一种人源突变型神经生长因子及其制备方法和应用与流程

本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种人源突变型神经生长因子及其制备方法和应用。

背景技术：

1950年发现，神经生长因子（ngf）是周围神经系统中感觉和交感神经神经元的营养因子，同时也可参与调控中枢神经系统中纹状体和基体前脑胆碱能神经元的营养状态。随着脑源性神经营养因子（bdnf），神经营养蛋白3（nt-3）和神经营养蛋白（nt-4）的发现，ngf现在已是神经营养蛋白家族的重要成员。ngf通过以下2种受体将信号传递至响应的神经元的细胞胞质与核中：140kd的酪氨酸受体激酶a(trka)和75kd的神经营养蛋白受体(p75ntr)。ngf-trka信号可以激发许多经典的神经营养反应。trkb和trkc可介导nt-3和nt-4信号。ngf-p75ntr信号也是ngf的重要信号通路，不仅有利于鞘磷脂-神经酰胺的代谢，同时也参与调节rhoa活性从而调控轴突生长。此外，已有研究证明，p75ntr信号可激活nf-ҡb,akt和jnk信号通路从而诱导细胞凋亡或者促进细胞生存与分化。

基于强大的神经营养作用，目前，ngf对pns和cns疾病的治疗作用已有相关研究。比如，在ngf对基底前脑胆碱能神经元（bfcns）神经营养功能的研究中发现ngf可以用于治疗ad这类退行性疾病。不幸的是，ngf的生物学特性限制了它的治疗范围。ngf不能通过血脑屏障限制了它的系统性运用。而且，即使是小剂量的ngf，运用血管系统传递后都会导致疼痛副作用。近期，一项临床ii期研究发现，运用病毒将ngf运载到基底前脑后是安全的，并没有疼痛副作用。bfcns神经纤维的显著生长可有利证实ngf潜在的神经营养功能，但是对认知方面并没有影响。另外，一些科学家们目前也在致力于研究ngf对糖尿病多发性神经病变的治疗作用。在临床ii期研究中发现，0.1和0.3μg/kg剂量的ngf具有一定的治疗意义，但是在注射位置处存在剂量依赖性的疼痛超敏。在大范围的临床iii期研究中发现，0.1μg/kg剂量的ngf与安慰剂相比没有治疗作用。

在周围神经系统中，ngf不仅是神经营养因子，而且是介导炎症性疼痛和神经性疼痛的重要分子。在临床研究中发现，大剂量的ngf被终止用于ad病患，因为ngf会导致极大的疼痛副作用。在另一项临床研究中，用hiv将ngf用于治疗糖尿病神经病变和周围神经病变也宣告停止，因为ngf具有严重的副作用，包括背部疼痛，注射部位痛觉超敏，肌痛和体重减轻。因此，ngf的疼痛副作用已严重限制它在治疗神经退行性疾病的运用。为了解决疼痛导致的副作用，详细阐明在疼痛过程中ngf的作用和它的受体信号将尤为重要。

一系列的遗传和临床研究证实，ngf可通过trkaandp75ntr介导免疫性疼痛。比如trka隐性突变导致遗传性感觉和自律性神经病变类型iv(hsaniv)(omim#256800)，也称为先天性疼痛感觉迟钝合并缺汗症（cipa）。已有有力证据证实，trka在介导ngf的疼痛敏感性效应中的作用：缓解trka的表达或者药理抑制trka介导的信号通路，如细胞外信号相关激酶(erk)，磷酸肌醇三激酶（pi3k），和磷脂酶cγ(plcγ)都可以缓解ngf所介导的痛觉过敏。此外，p75ntr基因缺失老鼠中，ngf仍然可诱导痛觉过敏，表明trka是ngf诱导痛觉过敏的主要下游分子。p75ntr在疼痛信号通路中作用的证据大部分是间接的证据。比如：注射p75ntr中和抗体可抑制ngf诱导的疼痛行为，而且ngf提高了感觉神经元的反应潜能。因此，trka和p75ntr信号在ngf诱导疼痛中都有起作用。然而，这两个受体在介导疼痛过程中是如何起作用的还不是很清楚。

