本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种适用于in-fusion克隆的pgadt7-in载体及其构建和使用方法。
背景技术：
：酵母双杂交是研究蛋白互作的最常用的方法，常常用于已知蛋白之间的互作验证和已知蛋白互作的蛋白的筛选。以常用的gal4酵母双杂交系统为例，酵母双杂交技术包含两个载体，分别含有转录因子gal4的激活结构域(ad)和转录因子gal4的dna结合结构域(bd)。使目的基因a和ad融合表达的载体称之为猎物载体，使目的基因b与bd融合表达的载体称之为诱饵载体。当目的基因a和目的基因b有相互作用时，gal4的ad空间上接近bd，可以激活报告基因的表达，看到的结果是酵母在筛选培养基上生长和变蓝。酵母双杂交实验的第一步，也是关键的一步，是酵母双杂交载体的构建。载体构建的传统方法是酶切和连接，包含对目的dna片段和载体的切割回收以及后续两者的连接。该方法过程繁琐，实验周期长，且常常受制于载体和插入基因上的酶切位点，成功率不高。gateway技术是invitrogen已经商业化的技术，它是基于噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段添加重组位点，将pcr产物与含重组位点的供体载体混合进行bp反应获得入门载体(entryclone)，入门载体可以和不同用途的目标载体进行lr反应获得相应的表达载体，不依赖于酶切位点。有一些酵母双杂交载体通过改造可以利用gateway技术进行载体构建。但是gateway技术需要两步反应，而且起始pcr的引物需要包含30bp左右的attb位点，长的引物增加了pcr的难度和合成引物的成本以及引物合成中带来突变的概率，同时gateway技术所用的酶比较贵。有研究者利用两轮pcr结合长引物的方法在目的基因两端融合attl的位点，绕过了bp反应，直接一步进行gateway的lr反应进行载体构建，这种方法需要两轮pcr反应，增加了pcr的复杂性和突变的概率。近些年发展起来的in-fusion克隆技术是一种更为方便的载体构建技术，能够实现dna片段无缝连接，完全不依赖于限制性内切酶和dna连接酶，只需要最少15min就可以将dna片段连接到任何载体中。in-fusion克隆技术已经由clontech公司开发出商业化的试剂盒，在相关酶的作用下，识别dna片段和线性化载体末端不少于15bp的重组臂序列，进而将dna片段整合入载体中。技术实现要素：本发明克服了传统载体构建过程中需进行的酶切和连接的繁琐步骤及酶切位点的限制、gateway技术需要较长引物起始和两轮反应耗时较长、改进后的gateway技术需要两轮pcr的缺点。本发明首先利用定点突变技术(site-directedmutagenesis)对诱饵载体pgadt7的多克隆位点(multiplecloningsite,mcs)进行改造，提供了一种适用于in-fusion克隆的pgadt7-in载体，所述pgadt7-in载体是由pgadt7载体定点突变获得，pgadt7-in载体和pgbkt7载体上多克隆位点中ecorⅰ酶切位点的上下游具有一段长15bp以上的相同序列。进一步地，所述pgadt7-in载体和pgbkt7载体上多克隆位点中ecorⅰ酶切位点的下游具有一段长15bp的相同序列，该序列的正向序列如seqidno.1所示，反向序列如seqidno.2所示。进一步地，pgadt7-in载体的构建方法为利用pgbkt7载体上多克隆位点中ecorⅰ酶切位点下游长15bp以上的序列，对pgadt7载体上多克隆位点中ecorⅰ酶切位点下游的序列进行替换，获得pgadt7-in载体。进一步地，上述pgadt7-in载体的构建方法，包括以下步骤：步骤1：设计正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别包含pgbkt7载体上多克隆位点中ecorⅰ酶切位点下游长15bp以上的正向序列和反向序列；步骤2：以pgadt7载体为模板，使用步骤1中的正向引物和反向引物，进行pcr扩增；步骤3：清除pcr扩增产物中的模板，得消化产物；步骤4：将消化产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的固体lb平板上进行筛选；步骤5：挑取单克隆，用含有抗生素的lb液体培养基进行扩大培养，提质粒；步骤6：对步骤5得到的质粒进行测序确认，序列正确的为pgadt7-in载体。进一步地，步骤1中所述正向引物和所述反向引物分别包含如seqidno.1和seqidno.2所示的序列。进一步地，步骤3中使用dpnⅰ酶清除pcr扩增产物中的模板。