本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种副溶血弧菌噬菌体微生态制剂及制备方法和应用。
背景技术：
：目前，控制和消除致病菌的主要手段仍是各种物理或化学的方法，包括各种抗生素的使用。物理或化学的方法都存在着明显的弊端。首先，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，不能实现整个领域所有环节的应用。其次，化学方法中的酸碱处理虽可以取得一定防治效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就极不理想。微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是噬菌体的研究受到人们的青睐。从噬菌体被fredericktwort(1915)和félixdhérelle(1917)发现开始，欧洲和前苏联等国家，就已经便开始用噬菌体来治疗细菌感染。然而在青霉素、链霉素等抗生素的崛起，以及早期噬菌体药物失效快等缺点这些药物很快就被淘汰了。抗生素虽然开始使用效果显著，但是长期使用，不仅会增强病原菌的抗药性，而且抑制有益菌群，最终不能有效地控制、消除致病菌。20世纪90年代末，很多科研工作者倡导重新应用噬菌体到临床治疗上来，噬菌体疗法逐渐复苏。此外，噬菌体本身具有广泛的应用，例如用于细菌鉴定和分型，用于诊断和治疗疾病，还用作分子生物学研究的实验工具。因此，噬菌体广泛的应用价值促进噬菌体的发酵生产越来越受到人们的关注。目前，噬菌体的发酵生产方法有很多，例如，专利申请号为94114314.7，名称为“噬菌体生态制剂的制备方法”的发明专利申请提出一种培养基培养方法：在10l放水瓶，装液为5000ml使用宿主弧菌培养噬菌体5～7天，最终噬菌体效价为105～108pfu/ml。专利申请号200810145709.5的发明专利使用宿主弧菌冻干粉作为营养源，噬菌体的效价也不高，为1×107pfu/ml。专利申请号200810202809.7的发明专利中使用嗜水气单胞菌进行噬菌体的生产，发酵周期长，为72～120h，噬菌体效价为1×108pfu/ml。上述专利中公开的噬菌体的发酵方法均存在噬菌体效价低的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种副溶血弧菌噬菌体微生态制剂及其制备方法和应用，所述制备方法发酵得到高效价的副溶血弧菌噬菌体。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种副溶血弧菌噬菌体微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将副溶血弧菌液接入发酵培养基中培养，得到宿主发酵液；副溶血弧菌宿主在发酵培养基中的初始菌体浓度为1010～1016cfu/ml；2)将浓度为108～1016pfu/ml的副溶血弧菌噬菌体液接种至所述宿主发酵液中发酵培养；副溶血弧菌噬菌体液的接种量为1％～10％；3)所述步骤2)中发酵培养进行6～12h时，向得到的宿主发酵液中流加副溶血弧菌液，继续发酵培养，控制整个发酵周期为18～24h，得到发酵液；4)将所述步骤3)中得到的发酵液进行灭活副溶血弧菌宿主，得到副溶血弧菌噬菌体微生态制剂。优选的，所述步骤3)中副溶血弧菌液的流加体积为宿主发酵液体积的1％～10％；副溶弧菌宿主液的浓度为1010～1014pfu/ml。优选的，所述步骤3)中每小时流加副溶血弧菌液的体积为宿主发酵液体积的0.5％～5％。优选的，所述步骤3)中副溶血弧菌液的流加时间为2～4h。优选的，所述步骤1)中发酵培养基包括以下含量组分：蛋白胨1～20g/l、牛肉浸粉1～20g/l和氯化钠1～20g/l；所述发酵培养基的ph值为7.0～9.0。优选的，所述步骤2)和步骤3)中的发酵培养条件独立如下：发酵温度为28～35℃，宿主发酵液的ph值维持6～9；发酵在搅拌条件下进行，搅拌转速为50～200rpm。优选的，所述步骤4)中灭活的方法为水浴；水浴的温度为45～65℃；水浴的时间为2～5h。本发明提供了所述方法制备的副溶血弧菌噬菌体的微生物制剂，副溶血弧菌噬菌体的效价为1012～1016pfu/ml。本发明提供了所述的副溶血弧菌噬菌体的微生物制剂在水产养殖中鉴定或检测副溶血弧菌中的应用。