本发明属于法医物证领域，涉及一种39个基因座的新型荧光标记复合扩增检验系统，具体是涉及一种同时分析人基因组常染色体及y染色体基因座的六色新型荧光标记复合扩增系统，该系统可以应用于个体识别、父-子亲权鉴定、嫌疑人家系排查、强奸案中微量男性样本检测、常染色体数据库及y染色体数据库的建库。
背景技术：
短串联重复序列(str)是目前普遍应用的分子遗传标记，它片段小易扩增，适宜于检验微量和降解生物检材，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增和自动化检测，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点，非常适用于建立dna数据库。目前，在法医检测中，常染色体分型与y染色体检测一般都是分开的。最多在常染色体检测中加入了dys391。因为dys391多态性差，主要用于辅助性别判定。如果能同时检测常染色体基因座及多态性更高的y染色体基因座，既能用y染色体基因座信息于嫌疑人的快速排查，又能根据常染色体基因座信息确定嫌疑人。
常用的str检测试剂盒包括常染色体str检测试剂盒和y染色体str检测试剂盒，可以分别进行个体识别检测和父系检测。当一个重大刑事案件发生时，往往会对现场提取的物证先进行常染色体str检测，当确认为男性犯罪嫌疑人遗留的物证时，再加做y染色体str检测，由此增加侦查线索。然而，现有的str分型技术因受到检材状态、扩增位点个数、扩增体系等因素的影响，仅pcr过程就耗时3个小时左右，这样两次的检验程序往往因为增加了检测时间而延误抓获犯罪嫌疑人的最佳机会，同时也会因为犯罪嫌疑人遗留在现场的物证量少导致检测失败，最终失去侦查线索。总而言之，随着刑事案件的增多，现有检测试剂盒已无法很好的满足公安实战对于法医dna的快速检验和现场检验能力的要求，如何实现常染色体str基因座和y染色体str基因座一起检测，达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率成为有待解决的问题。
在法医鉴定与亲子鉴定领域，dna分析主要依赖商业化的试剂盒进行。目前常用的str检测试剂盒包括常染色体str检测试剂盒和y染色体str检测试剂盒，可以分别进行个体识别检测和父系检测，其中y染色体str检测试剂盒也可用于建库工作。专利201310364183.0首次公开了常染色体str和y-str混合检测技术，但由于检测y-str位点个数太少，同时还是采用五色荧光技术，排查能力有限，实际应用中受到很大的限制；专利201510918064.4虽然采用最新的六色荧光技术，但扩增片段依旧是500bp以内，检测y-str位点依旧不能满足案件排查的需要。
本发明利用高效的热启动taq酶及六色荧光技术，创造性的将str扩增片段提升至600bp，采用最新的markersiz-600(专利201610839513.0)进行分析，实现在一个体系中同时扩增和检测39个str基因座，为业内之最，包含专利201510918064.4中所有str位点，同时加入多态性较高的dys437，dys19，dys448，dys576，dys533，dys481等六个y-str基因座，最终研发成a-str基因座和y-str基因座同时检测的综合试剂盒，为满足公安实战对于法医dna的快速检验和现场检验能力的要求提供有效的技术保障。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种可同时扩增检测18个a-str、20个y-str及性别(amel)位点的荧光标记复合扩增试剂盒，为满足公安实战对于法医dna的快速检验和现场检验能力的要求提供有效的技术保障。
一种同时扩增人常染色体和y染色体str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，所述试剂盒含有用于特异性扩增39个基因座的38组引物对(其中dys385a/b为1对引物),39个基因座分别为dys391、d3s1358、d13s317、d7s820、d16s539、pentae、dys635、dys458、dys456、tpox、th01、d2s1338、csf1po、dys385a/b、dys438、dys448、dys437、d19s433、vwa、dys19、d18s51、d6s1043、dys576、amelogenin、d8s1179、d5s818、d21s11、d12s391、fga、dys533、dys393、dys389i、dys389ii、dys439、dys392、y_gata_h4、dys390及dys481，39个基因座的引物序列和对应的浓度如表1所示：
表1各个基因座的引物序列及浓度
每个基因座中的至少一条引物的5’端标记有荧光染料。
