本发明涉及于微生物技术领域，尤其涉及一株屎肠球菌菌株及其在酸浆豆腐加工中的应用。
背景技术：
黄浆水是豆腐加工过程中产生的副产物，含有大豆异黄酮、蛋白质和维生素等营养物质，以及大量水溶性的糖类如水苏糖、棉籽糖等低聚糖，可以被微生物发酵利用。生产过程中直接排放不仅造成资源的浪费，而且会对周围的环境造成严重的污染。我国民间有利用黄浆水在自然条件下发酵产酸获得酸浆凝固剂，制得酸浆豆腐。与石膏、卤水作为凝固剂的豆腐相比，酸浆豆腐具有质地细腻、保水性好、口感鲜嫩等特点，深受人们的喜爱。但是自然发酵条件下制备的酸浆，微生物菌群复杂，除了产酸的乳酸菌外，还可能污染致病菌和杂菌，造成酸浆质量不稳定，并对豆腐的安全性构成危害。而一些商用乳酸菌如干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌在发酵利用黄浆水时需要前期补充蔗糖、葡萄糖等营养素或者在发酵结束后补充醋酸才能达到合适的酸度，增加了生产成本。
屎肠球菌是农业部《饲料添加剂品种目录》所列菌种，是微生态制剂常用乳酸菌菌种，其相对于商用乳酸菌如干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌等来说，培养条件和保存条件较为简单，更有利于生产和使用。一直以来，屎肠球菌主要用作动物饲料添加剂、中药发酵、有机肥料发酵等。到目前为止，还没有将屎肠球菌应用于发酵生产酸浆豆腐的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株屎肠球菌菌株及其在酸浆豆腐加工中的应用，使用该屎肠球菌菌株生产的酸浆豆腐中杂菌含量少，且无需补充各类营养素，易于达到合适的酸度，有效保证了酸浆豆腐的品质。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一株屎肠球菌菌株，所述屎肠球菌菌株的16srdna基因序列如seqidno.1所示，具体如下：
atgcagtcgaacgcttctttttccaccggagcttgctccaccggaaaaagaggagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccatcagaagggataacacttggaaacaggtgctaataccgtataacaatcgaaaccgcatggttttgatttgaaaggcgctttcgggtgtcgctgatggatggacccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggccacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagagaagaacaaggatgagagtaactgttcatcccttgacggtatctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaacaccagtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggatttaga(seqidno.1)
进一步地，所述菌株为r2，其分类命名为屎肠球菌enterococcusfaecium，其保藏编号为cgmccno.14944，保藏日期为2017年11月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的是提供一种上述的屎肠球菌菌株在酸浆豆腐加工中的应用。
为了进一步优化上述应用，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，在上述应用中，所述屎肠球菌菌株在在酸浆豆腐加工中的应用方法包括如下步骤：
步骤(1)将黄浆水在110～121℃灭菌15-30min；
步骤(2)将所述屎肠球菌菌株按3％-5％(v/v)的接种量接种到步骤(1)灭菌后的黄浆水中；
步骤(3)在35-40℃下将步骤(2)接种菌株后的黄浆水静置发酵30-36h，使黄浆水的ph达到3.6-4.0，获得酸浆；
步骤(4)将步骤(3)所得的酸浆按14～16％(v/v)添加到熟豆浆中，获得豆脑，所述豆脑经过后续处理制得酸浆豆腐。
进一步地，在步骤(2)中灭菌完成的黄浆水冷却至32～38℃后，进行屎肠球菌菌株的接种。
进一步地，所述步骤(2)中屎肠球菌菌株以屎肠球菌液体种子液的形式进行接种。
进一步地，所述屎肠球菌液体种子液的制备方法包括：取液氮中保藏的屎肠球菌r2甘油管，在37℃水浴锅中速溶后，无菌条件下转接到新鲜mrs液体培养基中，37℃静置培养20h，得种子液。
进一步地，所述步骤(4)中的后续处理为将获得的豆脑倾倒入铺好豆腐布的型框中，加网布、覆平、自沥后加压成型得酸浆豆腐。
进一步地，所述熟豆浆的制备步骤：大豆经除杂、清晰、浸泡、打浆去渣后煮沸得到熟豆浆。
