一种提高轮状病毒产量的方法与流程

本公开涉及轮状病毒生产制备领域，具体而言，涉及一种提高轮状病毒产量的方法。所述方法包含使用轮状病毒株感染组织培养细胞，在培养体系中培养感染后的组织培养细胞，和向培养体系中添加胰酶，使培养体系中胰酶浓度为2.0-10.0μg/ml之间。

背景技术：

轮状病毒(rotavirus,rv)是引起婴幼儿腹泻的主要病原体之一，主要感染小肠上皮细胞，导致严重的腹泻。轮状病毒是一种双链核糖核酸病毒，通过病毒蛋白vp4和vp7来实现病毒穿透。vp7构成了轮状病毒外层的主要部分，而vp4则形成轮状病毒朝外的二聚体刺突(dimericspikes)。vp4被报道与宿主选择和病毒效力等活动有关，并直接接触细胞表面并促使病毒进入该细胞。

对vp4进行蛋白质水解切割(proteolyticcleavage)，可以获得两个非共价连接的亚体，即vp5和vp8。同时，经过切割的vp4显著增强了病毒侵入并感染细胞的效力，使得细胞能够更有效地感染轮状病毒，从而使得轮状病毒产量提高。

在体外培养条件下，特别是培养轮状病毒用于生产相关疫苗时，所述切割是由胰酶完成。胰酶通过特异性切割精氨酸和赖氨酸位点，使得vp4切割分为两个亚体。

现有技术往往首先使用胰酶对轮状病毒进行激活处理，将轮状病毒的病毒蛋白vp4切割，增加轮状病毒感染组织细胞的效力，随后再将胰酶激活处理后的轮状病毒用于感染组织细胞。一般认为，较高浓度的胰酶会造成细胞损伤，反而会影响轮状病毒的复制，不利于轮状病毒生产。因此，现有技术没有考虑过在含有较高胰酶浓度的培养体系中培养轮状病毒感染后的组织细胞，或者在培养体系中多次或持续性添加胰酶。

美国授权专利us9,642,907b2披露了一种使轮状病毒适应于细胞系的方法。所述方法使用包含氯化钙和胰酶的细胞培养液对轮状病毒进行适应性传代，目的在于获得对细胞系适应的轮状病毒，而非用于增加轮状病毒产量。其中，该美国专利中使用的胰酶浓度范围为0.1-30μg/ml。该美国专利并未披露可以多次或连续性添加胰酶，也没有披露可以在培养体系中保持较高浓度的胰酶。同时，该美国专利也没有披露多次或连续性添加胰酶，或者添加较高浓度的胰酶可以增加轮状病毒产量。美国授权专利us9,642,907b2的全部内容并入此处作为参考。

中国授权专利cn1306961c提供了一种轮状病毒灭活疫苗的制备方法，该方法将胰酶(浓度为1-1.5μg/ml)添加到细胞培养体系中，用于培养轮状病毒感染后的组织细胞。该中国专利并未披露可以多次或连续性添加胰酶，也没有披露可以在培养体系中保持较高浓度的胰酶。同时，该中国专利也没有披露较高浓度的胰酶可以增加轮状病毒产量。中国授权专利cn1306961c的全部内容并入此处作为参考。

技术实现要素：

根据本公开的一方面，本公开提供了一种提高轮状病毒产量的方法，包含：

-使用轮状病毒株感染组织培养细胞；

-在培养体系中培养感染后的组织培养细胞；

-向培养体系中添加胰酶，培养体系中胰酶浓度为2.0-10.0μg/ml之间；和

-收获轮状病毒。

在一些实施例中，所述培养体系中胰酶浓度为2.0-10.0μg/ml之间。具体地，所述培养体系中胰酶浓度为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，或10.0μg/ml。