上述pgadt7-in载体的使用方法，包括以下步骤：步骤1：pcr扩增诱饵蛋白基因和猎物蛋白基因，pcr扩增使用的正向引物中含有如seqidno.3所示的重组臂接头序列，反向引物中含有如seqidno.4所示的重组臂接头序列；步骤2：线性化pgbkt7载体和pgadt7-in载体，得到线性化的pgbkt7载体和线性化的pgadt7-in载体；步骤3：将步骤1中的诱饵蛋白基因的pcr扩增产物与线性化的pgbkt7载体进行in-fusion反应，将猎物蛋白基因的pcr扩增产物与线性化的pgadt7-in载体进行in-fusion反应；步骤4：将步骤3得到的反应产物分别转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的的固体lb平板上进行筛选；步骤5：挑取单克隆，分别在含有抗生素的lb液体培养基进行培养；步骤6：使用引物yu03和yu04对含有pgadt7-in载体的菌液进行pcr检测，使用引物yu03和yu05对含有pgbkt7载体的菌液进行pcr检测，引物yu03、yu04和yu05的核苷酸序列如seqidno.5～7所示；然后对检测正确的克隆扩大培养，提质粒，即得到诱饵载体和猎物载体。进一步地，还包括步骤7：将步骤6得到的诱饵载体和猎物载体转化酵母菌株，涂布在固体缺陷培养基上培养，长出单克隆后，挑取单克隆，吹散置于灭菌的双蒸水中，然后再在检测培养基上培养并观察结果。进一步地，所述检测培养基中含有浓度为5～15mm的3-amino-1,2,4-triazole和40mg/l的x-α-gal。相比现有技术，本发明的有益效果在于：1、本发明利用定点突变技术(site-directedmutagenesis)对pgadt7载体的多克隆位点(multiplecloningsite,mcs)进行改造，得到pgadt7-in载体，使pgbkt7和pgadt7-in两个载体在被ecorⅰ酶切后形成的末端含有至少15bp相同的序列，进一步用in-fusion技术进行载体构建。构建一个给定的基因的诱饵载体或猎物载体只需一对引物，进行一次pcr。然后将得到的pcr产物和pgbkt7或pgadt7进行in-fusion反应，转化大肠杆菌，涂布不同抗性lb平板，用菌落或菌液pcr进行鉴定，很容易快速高效完成酵母双杂交的诱饵载体或猎物载体的构建。2、使用本发明的pgadt7-in载体进行酵母双杂交，极大地缩短实验周期，降低实验成本，提高成功率。附图说明图1为实施例1中pgadt7载体和pgadt7-in载体多克隆位点区域序列图，上方为pgadt7载体，虚线框内为被替换的序列；下方为pgadt7-in载体，虚线框内为替换后的序列。图2为实施例1中pgadt7-in载体sanger法测序图，虚线框内为替换后的序列测序结果。图3为实施例1中定点突变pcr后的电泳检测图。图4为实施例2中含有重组臂接头序列的t、lam和53蛋白基因片段电泳检测图，泳道1～2为t蛋白基因，泳道3～4为lam蛋白基因，泳道5～6为53蛋白基因。图5为实施例2中in-fusion技术构建的pgadt7-in-t载体的菌液pcr检测电泳图，泳道1、2、3、6、7、10为阳性克隆，泳道4、5、8、9为阴性克隆。图6为实施例2中in-fusion技术构建的pgbkt7-lam载体的菌液pcr检测电泳图，泳道2、3、5、6、7、9、10为阳性克隆，泳道1、4、8为阴性克隆。图7实施例2中in-fusion技术构建的pgbkt7-53载体的菌液pcr检测电泳图，泳道1、4、6、7、8、9为阳性克隆，泳道2、3、10为阴性克隆。图8为实施例2中in-fusion技术构建的载体和对照载体酵母双杂交检测图，实验组为pgadt7-in-t/pgbkt7-lam和pgadt7-in-t/pgbkt7-53，阳性对照为pgadt7-t/pgbkt7-53，阴性对照为pgadt7-t/pgbkt7-lam。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1pgadt7-in载体的构建载体pgbkt7和pgadt7来自clontech。实施例中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。pgbkt7载体和pgadt7载体在多克隆位点的ecorⅰ酶切位点的上游有一段长度超过15bp完全一样的序列，而ecorⅰ酶切位点的下游序列不同。本实施例利用定点突变pcr技术对pgadt7进行了改造。利用pgbkt7载体上多克隆位点ecorⅰ酶切位点下游15bp的一段序列对pgadt7载体上多克隆位点ecorⅰ酶切位点下游29bp的一段序列进行了替换，得到载体pgadt7-in，见图1和图2，具体步骤如下：步骤1：设计正向引物yu01和反向引物yu02，正向引物yu01中的5'-ccggggatccgtcga-3'，为pgbkt7载体上多克隆位点中ecorⅰ酶切位点下游15bp长的正向序列，反向引物yu02中含有与5'-ccggggatccgtcga-3'互补的的5'-tcgacggatccccgg-3'，正向引物yu01的核苷酸序列如seqidno.8所示，反向引物yu02的核苷酸序列如seqidno.9所示。步骤2：以pgadt7载体为模板，使用正向引物yu01和反向引物yu02，用kapahifihotstartreadymixpcrkits(kapabiosystems)进行pcr反应，反应体系50μl，见表1。表1pgadt7载体定点突变pcr反应体系kapahifihotstartreadymix25μl引物yu013μl引物yu023μlpgadt7载体0.5μl双蒸水18.5μl反应程序为：95℃3min，98℃20s，60℃20s，72℃5min，第二步到第四步再进行19个循环，然后72℃10min，最后在12℃保存。