一种稻瘟病抗性基因Pigm功能特异性分子标记及其应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因pigm功能性分子标记及其应用。

背景技术：

由稻瘟病菌(magnapotheoryzae)引起的稻瘟病害是水稻最重要的病害，给世界水稻的主产区都会造成严重的损失。由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致多数抗性品种会在种植3〜5年时间里逐渐丧失抗性；因此，鉴定和合理利用广谱抗性基因是抗病品种的重要途径。近年来，随着多个水稻稻瘟病抗性基因得以被精细定位或克隆（suetal.2015），以及分子标记的发展及应用，促进了抗性基因的鉴定以及多抗病基因聚合育种的发展。但在已克隆的抗性基因中，多数高抗基因成簇分布在同一区域上，如pi2/9,pik和pi-ta等基因座，连锁标记无法将同一基因座的基因分辨开来。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。

pigm位于pi2/9基因座上，目前在该基因座上至今已至少发现pi2,piz-t，pi9和pigm等抗性基因；pigm是其中较为重要的抗病基因之一，随着该基因被克隆及相关研究成果的发表，我们基本可以确定pigm是当前最广谱高抗的基因之一。当前，研究者已利用开发出一些与pigm连锁的分子标记，如“抗稻瘟病基因pigm的检测方法及其应用（cn106929585a）”，“一种水稻抗瘟病基因pigm的分子标记及其应用（cn107034308a）”和“一种与水稻稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用（cn107164547a）”等。这些标记要么是基于特定亲本间的多态性分析，要么是位于抗性基因pigm的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离；它们只适用于部分亲本间，不宜于种质资源鉴定或抗性资源筛选。因此，为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因pigm应用到水稻抗性育种工作中，有必要开发真实反映目标基因、方便易用的ρigm特异的分子标记。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因pigm基因功能特异性分子标记pigm-sm。

本发明的另一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因pigm基因特异性分子标记pigm-sm的检测方法。

本发明的再一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因pigm基因功能特异性分子标记pigm-sm的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种稻瘟病抗性基因pigm基因功能特异性分子标记pigm-sm，是通过引物对seqidno.1和seqidno.2从水稻基因组dna中扩增出与稻瘟病抗性基因pigm呈特异性带型的分子标记；

fl:seqidno.1（5’-3’）:tttcgtttgctatgagcac；

rl:seqidno.2（5’-3’）：actggactatgtgatcggt；

所述的水稻品种为谷梅4号（pigm供体亲本）；

所述的稻瘟病抗性基因pigm包括pigm-r2的3’utr片段i和pigm-r4和pigm-r6的nbs-lrr片段ii

i:tttcgtttgctatgagcaccaatcgtttgctagaatgtctgaaagatcttgtgtacatatggtggactgaacaattgaacattacaagttatcatattttatattgttgctaaccgatcacatagtccagt。

ii:tttcgtttgctatgcgcagttgcgcaccaaccgtttgctagaatgtctgaaagagcctatgtacatatggtggcctgaacattacaagttatcatattttatattgttgctagctttcctttcaaaaaaaaaaaattgttcctaaccgatcacatagtccagt。

所述的稻瘟病抗性基因pigm的功能特异性分子标记pigm-sm的检测方法，通过比对多个水稻稻瘟病抗性基因pigm的等位基因序列，包含以下步骤:

(1)从公共数据库中下载得到的pigm(ku904633.2)及其同源的pi2(dq352453)、pi9(dq285630.1)和piz-t(dq352040)以及测序品种日本晴(nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对pigm位点进行序列比对，筛查pigm特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的多态性位点；

(2)利用步骤(1)获得的多态性信息，根据标记的设计原理，在所述多态性位点处上下游100〜200bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下:

fl:5-tttcgtttgctatgagcac-3；

rl:5-actggactatgtgatcggt-3；

(3)以携带有稻瘟病抗性基因pigm的稻瘟病抗性品种谷梅4号的总dna为模板，进行pcr扩增，所获得的pcr产物即为稻瘟病抗性基因pigm基因特异性分子标记pigm-sm；

所述的稻瘟病抗性基因pigm基因特异性分子标记pigm-sm在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，特别适合于在鉴别pigm基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因的应用；优选包含如下步骤:

(i)扩增:利用引物fl和rl对待检测的水稻品种的基因组进行pcr；

(2)检测:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若检测到分子量大小为131bp和163bp的核苷酸片段，则携带有稻瘟病抗性基因pigm；若检测到分子量大小为131bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有pi9；若检测到分子量大小为164/165bp，则待检测的水稻品种携带有pi2/z-t；若没有检测到的核苷酸片段，则待检测的水稻品种不携带pigm位点的功能基因。

