一种具有调节抗生素引起的菌群结构紊乱的干酪乳杆菌的制作方法

本发明涉及一种具有调节抗生素引起的菌群结构紊乱的干酪乳杆菌，属于食品技术领域。

背景技术：

肠道微生物在人体生理代谢和避免疾病中发挥重要作用，大量共生细菌在胃肠道内寄居、繁殖，它们由几百种甚至可能上千种菌种构成，并对维持最佳的宿主生理生化代谢过程具有至关重要的影响。微生物群通过直接抵御入侵微生物或协调合适的免疫应答以保护宿主免受感染。人体结肠微生物的组成和代谢活动由一些包括饮食和抗生素治疗的外界因素调节，肠道微生物的结构和代谢变化可能对宿主健康有长期影响。而抗生素改变微生物组成，可能导致疾病风险增加、二次感染、过敏和肥胖等一系列后续症状。

乳酸菌是益生菌的一种，是人体内的必需菌群之一，广泛存在于人体肠道中。乳酸菌的黏附性有利于维持肠道菌群结构，并更好地保护肠粘膜形态和代谢功能的完整性。乳酸菌在肠道菌群失调的预防和治疗中发挥的良好作用主要通过空间位阻作用实现。由于高黏附性乳酸菌更易定植于肠道，可在其肠道表面形成物理屏障，从而减少病原菌与肠黏膜的接触。同时，益生乳酸菌在肠道中可产生较多的抑菌成分，如酸性物质、抗菌肽和生物酶等，因此可抑制病原菌活性。此外，乳酸菌发挥益生作用的先决条件是对胃肠道中的胃酸和胆汁等环境具有耐受性，因此，对人工胃液、肠液及胆盐具有耐受性的乳酸菌是保护肠道功能的基础。

由于乳酸菌具有安全健康、无副作用、作为益生菌可在动物体内定植并发挥多种有益健康等优势，乳酸菌微生态制剂作为临床补充剂已被广泛应用。对于抗生素导致的肠道菌群失调症状，尚无明确的治疗方案，多为针对相关症状如腹泻等使用相应药物以缓解或减轻症状。而针对单一症状使用的药物治疗，复发率较高，并存在引发更严重肠道失衡的风险。开发此益生菌补充剂，可以改善肠道菌群结构，同时还具有清除对人体有害的自由基等抗氧化作用，是一种非常健康的治疗方案，具有广阔的市场应用前景。

目前为止，虽然对于肠道菌群紊乱有较多治疗方案，如利用中药制剂、低聚糖等活性物质和益生菌等。cn106261423a公开了一种中药益生菌复合保健饮料(罗汉果、猪皮、太子参、石斛、百合、水素、益生菌等)调节肠道菌群的功能及其制备方法，申请专利cn105535580a公开了一种改善肠道菌群的生物制剂，该生物制剂包括乳酸菌、异构化乳糖、苹果醋、酵素及膳食纤维等，可有效抑制腐败细菌及病原菌的生长。cn105996050a公开了包含海藻多糖、乳酸菌、阿拉伯糖、天冬、香樟、玄参和荞麦秸等的乳酸菌制剂可抑制病原菌，改善肠胃功能并提高机体免疫力。此外，有相关专利cn101626774a制备组合物包含副干酪乳杆菌kw3110或其变体，测定其对肠道内有益菌生长的促进作用，从而改善肠道微生物群落。但是对于抗生素导致的肠道菌群紊乱相关研究较少，目前的益生菌对抗生素引起菌群紊乱的研究相对空白。

因此，提供一种乳酸菌制品，用以改善引抗生素导致的肠道菌群紊乱是目前亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是供一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌为一株干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)cgmcc12435，于2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc12435。

在本发明的一种实施方式中，所述干酪乳杆菌cgmcc12435为革兰氏阳性菌，细胞呈短杆状，菌体约宽0.5-1.0μm，长2-4μm，不形成芽孢，两端圆形。

在本发明的一种实施方式中，所述干酪乳杆菌cgmcc12435的菌落特征为，在mrs培养基上形成明显的菌落，直径在0.3-2.0mm之间，圆形，乳白色，半透明，表面湿润光滑，边缘整齐，不产生色素。

