本发明涉及植物叶蛋白的提取方法，尤其涉及鲁梅克斯叶蛋白的提取方法，属于植物叶蛋白的提取领域。
背景技术：
植物叶蛋白是以青绿的植物茎叶为原料，经榨汁、分离、浓缩、干燥等过程制备而成的蛋白质浓缩物。叶蛋白含有丰富的蛋白质，其营养丰富，氨基酸组成均衡，生物效价高，不含有胆固醇，可以用作动物饲料或食品添加剂，植物叶蛋白各种氨基酸组成接近动物蛋白，且无动物蛋白所含的胆固醇，具有防病治病、防衰抗老、强身健体等生理功能，是一种具有开发价值的少有的蛋白质资源。
鲁梅克斯全称鲁梅克斯k-1杂交酸模，又叫高秆菠菜，属于蓼科(polygonaceae)酸模属(rumex)(鲁喜荣.鲁梅克斯的栽培技术[j].草业科学,2006,23(3):63-64)。鲁梅克斯干品中的营养成分为粗蛋白质34.0％，粗脂肪3.6％，粗纤维13.0％，无氮浸出物8.3％，粗灰分18％(孟宪宝.优质饲草鲁梅克斯高产栽培技术[j].黑龙江畜牧兽医,2011,14:113)。鲁梅克斯是具有高抗逆的高蛋白植物，具备饲食双用的特点，是一种极具开发价值的植物蛋白资源。但是目前鲁梅克斯还主要作为牧草应用于畜牧业，对其研究也主要是鲁梅克斯种植及其对养殖牲畜的营养作用，用鲁梅克斯作原料提取叶蛋白的研究还较少。
因此，开发一种鲁梅克斯叶蛋白的提取方法，对于实现鲁梅克斯的植物资源推广利用尤为重要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种鲁梅克斯中叶蛋白的提取方法，该方法操作简便、叶蛋白的得率高。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种鲁梅克斯叶蛋的提取方法，包括以下步骤：(1)将鲁梅克斯茎或叶与制浆提取液混合制成匀浆；(2)将匀浆超声处理后过滤得到上清液；(3)将上清液ph值调为碱性后加热絮凝沉淀；(4)将沉淀离心、干燥，即得。
其中，步骤(1)中所述的制浆提取液可以是磷酸钠缓冲液、磷酸氢钠缓冲液、碳酸钠缓冲液或nacl溶液；作为本发明的一个具体的实施方式，本发明采用了0.4％的nacl溶液作为制浆提取液，其中，按照g/ml计，鲁梅克斯与提取液的料液比为1：2-7；本发明通过单因素实验发现，鲁梅克斯茎或叶与提取液的料液比对于提取效果有显著的影响，在絮凝ph值为10，絮凝温度为60℃，絮凝时间为30min时，当鲁梅克斯与提取液的料液比为1：2、1:3、1：4时，叶蛋白的提取率分别为0.75％、0.85％和0.87％；当料液比为1：5时，叶蛋白的提取率跃升到0.96％，当料液比再提升为1：6、1：7时，叶蛋白的提取率不仅未提升反而呈下降趋势，分别为0.95％和0.94％；因此，步骤(1)的料液比优选为1：5。
步骤(2)中所述的超声处理条件可以植物叶蛋白提取时所采取的常规的超声处理参数，例如：温度可以为20-35℃，超声波功率可以为30-50khz，超声处理时间可以为10-60min；作为本发明的一个具体的实施方式，所述的超声处理条件为温度为25℃、超声波功率优选为40khz，超声处理时间优选为30min。
步骤(2)中所述的过滤方式是本领域的常规过滤方式，例如，可以采用纱布过滤；本发明的一个具体的实施方式是以4层200目滤布过滤匀浆。
步骤(3)中的所述的碱性ph值范围为可以7-12；ph值对于提取效果的影响非常显著，本发明通过单因素优选实验发现，在料液比为1：5，絮凝温度为60℃，絮凝时间为30min时，当上清液ph值为7-9时，叶蛋白的得率最高仅为0.38％，当上清液ph值为10时，叶蛋白的得率达到0.96％，当ph值为11时，叶蛋白的得率下降为0.81％，当ph值为12时，叶蛋白的得率更下降为0.72％；因此，本发明的步骤(3)中优选将上清液ph值调为10。
步骤(3)所述的加热温度范围可以为40-90℃；本发明通过单因素优选实验发现，在料液比为1：5，上清液ph值为10、加热絮凝时间为30min时，加热温度为40℃、50℃时，叶蛋白的提取率分别为0.29％，0.33％，当加热温度为60℃时，叶蛋白的提取率达到0.96％，当加热温度为70℃、80℃和90℃、叶蛋白的提取率又呈急剧下降趋势，其提取率分别为0.41％、0.27％和0.32％，因此，步骤(3)中所述的加热温度最优为60℃；其中，所述的加热方式可以采取水浴的加热方式。
