KRAS基因检测引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种kras基因检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：结直肠癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，目前世界范围内其发病率占所有恶性肿瘤第3位，在中国结直肠癌的发病率和死亡率也呈逐年提高，近年来，随着肿瘤分子靶向治疗的兴起，帕尼单抗(panitumumab，商品名：维克替比)和西妥昔单抗(cetuximab，商品名：爱必妥)这两种针对表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)的单克隆抗体类药物在结直肠癌的治疗中显示了很好的疗效。肿瘤分子靶向用药是以肿瘤细胞中所具有的特异性分子作为靶点，利用分子靶向药物特异性阻断该靶点的生物学功能，从而从分子水平逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，达到抑制肿瘤的目的。表皮生长因子受体是一种跨膜受体，本身具有酪氨酶激酶活性，配体与受体细胞外区结合后通过诱导两个邻近受体结合形成受体二聚体而激活受体，从而激活胞内酪氨酸结构域，引发激酶自磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在内的多种细胞功能。帕尼单抗和西妥昔单抗是一类针对egfr的单克隆抗体，能阻止egfr与其天然配体的结合，抑制肿瘤细胞增生，诱导细胞凋亡，增强细胞毒药物的抗癌能力。kras基因是egfr传导通路中一个重要的下游信号分子，该基因突变或过度表达后成为致癌基因。kras基因突变主要集中在第2号外显子的第12-13位密码子上、也有密码子61位的突变，即condon12、condon13以及condon61位点突变。kras基因的突变使ras蛋白一直处于激活状态，不受上游egfr信号分子的影响，使信号传递通道一直处于持续激活状态，刺激细胞不断的生长或分化。即使使用了egfr佶抗剂(如帕尼单抗和西妥昔单抗等)阻断了上游信号传导，但kras促进肿瘤增殖的作用不受影响，即egfr佶抗剂对kras基因突变的结直肠癌不能发挥抗肿瘤作用。braf基因的突变是帕尼单抗和西妥昔单抗的另一个疗效预测因子。braf是egfr信号转导通路中位于kras下游的一个重要的丝氨酸激酶。通过检测kras和braf这两个基因的突变碱基，可以判断结直肠癌患者个体对帕尼单抗和西妥昔单抗的敏感性，筛选靶向治疗的最适合人群，从而避免了因为不合理用药而引起不必要的不良反应和经济损失。目前，已报道的用于帕尼单抗和西妥昔单抗靶向用药相关基因突变的方法主要包括传统的如pcr产物直接测序法、基因芯片杂交法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法（amplificationrefractorymutationsystemrealtimepcr，arms-rtpcr）、等位基因特异性扩增法（amplificationrefractorymutationsystemrealtimepcr，arms-rtpcr）等，每种方法都各有优缺点，例如灵敏度低、假阳性率高、耗时较长，通量小。因此，需要一种灵敏度高，假阳性率低，且检测周期短的检测condon12、condon13以及condon61位点突变的试剂盒及检测方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种kras基因检测引物组、试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术中kras基因检测灵敏度低、假阳性率高、周期长，通量小的技术问题。一种kras基因检测引物组，包括用于对kras基因含condon12、condon13以及condon61位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物seqidno:1和下游引物seqidno:2。一种kras基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述的kras基因检测引物组。优选地，所述试剂盒还包括接头，所述接头上含有标签序列，所述接头用于直接与扩增产物连接。优选地，所述接头包括第一接头seqidno:3和第二接头seqidno:4。优选地，所述试剂盒还包括库扩增引物组，包括库扩增上游引物seqidno:5和库扩增下游引物seqidno:6。