本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种磷脂类有机聚合物整体材料及其制备方法和应用。
背景技术：
1930年，tillett和francis发现在肺炎患者体内存在一种能和肺炎链球菌c多糖(cps)细胞壁上的磷脂类成分发生反应产生沉淀的物质[w.s.tillett,,t.jr.francis,j.exp.med.,1930,52:561]，后称之为c-反应蛋白(crp)。天然crp是一种由5个独立的亚基非共价组成的五聚体结构，由肝细胞产生，主要存在于血清、腹水和脑脊液中[j.p.atkinson,arthritisrheum.,2001,44:995–996.]，其在正常机体内含量很低，炎症反应时含量会成百上千倍的增加，因此现已成为一种非特异性的急性时相蛋白[m.mccarty,j.exp.meal.,1947,85:491.；a.p.osmand,n.ertel,j.siegel,h.gewurz.fed.proc.1975,34:854.]。此外，crp也可以作为预测心血管疾病发生的重要指标，并且与其它代谢综合征疾病(如：肿瘤、肥胖症、肠道性疾病等)关系密切。后续深入研究发现存在于机体内的crp还能激活补体系统，抑制特定的淋巴细胞和血小板的聚集，从而清除入侵机体的病原微生物及损伤、坏死或凋亡的组织细胞，在机体天然免疫过程中发挥着重要的作用[marketb.pepys,gideonm.hischfield,glenysa.tennent,etal.nature.2006,440:1217-1220.]。crp在生物体内的重要性使得其生理学功能研究越来越广泛，因此生理学家对crp的纯度和用量提出了更高的要求[johne.volanakis,w.lowellclements,ralphe.schrohenloher,jimmunolmethods,1978,23:285-295.]。
目前纯化crp的方法主要有薄膜分子印迹法[pei-chenchou,johnrick,tse-chuanchou,analchimacta,2005,542:20-25.]和以ca2+依赖性的磷脂类材料作为配基的亲和色谱法[l.soler,n.garcía,a.unzuetaetal.vetimmunolimmunop,2016,179:26–31]。薄膜分子印迹法能成功萃取标准蛋白混合物中的crp，但其特异性不佳且无法重复使用，实际应用价值不大。ca2+依赖性的磷脂类亲和色谱法是基于在ca2+存在条件下crp能和磷脂类官能团反应并产生沉淀进而进行分离分析的一种方法，其在crp的纯化中展现了纯化效率较高、重复利用率较好的优势，广泛应用于腹水、血清等体液中crp的富集。
常见的有将磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)作为配基固定在琼脂糖载体上的crp纯化方法[m.b.pepys,a.c.dash,m.j.ashley.clin.exp.immunol.1977,30,32-37.]，但是这些方法步骤繁琐，回收率低且一步纯化效果不理想。尤其是采用琼脂糖作为载体，其可能吸附与crp结构相近的血清淀粉样蛋白p成分(sap)，因此需要进一步通过凝胶过滤或梯度洗脱等精制步骤才能获得高纯度的crp。hiroshiendo等针对上述缺点，开发了一种热敏性聚合物的亲和沉淀法纯化兔血清中的crp。他们通过p-氨基苯磷酰胆碱凝胶(appc)与n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)的衍生物发生聚合反应得到热敏性appc-聚合物，并将其在临界温度32℃以下与兔血清混合后，温度上升到32℃以上进而形成crp-appc聚合物沉淀，最后通过离心分离达到富集纯化crp的目的。该方法所得crp纯度高且没有发现sap污染物，回收率达到82.3％，有效弥补了琼脂糖载体非特异性吸附的缺陷；但是该方法中crp溶液与热敏性聚合物的孵育时间长达12h且没有重现，后续推广有待证明[mori,s.,nakata,y.,endo,h.,proteinexprespurif,1994,5:153-156.]。近年来，基于磁性纳米材料比表面积大，分散性能好，抗非特异性吸附性能强等优点，已广泛应用于生物样品的分离分析[horak,d.,babic,m.,mackova,h.,benes,m.j.sep.sci.,2007,11:1751-1772.]。eunjookim等将3-(4)-乙烯基苄基-12-磷酸胆碱十二烷酸酯(vpc)修饰到磁珠上，构建vpc-mnps载体作为吸附剂分离人血清中的crp。该方法在一定程度上能达到一步纯化人血清中crp的效果，但是在纯化后的溶液中依然有其他杂蛋白条带的存在，纯度有待进一步验证；并且该方法没有进行特异性、重现性等考察，不足以后续推广使用[eunjookim,segeunlee,hyun-chulkimetal.separationscienceandtechnology,2013,48:2600-2607]。因此目前商业化的crp纯化技术依然采用琼脂糖凝胶作为载体，磷脂类材料作为配基(immobilizedp-aminophenylphosphorylcholinegel)，但其特异性和回收率不可兼得的弊端也在后续应用中展现出来[l.soler,n.garcía,a.unzuetaetal.vetimmunolimmunop,2016,179:26–31；michaelg.roper,meganl.frisk,janeenp.oberlander.analchimacta,2006,569:195–202]。