在一些实施例中，本公开所述方法进一步包含连续向培养体系中添加胰酶，或每12个小时、每24个小时、或每36个小时向培养体系添加一次胰酶。

根据本公开的一方面，本公开所述培养体系包含培养容器、细胞培养液、和/或细胞生长介质。在一些实施例中，所述培养容器为培养皿、多孔板、摇瓶、生物反应器、或一次性生物反应器。

根据本公开的一方面，本公开所述组织培养细胞为vero细胞，人二倍体细胞mrc-5,人二倍体细胞2bs，或人二倍体细胞wi-38。

根据本公开的一方面，本公开所述轮状病毒为cdc-9毒株。

根据本公开的另一方面，本公开进一步包含对收获的轮状病毒进行减毒和/或灭活处理。

相对于现有技术，本公开所述方法提供了诸多有益技术效果。比如，通过多次或连续滴加胰酶，可以有效保持培养体系中的胰酶浓度，增强轮状病毒的感染活性，使得轮状病毒产量提高。再比如，在培养体系中添加高浓度的胰酶，可以增加轮状病毒产量。

附图说明

本公开将进一步通过示例性实施方式的形式阐述。一些示例性实施方式的细节将联系附图进行说明。应当理解的是，这些实施例是不对本公开范围进行限制的示例性实施方式，其作用类似于引用数学序号在绘图的多个视图中表示相似的结构一样。其中：

图1表示根据本公开的一些实施例中通过六孔板培养轮状病毒的产量情况；

图2表示根据本公开的一些实施例中通过摇瓶培养轮状病毒的产量情况。

具体实施方式

在如下发明内容阐述中，许多细节是通过举例的形式进行揭示，以便于提供对本公开的全面理解。但应当注意的是，对于本领域的普通技术人员而言，可能无需这些细节就可以实现本公开的内容。同时，对本领域的普通技术人员而言，对于已披露的实施例可以有许多的修改，在不背离本公开的精神和目的的情况下，本公开披露的一般性原理仍然适用于其他实施例或者应用。

应当注意，除非另有定义，本公开的所有技术性和科学性术语与本领域普通技术人员理解的一致。

应当注意，除非特别指出，本公开所述的单数形式，如“一个”、“一种”等，都包含了复数含义。特此，术语“和/或”包含了一个或多个相关列举事物的任何和所有组合。进一步地，术语“包含”和“包含但不限于”，在本公开中，用于阐明步骤、操作、和/或组成部分的存在，但是并不排除一个或多个其他步骤、操作、和/或组成部分的存在或者添加。

本公开提供了一种提高轮状病毒产量的方法，包含：

-使用轮状病毒株感染组织培养细胞；

-在培养体系中培养感染后的组织培养细胞；

-向培养体系中多次或持续性添加胰酶；

-向培养体系中添加胰酶，培养体系中胰酶浓度为2.0-10.0μg/ml之间；和

-收获轮状病毒。

在一些实施例中，所述培养体系中胰酶浓度为2.0-10.0μg/ml之间。具体地，所述培养体系中胰酶浓度为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，或10.0μg/ml。

在一些实施例中，所述方法通过多次(比如每12个小时添加一次、每24个小时添加一次、或每36个小时添加一次等频率)或者持续性(比如以每小时0.01μg/ml、每小时0.05μg/ml、每小时0.1μg/ml、每小时0.2μg/ml、每小时0.3μg/ml、每小时0.4μg/ml、每小时0.5μg/ml、每小时0.6μg/ml、每小时0.7μg/ml、每小时0.8μg/ml、每小时0.9μg/ml、每小时1.0μg/ml或每小时1.5μg/ml的速度等添加)向培养体系中添加胰酶，使培养体系中的胰酶浓度达到适合浓度。