本发明的第二个目的是供一种冻干菌粉的制备方法，所述方法步骤如下：干酪乳杆菌cgmcc12435菌种按质量计以2-4％的接种量接种到培养基中，然后在35-87℃下扩大培养14-20h，离心后用ph7.0-7.4磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用冷冻干燥保护剂重悬使活菌浓度达10⁹-10¹¹cfu/ml，混匀后预冻，之后进行冷冻干燥得到所述的冻干菌粉即为膳食补充剂。

在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥保护剂由海藻糖和脱脂乳粉组成。

在本发明的一种实施方式中，所述冷冻干燥保护剂成分为：75-125g/l的海藻糖，100-250g/l的脱脂乳粉，余量为水。

在本发明的一种实施方式中，所述膳食补充剂，按重量分数计含有85-88％的菌粉，5％的海藻糖，7-10％的脱脂乳粉。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为deman,rogosaandsharpeagar(mrs)培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述菌在发酵乳制品和功能食品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，应用所述菌制备发酵乳的方法为：配制全脂乳，加热到25-45℃，加入3-6％蔗糖，将乳化稳定剂溶解后按质量分数0.2-0.4％加入到全脂乳，在压力为18-22mpa下进行均质后，加热灭菌；待冷却后按照全脂乳体积计3-5％接种发酵剂，所述发酵剂由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和干酪乳杆菌cgmcc12435组成，在37-42℃下发酵至凝乳，冷却后在4℃贮藏。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和干酪乳杆菌cgmcc12435的体积比为1-2:1-2:1-3。

在本发明的一种实施方式中，灭菌为90-100℃下灭菌3-8min。

本发明的一种实施方式中，应用所述菌制备果蔬饮料的方法为：选用新鲜果蔬洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，随后接入干酪乳杆菌cgmcc12435菌剂发酵剂，使其浓度达到10⁵-10⁷cfu/ml以上，在温度2-6℃下冷藏保存。

在本发明的一种实施方式中，所述高温瞬间灭菌为在温度140℃下高温热杀菌2s后，立即降温到约37℃。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述的干酪乳杆菌在具有耐酸、耐胆盐的同时，可利用低聚糖良好生长表明其具有潜在优异的肠道定植能力。

(2)本发明制备的膳食补充剂能够调节抗生素导致的菌群结构紊乱，缓解小鼠体内因抗生素使用导致的氧化应激损伤，非常具有应用前景。

(3)本发明发明的膳食补充剂活性成分含量高、货架期长；益生菌含量可达到5.36×10⁹cfu/g，在4℃贮存6个月后活菌数仍大于10⁶cfu/g。

生物材料保藏：

一株干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)cgmcc12435，于2016年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc12435。

附图说明

图1是不同干酪乳杆菌对ht-29细胞的黏附情况；

图2是显微镜下干酪乳杆菌cgmcc12435和ht-29细胞黏附图(10×目镜，100×油镜物镜)；

图3是干酪乳杆菌cgmcc12435对小鼠中抗生素导致肠道菌群变化的恢复情况

图4是小鼠肝脏和肾脏的丙二醛(mda)变化；

图5是小鼠肝脏和肾脏的过氧化氢酶(cat)变化；

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

干酪乳杆菌cgmcc12435的分离与鉴定：本发明乳酸菌来源于内蒙古乌兰察布市四子王旗传统发酵制品“奶嚼口”，此为一种发酵稀奶油制品，是牛乳静置后，分离得到上层油脂后自然发酵而制成。采集样品存放于灭菌采样瓶中，-20℃下保存。取1.0g样品梯度稀释后在mrs培养基中37℃下培养48h，进一步划线分离培养后，得到单菌落，菌种鉴定后保存。