有机聚合物整体材料是功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂的聚合液在光或热引发条件下发生自由基聚合反应而形成的聚合物，其制备过程简单快速、大小孔分布均匀、渗透性好、稳定性高且具有良好的传质速率和优异的生物相容性，并可根据不同的分离需求选用合适的功能单体和交联剂，现已在催化、蛋白纯化和分离分析等领域展现出了不错的应用前景。因此开发特异性强、回收率高、重现性好、重复利用率高、操作步骤简单且能有效避免sap干扰的crp纯化新方法新材料，理论和实际价值非常重大。
技术实现要素：
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种磷脂类有机聚合物整体材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备得到的磷脂类有机聚合物整体材料。
本发明的再一目的在于提供上述磷脂类有机聚合物整体材料在纯化c-反应蛋白中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种磷脂类有机聚合物整体材料的制备方法，包括如下制备步骤：
将磷脂类单体化合物、交联剂、致孔剂和引发剂混合，然后超声溶解、脱气后灌入容器内，在40～70℃温度或紫外光照条件下聚合反应，得到所述磷脂类有机聚合物整体材料；
所述磷脂类单体化合物是指具有如下式1结构的2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-[n-(2-甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酰胆碱(mmpc)化合物，式2结构的单链磷脂酰胆碱(pc)化合物，式3结构的双链磷脂酰胆碱(dcpc)化合物(可参考文献[dieterverzele,fre′de′riclynen,mikedevrieze,etal.developmentofthefirstsphingomyelinbiomimeticstationaryphaseforimmobilizedartificialmembrane(iam)chromatography.chem.commun.,2012,48,1162–1164.])，式4结构的单链磷脂酰乙醇胺(pe)化合物，式5结构的双链磷脂酰乙醇胺(dcpe)化合物，式6结构的单链磷脂酸(pa)化合物，式7结构的双链磷脂酸(dcpa)化合物，式8结构的单链磷脂酰丝氨酸(ps)化合物，式9结构的双链磷脂酰丝氨酸(dcps)化合物中的至少一种，式中a为n或o元素，n的范围是2～18；
上述磷脂类单体化合物可参考文献[heejinkim,wonminchoi,seonjuleeetal.synthesisofbiomembrane-mimicpolymerswithvariousphospholipidheadgroups.polymer,2014,55,517-524.]制备得到。
优选地，所述的交联剂为n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(n,n'-methylenebisacrylamide,mba)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethyleneglycoldimethacrylate,edma)、聚乙二醇二丙烯酸酯(poly(ethyleneglycol)diacrylate,pda)中的任意一种，所述磷脂类单体化合物与交联剂的质量比优选为(1:4)～(4:1)。
优选地，所述的致孔剂为异丙醇(isopropanol,ipa)、四氢呋喃(tetrahydrofuran,thf)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,dmso)、甲醇(methanol,meoh)、环己醇(cyclohexanol,anol)、1，4丁二醇(1,4-butanediol,bdo)、正十二醇(1-dodecanol,lorol)、水(water,h2o)中的任意两种所组成的双元混合体系，其中两种致孔剂的质量比优选为(1:5)～(5:1)；所述磷脂类单体化合物与致孔剂的质量比为(1:6)～(1:1)。
优选地，所述的引发剂为热引发剂偶氮二异丁腈(azobisisobutyronitrile,aibn)或光引发剂安息香双甲醚(2,2’-dimethoxy-2-phenylacetophenone,dmpa)，或2,2’-偶氮二异丁腈脒二盐酸盐(2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,aiba)、过氧化苯甲酰(dibenzoylperoxide,bpo)、过氧化双月桂酰(lauroylperoxide,lpo)中的任意一种，所述引发剂的加入量优选为磷脂类单体化合物质量的1％。
优选地，所述的容器为不锈钢管、玻璃管、毛细管、固相萃取小柱、移液枪头、固相萃取吸头、磁性纳米颗粒、薄层板、滤纸、滤膜或玻璃单体瓶。
优选地，所述聚合反应的时间为30～1440min。
优选地，所述聚合反应完成后，用甲醇进一步冲洗除去致孔剂、未反应的单体、交联剂和低聚物。
一种磷脂类有机聚合物整体材料，通过上述方法制备得到。
上述磷脂类有机聚合物整体材料在c-反应蛋白纯化中的应用。
优选地，所述磷脂类有机聚合物整体材料在c-反应蛋白纯化中的应用步骤如下：将磷脂类整体材料先用缓冲溶液a平衡一段时间，再加入含crp的待纯化溶液，接着通过缓冲溶液a洗脱杂质，最后使用缓冲溶液b洗脱被特异性吸附的crp，得到纯化后的c-反应蛋白；所述缓冲溶液a的组成为10mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，50～400mm氯化钠(nacl)，2～10mm氯化钙(cacl2)，ph＝8.0～8.5；所述缓冲溶液b的组成为10mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，50～400mm氯化钠(nacl)，2～10mm乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，ph＝8.0～8.5。