本发明的原理：本发明通过多序列比对的方法寻找pigm基因序列上出现的两个片段，由于这两个片段分别只有一个存在于pi2/z-t和pi9，而在日本晴中不含有该位点，因此很容易将pigm从中区分出来。本发明据此设计引物对f1/r1，通过常规pcr扩增，在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，以不同大小的片断得以呈现。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

(1)本发明提供的分子标记特异性高:pigm所在的基因组区域存在着包括pigm在内的4个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源(dengetal.2017)。本发明提供的分子标记是本发明人经过不断的进行序列多态性搜查并通过实验验证得到的，能明显地将pigm-sm与存在于该基因组区域内的pi2/z-t和pi9进行区分。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量：目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。本发明提供的分子标记只需pcr结合琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。

(3)本发明是第一个针对pigm基因两个特异区域所开发的标记。本发明能通过电泳检测的方法成功地将pigm与定位在该位点上的其它稻瘟病抗性基因(pi2,piz-t和pi9)区分开，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所提供的pigm特异性分子标记pigm-sm是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优于显性标记。本发明可应用于pigm的种质资源筛选、转基因鉴定和基因聚合以及基于mas技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于pigm基因内部，因此对pigm的筛选能力理论值可达100%，其综合性能优于已报道的与pigm连锁的分子标记和功能标记。

(4)本发明提供的分子标记能简便地应用于遗传背景不同的群体中。现有的与pigm连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体两个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。本发明适用于任何遗传背景下的转基因育种，基因聚合以及基于mas技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。

因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因pigm-sm具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在种质资源筛选、分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

附图说明

图1是pigm基因特异性分子标记pigm-sm在pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因及日本晴的验证结果图，其中：泳道1为dnaladder，泳道2〜6的dna模板依次为抗性品种谷梅4号(pigm)、抗性品种华占(pi2)、抗性品种toride-1(piz-t)、抗性品种75-1-127(pi9)、感病品种日本晴(npb)。

图2是pigm基因特异性分子标记pigm-sm在其它水稻品种中的验证结果图，其中：泳道1为dnaladder，泳道2〜96的dna模板依次为抗性基因供体品种谷梅4号、华占、toride-1、75-1-127、谷丰a、鄂早11、闽恢3119、新1223、y58s、中逝b、湘早籼45号、中早23、618b、宜香1b、花香b、ii-32b、629b、2155、五丰b、荟丰b、安丰b、龙特浦b、金抗1b、泰丰b、天丰b、ir88988b、广抗13b、珍汕97b、金23b、地香b、d702b、博白b、深95b、粤丰b、福伊b、710s、se21s、闽2b、朝阳一号b、黎明b、金南特43b、优1b、岳4b、d62b、冈46b、丰源b、d702b、明恢86、r1128、空育131、湘早籼7号、中恢8015、银占、广超128、小占、黄华占、中香1号、中鉴100、广陆矮4号、南特号、桂朝2号、台中在来1、万利籼、镇籼232、矮仔占、二九南1号、恢29、矮脚南特、明恢63、ir661-1、南京11号、圭630、矮沱谷151、湘晚籼1号、洞庭晚籼、扬稻2号、中农4号、广恢128、特青选、测64、晚3、r527、广恢998、乐恢188、蜀恢881、多系1号、蜀恢498、明恢72、泸恢17、盐恢559、辐恢838、江油恢151、抗蚊青占、桂99、成恢448、辐恢718。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1:稻瘟病抗性基因pigm基因特异性分子标记及其引物设计与检测

(1)pigm基因多态性的分析:

从公共数据库中下载得到pigm、pi2、piz-t和pi9的基因组序列及测序品种日本晴(nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对pigm特异序列进行序列比对，筛查pigm特异的、能区别于该位点等位基因的差异位点。具有pigm基因特异性的的多序列比对结果下表所示:

i：

pigm:1cttatttcgtttgctatgagcaccaatcgtttgctagaatgtctgaaagatct53

pi2/z-t:1-----------------------------------------------------53

pi9:1cttatttcgtttgctatgagcaccaatcgtttgctagaatgtctgaaagatct53

54tgtgtacatatggtggactgaacaattgaacattacaagttatcatattttatattgt111

54-----------------------------------------------------------111

54tgtgtacatatggtggactgaacaattgaacattacaagttatcatattttatattgt111

112tgctaaccgatcacatagtcc132

112----------------------132

112tgctaaccgatcacatagtcc132

ii：

pigm:1cttatttcgtttgctatgcgcagttgcgcaccaaccgtttgctagaatgtctga54

pi2/z-t:1cttatttcgtttgctatgcgcagttgcgcaccaaccgtttgctagaatgtctga54

pi9:1--------------------------------------------------------------54

55aagagcctatgtacatatggtggcctgaacattacaagttatcatattttatattgttgcta116

55aagagcctatgtacatatggtggcctgaacattacaagttatcatattttatattgttgcta116

55---------------------------------------------------------------------116

117gctttcctttc--aaaaaaaaaaaattgttcctaaccgatcacatagtcc165

117gctttcctttcaaaaaaaaaaaaaattgttcctaaccgatcacatagtcc165

117---------------------------------------------------------165

(2)设计引物:

