一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术：

对映纯对氯环氧苯乙烷(pcso)与其水解产物对氯苯乙二醇(pcped)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如r型对氯环氧苯乙烷((r)-pcso)可以用于合成cb1拮抗剂；r型对氯苯乙二醇((r)-pcped)是nmda受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pcso与pcped的生物化学方法已经被报道。其中，suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(r)-pcso，其eep最高可达47％；karboune等人利用来自重组黑曲霉(aspergillusniger)的环氧化物水解酶(aneh)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(r)-pcso，当转化率达到51％时，eep为87％并保留s型底物；manoj等人使用两种对映选择性互补的eh(steh与aneh)协同水解外消旋pcso合成(r)-pcso，eep达到93％。利用ehs催化制备(r)-pcso与(r)-pcped与席夫碱催化合成相比，具有eep高，来源清洁，更易分离等优势。

环氧化物水解酶(epoxidehydrolases,ehs,ec3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的ehs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，ehs对外消旋环氧化物的对映选择率e决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ees和eep。

ehs广泛存在于各生物体中，如真菌、细菌、古生菌、病毒、植物和哺乳动物等。迄今为止，ncbi数据库中收录的ehs基因序列已达数千个。pdb数据库中与ehs晶体结构相关的数据已达两百多条，根据其晶体结构与催化机理的不同，ehs分为三类：(1)α/β水解折叠ehs，例如有微生物来源的areh，植物来源的steh和动物来源的mmseh；(2)非α/β水解折叠ehs，例如来源于人的lta4h；(3)其他类型，例如来源于红串红球菌的leh。为了更好地将pveh1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，对现有的ehs中进行结构和特性方面的优化显得十分必要。

技术实现要素：

为了更好地将pveh1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，本发明利用定点突变获得了立体选择性提高的pveh1突变体。本发明采用全质粒pcr的方法对102位色氨酸进行单向定点突变，获得了立体选择性和催化活性同时提高的突变酶w102l，解决了立体选择性不能满足生产高对映纯环氧化物与邻二醇的需求，为拓宽pveh1的工业应用奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种催化外消旋环氧化物的方法，所述方法是向含有外消旋环氧化物的体系中加入seqidno.1所示的环氧化物水解酶或表达seqidno.1所示的环氧化物水解酶的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述含有外消旋环氧化物的体系为溶液体系。

在本发明的一种实施方式中，所述外消旋环氧化物包括但不限于外消旋对氯环氧苯乙烷。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在ph为6～8的有机相中进行催化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述有机相包括但不限于甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将seqidno.1所示的环氧化物水解酶表达至大肠杆菌中，培养菌体细胞，以200～280u/g底物的添加量加入所述细胞，催化外消旋对氯环氧苯乙烷生成r型对氯环氧苯乙烷及r型对氯苯乙二醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将seqidno.1所示的环氧化物水解酶表达至大肠杆菌中，培养菌体细胞，以235u/g底物的添加量加入所述细胞，催化外消旋对氯环氧苯乙烷生成r型对氯环氧苯乙烷及r型对氯苯乙二醇。

本发明还提供所述环氧化物水解酶在食品、医药领域水解外消旋环氧化物方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备手性药物或功能材料。

本发明的有益效果：

本发明通过菜豆来源的环氧水解酶1(pveh1)的trp102进行单向定点突变，获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶w102l。与野生型相比，w102l对外消旋对氯环氧苯乙烷rac-pcso的e值从2.6提高至25.5，这表明w102l对rac-pcso的对映选择性提高了9.8倍。同时，该突变体的稳定性没有发生变化，有利于酶在工业生产上的应用

附图说明

图1为pveh1w102l拆分pcso液相色谱分析以及ees与初始底物浓度关系；(a)为全细胞催化反应的液相色谱分析；(b)为ees与初始底物浓度关系；

图2为pveh1w102l全细胞动力学拆分rac-pcso进程曲线。

具体实施方式

突变体命名方式：

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如w102l，表示位置102的氨基酸由亲本pveh1的trp替换成leu，位置的编号对应于亲本pveh1的氨基酸序列。

全细胞比活力和对映选择性测定：称取100mg重组菌湿菌体悬浮于1ml磷酸钠缓冲液(100mmol·l^-1，ph＝7.0)中，吸取200μl菌悬液(100mg·ml^-1)加入到含750μl磷酸钠缓冲液的2mlep管中，25℃孵育5min后加入50μlrac-pcso(200mmol·l^-1，溶剂为甲醇)至终浓度为10mmol·l^-1，25℃、800r·min^-1恒温震荡反应器中反应10min，取50μl样品用1ml乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥。样品分析采用高效液相色谱仪waterse2695、手性液相色谱柱和紫外检测器。rac-pcso高效液相色谱条件为：流动相为正己烷:异丙醇＝80:20，柱温为30℃，流速为0.8ml·min^-1，检测波长为220nm，手性液相色谱柱as-h(250mm×4.6mm×5μm)。(r)-对氯环氧苯基乙烷((r)-pcso)：6.290min，(s)-p对氯环氧苯基乙烷((s)-pcso)：7.062min，(r)-对氯苯基乙二醇((r)-pcped)：7.977min，(s)-对氯苯基乙二醇((s)-pcped)：9.059min。在上述测定条件下，酶活单位定义为每分钟消耗1μmol的pcso或rac-mcso所需的酶量定义为1个单位酶活(u)。全细胞比活力(u·g^-1)计算如公式(1)所示，其中c全细胞催化rac-pcso或rac-mcso的转化率，c0为初始浓度，t为反应时间，v为反应体积，m为全细胞质量。