应当注意，本公开所述胰酶添加频率或次数以及胰酶浓度并非限制性的。胰酶浓度可以根据多种因素(比如培养细胞数目、培养阶段等)进行调整。在一些实施例中，胰酶浓度可以根据细胞培养数目来调整。比如，当使用多孔板培养细胞时，在细胞浓度为5×10⁵cells/well时，胰酶浓度可以在5.0-10.0μg/ml范围。在一些实施例中，胰酶浓度可以根据培养阶段来调整。比如，在培养初期(如培养1-2天时)，可以降低胰酶浓度以便于减少胰酶对细胞的伤害。

本公开所述培养体系包含培养容器、细胞培养液、细胞生长介质和/或其他任何可以提供经轮状病毒感染后细胞生长的组成部分。在一些实施例中，所述培养容器为培养皿、多孔板、摇瓶、生物反应器、或一次性生物反应器。仅仅举例而言，六孔板和摇瓶可以用于经轮状病毒感染后的细胞培养。所述细胞生长介质是指利用本身物理化学特性为细胞提供生长所需的结构性支撑。在一些实施例中，所述细胞生长介质为微载体(比如球型微载体等)。仅仅举例而言，对于贴壁生长的细胞(比如vero细胞等)，可以使用球形微载体用于细胞的贴附与生长。所述球形微载体可以在培养容器中悬浮，充分接触细胞培养液。

本公开所述组织培养细胞可能是vero细胞，人二倍体细胞mrc-5,人二倍体细胞2bs，或人二倍体细胞wi-38。在一些实施例中，所述组织培养细胞可能是无血清适应性细胞，比如可能是无血清适应性的vero细胞。

本公开所述轮状病毒是可以用于生产轮状病毒疫苗或疫苗组合物的轮状病毒株系。在一些实施例中，所述轮状病毒可能是来源于centersfordiseasecontrol(cdc)的cdc-9毒株。

应当注意，本公开中对组织培养细胞和/或轮状病毒的描述是举例性的，而并非限制性的。本公开所述方法的目的和精神在于提高轮状病毒产量，因此多种可以用于轮状病毒感染的细胞都可以在本公开中使用。比如，本公开所用轮状病毒(如cdc-9毒株等)可能最初对一些细胞(如vero细胞、mrc-5细胞等)不适应，无法产生合适的病毒滴度，但这些轮状病毒和/或细胞均适合于在本公开中使用。在一些实施例中，通过本公开所述方法，向培养体系中添加一定浓度的胰酶(如2-10μg/ml，或10-20μg/ml等浓度的胰酶)可以使轮状病毒在数次传代后(如2-5代)对这些细胞产生适应性，产生合适滴度的轮状病毒。

在一些实施例中，本公开进一步包含对收获的轮状病毒进行减毒和/或灭活处理。仅仅举例而言，本公开可能使用福尔马林(如0.05％福尔马林)或β-丙内酯(如1:4000β-丙内酯)等进行轮状病毒灭活。再比如，本公开可能对轮状病毒进行热处理灭活(如55-56℃下保持30分钟)。

所述减毒和/或灭活后的轮状病毒可以用于制备轮状病毒疫苗或疫苗组合物等。在一些实施例中，轮状病毒灭活后可能与铝盐佐剂(如氢氧化铝佐剂等)混合用于制备轮状病毒疫苗。

本公开将通过如下数个示例性实施例对本公开的内容进行进一步描述。应当注意的是，对于本领域普通技术人员，可能无需如下实施例就可以实现本公开的内容，同时也可以在不违背本公开的精神和目的情况下轻易对如下实施例进行修改和变化。

实施例1.六孔板培养

根据本公开的一些实施例，六孔板可以用于轮状病毒培养和制备。具体操作如下：

1.细胞准备：取140代次左右vero细胞，以5×10⁵cells/well的密度接种于六孔板中，置co2细胞培养箱中37℃培养过夜，备用；

2.病毒激活：取已知滴度病毒收获液，按20μg/ml加入胰酶，置37℃水浴激活45-60分钟；

3.病毒感染及培养：吸弃细胞培养液，用无血清dmem培养液清洗细胞3次，2ml/次。按感染复数(multiplicityofinfection,moi)为0.05的比例接种病毒，补加dmem培养液至2ml/well，并按标记加入适量胰酶，置co2细胞培养箱37℃培养，连续添加胰酶组每24小时补加适量胰酶；