最近，在瑞典的一个家族中发现一种自发的ngf错义隐性突变，这些病人失去深部痛觉，并常常导致骨折和关节损伤。这种疾病被定义为遗传性感觉自主神经病变类型v(hereditarysensoryautonomicneuropathytypev,hsanv)、(onlinemendelianinheritanceinman(omim)#608654).对这些hsanv病患进行基因分析，发现ngf基因序列的一个位点发生突变(661c>t)，导致成熟的ngf多肽链第100个氨基酸位置上的色氨酸代替了精氨酸(成熟ngfr100w)。不像trka突变导致的iv型hsan，hsanv病人具有正常的认知功能，表明ngf突变不不影响它在中枢神经中的营养功能。我们当前的研究和其他人的研究表明ngfr100w可作为破解ngf神经营养功能和疼痛功能的差异的潜在工具。

ngfr100w最初特点揭示了在培养的细胞中，r100突变可能会打乱ngf前体向成熟的ngf转化，从而导致相对更多的前体ngf释放。鉴于ngfr100w表达困难，catanneo和他的同事运用重组技术，在100这个位置上检测了一系列残留物，包括ngfr100e和ngf双突变(ngfp61s/r100e)。他们发现这些ngfr100突变体可正常结合与trka受体，但是不能结合于p75ntr。这些发现表明，不能激活p75ntr信号通路可以有效的缓解ngf诱导的疼痛，也表明trka信号在疼痛中基本上没有作用。本发明人认为，ngfr100突变可发展为p75ntr拮抗剂，比如ngfr100作为一种无痛ngf治疗制剂。

技术实现要素：

目的一：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种人源突变型神经生长因子，该人源突变型神经生长因子可以支持周围神经系统的感觉神经元和交感神经元，同时也可以调节中枢神经系统和周围神经系统部分神经元的营养状态，但是人源突变型神经生长因子不会像其野生型神经生长因子ngf^wt引起疼痛反应，从而解决长期困扰和阻碍神经生子因子（ngf）在临床上运用的关键问题，使其可用于预防或治疗各种外周性与中枢性神经性以及免疫疾病等。

为了实现上述目的一，本发明采用的技术方案是：一种人源突变型神经生长因子，其特征在于：包括hngf^r100和hngf(kke/δ9/13)，所述人源突变型神经生长因子的氨基酸序列如图1所示，所述hngf^r100的前体（prongf^r221）的氨基酸序列如图2所示，所述kke=k32/k34/e35，δ9/13为去除9-13位置的氨基酸碱基。

进一步的，所述hngf^r100为hngf^r100w、hngf^r100e、hngf^r100x或hngf^r100p，所述x为除了r，w，e，p之外的任何氨基酸碱基及衍生物，所述kke=k32a/k34a/e35a或kke=k32b/k34b/e35b。

进一步的，人源突变型神经生长因子为在野生型人神经生长因子前体（prongf）多肽链的第221个氨基酸位置上取代部分氨基酸残基侧链所形成的，所述野生型人神经生长因子前体（prongf）的氨基酸序列为seqidno：np_002497.2，所述取代原氨基酸残基侧链的取代氨基酸侧链包括一至五个取代氨基酸，取代氨基酸包括疏水性氨基酸(a、i、l、m、f、p、w、y、v)、亲水性氨基酸(r、d、n、c、e、q、g、h、k、s、t)、脂肪族侧链的氨基酸(g、a、v、l、i、p)、含羟基侧链的氨基酸(s、t、y)、含硫原子侧链的氨基酸(c、m)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(d、n、e、q)、含碱性基团侧链的氨基酸(r、k、h)、含芳香族侧链的氨基酸(h、f、y、w)中的至少一种。

上述人源突变型神经生长因子是野生型人神经生长因子前体（prongf）多肽链的第221个氨基酸位置上的色氨酸代替了精氨酸（prongf^r221），导致成熟的ngf多肽链第100个氨基酸位置上的色氨酸代替了精氨酸(成熟ngf^r100)。hngf^r100可以支持周围神经系统的感觉神经元和交感神经元，同时也可以调节中枢神经系统和周围神经系统部分神经元的营养状态，但是hngf^r100不会像其野生型ngf^wt引起疼痛反应。