取10μlpcr产物经电泳检测，有一明显条带，见图3。对剩余的40μlpcr产物进行乙醇沉淀纯化，得纯化产物。步骤3：清除纯化产物中的模板：在纯化产物中加入1μldpnⅰ酶，2μlcutsmartbuffer(neb)，37℃消化2h，得消化产物。步骤4：步骤3所得的消化产物取10μl，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，涂布在含有氨苄青霉素(100mg/l)的固体lb平板上，37℃倒置培养12～16h至长出单克隆。步骤5：挑单克隆到5ml含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中，用50ml离心管，37℃震荡培养12～16h，提质粒。步骤6：对得到的质粒用t7引物进行sanger测序确认，序列正确的记为pgadt7-in载体。步骤2中的纯化具体包括以下步骤：步骤a：pcr产物转移至1.5ml离心管，加入4μl3mph5.2的醋酸钠混匀；步骤b：加入100μl-20℃预冷的无水乙醇混匀；步骤c：-20℃放置30min；步骤d：4℃12000rpm离心15min；步骤e：沉淀加入1ml体积分数75％乙醇上下颠倒4～5次，倒掉上清，吸去残留的液体，室温开盖5min；步骤f：加入17μl双蒸水。实施例2sv40larget-antigen蛋白和p53蛋白以及laminc(66-230)蛋白之间的互作验证本实施例中，蛋白sv40larget-antigen、p53和laminc(66-230)分别简写为t、53和lam，已知蛋白t和蛋白53互作，蛋白t和蛋白lam不互作。1.菌株材料和培养基酵母菌株ah109和所有酵母培养基来自clontech。大肠杆菌感受态购自北京全式金生物公司。酵母培养温度为30℃，大肠杆菌培养温度为37℃。固体培养在培养箱中进行，液体培养在恒温震荡摇床中进行。2.载体和引物载体pgbkt7和pgadt7以及载体pgadt7-t、pgbkt7-lam和pgbkt7-53来自clontech。pgadt7-in载体来自实施例1。实施例中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。3.酶扩增基因时使用kapahifihotstartreadymixpcrkits(kapabiosystems)，菌液pcr检测克隆使用2×taqpcrstarmixwithloadingdye(genstar,www.gene-star.com)。内切酶均购自neb公司。5×in-fusionhdenzymepremix购自clontech公司。4.质粒提取和dna纯化试剂盒质粒提取和pcr纯化试剂盒均购自捷瑞公司(shanghaigeneraybiotechco.,ltd)，操作按照说明书进行。5.含有重组臂接头序列的t、53和lam蛋白基因片段的获得以pgadt7-t载体为模板，使用正向引物yu06和反向引物yu07对t蛋白基因片段进行扩增；以pgbkt7-53载体为模板，使用正向引物yu08和反向引物yu09对53蛋白基因片段进行扩增；以pgbkt7-lam载体为模板，使用正向引物yu10和反向引物yu11对lam蛋白基因片段进行扩增；引物yu06、yu07、yu08、yu09、yu10、yu11的核苷酸序列分别如seqidno.10～15所示，引物yu06、yu08、yu10中含有如seqidno.3所示的重组臂接头序列，引物yu07、yu09、yu11中含有如seqidno.4所示的重组臂接头序列。利用kapahifihotstartreadymixpcrkits进行pcr反应，反应体系和程序按照产品说明书进行。取5μlpcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别在2000bp、500bp和1000bp处可见明显条带，如图4所示，将剩余pcr产物纯化备用。6.pgbkt7载体和pgadt7-in载体的线性化用ecorⅰ消化pgbkt7载体和pgadt7-in载体，然后纯化，即得到线性化的pgbkt7载体和线性化的pgadt7-in载体。7.用in-fusion技术构建载体pgadt7-in-t、pgbkt7-lam和pgbkt7-53将含有重组臂接头序列的t蛋白基因的pcr产物和线性化的pgadt7-in载体进行in-fusion反应，将含有重组臂接头序列的53和lam蛋白基因的pcr产物分别与线性化的pgbkt7载体进行in-fusion反应，反应条件为：50℃反应15min～1h，反应体系见表2。表2in-fusion反应体系in-fusionhdenzymepremix1μlpcr产物3μl线性化载体(pgbkt7载体/pgadt7-in载体)1μl然后将反应产物分别转化大肠杆菌dh5α，将含有pgadt7-in载体的大肠杆菌感受态细胞涂布在含有100mg/l氨苄青霉素的固体lb平板上，含有pgbkt7载体的大肠杆菌感受态细胞涂布在含有50mg/l卡那霉素的固体lb平板上，37℃倒置培养12～16h至长出单克隆。