步骤(3)中所述的加热絮凝沉淀时间可以是10-60min；本发明通道单因素优选实验发现，在料液比为1：5，上清液ph值为10、加热温度为60℃时，加热絮凝沉淀时间分别为10min和20min时，叶蛋白的提取率分别为0.34％和0.37％，当加热絮凝沉淀时间为30min时，叶蛋白的提取率达到0.96％，当加热絮凝沉淀时间分别为40min、50min和60min时，叶蛋白的提取率又呈急剧下降趋势，其提取率分别为0.45％、0.38％和0.39％，因此，步骤(3)中所述的加热絮凝沉淀时间最优选为30min。
步骤(4)中所述的离心转速为500-15000r/min，离心时间可以为2-30min；优先为离心转速为5000r/min，离心时间为10min；步骤(4)中所述的干燥温度可以为40-70℃，优选为60℃。
本发明进一步根据design-expert软件中的box-benhnken(bbd)中心组合实验设计原理，进行响应面实验设计，对鲁梅克斯叶蛋白得率有显著影响的四个因素：(a)料液比、(b)加热絮凝沉淀温度、(c)絮凝ph值(即：上清液的ph值)、(d)加热絮凝沉淀时间做4因素3水平的响应面分析实验，经响应面优化得到理论最佳工艺：料液比为1:4.348、絮凝ph为10.57、絮凝温度为58.19℃、絮凝时间为40min，理论得率为0.946001％。经4次重复验证实验发现，采用料液比为1:4.348、絮凝ph为10.57、絮凝温度为58.19℃、絮凝时间为40min采用叶蛋白的得率分别为1.0972％、1.1895％、1.2212％、1.2363％，平均值为1.18605％大于理论得率为0.946001％。
由此，本发明进一步提供了一种鲁梅克斯中叶蛋的提取方法，包括以下步骤：(1)按照g/ml计，将鲁梅克斯茎或叶与制浆提取液按照1:4.348的料液比混合制成匀浆；(2)将匀浆超声处理后过滤得到上清液；(3)将上清液ph值调为10.57后加热絮凝沉淀；期中，所述的加热温度为58.19℃，加热絮凝沉淀时间为40min；(4)将沉淀离心、干燥，即得。
本发明对比已有5种叶蛋白提取方法(加热法、酸法、碱法、酸热法、碱热法)，分别用于鲁梅克斯叶蛋白提取，根据得率的差异性发现，碱热法的提取效果显著优于加热法、酸法、碱法以及酸热法的提取方法，因此本发明采用碱热法用于鲁梅克斯叶蛋白的提取方法。
本发明通过进一步的单因素优选实验，对显著影响鲁梅克斯提取效果的料液比、絮凝ph值、加热絮凝沉淀温度以及热絮凝沉淀时间进行了单因素优化；优化结果发现，当料液比为1:5、絮凝ph值为10、加热絮凝沉淀温度为60℃、热絮凝沉淀时间为30min时，叶蛋白的提取率相比其它的参数呈显著提升；本发明进一步根据design-expert软件中的box-benhnken(bbd)中心组合实验设计原理，进行响应面实验设计，对鲁梅克斯叶蛋白得率有显著影响的四个因素：(a)料液比、(b)加热絮凝沉淀温度、(c)絮凝ph值(即：上清液的ph值)、(d)加热絮凝沉淀时间做4因素3水平的响应面分析实验，经响应面优化得到理论最佳工艺：料液比为1:4.348、絮凝ph为10.57、絮凝温度为58.19℃、絮凝时间为40min，理论得率为0.946001％；本发明为了验证上述最佳工艺进行了4次重复验证实验，实验结果发现，叶蛋白的得率平均值为1.18605％，大于理论得率0.946001％。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明中的叶蛋白提取方法，着重优化了料液比、絮凝ph、絮凝温度和絮凝时间4个因素。该方法在用于鲁梅克斯叶蛋白提取时，相对于以往其他的方法，诸如加热法、酸热法等，具有针对性强、得率高、蛋白致密、易分离等优点，极大地提高了提取效果，为工业大规模生产提供一种高效快捷的工艺思路。
附图说明
图1本发明制备鲁梅克斯叶蛋白的工艺流程图。
图2料液比及絮凝温度对鲁梅克斯叶蛋白得率影响的响应曲面结果。
图3料液比及絮凝ph对鲁梅克斯叶蛋白得率影响的响应曲面。
图4料液比及絮凝时间对鲁梅克斯叶蛋白得率影响的响应曲面。
图5絮凝温度与絮凝ph对鲁梅克斯叶蛋白得率影响的响应曲面。
图6絮凝温度与絮凝时间对鲁梅克斯叶蛋白得率影响的响应曲面。
图7絮凝ph与絮凝时间对鲁梅克斯叶蛋白得率影响的响应曲面。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
俄罗斯引种鲁梅克斯；
实施例1鲁梅克斯叶蛋白的提取
取叶簇期新鲜鲁梅克斯茎叶100g，选用0.4％的nacl溶液作为制浆提取液，将鲁梅克斯与提取液按料液比为1：4.348混合制浆，匀浆在25℃经40khz超声波处理30min，再经4层200目滤布过滤得到上清液。将上清液ph调至10.57，58.19℃水浴加热40min，叶蛋白絮凝沉淀。将沉淀5000r/min，离心10min，弃上清，沉淀60℃烘干，制成粉末。