常见的可以缺失或添加一个或几个氨基酸的部分包括纯化标签（如avi-tag，his-tag）、n端的met、n端的信号肽等，这些都是本领域技术人员所熟知的。当在原核生物中表达，蛋白n端一般需要有编码met的核苷酸序列；为了在真核生物中分泌表达，蛋白n端通常需要有信号肽。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、插入或添加了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南（第三版）》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。优选的是取代、缺失或添加一个至五个氨基酸，更优选是一个至三个氨基酸。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸。例如，侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(a、i、l、m、f、p、w、y、v)、亲水性氨基酸(r、d、n、c、e、q、g、h、k、s、t)、脂肪族侧链的氨基酸(g、a、v、l、i、p)、含羟基侧链的氨基酸(s、t、y)、含硫原子侧链的氨基酸(c、m)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(d、n、e、q)、含碱性基团侧链的氨基酸(r、k、h)、含芳香族侧链的氨基酸(h、f、y、w)。

发明目的二：本发明提供了一种编码人源突变型神经生长因子的核酸，其特征在于：所述人源突变型神经生长因子的核酸为dna分子或rna分子形式，所述dna分子包括重组的dna和人工合成的cdna，重组的dna为编码链或模板链，所述核酸的多核苷酸序列如图3所示，该人源突变型神经生长因子的核酸的前体（prongf^r221）如图4所示，野生型人神经生长因子前体（prongf）的多核苷酸序列如seqidno：np_002497.2所示，所述人源突变型神经生长因子的氨基酸序列如图1所示，人源突变型神经生长因子的前体（prongf^r221）的氨基酸序列如图2所示。

上述核酸，可以是dna形式，也可以是rna形式，优选dna形式。dna形式包括重组的dna和人工合成的cdna，dna可以是编码链或模板链。通过常规技术，如pcr方法、dna重组技术或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列或其片段。事实上，根据设计的多核苷酸序列，当前已经能够通过商业渠道规范地制备出相应的dna。一旦获得核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核苷酸序列。在本发明的具体实施方式中，本发明的核酸的多核苷酸序列如图3所示，其前体prongf^r221如图4所示，野生型prongf多核苷酸序列如seqidno：np_002497.2所示。

发明目的三：本发明提供了一种包含有可编码人源突变型神经生长因子的核酸的载体，其特征在于：包括在细菌中表达用的原核表达载体；在酵母中表达用的毕赤酵母载体、汉逊酵母载体；在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体；在哺乳动物的细胞中表达用的痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体。

本发明提供了载体，其含有上述的核酸。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如his，leu，trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在本发明的具体实施方式中，本发明的载体是pcdna，其适合在哺乳动物细胞中表达。

发明目的四：本发明提供了一种包含有如上发明目的三中所述载体的细胞，其特征在于：该细胞为转化或转染有所述人源突变型神经生长因子核酸的人胚肾上皮细胞（hek293）。

上述细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。本领域技术人员熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法、原生质体融合法、脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。令人惊讶的是，本发明人从当前天文数字般的宿主细胞中发现了鼠骨髓瘤细胞能够分泌表达转染入其中的本发明的hngf^r100，由此无需破碎细胞即可利用相对杂质成分较少的培养上清液直接进行纯化。因此，本发明优选所述细胞是转化或转染有本发明上述核酸的人胚肾上皮细胞（hek293）和其它用于制造生物药品的人源细胞株系。

发明目的五：本发明提供了一种人源突变型神经生长因子的制备方法，其方法如下：

第一，①设计人源突变型神经生长因子的氨基酸序列如图1所示，②利用人胚肾上皮细胞（hek293）细胞密码子表达频率优化出了编码该人源突变型神经生长因子蛋白质的基因，该基因的多核苷酸序列如图3所示，③通过pcr法分段拼接出多核苷酸序列如图3所示的dna，并克隆入pcdna质粒中以形成hngf^r100-avitag质粒，转化大肠杆菌（e.coli）xl-1，④抽提出hngf^r100质粒，经酶切和测序鉴定，其中以符合读框的顺序包含了多核苷酸序列如seqidno：1所示的dna；