每个平板挑10个单克隆在0.5ml含有相应抗生素的lb液体培养基中，用2ml离心管，37℃震荡培养4～6h。取1μl菌液作模板，用载体序列特异引物yu03和引物yu04检测pgadt7-in-t载体，用引物yu03和引物yu05检测pgbkt7-lam载体和pgbkt7-53载体，引物yu03、引物yu04和yu05的核苷酸序列如seqidno.5～7所示。pcr产物经电泳检测，条带片段为2.2kb、750bp和1.2kb的分别为pgadt7-in-t载体，pgbkt7-lam载体和pgbkt7-53载体的正确克隆，如图5～7所示。将载体序列正确的菌液扩大到5ml含有相应抗生素的lb液体培养基中，用50ml离心管，37℃震荡培养12～16h，提质粒，即得到载体pgadt7-in-t、pgbkt7-lam和pgbkt7-53，测序做进一步确认。8.酵母双杂交实验验证将pgadt7-in-t/pgbkt7-lam和pgadt7-in-t/pgbkt7-53以及酵母双杂交的对照载体组合pgadt7-t/pgbkt7-lam和pgadt7-t/pgbkt7-53利用酵母转化试剂盒(yeasttransformationkit，clontechwww.clontech.com)转化酵母菌株ah109，涂布固体缺陷培养基sd/-trp/-leu(clontech)，30℃倒置培养3～5天，转化步骤按照相关说明书。长出单克隆后，每个平板挑取3～5个单克隆，吹散到20μl灭菌的双蒸水中，取2μl点到含有40mg/lx-α-gal和15mm3-amino-1,2,4-triazole(3at)的检测培养基sd/-ade/-his/-trp/-leu上，30℃倒置培养2～3天。可看到转化pgadt7-in-t/pgbkt7-53的酵母克隆和阳性对照(pgadt7-t/pgbkt7-53)相同，在检测培养基上生长并且呈现明显的蓝色，而转化pgadt7-in-t/pgbkt7-lam的酵母克隆和阴性对照(pgadt7-t/pgbkt7-lam)相同，不能在检测培养基上生长，如图8所示。以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本
技术领域：
的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。sequencelisting<110>周口师范学院<120>一种适用于in-fusion克隆的pgadt7-in载体及其构建和使用方法<130>无<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>15<212>dna<213>人工序列<400>1ccggggatccgtcga15<210>2<211>15<212>dna<213>人工序列<400>2tcgacggatccccgg15<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<400>3tggccatggaggccgaa17<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4cgacggatccccgggaa17<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5taatacgactcactataggg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6agatggtgcacgatgcacag20<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7tttcgttttaaaacctaagagtc23<210>8<211>46<212>dna<213>人工序列<400>8aggccagtgaattccccggggatccgtcgacgagctcgagctgcag46<210>9<211>46<212>dna<213>人工序列<400>9ctgcagctcgagctcgtcgacggatccccggggaattcactggcct46<210>10<211>36<212>dna<213>人工序列<400>10tggccatggaggccgaaggaactgatgaatgggagc36<210>11<211>38<212>dna<213>人工序列<400>11cgacggatccccgggaattatgtttcaggttcaggggg38<210>12<211>37<212>dna<213>人工序列<400>12tggccatggaggccgaatctgaagaggtggtcagccg37<210>13<211>39<212>dna<213>人工序列<400>13cgacggatccccgggaattagtcaatctccaccagtcgg39<210>14<211>37<212>dna<213>人工序列<400>14tggccatggaggccgaacctgtcaccgagacccctgg37<210>15<211>37<212>dna<213>人工序列<400>15cgacggatccccgggaatcagtctgagtcaggcccca37当前第1页12