优选地，所述缓冲溶液a平衡时间为0～60min。
优选地，所述含crp的待纯化溶液为含crp的标准蛋白溶液、炎症患者的血清或动物血清等实际样本。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)新型纯化材料。传统的crp纯化材料通常采用磷脂类化合物与琼脂糖基质相结合。而本发明采用磷脂类有机聚合物整体材料作为吸附剂，充分结合了磷脂类化合物特异性吸附crp的特性和整体材料制备简单、传质速率快、表面官能团密度大、渗透性好、重现性高、生物相容性好且抗蛋白非特异性吸附的优势，有效克服了传统crp纯化材料所存在的缺陷。
(2)新型纯化方法。传统的crp纯化方法主要包含亲和色谱和凝胶过滤等步骤，操作繁琐、纯化效率低且回收率不高。而本发明所述方法仅需通过一步纯化策略即可得到高纯度的crp蛋白且操作简单、回收率接近100％。
(3)操作简单、重复使用率高，利于实现产业化。商业化的crp纯化小柱纯化crp时需与样品孵育60min后才能进行下一步操作，且最终纯化的crp中含有杂蛋白。而本发明所得磷脂类有机聚合物整体材料吸附剂富集crp时无需孵化，纯化得到的crp通过maldi-tof-ms和sds-page验证不含其它杂蛋白，且吸附剂重复使用98次后对crp的回收率基本无变化。
附图说明
图1为实施例1中得到的poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料内部形貌的扫描电镜图。
图2为实施例1中得到的poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料的能谱分析图。
图3为实施例1的磷脂类有机聚合物整体材料对crp和其他蛋白的特异性选择的sds-page图(左)和回收率结果图(右)。
图4为实施例1的磷脂类有机聚合物整体材料连续使用四周(总计98次)后，所得crp的回收率结果图。
图5为poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料对炎症患者血清(a)和鼠血浆(b)的纯化结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将磷脂类单体化合物2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine，mpc)、交联剂mba、致孔剂(ipa和thf的混合体系)和引发剂aibn，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μl移液枪头内，然后将移液枪头两端封口，放入60℃水浴中反应12h；反应完毕后将移液枪头与注射器连接，在蠕动泵上用甲醇冲洗掉致孔剂、未反应的单体、交联剂和低聚物得到磷脂类有机聚合物整体柱(poly(mpc-co-mba))。其中单体mpc与致孔剂的质量比为25:75，单体mpc与交联剂mba的质量比为70:30，致孔剂ipa与thf的质量比为60:40，引发剂aibn的质量为单体mpc的1％。
本实施例中得到的poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料内部形貌的扫描电镜图(sem)及能谱分析图(eds)分别如图1和图2所示。由图1结果可知整体材料内部大小孔分布均匀且大孔孔径能够达到微米级，这种多孔结构保证了整体材料良好的渗透性和完整蛋白分子通过的能力。另一方面，整体材料的eds结果(图2)表明p元素成功键合到聚合物表面，证实了mpc被成功固定在整体材料基质上。
实施例2
将磷脂类单体化合物mpc、交联剂pda、致孔剂(dmso和thf的混合体系)和引发剂aibn，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μl移液枪头内，然后将移液枪头两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将移液枪头与注射器连接，在蠕动泵上用甲醇冲洗掉致孔剂及未反应的单体、交联剂和低聚物，得到poly(mpc-co-pda)有机聚合物整体材料。其中单体mpc与致孔剂的质量比为15:85，单体mpc与交联剂pda的质量比为80:20，致孔剂中dmso与thf的质量比为40:60，引发剂的质量为单体mpc总量的1％。
实施例3
将磷脂类单体化合物mpc、交联剂edma、致孔剂(ipa和bdo的混合体系)和引发剂aibn，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μl移液枪头内，然后将移液枪头两端封口，放入60℃水浴中反应12h；反应完毕后将移液枪头与注射器连接，在蠕动泵上用甲醇冲洗掉未反应的单体、致孔剂和低聚物，得到poly(mpc-co-edma)有机聚合物整体材料。其中单体mpc与致孔剂的质量比为15:85，单体mpc与交联剂edma的质量比为53:47，致孔剂中ipa与bdo的质量比为25:75，引发剂的质量为单体mpc质量的1％。
实施例4