第二，设计人源突变型神经生长因子前体（prongf^r100）的氨基酸序列如图2所示，②利用人胚肾上皮细胞（hek293）细胞密码子表达频率优化出了编码该人源突变型神经生长因子前体（prongf^r100）蛋白质的基因，该基因的多核苷酸序列如图4所示，③通过pcr法分段拼接出多核苷酸序列如图4所示的dna，并克隆入pcdna质粒中以形成pcdna/1c质粒，转化大肠杆菌（e.coli）xl-1，④抽提出prongf^r100质粒，经酶切和测序鉴定，其中以符合读框的顺序包含了多核苷酸序列如图4所示的dna；

第三，将hngf^r100-avitag质粒和pcdna/1c质粒分别按照电转化方法转染入hek293细胞中进行分泌表达，得到分别转染了hngf^r100或prongf^r100质粒的阳性转染细胞及其培养物；

第四，将分别转染了hngf^r100-hngf(kke/δ9/13)或prongf^r100质粒的阳性转染细胞及其培养物的培养上清液依次用proteina亲和层析、sp-sepharose离子交换层析和q-sepharose层析纯化后得到人源突变型神经生长因子hngf^r100。

上述制备方法，其包括以下步骤：用本发明目的四所述的细胞表达本发明目的一所述的hngf^r100，并分离所述的hngf^r100。表达本发明发明目的一所述的hngf^r100的细胞可以通过常规方法培养和/或诱导来表达所需要的hngf^r100。表达的hngf^r100可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。分离（纯化）的方法包括但不限于：裂菌（超声波裂菌、渗透压裂菌），离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及变性、复性处理等。由于鼠骨髓瘤细胞能够分泌表达转染入其中的本发明的hngf^r100，因此优选直接将细胞表达的培养上清液用以分离。优选在本发明的第五个方面中，分离过程包括，将细胞表达的培养上清液依次用proteina亲和层析、sp-sepharose离子交换层析和q-sepharose层析纯化。

发明目的六：本发明提供了一种用于预防或治疗外周性、中枢性、神经性以及免疫疾病的药物组合物，其特征在于：包括人源突变型神经生长因子以及还包括人源突变型神经生长因子的载体。

进一步的，所述载体包括无毒的填充剂、无毒的稀释剂、无毒的佐剂或无毒的制剂辅料。

进一步的，药物组合物制成为片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、或喷雾剂型的剂型。

本发明提供了hngf^r100临床应用的药物组合物，其包括本发明发明目的一所述的hngf^r100以及药学上可接受的载体。上述的药物组合物能用于预防或治疗各种外周性与中枢性神经性以及免疫疾病等，例如由于糖尿病多发性神经病变等。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、或喷雾剂型。

采用上述方案，本发明的人源突变型神经生长因子的应用在于制备可预防或治疗各种外周性与中枢性神经性以及免疫疾病等（如糖尿病多发性神经病变）的药物。

本发明的有益效果在于：人源突变型神经生长因子可以支持周围神经系统的感觉神经元和交感神经元，同时也可以调节中枢神经系统和周围神经系统部分神经元的营养状态，但是hngf^r100不会像其野生型ngfwt引起疼痛反应，从而解决长期困扰和阻碍ngf在临床上运用的关键问题；本发明的hngf^r100可以利用特定的哺乳动物细胞分泌表达，在糖基化谱接近于人类的同时，更方便了后期的纯化。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

附图说明

附图1为本发明hngf^r100w氨基酸序列图；

附图2为本发明prongf^r221w氨基酸序列图；

附图3为本发明hngf^r100w多核苷酸序列图；

附图4为本发明prongf^r221w多核苷酸序列图；

附图5为本发明hngf^r100w多核苷酸序列和氨基酸序列对照图；

附图6为本发明prongf^r221w多核苷酸序列和氨基酸序列对照图。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就如其全文已经包含于本文之中。

本发明通过具体的实施例来进行示例性的说明，其中，如有未尽之处，可参见《分子克隆实验指南（第三版）》（科学出版社，北京）等实验手册以及市售的试剂和试剂盒的使用说明。