优选地，39个基因座的引物对使用5种不同的荧光染料标记，根据标记的荧光染料不同分为5组，分别是：dys391、d3s1358、d13s317、d7s820、d16s539、pentae、dys635和dys458为第一组，荧光染料标记为6-fam；dys456、tpox、th01、d2s1338、csf1po、dys385a/b、dys438和dys448为第二组，荧光染料标记为hex；dys437、d19s433、vwa、dys19、d18s51、d6s1043、dys576为第三组，荧光染料标记为ea50；amelogenin、d8s1179、d5s818、d21s11、d12s391、fga、dys533为第四组，荧光染料标记为e11；dys393、dys389i、dys389ii、dys439、dys392、y_gata_h4、dys390及dys481为第五组，荧光染料标记为620。
pcr是一个复杂的分子动力学过程。随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，小片段优势扩增越来越明显，同时由于荧光染料的检测效率问题，大片段扩增峰将会很低，本发明采用新型荧光标记技术，将ea50色dys576，e11色dys533，620色dys481三个基因座引物序列的5端第六个碱基标记fam，克服了ea50色dys576，e11色dys533，620色dys481扩增检测效率问题，使其扩增检测效率达到同色其他基因座水平。
除了特异性引物和新型荧光标记外，本试剂盒还包含以下成份，如下表2：
表2试剂盒包含组分
本发明试剂盒因为需要满足不同物证检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的dna分型。最终扩增程序如表3：
表3试剂盒扩增程序
本发明试剂盒的扩增产物采用毛细管电泳方法检测。
本发明试剂盒具有很强的检材适应性，包括采用chelex法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的人基因组dna及滤纸、fta卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
本发明试剂盒实现a-str和y-str两库同建，可用于个体识别、亲权鉴定、家系排查及家谱构建等。
本发明的有益效果包括：
1、本发明包含了公安部常染色体dna数据库推荐使用的18个a-str基因座，y染色体dna数据库推荐使用的20个核心y-str基因座，实现单管同时扩增检测39个基因座，为业内最多。
2、本发明实现了一次实验同时分析a-str及y-str两种数据，可同时用于案件家系的快速排查和犯罪嫌疑人的精准认定，达到缩短检测时间同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率，20个y-str基因座对于案件的排查具有很大的地域、姓氏指向性，可最大限度的排除无关家系。
3、本发明实现了a-str及y-str两个dna数据库同时建设，大大节约了人力物力财力。
4、本试剂盒采用最新的markersiz-600分析，同时采用新型荧光标记的方法进行标记，提高大片段的荧光效率，确保了更快的扩增速度，更好的均衡性和更高的灵敏度。
5、本发明可以检测出大量女性dna样本背景下的微量男性dna，是检测如强奸犯罪等混合斑检材的有力武器。
6、本发明在检测父-子亲权鉴定时，由于y-str数据已包含而无需单独再做y-str实验分析。
7、本发明涉及一种采用六色新型荧光标记复合扩增检验系统对dna样品进行分析的方法；其中，本发明适用的dna样品来源于精斑、唾液斑、组织、毛囊、血痕或血液等。
8、本发明试剂盒引物通过精心设计和不断修改，具有较强的扩增特异性，种属特异性及温度耐受性。
附图说明
图1是对照品9948的str分型结果；
图2是等位基因分型标准物的电泳图谱；
图3是dys576、dys533、dys481使用现有的直扩血卡的扩增图谱；
图4是dys576、dys533、dys481使用所述荧光标记复合扩增试剂盒的扩增图谱；
图5是实施例5中大量女性样本背景下微量男性样本的检测图谱；
图6是实施例5中男性样本量和女性样本量相当的检测图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：检测基因座的确定；试剂盒引物组、扩增体系、扩增方法的确定。
一、基因座的确定
本发明在201110243734.9方案基础上，添加两个常染色体基因座d19s433、pentae，使其常染色体str位点数达到18个，通过对10000多名无关个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率统计分析个体识别力(dp)、杂合度(h)、非父排除率(pe)等数据，结果表明其中有16个a-str基因座的dp值均接近0.9，h均大于0.7，pe值在0.5以上，具有较好的法医学应用价值，而th01、tpox两个基因座的遗传统计数据虽不及上述16个a-str，但仍属于公安部dna数据库的推荐范畴。保持现有的a-str，增加一定数量的y-str，对亲缘关系的鉴定，家系排查，估计可能的人群来源有巨大的作用。