本发明提供了一种副溶血弧菌噬菌体微生态制剂的制备方法，将副溶血弧菌液和副溶血弧菌噬菌体液接种至发酵培养液中进行发酵培养；在发酵培养进行6～15h时，向宿主发酵液中流加副溶血弧菌液，继续发酵培养，整个发酵周期控制在18～24h，得到的发酵液进行灭活副溶血弧菌宿主，得到副溶血弧菌噬菌体微生态制剂。本发明避免一次性投加副溶血弧菌液后使发酵后期宿主菌浓度降低，进而影响噬菌体的发酵生产，在发酵培养进行至6～12h，补充流加宿主液，能够实现不延长发酵时间的前提下，大大提高噬菌体的效价。经过不同发酵体积的实验验证，采用本发明提供的制备方法，发酵生产的副溶血弧菌噬菌体的效价为1010～1016pfu/ml，较现有技术生产的噬菌体的方法，效价上提高了2～6个数量级。同时，本发明提供的制备方法中进行了发酵液的灭活处理，使副溶血弧菌宿主被灭活，既可以消除噬菌体微生态制剂中宿主弧菌的含量，又能避免了对环境的危害。进一步的，本发明提供的制备方法，具体限定了发酵培养基组分和发酵培养的条件，配合流加宿主发酵液操作一起制备副溶血弧菌噬菌体微生物菌剂，能够有效进一步提高副溶血弧菌噬菌体的效价。具体实施方式本发明提供了一种副溶血弧菌噬菌体微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将副溶血弧菌液接入发酵培养基中培养，得到宿主发酵液；副溶血弧菌宿主在发酵培养基中的初始菌体浓度为1010～1016cfu/ml；2)将浓度为108～1016pfu/ml的副溶血弧菌噬菌体液接种至所述宿主发酵液中发酵培养；副溶血弧菌噬菌体液的接种量为1％～10％；3)所述步骤2)中发酵培养进行6～12h时，向所述步骤2)中宿主发酵液中流加副溶血弧菌液，继续发酵培养，控制整个发酵周期为18～24h，得到发酵液；4)将所述步骤3)中得到的发酵液进行灭活副溶血弧菌宿主，得到副溶血弧菌噬菌体微生态制剂。本发明将副溶血弧菌液接入发酵培养基中培养，得到宿主发酵液；副溶血弧菌宿主在发酵培养基中的初始菌体浓度为1010～1016cfu/ml。本发明对所述接入的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接入方式即可。在本发明中，所述发酵培养基优选包括以下含量组分：蛋白胨1～20g/l、牛肉浸粉1～20g/l和氯化钠1～20g/l；更优选为蛋白胨5～15g/l、牛肉浸粉5～15g/l和氯化钠3～10g/l；最优选为蛋白胨10g/l、牛肉浸粉10g/l和氯化钠5g/l。所述发酵培养基的ph值优选为7.0～9.0，更优选为7.5～8.5，最优选为8.0。本发明对所述发酵培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培养基的配制方法即可。在本发明中，副溶血弧菌在发酵培养基中的初始菌体浓度优选为1010～1016cfu/ml，更优选为1012～1015cfu/ml，最优选为1014cfu/ml。本发明对所述副溶血弧菌的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的副溶血弧菌菌株即可。在本发明实施例中，所述副溶血弧菌分离自南美白对虾肠道。南美白对虾养殖池位于山东、福建、广东、海南等地，采集时间为2016.9。分离得到的副溶血弧菌经过常规方法进行扩大培养，得到副溶血弧菌液。得到宿主发酵液后，本发明将浓度为108～1016pfu/ml的副溶血弧菌噬菌体液接种至所述宿主发酵液中发酵培养；副溶血弧菌噬菌体液的接种量为1％～10％。在本发明中，所述副溶血弧菌噬菌体的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的副溶血弧菌噬菌体来源即可。本发明实施例中，所述副溶血弧菌噬菌体从副溶血弧菌中分离得到。本发明对所述分离的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的噬菌体分离方法即可。本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接入方式即可。副溶血弧菌噬菌体液的浓度优选为1010～1014pfu/ml，更优选为1012pfu/ml。副溶血弧菌噬菌体液的接种量优选为3％～7％，更优选为5％。在本发明中，所述副溶血弧菌噬菌体进行发酵培养的条件优选如下：发酵温度为28～35℃，更优选为30～32℃。