，上、中、下三相各取定量样品由hplc检测其中目标化合物的含量；
（4）根据步骤（3）中的各相中目标化合物的含量综合各相体积，得出目标化合物在各相中的分配比；
（5）将一定量待提取天然产物粗提物中的同种油加入三相溶剂体系中，充分振荡溶解静置后精确分为三相，40℃减压蒸至无明显体积减少时，称量每相重量；
（6）将步骤（5）中等量同种油40℃减压蒸至无明显体积减少时，称量重量；
（7）根据步骤（5）中各相蒸干重量明确油的分布，根据根据步骤（4）各相目标化合物的含量明确其富集位置，依据油最大化分配于一相中，目标化合物最大化富集于另一相的要求，筛选出最适三相溶剂体系；
（8）采用步骤（7）筛选得到的三相溶剂体系对微生物发酵产物萃取1-2次，同时完成除油及目标化合物富集。
二、应用实施例
一种微生物发酵产物中巴弗洛霉素a1的分离纯化方法，如图1所示具体步骤如下：
1、三相溶剂体系萃取巴弗洛霉素a1
（1）采用三相溶剂体系溶解粗提物，经hplc分析以峰面积归一法了解目标化合物在三相溶剂体系各相中的分布情况，具体步骤如下：
根据hplc色谱分离保留时间和紫外吸收图谱确定待分离粗提物中的巴弗洛霉素a1，粗提物hplc图谱见图2。选取正己烷、乙酸乙酯、乙腈和水按体积比7：3：5：5的比例配制成三相溶剂体系。各100mg微生物发酵产物巴弗洛霉素a1粗提物溶解于20ml三相溶剂体系中，振荡充分溶解。分相稳定后三相各取一定量溶液进行hplc检测。检测结果以吸收峰面积归一法综合各相体积，得出目标化合物在各相中的分布情况，见表1。
表1
（2）将同油料加入空白三相溶剂体系中，比较加入前后三相溶剂体系各相体积，蒸干后重量增加情况，了解残油在三相溶剂体系各相中的分布情况，具体步骤如下：
配制40ml的三相溶剂体系，并各加入5ml大豆油，充分混匀后分离各相，于40℃旋蒸15min，测算三相溶剂体系中各相的剩余重量。单独将5ml大豆油以40℃旋蒸15min，测算其剩余重量。各相旋蒸后重量及大豆油旋蒸后重量见表2。
表2
由上表2可知，上相除去了96.1%的残油。
（3）经过第一次三相溶剂体系萃取，上相仍然分配有15%左右的目标化合物巴弗洛霉素a1。将其采用相同三相溶剂体系进行二次萃取，以提高目标化合物回收率。将一次萃取得到的上相组分按质量体积比1g：120ml的比例溶解于三相溶剂体系中进行萃取，振荡充分溶解，萃取稳定后分成上中下三层，hplc分别检测三相巴弗洛霉素a1的分配情况，见表3。
表3
综上所述，三相溶剂体系二次萃取除油及富集巴弗洛霉素a1的流程及结果如下：首先采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈和水按体积比7：3：5：5混合成的三相溶剂体系萃取，84.4%的巴弗洛霉素a1富集于中相，15.6%存于上相，下相为大极性杂质，弃置不用。同时上相除去了96.1%的残油。将第一次上相分液蒸干后进行第二次三相溶剂体系萃取，第一次上相中77.3%的巴弗洛霉素a1进入第二次中相。将两次中相合并蒸干供分离纯化用。根据巴弗洛霉素a1在各相的分配，得出经两步经三相溶剂萃取富集及除油后，巴弗洛霉素a1理论回收率为96.4%，存油仅占粗提物的0.5%。
2、高速逆流色谱分离巴弗洛霉素a1
（1）分别用干净量筒量出900ml正己烷、540ml乙腈和660ml纯水，加入2l分液漏斗中配置为15：9：11(v：v：v)溶剂体系，剧烈震荡充分混合后静置分层。完全分层之后将上下两相分装在干净试剂瓶中，做好标记，在超声波清洗机中超声15min脱气待用；