根据标记的设计原理，在所述位点处上下游100-200bp处设计引物，引物对碱基序列如下所示:

fl:5’-tttcgtttgctatgagcac-3’；

rl:5’-actggactatgtgatcggt-3’。

(3)选择水稻代表品种:选择携带有pigm等位功能基因以及非功能等位基因的代表品种如下:

功能基因：华占（pi2）、toride-1（piz-t）和75-1-127（pi9），感病对照品种：日本晴。

(4)pcr扩增，获得含有pigm基因特异性片段

利用上述引物对fl和r1，以上述水稻品种的总dna为模板，进行常规pcr扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到的结果如图1所示。

扩增反应体系如下:

2×mixbuffer(mg2+plus):12.5μl

引物fl(10μμ):1μl

引物rl(10μμ):1μl

taqase(5u/ml):0.2μl

dna模板(20-50ng/μi):1μl

ddh2o:补足至25μl。

pcr温度循环条件如下:94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

pcr反应结束后，取适量样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90v，1小时。

其中，图1的泳道i为pigm供体品种水稻品种谷梅4号基因组为模板pcr得到的片段，与稻瘟病抗性基因pigm呈特异性带型，即泳道1为pigm基因特异性分子标记pigm-sm。图1的结果显示，pigm-sm能将pigm从该位点的功能和非功能基因中区分出来。也就是说，凡是携带有pigm的水稻品种，其pcr扩增产物的电泳检测条带以132bp和163bp呈现，而含有其它单个条带或者不含有条带的，表示该位点含其它功能基因和非功能基因。

实施例2:抗性基因pigm基因特异性分子标记在鉴别pik基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

根据多态性的pcr产物条带，可以把含有目标基因pigm与其它pi2/9基因簇上的抗性基因区分开来。如图1所示，根据条带位置和存在情况可以将pigm与该位点所鉴定到的其它抗性基因区分开来，含有132bp和163bp表示pigm基因，其它带型表示不含有该位点的功能基因。可见试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因pigm基因特异性分子标记可在鉴别pigm基因与pi2/9基因族等位基因等方面得到应用。

实施例3:抗性基因pigm基因特异性分子标记在其它水稻品种中的检测应用

选择92个代表性水稻品种，依次为:谷丰a、鄂早11、闽恢3119、新1223、y58s、中逝b、湘早籼45号、中早23、618b、宜香1b、花香b、ii-32b、629b、2155、五丰b、荟丰b、安丰b、龙特浦b、金抗1b、泰丰b、天丰b、ir88988b、广抗13b、珍汕97b、金23b、地香b、d702b、博白b、深95b、粤丰b、福伊b、710s、se21s、闽2b、朝阳一号b、黎明b、金南特43b、优1b、岳4b、d62b、冈46b、丰源b、d702b、明恢86、r1128、空育131、湘早籼7号、中恢8015、银占、广超128、小占、黄华占、中香1号、中鉴100、广陆矮4号、南特号、桂朝2号、台中在来1、万利籼、镇籼232、矮仔占、二九南1号、恢29、矮脚南特、明恢63、ir661-1、南京11号、圭630、矮沱谷151、湘晚籼1号、洞庭晚籼、扬稻2号、中农4号、广恢128、特青选、测64、晚3、r527、广恢998、乐恢188、蜀恢881、多系1号、蜀恢498、明恢72、泸恢17、盐恢559、辐恢838、江油恢151、抗蚊青占、桂99、成恢448、辐恢718。

分别提取其基因组dna，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行pcr扩增和电泳检测。根据条带的大小和存在情况，可以把抗性基因pigm与其他稻瘟病抗性基因区分开来。如图2所示，在rt-pcr为pigm型的个体(表达有稻瘟病抗性基因pigm的抗病品种谷丰a、安丰b，广抗13b和福伊b)中能检测到pigm-sm基因特异性分子标记的存在，而其他个体则不能检测到该带型。可见，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因pigm基因特异性分子标记可在鉴别pigm基因与其他稻瘟病抗性基因，包括pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院生物技术研究所

<120>一种稻瘟病抗性基因pigm功能特异性分子标记及其应用

<130>9

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

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