将磷脂类单体化合物2-甲基丙烯酰氧十二烷基磷脂酰胆碱(12-methacryloyldodecylphosphocholine,mdpc)、交联剂edma、致孔剂(ipa和bdo的混合体系)和引发剂aibn，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μl移液枪头内，然后将移液枪头两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将移液枪头与注射器连接，在蠕动泵上用甲醇冲洗掉致孔剂及未反应的单体、交联剂和低聚物，得到poly(mdpc-co-edma)有机聚合物整体材料。其中单体mdpc与致孔剂的质量比为25:75，单体mdpc与交联剂edma的质量比为40:60，致孔剂中ipa与bdo的质量比为83.3:16.7，引发剂的质量为单体mdpc质量的1％。
实施例5
将磷脂类单体化合物1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺十一酰)-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1-dodecanoyl-2-(11-methacrylamidoundecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine,mdspc)、交联剂edma、致孔剂(ipa和anol的混合体系)和引发剂aibn，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μl移液枪头内，然后将移液枪头两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将移液枪头与注射器连接，在蠕动泵上用甲醇冲洗掉致孔剂及未反应的单体、交联剂和低聚物，得到poly(mdspc-co-edma)有机聚合物整体材料。其中单体mdspc与致孔剂的质量比为27:73，单体mdspc与交联剂edma的质量比为45:55，致孔剂中ipa与anol的质量比为83.3:16.7，引发剂的质量为单体mdspc质量的1％。
实施例6
将磷脂类两性离子化合物mmpc、致孔剂(meoh和thf的混合体系)和引发剂aibn，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μl移液枪头内，然后将移液枪头两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将移液枪头与注射器连接，在蠕动泵上用甲醇冲洗掉致孔剂及未反应的单体和低聚物，得到polymmpc有机聚合物整体材料。其中mmpc与致孔剂的质量比为30:70，致孔剂中meoh与thf的质量比为35:65，引发剂的质量为mmpc质量的1％。
上述实施例的磷脂类有机聚合物整体柱在c-反应蛋白纯化中的应用效果测试：
一、以实施例1所得有机聚合物整体材料为吸附剂，考察其对crp的特异选择性：
以含有人血清白蛋白(hsa)、人免疫球蛋白g(igg)、β乳球蛋白(β-lactoglobulin)、溶菌酶(lysozyme)、细胞色素c(cytochromec)、crp的混样为测试样品，考察该吸附剂对crp的特异选择性。测试条件为：
吸附剂：poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料；
样品：hsa、igg、β-lactoglobulin、lysozyme、cytochromec；
淋洗液：缓冲溶液a(组成为10mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，140mm氯化钠(nacl)，2mm氯化钙(cacl2)，ph＝8.0～8.5)；
洗脱液：缓冲溶液b(组成为所述缓冲溶液b的组成为10mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，140mm氯化钠(nacl)，2mm乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，ph＝8.0～8.5。)
流速：100μl/min。
得到的该磷脂类有机聚合物整体材料对crp和其他蛋白的特异性选择的sds-page图(左)和回收率结果图(右)如图3所示，由图3结果可知，在淋洗步骤中杂蛋白都能被缓冲溶液a冲洗完全，在洗脱液中只存在crp，这证明了该吸附剂对crp具有非常好的特异选择性。
二、以实施例1所得有机聚合物整体材料，用于考察连续纯化样品时的稳定性和重复利用率：
测试条件为：
吸附剂：poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料；
样品：标准crp溶液；
淋洗液：缓冲溶液a；
洗脱液：缓冲溶液b；
流速：100μl/min。
连续使用四周(总计98次)后，所得crp的回收率如图4所示，由图4结果可知，poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料连续使用四周(总计98次)后，所得crp的回收率没有明显变化，证明该吸附剂在整个纯化过程中稳定性良好，重复使用率高。
三、以实施例1所得的有机聚合物整体材料，用于实际生物样品中crp的纯化：
纯化条件为：
吸附剂：poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料；
样品：a：炎症患者血清；b：鼠血浆；
淋洗溶液：缓冲溶液a；
洗脱溶液：缓冲溶液b；
总流速：100μl/min；
poly(mpc-co-mba)有机聚合物整体材料对炎症患者血清(a)和鼠血浆(b)的纯化结果图如图5所示，由图5结果可知，样品中的crp能被该吸附剂富集，而其他蛋白均不能吸附在该整体柱上，证明了本发明制备的磷脂类有机聚合物整体柱能成功应用于实际样品中crp的纯化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。