（2）将正己烷、乙腈和水按体积比15：9：11的比例混合得到混合溶剂体系，用14ml该混合溶剂体系，溶解中相浸膏150mg，震荡30s后用滤纸过滤后，取滤液得到中相浸膏溶液样品待用；
（3）正常开启高速逆流色谱系统、恒温水浴系统（定为25℃）、检测器、泵后，按50ml/min泵入上相作为固定相。泵入体积超出350ml以确定固定相充分占据300ml的柱体积。色谱系统正转，转速800rpm时以5ml/min泵入下相作为流动相。待流出下相时，停泵等待进样。柱体积及其他管路体积共为320ml，推出上相体积为128ml，保留率为60%；
（4）高速逆流色谱分离采用头-尾洗脱模式，247nm波长下检测。将之前配好的中相浸膏溶液样品进样（150mg进样量，14ml进样体积），3ml/min流速以下相洗脱。同时开启谱图检测。73min开始出峰时接取，接至85min，逆流图谱见图3。
（5）分离得到的组分40℃蒸干后用乙腈复溶过滤后送hplc检测，以峰面积归一法测算纯度，得到巴弗洛霉素a1纯度为95.91%，见图4。
三、对比试验
1、三相溶剂体系的溶剂和配比确认优化
根据待提取目标化合物选取至少4种溶剂，前提是溶剂不会引起目标化合物的分解；按照不同比例混合前述步骤（1）中多种溶剂，充分振荡混合配置成混合溶剂体系，前提是体系可以清晰分为三相。
将正己烷，乙酸乙酯，乙腈，水按照表4各项比例配置混合溶剂，充分振荡后静置分层。分层完毕后观察相数，测量各项体积，具体见表4所示；将一定量的待提取微生物发酵产物充分溶解于筛选得到的三相溶剂体系中，待溶剂体系分相完毕后，上、中、下三相各取定量样品由hplc检测其中目标化合物的含量，见表5；将一定量大豆油加入各溶剂体系中充分溶解，溶剂体系分相完毕后，上、中、下三相分液蒸干，称重并对照等量大豆油重，得出大豆油在三相中的分布，见表6。综合目标化合物的富集以及除油的效果，选择正己烷：乙酸乙酯：乙腈：水按体积比7：3：5：5的配比配制。
表4不同溶剂配比的分相结果
表5三相溶剂体系中巴弗洛霉素在各相中分配比
表6三相溶剂体系中大豆油在各相中分配比
由上述表格可知，当正己烷，乙酸乙酯，乙腈，水的混合溶液中，正己烷占30%，乙酸乙酯占20%至正己烷占40%，乙酸乙酯占10%的范围内时，该混合溶剂可以自发形成三相，其中上、中两相为有机相，下相一相为水相，极性以上到下顺序增大。其中各相中因四种溶剂比例不同，呈现出极大的极性差异。通常，在含有油脂的微生物发酵产物粗提物中，油脂的极性往往很小，目标天然产物具有中等的极性，而包括培养基中成分、细胞碎片和色素等杂质极性较大。以该混合溶液溶解萃取上述含油脂粗提物时，根据相似相溶原理，其中极性较小的油脂会极大地分配于上相（有机相）；极性中等的目标天然产物分配于中相（有机相）；大极性杂质分配于下相（水相）。可以依具体实例，通过在可形成三相混合溶剂的配比范围内微调该混合溶剂体系中前两项溶剂（正己烷，乙酸乙酯）的组成，调整各相的极性范围。本发明方法配置的三相溶剂体系从含有残留油脂的粗提物中，分离纯化中等极性天然产物具有较大优势，油脂去除与目标化合物的富集可一步完成。除上述实施例所述外，用石油醚代替正己烷仍有效。
当然，本发明还可有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。