经4次重复提取实验，叶蛋白的得率分别为1.0972％、1.1895％、1.2212％、1.2363％，平均值为1.18605％，大于理论得率为0.946001％。
实验例1鲁梅克斯叶蛋白提取工艺优化
1、实验方法
1.1叶蛋白提取方法筛选
材料处理：选取叶簇期新鲜鲁梅克斯叶片，清洗切碎，按1:5的比例加入0.4％nacl溶液，磨碎制成匀浆，将匀浆以25℃、40khz的超声波处理30min，再以4层200目滤布过滤匀浆，保留上清液，将其分别以以下5种方法进行叶蛋白提取，将叶蛋白得率(叶蛋白质量与植物原材料质量的百分比)作为评价标准。
(1)加热法：将上清液60℃水浴加热30min，使蛋白充分絮凝沉淀，5000r/min离心10min，弃上清，将沉淀60℃烘干并研成粉末。
(2)酸法：将上清液ph调至2，静置30min，使蛋白充分絮凝沉淀，5000r/min离心10min，弃上清，将沉淀60℃烘干并研成粉末。
(3)碱法：将上清液ph调至10，静置30min，使蛋白充分絮凝沉淀，5000r/min离心10min，弃上清，将沉淀60℃烘干并研成粉末。
(4)酸热法：将上清液ph调至2，60℃水浴加热30min，使蛋白充分絮凝沉淀，5000r/min离心10min，弃上清，将沉淀60℃烘干并研成粉末。
(5)碱热法：将上清液ph调至10，60℃水浴加热30min，使蛋白充分絮凝沉淀，5000r/min离心10min，弃上清，将沉淀60℃烘干并研成粉末。
1.2单因素实验
材料处理：选取叶簇期鲁梅克斯新鲜叶片，清洗切碎，按设定的料液比加入0.4％nacl溶液，磨碎制成匀浆，将匀浆以25℃、40khz的超声波处理30min，再以4层200目滤布过滤匀浆，保留上清液。将上清液调至设定ph，在设定温度下水浴加热，并保持一定的设定时间，使蛋白充分絮凝沉淀，然后将其5000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀在60℃恒温干燥箱内烘干，并研成粉末。
(1)料液比探究实验：分别探究在料液比为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7，絮凝ph为10，絮凝温度为60℃，絮凝时间为30min时，叶蛋白的得率。
(2)絮凝温度探究实验：分别探究在絮凝温度为40、50、60、70、80、90℃，料液比为1:5，絮凝ph为10，絮凝时间为30min时，叶蛋白的得率。
(3)絮凝ph探究实验：分别探究在絮凝ph为7、8、9、10、11、12，料液比为1:5，絮凝温度为60℃，絮凝时间为30min时，叶蛋白的得率。
(4)絮凝时间探究实验：分别探究在絮凝时间为10、20、30、40、50、60min，料液比为1:5，絮凝温度为60℃，絮凝ph为10时，叶蛋白的得率。
1.3响应面优化实验
依据单因素实验结果，运用design-expert软件，根据box-behnken(bbd)中心组合实验设计原理，以叶蛋白的得率作为响应值，对影响因素a料液比、b絮凝温度、c絮凝ph、d絮凝时间进行4因素3水平响应面实验设计，以期得到鲁梅克斯叶蛋白提取的最优工艺。
2、实验结果
2.1叶蛋白提取方法筛选结果
本发明采用5种方法用于鲁梅克斯叶蛋白的提取，叶蛋白得率存在显著差异，如表1所示，碱热法效果显著优于其他方法，因此本发明采用碱热法用于后续的提取工艺优化。
表1叶蛋白提取方法筛选
2.2单因素实验结果
本发明探究不同的单一因素对鲁梅克斯叶蛋白得率的影响，其结果如表2所示，分别在料液比为1:5、絮凝温度为60℃、絮凝ph为10、絮凝时间为30min时，叶蛋白得率达到该区间范围内的最大值，故分别以此为中心点，进行下一步响应面优化。
表2不同单一因素对鲁梅克斯叶蛋白得率的影响
2.3响应面优化实验结果
本发明根据design-expert软件中的box-benhnken(bbd)中心组合实验设计原理，进行响应面实验设计，对鲁梅克斯叶蛋白得率有显著影响的四个因素：(a)料液比、(b)絮凝温度、(c)絮凝ph、(d)絮凝时间，做4因素3水平的响应面分析实验，实验设计与结果表3所示，相应的响应曲面图如图2-图6所示。
经响应面优化得到理论最佳工艺：料液比为1:4.348、絮凝ph为10.57、絮凝温度为58.19℃、絮凝时间为40min，理论得率为0.946001％。
表3鲁梅克斯叶蛋白提取的响应面优化设计与结果