宿主发酵液的ph值维持6～9，更优选为7～8；发酵在搅拌条件下进行，搅拌转速为50～200rpm，更优选100～150rpm。在本发明中，本发明在所述发酵培养进行6～15h时，向培养得到的宿主发酵液中流加副溶血弧菌液，继续发酵培养，控制整个发酵周期为18～24h，得到发酵液。在本发明中，所述副溶血弧菌液的流加体积优选为宿主发酵液体积的1％～10％，更优选为2％～8％，最优选为5％。副溶血弧菌液的浓度优选为1010～1014pfu/ml，更优选为1012～1013pfu/ml。在本发明中，每小时流加副溶血弧菌液的体积为宿主发酵液体积的0.5％～5％，更优选为1％～4％，最优选为3％。在本发明中，所述副溶血弧菌液的流加时间优选为2～4h，更优选为3h。在本发明中，所述继续发酵培养条件优选如下：发酵温度为28～35℃，更优选为30～32℃。宿主发酵液的ph值维持7～9，更优选为7.5～8.5，最优选为8.0；发酵在搅拌条件下进行，搅拌转速为50～200rpm，更优选100～150rpm。得到的发酵液后，本发明将所述发酵液进行灭活副溶血弧菌宿主，得到副溶血弧菌噬菌体微生态制剂。在本发明中，所述灭活的方法优选为水浴；水浴的温度优选为45～65℃，更优选为50℃。水浴的时间优选为2～5h，更优选为3～4h。本发明提供了上述方案制备的副溶血弧菌噬菌体的微生物制剂，副溶血弧菌噬菌体的效价为1012～1016pfu/ml。在本发明中，所述副溶血弧菌噬菌体的效价测定方法，用双层平板法测定；所述双层平板法：取1ml噬菌体发酵液，8000rpm离心20min，取100μl上清液，加入900μl无菌生理盐水中摇匀，依次进行梯度稀释。取10-11～-13稀释梯度的稀释液100μl与100μl处于对数生长期的宿主菌加到8ml冷却至50℃左右的半固体培养基中，混匀，33℃倒置培养12h，对噬菌斑进行计数。噬菌斑的个数与效价的计算公式如下：菌体效价(pfu/ml)＝平板上的噬菌斑数×稀释倍数×10。本发明提供了所述的副溶血弧菌噬菌体的微生物制剂在水产养殖中鉴定或检测副溶血弧菌中的应用。下面结合实施例对本发明提供的一种副溶血弧菌噬菌体微生态制剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1副溶血弧菌分离自南美白对虾养殖池。南美白对虾养殖池在山东、福建、广东、海南等地均有。采集时间为2016年9月。副溶血弧菌从南美白对虾肠道中分离，副溶血弧菌噬菌体从南美白对虾养殖水中及海水中分离。分离的3株副溶血弧菌噬菌体扩大培养方法，具体步骤如下：先测定噬菌体的最佳感染复数：感染复数(multiplicityofinfection，moi)是指噬菌体初始感染宿主菌的时候噬菌体数量与宿主菌数量的比值，也称感染倍数。宿主菌接种100ul副溶血弧菌到200mlnb培养液中，150r/min12h培养至对数期。然后取初始效价为109pfu/ml的噬菌体培养液，按照感染复数分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001的比例，将噬菌体vp11与pvp11以同等体积加入液体培养基中，37℃摇床，120r/min培养10h，4000r/min离心15min，去掉沉淀,上清液用0.22μm的膜过滤,过滤3遍，用双层平板法测定噬菌体的效价，效价最高的感染复数为最佳感染复数。按照最佳感染复数接种，各占总体积的2％，33℃，150rpm，培养18h，得到3株副溶血弧菌噬菌体液。实施例2流加噬菌体宿主发酵生产噬菌体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用50l发酵罐进行发酵，发酵罐中盛装发酵培养基的体积为35l，将宿主接入发酵培养基中，使每毫升的初始培养基中菌落数为1010cfu/ml；所述发酵培养基配方如下：蛋白胨10g/l；牛肉浸粉10g/l；氯化钠1g/l；ph为8.0；2)再加入一株发酵液体积的1％的108pfu/ml的副溶血弧菌噬菌体液至发酵罐中进行培养，发酵温度为28℃，转速为200rpm；控制在9。3)在发酵进行6h时，向发酵罐中流加噬菌体宿主，控制浓度在1014cfu/ml之间，流加时间为3h，流加速度为2l/h，流加总发酵体积6％的量，发酵周期为18小时，等发酵液颜色由浑浊变为清澈时，即可放罐；4)将所得的发酵液，在50℃条件下水浴5h，灭活宿主，即得噬菌体微生态制剂。