进一步地，所述步骤(2)中的屎肠球菌菌株的接种量为3％(v/v)，所述步骤(4)中酸浆的添加量为16％(v/v)。
进一步地，所述屎肠球菌菌株在在酸浆豆腐加工中的应用方法具体如下：取新鲜的豆腐黄浆水，分装在250ml锥形瓶中，120℃，灭菌15min。冷却至35℃左右接种3％(v/v)屎肠球菌enterococcusfaeciumr2液体种子液(mrs培养基)，于37℃下静置培养32h，得到ph为4.0的豆腐酸浆。此豆腐酸浆可直接作为酸浆豆腐的凝固剂使用。大豆经除杂、清晰、浸泡、打浆去渣后煮沸得到豆浆，将所得酸浆凝固剂按16％(v/v)的添加量加入到所得熟豆浆中得到豆脑，所得豆脑倾倒入铺好豆腐布的型框中，加网布、覆平、自沥后加压成型得酸浆豆腐。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明所述的屎肠球菌菌株培养条件简单，产酸速度快，稳定性好，使用方便；利用该菌株进行酸浆豆腐的生产，其能有效地生产乳酸菌等益生菌，减少污染致病菌和杂菌的含量，保证了酸浆的质量及其稳定性，从而保证了豆腐的安全性；在采用屎肠球菌发酵过程中，无需补充蔗糖、葡萄糖等营养素，且在发酵结束后无需补充醋酸即可达到合适的酸度，这有效降低了生产成本。
附图说明
图1为屎肠球菌r2的生长曲线图；
生物材料保藏说明：
分类命名：屎肠球菌enterococcusfaecium；菌株编号：r2；保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏机构简称：cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年11月20日；保藏中心登记入册编号：cgmccno.14944。
具体实施方式
本发明涉及一株屎肠球菌菌株，所述屎肠球菌菌株的16srdna基因序列如seqidno.1所示；所述菌株为r2，其分类命名为屎肠球菌enterococcusfaecium，其保藏编号为cgmccno.14944；本发明还涉及上述屎肠球菌菌株在在酸浆豆腐加工中的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为屎肠球菌r2菌株的获得及筛选过程。其具体操作如下：
1.1菌种筛选
称取10g泡菜样品置于含100ml无菌生理盐水的锥形瓶中，充分震荡均匀，形成混悬液。采用无菌操作，使用无菌生理盐水将上述混悬液分别稀释至10-5、10-6、10-7倍，涂布于含caco3的mrs固体培养基上。然后于37℃下培养48h。挑选具有溶钙圈的菌落，进行平板划线分离，如此重复4-5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单菌落转接到灭菌后的纯黄浆水液体培养基中，于37℃下静置培养72h，以乳酸菌生物量和发酵液ph为指标评价乳酸菌的发酵性能，筛选一株生物量最高、ph最低的乳酸菌菌株r2，该r2菌株的16srdna基因序列如seqidno.1所示。
表1.乳酸菌发酵性能
2.2菌种鉴定
菌株r2为革兰氏阳性菌，在mrs培养基上可迅速生长，37℃下培养24h后形成乳白色、不透明、表面光滑湿润、凸起、边缘整齐、直径1mm左右圆形菌落；油镜下观察其菌体呈椭圆形或圆形、无芽孢、成对成链或聚团排列。
根据生理生化鉴定结果，菌株r2可在ph11.0、6.5％氯化钠和40％胆汁环境中生长，可以分解乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等，不能分解可溶性淀粉、棉子糖、山梨醇，结果与《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸菌的分类鉴定》对照，菌株r2的情况符合屎肠球菌的生理生化特征。
表2.屎肠球菌r2部分生理生化特征
注：“+”生长良好或呈阳性；“-”不生长或呈阴性。
将菌种的16srdna基因序列(见seqidno.1)经genbank比对与enterococcusfaecium(ky490552)相似性达到99％；结合菌落、菌体形态，生理生化结果及菌株的16srdna基因序列对比，将菌株r2鉴定为屎肠球菌，命名为enterococcusfaecium，已于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.14944。
实施例3
本实施例为屎肠球菌r2菌株的生长特性研究。
将屎肠球菌r2菌株接种到新鲜mrs液体培养基(100ml/250ml三角瓶)中，37℃静置培养，测定其在600nm处的吸光度，绘制该菌株的生长曲线，如图1所示，菌株达到生长稳定期的时间为16h。
实施例4
本实施例为一较佳形式的屎肠球菌r2菌株在酸浆豆腐加工中的应用方法，其包括以下步骤：