本发明设计了一种人源突变型神经生长因子，其包括hngf^r100和hngf(kke/δ9/13)，人源突变型神经生长因子的氨基酸序列如图1所示，所述hngf^r100的前体（prongf^r221）的氨基酸序列如图2所示，所述kke=k32/k34/e35，δ9/13为去除9-13位置的氨基酸碱基。优选的，hngf^r100为hngf^r100w、hngf^r100e、hngf^r100x或hngf^r100p，其中，x为除了r，w，e，p之外的任何氨基酸碱基及衍生物，kke=k32a/k34a/e35a或kke=k32b/k34b/e35b。本发明的实施例以hngf^r100和hngf(k32a/k34a/e35a)为例子具体说明。

实施例1本发明的hngf^r100w的设计

我们设计了氨基酸序列如图1所示的hngf^r100w蛋白质，并根据我们研究得到的hek293细胞密码子表达频率优化出了编码该蛋白质的基因，其多核苷酸序列如图3所示，根常规的pcr法分段拼接出多核苷酸序列如图3所示的dna，并克隆入pcdna质粒（可购自invitrogen公司））中以形成hngf^r100w-avitag质粒，转化大肠杆菌（e.coli）xl-1。抽提出hngf^r100w质粒，经酶切和测序鉴定，其中以符合读框的顺序包含了多核苷酸序列如seqidno：1所示的dna，其在理论上能够表达氨基酸序列如图1所示的蛋白质。

另外，我们设计了氨基酸序列如图2所示的prongf^r100w蛋白质，并根据我们研究得到的hek293细胞密码子表达频率优化出了编码该蛋白质的基因，其多核苷酸序列如图4所示，根据常规的pcr法分段拼接出多核苷酸序列如图4所示的dna，并克隆入pcdna质粒（可购自invitrogen公司）中以形成pcdna/1c质粒，转化大肠杆菌（e.coli）xl-1。抽提出hngf(k32a/k34a/e35a)-prongf^r100w质粒，经酶切和测序鉴定，其中以符合读框的顺序包含了多核苷酸序列如图4所示的dna，其在理论上能够表达氨基酸序列如图2所示的蛋白质。

以上质粒均返回给我们进行下一步实验。

实施例2本发明的hngf^r100w-hngf(k32a/k34a/e35a),的表达和纯化以上两个质粒分别按照常规的电转化方法转染入hek293细胞（可购自上海爱丁堡生物科技发展有限公司）中进行分泌表达。简而言之，hngf(k32a/k34a/e35a)-hngf^r100w或prongf^r100w质粒各取40μg，用限制性内切酶sali.分别酶切以线性化，冰浴备用。在37°c、5%co2的条件下，将hek293细胞培养于10%灭活胎牛血清（gibco，australia），1%青霉素和链霉素（invitrogen，carlsbad，ca，usa）的dmem高糖培养液（gibco，australia）。当达到指数生长期并且存活率大于90%时，用冰冷的pbs（ph7.2）洗涤后重悬于pbs（ph7.2）中（浓度为1x10⁷个细胞/ml），然后用genepulser电转化仪分别转化线性化的hngf^r100w或prongf^r100w质粒各（电转化参数为：1500伏，3µfd）。冰浴5分钟后，加入dmem培养基于37°c培养，然后转移入添加了5μg/mlblasticidin）的dmem培养基中培养约3-4周，直至出现显著的细胞死亡情况并且存活的细胞呈离散状，得到分别转染了hngf^r100w或prongf^r100w质粒的阳性转染细胞及其培养物。

吸取两种细胞不同培养阶段的培养基上清液，分别根据elisa检测其中氨基酸序列如图1和2所示的蛋白质的表达量。根据厂商说明，利用caltaglaboratories(southsanfrancisco,美国)elisa检测试剂进行检测，在微平板读数仪(bio-tek)上读取od405，计算所得蛋白质的表达量。结果如图1和2所示，这两种蛋白质都够被hek293分泌表达，而且表达量均能超过100mg/l的较高表达水平。