实施例1：不同干酪乳杆菌在人工模拟胃肠液中的存活率测定

配制模拟胃肠液，模拟胃液(6.2g/lnacl,2.2g/lkcl,0.22g/lcacl2,1.2g/lnahco3,0.3％胃蛋白酶)用6mhcl调至ph2.0，合成小肠液(6.4g/lnahco3，0.239g/lkcl，1.28g/lnacl和0.1％胰液素)，用6mhcl调节至ph7.4。充分溶解后将模拟胃液及肠液用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌并分装5ml于每只试管中，4℃冷藏备用。将培养18h的乳酸菌菌种离心，用0.9％生理盐水重悬代谢2h后接入模拟胃液混匀；另吸取100μl梯度稀释平板计数法计数。

将振荡水浴锅温度设置为37℃，转速75r/min，将菌株接入模拟胃液后，置于振荡水浴锅，模拟人体胃肠蠕动消化，2h后取出，再次梯度稀释至10^-9，涂布后置于37℃恒温培养箱培养24h，用平板计数法计数并计算在模拟胃液ph2.0中经过2h后乳酸菌存活率。另离心后加入模拟肠液，置于振荡水浴锅振荡2h后取出，梯度稀释至10^-9，将稀释度为10^-7、10^-8、10^-9的液体吸取100μl注入mrs琼脂平板，置于37℃恒温培养箱培养24h，用平板计数法计数并计算在模拟肠液中经过2h后乳酸菌存活率。

胃液存活率(％)＝2h活菌数/0h活菌数×100％

肠液存活率(％)＝4h活菌数/2h活菌数×100％

表1干酪乳杆菌在模拟胃肠液中存活率

通过表1可知，来自江南大学生物技术中心菌种保藏库(ccfm)的不同干酪乳杆菌在人工胃液中的存活率存在差异性。在ph2.0的人工胃液中培养2h菌株存活率的范围为40-90％，其中ccfm236最高，为64.66±8.95％，而cgmcc12435的存活率也高达62.48±5.21％，表明此菌株具有良好的耐酸特性。不同的干酪乳杆菌对人工肠液也具有不同程度的耐受性，菌株的存活率范围为10-88％，其中cgmcc12435存活率最高，为87.76±5.98％。

实施例2：干酪乳杆菌在低聚糖为唯一碳源的培养基中生长情况

制作培养基：4g低聚果糖、2g胰蛋白胨、1g酵母提取物、2gkh2po4、0.002gmgso4·7h2o、0.08gnacl、8mgcacl2、0.73mgfeso4·7h2o、1.2mg高铁血红素、10mlatcc维生素混合物、10mlatcctracemineral、0.5ml吐温80、0.5gl-半胱氨酸盐酸盐，加水至1000ml，调节ph至7.0，115℃灭菌20min。其中，低聚果糖经0.22μm滤膜过滤除菌后添加到培养基中。分离细菌时，添加质量浓度为0.5％的溴甲酚紫溶液做指示剂，添加量为15ml/l。

利用低聚果糖单一碳源-溴甲酚紫(变色5.7-6.2)固体mrs培养基测定益生菌对低聚果糖的利用情况：生长说明低聚糖不抑制生长；变色说明分解低聚糖产酸，结果如下表2。

表2干酪乳杆菌对低聚糖利用情况

注，—：只生长不产酸，+：生长且产酸，++：生长快且产酸较多

结果表明，不同干酪乳杆菌对低聚糖利用情况不同，其中干酪乳杆菌cgmcc12435可利用低聚糖作为唯一碳源正常生长，且在2小时进入对数期，11小时进入稳定期，生长速率超过大部分对照菌株。