本发明，在上述18个常染str位点的基础上，加入20个y-str基因座(包含y-filer试剂盒中17个y-str，同时包含dys576，dys533，dys481)，20个y-str基因座完全符合公安部y-str数据库建设方案推荐的核心基因座要求，每个基因座信息如表4：
表4各基因座信息
二、荧光标记str复合扩增体系的优化及建立
在引物设计时，需保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、tm值和gc含量相近、引物之间不能形成二聚体；同时由于有些y-str基因座与x染色体上有较高的同源性，所以在引物设计时需要考虑到引物扩增的特异性，既要保证女性样本无扩增，同时还要考虑到在复合扩增中引物对不同检材的适用性，保证不同检材扩增均衡性要求。
最终确定同时扩增人常染色体和y染色体str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其中pcr扩增体系由如下组成：
表5扩增体系组成
其中所述的reactionmix中各组分反应终浓度为50mmtris-hcl、50mmkcl、2.0mmmgcl2和0.2mmdntps，0.8mg/mlbsa。
其中39个基因座对应的引物及其引物浓度如表1所示。将所述39个基因座按如下分组并进行荧光标记：dys391、d3s1358、d13s317、d7s820、d16s539、pentae、dys635和dys458为第一组，荧光染料标记为6-fam；dys456、tpox、th01、d2s1338、csf1po、dys385a/b、dys438和dys448为第二组，荧光染料标记为hex；dys437、d19s433、vwa、dys19、d18s51、d6s1043、dys576为第三组，荧光染料标记为ea50；amelogenin、d8s1179、d5s818、d21s11、d12s391、fga、dys533为第四组，荧光染料标记为e11；dys393、dys389i、dys389ii、dys439、dys392、y_gata_h4、dys390及dys481为第五组，荧光染料标记为620。
试剂盒的热循环仪的扩增程序如下：(1)初始变性：95℃，2min；(2)热循环：15个循环：94℃30s，60℃40s，72℃1min；再进行15个循环：90℃30s，58℃1min，65℃1min20s；(3)终延伸：60℃20min；(4)保温：4℃维持。
电泳结束后，将pcr扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μl产物或试剂盒等位基因分型标准物与0.5μl荧光分子量内标agcumarkersiz-600和12μl去离子甲酰胺混合，避免产生气泡，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，遗传分析仪电泳检测，用片段分析软件genemapper分析电泳数据。dna标准对照品9948和等位基因分型标准物的分型结果如图1、图2所示。
实施例2：新型荧光标记对比测试。
本发明为实现39个位点的pcr单管扩增，创造性的将扩增片段延伸至600bp。对于扩增片段较大的基因座(ea50色dys576，e11色dys533，620色dys481)，采用传统单荧光标记，按照实施例1的技术方案，扩增某直扩血卡样本x1，扩增图谱见图3。
pcr是一个复杂的分子动力学过程。随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰越来越严重，同时由于扩增片段较大，加之荧光发射波长越长，检测效率越低，导致放置在大片段的基因座，采用传统单荧光标记，不能满足扩增检测的需求，本发明采用新型的荧光标记，可以解决大片段扩增效率低的问题，具体的方法为：dys576基因座5’端标记ea50荧光，距离5’端第六个碱基标记fam荧光；dys533基因座5’端标记e11荧光，距离5’端第六个碱基标记fam荧光；dys481基因座5’端标记620荧光，距离5’端第六个碱基标记fam荧光。本发明通过不断摸索第二荧光标记在引物序列的位置，使得供体荧光分子(fam)与受体荧光分子(ea50、e11或620)靠近，产生fret现象，在不影响其原有发射波长的情况下，使得原有荧光(ea50、e11或620)效率提升6-10倍，使其扩增检测效率达到同色其他基因座水平。新型荧光标记的扩增图谱见图4。
实施例3：调整pcr反应程序。