分别取3l两种细胞培养平台期的上清液，上样于用pbs（ph7.2）平衡的proteina亲和层析柱（可购自gehealthcare公司），然后用5倍柱体积的pbs（ph7.2）洗，均弃去流出液。然后用3倍柱体积的0.1m乙酸缓冲液（ph3.0）洗脱蛋白，收集洗脱液并加入2mtris以中和ph至5.5。然后，将中和的洗脱液以4ml/min的流速上样于sp-sepharose离子交换层析柱（可购自gehealthcare公司），用0.05m乙酸缓冲液（ph5.5）洗，弃去流出液。然后用含0.15mnacl的磷酸缓冲液（ph7.4）洗脱蛋白，用分光光度仪检测流出液，当od280超过0.2开始持续收集，直至od280重新回落到0.4。将该洗脱液以4ml/min的流速上样于q-sepharose层析柱（可购自gehealthcare公司），用分光光度仪检测流出液，当od280超过0.2开始持续收集，直至od280重新回落到0.4。收集的流出液分别在还原条件下和非还原条件下进行sds-page检测，氨基酸序列如图1和2所示的蛋白质都能够得到有效纯化。

实施例3前体ngf^r100w剪切成ngf^r100w和ngf^r100w纯化prongf^r100w是ngf^r100w前体。因此，prongf^r100w序列被剪切从而得到有活性的ngf^r100w。与胰蛋白酶样底物相互作用的蛋白酶特异性剪切蛋白，并没有消化蛋白分子的活性部位。胰蛋白酶样蛋白酶剪切肽键，形成带正电荷氨基酸，比如精氨酸和赖氨酸。作为胰蛋白酶样蛋白酶，一些丝氨酸蛋白酶（丝氨酸肽链内切酶）参与了prongf^r100w转化为ngf^r100w过程。更好的是，丝氨酸胰蛋白酶被用于剪切前序列，而其它蛋白酶可以用来替代丝氨酸蛋白酶的功能。值得注意的是，剪切不是只是针对胰蛋白酶本身，而是也包括了其它有胰蛋白酶样的底物。通常，如果prongf^r100w/ngf^r100w的比例比较合理的情况下，成熟的beta-ngf就不会被这种蛋白酶剪切。相反，变性蛋白和折叠中间产物暴露的序列就比较容易被蛋白酶剪切掉。

为了更好的将prongf^r100w剪切成ngf^r100w，胰蛋白酶相对prongf^r100w突变的比例是从1:200至1:100,000；比较理想的是1:5000至1:20,000；最好的是1:10,000（w/w）。在最优化的条件下，常温下剪切8至23小时，最好是18小时。在该专利所设定的条件下，prongf^r100w被完全剪切，而且几乎没有副产物产生，也没有发现任何聚合物。

prongf^r100w突变剪切产生的ngf^r100w将用层析法等进一步纯化。进一步纯化步骤要求将胰蛋白酶与ngf^r100w胰蛋白酶消化产生的相关杂质分离。纯化步骤将减少hcps，内毒素和dna等。任何蛋白纯化的方法都可以使用。最好的方法是层析法纯化，比如用琼脂糖分离柱。终产物beta-ngf将用sds-page，rp-hplc，se-hplc和iex-hplc等方法鉴定其纯度。

磷酸盐缓冲液将用于prongf^r100w消化成ngf^r100w的过程，它并不会一直蛋白酶的活性。磷酸钠缓冲液被加到mep-洗脱液中至终浓度为25mm。ph值为6.5。对于蛋白分解，胰蛋白酶(roche,gmpgrade)是按照1:10,000(w/w)(trypsin:prongfr100wt)比例添加。蛋白裂解条件是在常温条件下裂解18个小时。胰蛋白酶消化后，beta-ngf被转载在sp琼脂糖hp柱上过滤胰蛋白酶，剪切副产物和相关杂质。柱子由25mm的磷酸钠缓冲液（ph6.5）平衡。胰蛋白酶消化反应被转载在sp琼脂糖hp柱上(2gbeta-ngf/l介质)，没结合的蛋白将被平衡液洗脱下来。洗脱过程将分为三个步骤(3cv25%25mm磷酸钠ph6.5/1m氯化钠洗脱(缓冲液b),10cv25%至50%缓冲液b进行线性梯度洗脱,and3cv100%缓冲液b(流速为60cm/h))。

sequencelisting

<110>温州医科大学

温州市生物医药协同创新中心

<120>一种人源突变型神经生长因子及其制备方法和应用

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