取新鲜的豆腐黄浆水，分装在250ml锥形瓶中，120℃，灭菌15min。冷却至35℃左右接种3％(v/v)屎肠球菌enterococcusfaeciumr2液体种子液(mrs培养基)，于37℃下静置培养32h，得到ph为4.0的豆腐酸浆。此豆腐酸浆可直接作为酸浆豆腐的凝固剂使用。大豆经除杂、清晰、浸泡、打浆去渣后煮沸得到豆浆，将所得酸浆凝固剂按16％(v/v)的添加量加入到所得熟豆浆中得到豆脑，所得豆脑倾倒入铺好豆腐布的型框中，加网布、覆平、自沥后加压成型得酸浆豆腐。
上述步骤中，屎肠球菌enterococcusfaeciumr2液体种子液的制备方法包括：取液氮中保藏的屎肠球菌enterococcusfaeciumr2甘油管，在37℃水浴锅中速溶后，无菌条件下转接到新鲜mrs液体培养基(100ml/250ml三角瓶)中，37℃静置培养20h，得种子液。
实施例5
本实施例为另一较佳形式的屎肠球菌r2菌株在制备在酸浆豆腐加工中的应用方法，其包括以下步骤：
取新鲜的豆腐黄浆水，分装在250ml锥形瓶中，110℃，灭菌30min。冷却至32℃左右接种5％(v/v)屎肠球菌enterococcusfaeciumr2液体种子液(mrs培养基)，于35℃下静置培养36h，得到ph为3.8的豆腐酸浆。此豆腐酸浆可直接作为酸浆豆腐的凝固剂使用。大豆经除杂、清晰、浸泡、打浆去渣后煮沸得到豆浆，将所得酸浆凝固剂按12％(v/v)的添加量加入到所得熟豆浆中得到豆脑，所得豆脑倾倒入铺好豆腐布的型框中，加网布、覆平、自沥后加压成型得酸浆豆腐。
实施例6
本实施例为另一较佳形式的屎肠球菌r2菌株在制备在酸浆豆腐加工中的应用方法，其包括以下步骤：
取新鲜的豆腐黄浆水，分装在250ml锥形瓶中，115℃，灭菌25min。冷却至38℃左右接种4％(v/v)屎肠球菌enterococcusfaeciumr2液体种子液(mrs培养基)，于38℃下静置培养30h，得到ph为3.9的豆腐酸浆。此豆腐酸浆可直接作为酸浆豆腐的凝固剂使用。大豆经除杂、清晰、浸泡、打浆去渣后煮沸得到豆浆，将所得酸浆凝固剂按14％(v/v)的添加量加入到所得熟豆浆中得到豆脑，所得豆脑倾倒入铺好豆腐布的型框中，加网布、覆平、自沥后加压成型得酸浆豆腐。
对比例
本对比例为现有技术分别采用植物乳杆菌和自然发酵酸浆进行制备酸浆豆腐，其方法为：
植物乳杆菌发酵酸浆：用接种环挑取一环斜面保藏的植物乳杆菌于mrs液体培养基中，37℃下活化培养20h，获得种子培养液，将种子培养液按3％-5％接种量转接到纯黄浆水培养基中，37℃下培养30h，测定其ph、大肠菌群并进行点脑。
自然发酵酸浆：将压制豆腐后剩余的黄浆水于37℃下自然发酵30h，测定其ph、大肠菌群并进行点脑。
将本发明实施例2与上述对比例进行比较，其发酵过程及产物性能的比较如表3所示：
表3.发酵30h植物乳杆菌、自然发酵与屎肠球菌r2发酵酸浆比较
由上表可知，本发明所述的屎肠球菌r2与植物乳杆菌相比，发酵酸浆ph值低，成型性好；与自然发酵相比，发酵酸浆的稳定性高，不含致病菌，安全性高。这表明本发明所述的屎肠球菌r2发酵酸浆的质量及其稳定性更优。
由上述实施例可知，本发明所述的屎肠球菌菌株培养条件简单，产酸速度快，稳定性好，使用方便；利用该菌株进行酸浆豆腐的生产，其能有效地生产乳酸菌等益生菌，减少污染致病菌和杂菌的含量，保证了酸浆的质量及其稳定性，且在发酵过程中，无需补充蔗糖、葡萄糖等营养素，同时在发酵结束后无需补充醋酸即可达到合适的酸度，这有效降低了生产成本。本发明所述的应用方法简单，操作参数易于控制，适于大范围推广使用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>淮南师范学院
<120>一株屎肠球菌菌株及其在酸浆豆腐加工中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>755
<212>dna
<213>屎肠球菌16srdna基因序列(artificialsequence)
<400>2
atgcagtcgaacgcttctttttccaccggagcttgctccaccggaaaaagaggagtggcg60
aacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccatcagaagggataacacttggaaacaggt120
gctaataccgtataacaatcgaaaccgcatggttttgatttgaaaggcgctttcgggtgt180
cgctgatggatggacccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcc240
acgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaa300
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