优选地，所述试剂盒还包括测序引物，所述测序引物用于对含condon12、condon13以及condon61位点的分子进行测序，所述测序引物包括barcode测序引物seqidno:7、5’测序引物seqidno:8和3’测序引物seqidno:9。一种kras基因检测方法，包括以下步骤：a、利用引物组，分别对含condon12、condon13以及condon61位点的kras基因样本进行扩增，所述引物组包括上游引物seqidno:1和下游引物seqidno:2，得扩增产物；b、随机片段化所述扩增产物，获得多个双链核酸片段；c、在双链核酸片段的一端连接具有酶切识别序列的第一接头；d、将双链核酸片段酶切至预设长度获得库片段；e、将第一接头的一端固定在磁珠上提纯库片段；f、在库片段第一接头的另一端连接第二接头，得到文库分子；g、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定待测位点的基因型。优选地，步骤g进一步包括使用库扩增上游引物seqidno:5、库扩增下游引物seqidno:6对文库分子进行扩增的步骤。优选地，步骤g使用测序引物进行连接测序，所述测序引物包括barcode测序引物seqidno:7、5’测序引物seqidno:8和3’测序引物seqidno:9。本发明提供的kras基因检测引物组，能够对含待测位点的片段进行特异性扩增，降低了扩增多个靶位点的复杂性，提高了对待测位点扩增的特异性和灵敏度，降低了假阳性率；同时，采用第二代高通量基因测序技术，建立同一反应体系对心脑血管疾病药物多个相关基因的位点进行分型测试，使得对待测位点的检测周期短，通量高。附图说明图1是本发明第四实施例中待测基因片段扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图。图2是本发明第四实施例中酶切获得部分库片段的琼脂糖凝胶电泳检测图。图3是本发明第四实施例部分中文库分子的琼脂糖凝胶电泳检测图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明提出第一实施例，一种kras基因检测引物组，用于对kras基因含condon12、condon13以及condon61位点的核酸片段进行特异性扩增的引物组，所述引物组包括上游引物seqidno:1和下游引物seqidno:2。本方案提供的kras基因检测引物组，能够特异性扩增kras基因含condon12、condon13以及condon61位点的核酸片段，扩增产物可以用于进行kras基因检测，可以系统方便的同时对多个样本进行多种相关基因分型检测。本发明提出第二实施例，一种kras基因检测试剂盒，含有上述第一实施例的kras基因检测引物组。优选的，所述试剂盒还包括对上述引物组扩增后的产物进行随机片段化的片段化酶。本实施例中，片段化酶将扩增产物随机片段化为200-50kbp，获得多个双链核酸片段。优选的，所述试剂盒还包括第一接头seqidno:3、所述第一接头seqidno:3用于直接与多个双链核酸片段的一端连接，所述第一接头seqidno:3上含有标签序列，标签序列为nnnn，其中n为a、g、c或t。优选的，所述第一接头还包含与测序引物序列互补的序列、扩增引物的序列以及酶切识别序列ctgaag。替代实施例中，第一接头seqidno:3还可以为seqidno:26。优选的，所述试剂盒还包括acui酶，用于将连接第一接头的。由于所述第一接头seqidno:3包含ctgaag序列，采用acui酶对扩增产物进行切割，可将多个双链核酸片段切割为13bp的库片段，并形成粘性末端，该粘性末端在后续连接接头的过程中连接效率更高。优选的，所述第一接头seqidno:3上含有生物素标记，用于使其固定在含亲和素的磁珠上，利用该生物素标记，可以在连接反应结束后，很方便的将酶切为13bp的库片段分离出来。优选的，所述试剂盒还包括第二接头seqidno:4，所述第二接头seqidno:4用于连接库片段连接第一接头seqidno:3的另一端，以获得文库分子。替代实施例中，第二接头seqidno:4还可以为seqidno:28。优选的，所述试剂盒还包括对文库分子进行单分子扩增的库扩增上游引物seqidno:5、库扩增下游引物seqidno:6。优选的，所述试剂盒还包括荧光标记的寡聚核苷酸探针和无荧光标记的寡聚核苷酸探针。优选的，所述试剂盒还包括测序引物，所述测序引物包括对文库分子进行测序的barcode测序引物seqidno:7、5’测序引物seqidno:8和3’测序引物seqidno:9。优选的，本方案的测序引物适用于采用连接测序法对待测位点进行检测，本方案使得测序探针可连接在测序引物的5’末端。优选的，所述试剂盒还包括连接酶。