实施例3：不同干酪乳杆菌对人体肠细胞黏附性能的比较

培养ht-29细胞于rpmi1640(10％胎牛血清，1％抗生素)培养基中，每两天更换培养基直到细胞达到80-90％。调整细胞浓度为1×10⁵cells/ml，接种于六孔培养板中，在培养板中预先放入18×18mm无菌盖玻片，并置于37℃，95％空气/5％co2培养箱中培养，直到生长成为致密单层细胞。用pbs缓冲液清洗细胞两次后，每孔加入1ml无抗生素的rpmi培养基和1ml培养好并重悬于pbs中的菌悬液(细菌总数为10⁸)，混匀后置于培养箱中孵育，每株菌有三个平行。培养2h后，取出培养板，用pbs缓冲液清洗细胞直至除去未黏附的乳酸菌。加入无水甲醇固定30min后对细胞玻片进行革兰氏染色。

在显微镜下随机选取20个视野，计数100个细胞上黏附的乳酸菌个数。将乳酸菌与ht-29细胞共培养2h后固定制成玻片，显微镜观察乳酸菌情况，结果见图1和图2。

来自江南大学生物技术中心菌种保藏库(ccfm)的不同干酪乳杆菌对细胞的黏附情况如图1所示，它们之间黏附能力差异较大，由于乳酸菌表面结构和表面成分是影响其黏附性能的重要因素，研究表明，乳酸菌表面的黏附素如表层蛋白、肽聚糖和脂磷壁酸等成分对黏附性能有较大影响。图1中，五株干酪乳杆菌的黏附数都大于10个/细胞，其中干酪乳杆菌cgmcc12435的黏附数最高，为35.09个/细胞。

实施例4：含干酪乳杆菌cgmcc12435膳食补充剂的制备

干酪乳杆菌cgmcc12435菌种按质量计以3％的接种量接种到在温度120℃下灭菌10min后冷却的培养基中，然后在37℃下扩大培养18h，离心后用ph7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，以100g/l的海藻糖和100-250g/l的脱脂乳溶液作为冻干保护剂，采用冷冻干燥保护剂重悬使活菌浓度达10¹¹cfu/ml，混匀后预冻，之后进行冷冻干燥得到所述的冻干菌粉即为膳食补充剂。

实施例5：干酪乳杆菌cgmcc12435对抗生素小鼠肠道紊乱的恢复作用

饲养4周龄的健康雄性c57bl/6小鼠，随机分为4组：空白对照组、抗生素模型组、干酪乳杆菌cgmcc12435恢复组、自然恢复组，每组8只小鼠，全程自由饮水、进食。实验为期42天，空白对照组在实验期间每天灌胃0.2ml无菌生理盐水溶液；抗生素模型组前14天每天灌胃0.2ml的500mg/kg氨苄青霉素溶液，造模结束后处死。干酪乳杆菌cgmcc12435恢复组前14天每天灌胃0.2ml的500mg/kg氨苄青霉素溶液，之后28天灌胃干酪乳杆菌膳食补充剂溶液(冷冻干燥制备的膳食补充剂溶解于1ml无菌生理盐水溶液中，调整活菌数为10⁹)。自然恢复组组前14天每天灌胃0.2ml500mg/kg氨苄青霉素溶液，之后28天每天灌胃0.2ml无菌生理盐水溶液。无菌条件下取各组小鼠14天和42天的粪便，提取总dna并进行16s测序，得到菌群的相对丰度变化。结果如附图3所示：

通过图3可知，相比空白对照组，抗生素造模后，门水平粪便菌群具有显著差异，拟杆菌门相对丰度显著降低而变形菌门大量增加。自然恢复组的恢复效果较差，仍有较高丰度的变形菌门和下降的拟杆菌门。而干酪乳杆菌治疗组中，变形菌门显著降低至对照组水平，而且拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度都恢复到对照组水平。说明本发明干酪乳杆菌cgmcc12435膳食补充剂具有调节抗生素导致的肠道菌群紊乱功能，可恢复肠道菌群平衡。

为考虑不同干酪乳杆菌在调节肠道菌群功能间的差异，又设置了干酪乳杆菌ccfm30和ccfm9的对照实验组，结果证明两株乳杆菌对抗生素导致的菌群紊乱也具有一定的调节作用，但在拟杆菌门等菌群的恢复方面，并未达到cgmcc12435的显著程度。