本发明试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的扩增程序，以保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的dna分型。首先，循环数测试：分别测试了28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，实验证明最佳循环为30个；其次退火温度测试：分别测试了57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，实验证明最佳温度为60℃和58℃。最终扩增程序如下：
表6扩增程序
实施例4：分辨能力比较。
采用实施例1中的方案应用39个基因座的荧光标记复合扩增试剂盒中的20个y-str基因座进行案件排查。
1、收集案件排查中的不同检材
本实验中3820份来自不同个体的样品均由佛山市公安局提供：包括2940份血样，200份精斑、400份唾液斑、280份组织。基因组dna的提取参考《ga/t383-2014法庭科学dna实验室检验规范》进行。
2、扩增检测
按照实施例1进行pcr扩增、电泳检测和结果分析。所有样品用y-filer试剂盒、发明专利201410208458.6所述试剂盒和发明专利201510918064.4所述的试剂盒和本发明所提供的试剂盒同步扩增分析。
3、结论
结果如表7所示，本发明的分辨效能优势明显。不同来源的1000份样品测试结果表明，发明专利201410208458.6方案新加入的10个y-str基因座可以把该1000份样品分出510种单倍型，发明专利201510918064.4方案加入的14个y-str基因座可以分成745种单倍型，分别较y-filer试剂盒分辨能力可以达到63％和92％(510种单倍型/810种单倍型、745种单倍型/810种单倍型)，而本发明(20y)的分辨能力较y-filer试剂盒有很大的提升，1000份无关样本分辨能力提升19％((20y分辨出的1000种单倍型-17y分辨出的810种单倍型)/1000份样本)；2000份样本分辨能力提升23％，3000份样本和3820份样本分辨能力分别提升24％和25％，检测样本数目越多，分辨能力优势越明显，在实际案件排查过程中，可以尽可能多的排查无关家系，增加了案件排查效率，节省了人力物力和财力，满足公安法医案件y排查的需要。
表7、3820份模板10y、14y、20y分型结果中的单倍型数量的统计
实施例5：本发明试剂盒在强奸案件中的应用。
应用39个基因座的荧光标记复合扩增检验系统对强奸案中男女混合斑检测。
1、收集强奸案件中不同检材：本实验中10份男女混合斑均由佛山市公安局提供，基因组dna的提取参考《ga/t383-2014法庭科学dna实验室检验规范》进行。
2、扩增检测
按照实施例1进行pcr扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。
3、结论
图5为上述案件之一检测图谱，结果显示，在强奸案件中，当大量女性样本混合有微量男性样本时，采用该系统进行扩增检测，仍然可以检测出20个y-str的大部分基因座信息，利用获得的y-str信息，可进行家系排查，快速锁定嫌疑人，由于女性样本含量较高，女性样本常染色体基因座等位基因扩增峰较高，掩盖了男性样本中常染色体的分型，系统不能读出，因此该系统对于检测大量女性样本中混有的微量男性dna很灵敏，对于混合斑的检测有巨大作用。
图6为上述案件之二代检测图谱，结果显示，在强奸案件中，当混合斑中女性样本量和男性样本量近乎相当时，采用该系统进行扩增检测，不仅可以检测出20个y-str基因座的信息，同时常染色体处，可以检测出混合样本分型，通过对比受害人分型，可以剥离出嫌疑人常染str分型，直接锁定嫌疑人。
本试剂盒实现了a-str基因座和y-str基因座同步检测分析，原本需要两次的检验程序缩减到一次完成，减少了检测时间，提高了检测效率，从而增加了抓获犯罪嫌疑人的机会；另外一次检验减少了样品所需的绝对量，从而增加了犯罪嫌疑人遗留在案件现场的有效物证量，最终更多的物证信息增加了侦查线索。总而言之，随着刑事案件的增多，现有检测试剂盒已不能很好的满足公安实战对于法医dna的快速检验和现场检验能力的要求，而a-str和y-str两种基因座一起检测，可以达到缩短检测时间的同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率。
sequencelisting
<110>广东华美众源生物科技有限公司
<120>一种同时扩增人常染色体和y染色体str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及
其应用
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