5)噬菌体微生态制剂的效价测定方法，用双层平板法测定；所述双层平板法：取1ml噬菌体发酵液，8000rpm离心20min，取100μl上清液，加入900μl无菌生理盐水中摇匀，依次进行梯度稀释。取10-10稀释梯度的稀释液100μl与100μl处于对数生长期的宿主菌加到8ml冷却至50℃左右的半固体培养基中，混匀，33℃倒置培养12h，对噬菌斑进行计数。噬菌斑的个数与效价的计算公式如下：菌体效价(pfu/ml)＝平板上的噬菌斑数×稀释倍数×10。实施例3流加噬菌体宿主发酵生产噬菌体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用1000l发酵罐进行发酵，发酵罐中盛装发酵培养基的体积为800l，将宿主接入发酵培养基中，保持初始培养基的菌落数为1015cfu/ml。所述发酵培养基配方如下：蛋白胨20g/l；牛肉浸粉10g/l；氯化钠5g/l；ph为7.0。2)再加入另外一株发酵液体积5％的pfu为1012pfu/ml的噬菌体液至发酵罐中进行培养，发酵温度为35℃，转速为200rpm；控制在7。3)在发酵进行8小时内，流加噬菌体宿主，控制浓度在1010cfu/ml，流加时间为4小时，流加速度为35l/h，流加总发酵体积8％的量，发酵周期为20小时，等发酵液颜色呈现由浑浊变为清澈时，即可放罐。4)将所得的发酵液，在65℃条件下水浴2h，灭活宿主，即得噬菌体微生态制剂。5)噬菌体微生态制剂的效价测定方法，用双层平板法测定；所述双层平板法：取1ml噬菌体发酵液，8000rpm离心20min，取100μl上清液，加入900μl无菌生理盐水中摇匀，依次进行梯度稀释。取10-12稀释梯度的稀释液100μl与100μl处于对数生长期的宿主菌加到8ml冷却至50℃左右的半固体培养基中，混匀，33℃倒置培养12h，对噬菌斑进行计数。噬菌斑的个数与效价的计算公式如下：菌体效价(pfu/ml)＝平板上的噬菌斑数×稀释倍数×10。实施例4流加噬菌体宿主发酵生产噬菌体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)采用5000l发酵罐进行发酵，发酵罐中盛装发酵培养基的体积为4000l，将宿主接入发酵培养基中，保持初始培养基的菌落数为1015cfu/ml；所述发酵培养基配方如下：蛋白胨10g/l；牛肉浸粉20g/l；氯化钠8g/l；ph为9.0。2)再加入第三株发酵液体积8％的pfu为1010pfu/ml的噬菌体液至发酵罐中进行培养，发酵温度为32℃，转速为150rpm；控制在9。3)在发酵进行12小时内，流加噬菌体宿主，控制浓度在1015cfu/m之间，流加时间为2小时，流加速度为200l/h，流加总发酵体积10％的量，发酵周期为24小时，等发酵液颜色由浑浊变为清澈时，即可放罐。4)将所得的发酵液，在55℃条件下水浴3h，灭活宿主，即得噬菌体微生态制剂。5)噬菌体微生态制剂的效价测定方法，用双层平板法测定；所述双层平板法：取1ml噬菌体发酵液，8000rpm离心20min，取100μl上清液，加入900μl无菌生理盐水中摇匀，依次进行梯度稀释。取10-13稀释梯度的稀释液100μl与100μl处于对数生长期的宿主菌加到8ml冷却至50℃左右的半固体培养基中，混匀，33℃倒置培养12h，对噬菌斑进行计数。噬菌斑的个数与效价的计算公式如下：菌体效价(pfu/ml)＝平板上的噬菌斑数×稀释倍数×10。对比例1按照实施例4的方案进行发酵，不同之处为发酵培养基配方如下：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，氯化钠10g/l。发酵得到的噬菌体微生态制剂的效价按照实施例4的方法进行统计和计算。对比例2按照实施例4的方案进行发酵，不同之处是将流加噬菌体宿主液在步骤2)中一同加入发酵罐中，噬菌体宿主液的投入体积不变。实施例2～4和对比例1～2的噬菌体微生态制剂的效价检测结果见表1。表1实施例2～4和对比例5的噬菌体微生态制剂的效价一览表实施例效价(pfu/ml)实施例21015实施例31012实施例41014对比例11010对比例2109以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12