实施例6：营养补充剂缓解小鼠体内抗生素导致的氧化应激损伤

按照实施例4所述分组和方案进行动物实验，实验结束后取小鼠肝脏，肾脏。通过南京建成生物工程研究所试剂盒，蛋白定量后测定过氧化氢酶(cat)、和丙二醛(mda)的含量。测定结果如附图4、5所示。

过氧化氢酶(catalase，cat)是机体内重要的抗氧化酶，也是氧化应激损伤标志物之一。丙二醛(malondialdehyde，mda)是一种脂质过氧化物，其水平可以反映机体的脂质过氧化程度与细胞损伤程度。通过图4和图5可知，抗生素造模组小鼠肝脏和肾脏中的cat活性相比于空白对照组显著降低，mda含量显著上升。而干酪乳杆菌治疗组中，肝脏和肾脏组织中的cat和mda水平显著恢复到正常水平，对比自然恢复组可知，干酪乳杆菌补充剂在缓解抗生素导致的氧化应激损伤方面效果非常显著。综合上述结果，说明干酪乳杆菌

cgmcc12435膳食补充剂可有效的缓解小鼠体内抗生素导致的氧化应激损伤。

实施例7：贮存条件对益生菌膳食补充剂中干酪乳杆菌活性的影响

将冷冻干燥制成的干酪乳杆菌膳食补充剂以铝箔袋真空热封包装，避光、避湿、避氧，置于-20℃条件下贮存，测定贮存15天、30天、180天后的干酪乳杆菌cgmcc12435活菌数量，考察贮存温度和贮存时间对益生菌膳食补充剂活性的影响。以平板菌落计数法测定其初始时的活菌数。贮存一定时间后，以相同方法测定益生菌膳食补充剂的活菌数。结果如表3所示：

表3膳食补充剂在-20℃条件下贮存过程中干酪乳杆菌cgmcc12435活性变化

通过上表可知，在-20℃条件下保存可大大提高本产品货架期，贮存6个月仍有10⁸cfu/g活菌，说明干酪乳杆菌适宜长时间的保存，可有效的延长产品货架期。

实施例8：利用干酪乳杆菌cgmcc12435制备发酵乳

将干酪乳杆菌cgmcc12435制得的膳食补充剂作为发酵剂，其活菌数约为10⁸-10⁹cfu/ml。配制全脂乳(10％)并加热到40℃左右，加入5％蔗糖，将乳化稳定剂溶解后按0.2-0.4％量加入到牛乳中，在压力为18-22mpa下进行均质，然后在95℃5min条件下加热灭菌。待冷却后按照牛乳体积计3-5％接种保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和上述制备的干酪乳杆菌cgmcc12435工作发酵剂(体积比为1:1:1)，在37-42℃下发酵至凝乳，冷却后在4℃贮藏，即制得益生菌发酵乳。

实施例9：利用干酪乳杆菌cgmcc12435制备发酵乳饮料

配制10％脱脂乳，加热溶解后在95℃5min条件下加热处理，冷却后按5％接种量接种接种量在脱脂乳中接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌液体发酵剂以及干酪乳杆菌cgmcc12435发酵剂(体积比为1:1:1)，在37℃下发酵24h左右，控制终点酸度为160°t左右，加入等量的110℃5min杀菌的糖混合溶液(含12％蔗糖，0.1％蔗糖酯和0.4％果胶)。混合后预热至60℃，20mpa压力下进行均质，热处理后冷却并灌装，可制成干酪乳杆菌cgmcc12435发酵乳饮料。

实施例10：制备含有干酪乳杆菌cgmcc12435的果蔬饮料

选用新鲜果蔬洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2s后，立即降温到约37℃，随后接入本发明制备的干酪乳杆菌cgmcc12435菌剂发酵剂，使其浓度达到10⁶cfu/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有干酪乳杆菌cgmcc12435活菌的果蔬饮料。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。