底物ees和产物eep的计算公式(2)和(3)所示，其中rs和ss分别代表(r)-pcso和(s)-pcso的峰面积，rp和sp表示(r)-pcped和(s)-pcped的峰面积^[17]。酶的对映选择性通常用对映体比率(enantiomericratio,e)来评价，e值越高，则对映选择性越高，其计算公式如(4)，其中c是转化率。

实施例1：突变质粒构建

利用高纯度质粒小提试剂盒pureplasmidminikit(购于康为试剂有限公司)从实验室保藏的e.colibl21(de3)/pet-28a-pveh1(叶慧华,胡蝶,李闯,等.新型菜豆环氧化物水解酶的异源表达及对映归一性催化特性[j].中国生物工程杂志,2016,36(10):21-27.169:41-54.)中提取质粒作为单向定点突变的模板，

所用的引物为w102l-f(5’-3’gttgcccatgatctcggagccctagta)；w102l-r(tactagggctccgagatcatgggcaac)。

利用hspcr酶(购于takara公司)采用全质粒pcr的方法。以pveh1的质粒为模板，pcr条件：变性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，3.5min，循环30次，72℃延伸10min。pcr产物经采用dpni酶消化模板质粒转化e.colibl21(de3)感受态细胞，转化参照sk9302超级感受态细胞制备试剂盒使用说明书，突变体经测序确认碱基序列。得到了氨基酸序列为seqidno:1的突变酶，与野生酶(phaseolusvulgaris来源的pveh1，genbankaccessionno.xm007146940)相比，第102位的氨基酸由色氨酸突变成了亮氨酸。

实施例2：突变体酶的获取

将获得的突变酶表达载体接种(接种量为1％)于2ml含1％卡那霉素的lb培养基中，于37℃、220r·min^-1培养过夜；取2ml培养液转接于100ml含1％卡那霉素的lb培养基中，培养至od600为0.6～0.8时，加入100μl的iptg(500mmol·l^-1)至终浓度为0.5mmol·l^-1，20℃下诱导10h后离心收集重组菌菌体。经测定，菌体的环氧化物水解酶对rac-pcso的酶活为27u/g菌体。

实施例3：全细胞催化初始底物浓度分析

在2mlep管中加入湿菌体菌悬液浓度为200mg·ml^-1的pveh1^w102l全细胞，底物初始浓度从0到300mmol·l^-1的rac-pcso，缓冲液为磷酸钠缓冲液(ph＝7.0，100mmol·l^-1)，反应体系为1ml，25℃、220r·min^-1恒温摇床中反应12h后，取50μl样品用1ml乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后hplc测定ees。

如图1(a)所示，利用pveh1^w102l全细胞催化rac-pcso水解过程中未见明显的副产物生成，其中(s)-pcso被pveh1^w102l优先催化水解为(r)-pcped。

采用终浓为200mg·ml^-1的pveh1^w102l分别拆分初始浓度从50到300mmol·l^-1不等的rac-pcso，反应12h，结果如图1(b)。当底物初始浓度≤150mmol·l^-1时，最终ees均可到达99％，这意味着经过24h反应后(s)-pcso基本被水解完全。而当底物初始浓度大于150mmol·l^-1时，体系中的(s)-pcso不能被完全水解。

实施例4：全细胞催化反应进程

在2mlep管中加入湿菌体菌悬液浓度为200mg·ml^-1的pveh1^w102l全细胞，底物初始浓度为150mmol·l^-1的rac-pcso，缓冲液为磷酸钠缓冲液(ph＝7.0，100mmol·l^-1)，反应体系为1ml，25℃、220r·min^-1恒温摇床中，反应不同时间取50μl样品用1ml乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后使用hplc测定残余(r)-pcso和(s)-pcso的浓度、ees、eep和c绘制反应进程曲线。

通过对于pveh1^w102l全细胞动力学拆分初始浓度为150mmol·l^-1的rac-pcso定期取样监测(结果如图2)，发现在pveh1^w102l催化的rac-pcso水解开环反应中，产物(r)-pcped的eep可达到90％以上，符合利用生物催化法生产高对映纯(r)-pcped的工业要求；此外，反应过程中(s)-pcso的浓度从初始的75mmol·l^-1经过4h的反应快速下降到了1.29mmol·l^-1，仅为初始浓度的0.8％。此时(r)-pcso的产率为45.62％，(s)-pcso的保留率仅为0.8％，ees为96.30％，并且(r)-pcped产率达到了50.91％，eep为90.26％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及其应用

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