4.病毒收获及滴度检测：培养3-5天，每天观察细胞病变，待超过85％的细胞发生病变，收集病毒培养液，离心取上清，分装冻存于-20℃。用病毒空斑法检测病毒收获液病毒滴度。

图1表示根据本公开的一些实施例通过六孔板培养轮状病毒的产量情况。根据图1所示，a组是指低剂量一次性添加胰酶。b组是指高剂量一次性添加胰酶。c组是指高剂量连续3次添加胰酶。具体而言，a组中胰酶浓度为2μg/ml，b组中胰酶浓度为5μg/ml，c组中胰酶浓度为5μg/ml。由图1可知，在b组和c组中培养体系中添加了高浓度的胰酶后，b组中轮状病毒的滴度约为1×10⁵cfu/ml，而c组中轮状病毒滴度约为8×10⁵cfu/ml，说明经添加高浓度胰酶后，轮状病毒的滴度显著提高。

实施例2.摇瓶培养

根据本公开的一些实施例，摇瓶(spinner)可以用于轮状病毒培养和制备。具体操作如下：

1.细胞准备：取140代次左右的vero细胞，接种于t175细胞培养瓶，置co2细胞培养箱中37℃培养，待生长至90％，备用。

2.微载体准备：取3gcytodex1微载体，加入100mlpbs进行水化3-4小时，弃上层pbs，加入新鲜pbs100ml清洗2次，换新鲜pbs后高压灭菌，备用。

3.细胞接种：取高压灭菌后微载体，弃pbs，用dmem培养液清洗微载体2次，100ml/次。消化细胞并计数，取10⁸细胞加入微载体并混匀，转移细胞-微载体混合液于spinner培养瓶中，添加细胞培养液至400ml，置37℃co2细胞培养箱中培养，转速设定为30round/minute(rpm)；4小时后，转速调整至60rpm。于co2细胞培养箱中37℃培养5-7天，每天取样观察细胞状态并计数，同时监控细胞营养消耗，及时置换细胞培养液。

4.病毒感染与培养：取已知滴度病毒收获液，按20μg/ml加入胰酶，置37℃水浴激活45-60分钟。spinner取样计数细胞数，按moi＝0.05计算所需接种病毒量。弃spinner培养瓶中细胞培养液，用pbs对细胞进行清洗。接种所需病毒，添加细胞维持液至400ml，设置spinner转速至30rpm，于co2细胞培养箱中37℃培养2小时。然后补加细胞维持液至1l，并添加5μg/ml胰酶，每24小时补加胰酶。

5.病毒收获及浓缩：培养5-7天，每天取样观察细胞病变，待超过85％的细胞发生病变，收集病毒培养液，留样检测病毒滴度。病毒培养液离心后浓缩，病毒浓缩液经热灭活，用于制备灭活型轮状病毒疫苗制品。

图2表示根据本公开的一些实施例中通过摇瓶培养轮状病毒的产量情况。根据图2所示，组1是指不添加胰酶，组2是指连续添加胰酶。具体而言，组2中胰酶浓度为5μg/ml。由图2可知，经过连续添加5μg/ml胰酶，组2中的轮状病毒滴度显著增加。在培养体系中添加了高浓度的胰酶后，组2中轮状病毒的滴度约为4.5×10⁶cfu/ml，说明经添加连续添加高浓度胰酶后，轮状病毒的滴度显著提高。

应当理解，尽管本公开的实施例对本公开进行了描述，但对于本领域的普通技术人员而言，在不背离本公开的精神和范围的条件下，可以对本公开的各种形式和细节进行变化，或者对本公开的实施方式进行组合。