在连接酶的作用下，所述扩增产物和第一接头seqidno:3之间以及库片段和第二接头seqidno:4之间能够稳定的连接。优选的，所述试剂盒还包括连接缓冲液。本发明提供的试剂盒，对kras基因含condon12、condon13以及condon61位点的核酸片段分别构建随机短标签文库分子，通过对文库分子进行二代测序后和标准序列匹配识别待测位点的基因类型，本发明的分型测序方法避免了扩增出现异常导致基因分型不准确的问题，充分利用了二代高通量连接测序法的优势，不同位点和不同标本建立相同的反应体系制作文库分子后统一进行测序，不仅效率高而且成本低。当采用本发明的试剂盒对在同一体系中对不同样本的同一待测位点进行检测时，由于在测序过程中使用的测序引物是相同的，因此需要采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，从而无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。本发明提出第三实施例，一种kras基因检测方法，包括以下步骤：a、利用引物组，分别对含condon12、condon13以及condon61位点的kras基因样本进行扩增，所述引物组包括上游引物seqidno:1和下游引物seqidno:2，得扩增产物；b、随机片段化所述扩增产物，获得多个双链核酸片段；c、在双链核酸片段的一端连接具有酶切识别序列的第一接头；d、将双链核酸片段酶切至预设长度获得库片段；e、将第一接头的一端固定在磁珠上提纯库片段；f、在库片段连接第一接头的另一端连接第二接头，得到文库分子；g、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定待测位点的基因型。优选的，步骤b之后进一步包括提取多个双链核酸片段中长度为30-200bp的步骤。优选的，步骤b之后进一步包括对多个双链核酸片段进行末端修复的步骤。优选的，所述步骤g包括以下步骤：g1、利用无荧光标记的寡核苷酸探针，对文库分子进行一次连接测序；g2、利用荧光探针对文库分子进行连接测序，确定待测位点的基因型。需要说明的是，所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的荧光探针相比，序列完全相同，区别仅在于无荧光标记。本方案的检测方法，在测序过程中加入无荧光标记的寡核苷酸探针，能够有效减少连接测序中出现的错误信号，提高了对待测位点检测的准确性。每一次连接测序均包括以下步骤：测序引物锚定，冲洗（除去多余的未锚定的测序引物），连接探针，冲洗（除去多余探针，连接酶等），采图（获得探针上荧光标记所对应位置的序列信息），变性洗脱连接产物（以便下一次连接测序反应中测序引物的锚定）。步骤e1中的连接测序反应，使用无荧光标记的寡核苷酸探针，可以不进行采图步骤，以减少实验步骤，提高实验效率。本方案设计的测序引物，在测序过程中连接第一接头与测序引物序列互补的序列，使得在测序过程中，仅需较少次数的测序即可确定待测位点的基因型。优选的，本方案的测序引物尤其适用于采用连接测序法，在测序过程中，测序探针连接在该测序引物5’末端。相对于现有技术，本实施例的kras基因检测方法同时对kras基因的多个位点分别构建随机短标签文库分子，通过对文库分子进行二代测序后和标准序列匹配识别多个待测位点的基因类型，本发明的分型检测方法避免了扩增出现异常导致基因分型不准确的问题，充分利用了二代高通量连接测序法的优势，不同位点和不同标本分别制作文库分子后统一进行测序，不仅效率高而且成本低。由于文库分子需要测序的碱基数量不多，因此测序的时间和效率都明显提高。当采用本发明的试剂盒在同一体系中对相同样本的多个待测位点进行检测时，可以使用相同的标签序列的接头以及相同的测序引物，使得测序方法较为简单。当在同一体系中有不同样本时，采用含不同标签序列的接头分别连接不同的样本，通过对标签序列进行测序，从而无需对样本进行多次测序即可有效区分不同样本的测序结果。本发明提供了第四实施例：采集病人抗凝血5ml,经3000rpm离心15分钟后分离出血浆和全血。使用qiagen公司qiaampdnabloodminikit对样本血浆中的dna进行提取。步骤a、针对上述样本，配制反应体系，采用第一实施例的引物组分别对样本含condon12、condon13以及condon61位点的kras基因片段进行扩增：1）反应体系如下：pcrcomponents实际加样体积(μl)hottaqmix25dnatemplate0.3引物组上游引物(10μm)1引物组下游引物(10μm)1dnso0.8ddh2021.9totalvolume50ul2）设置反应程序：94℃条件下持续5分钟；然后进入第一轮循环，94℃条件下持续1分钟，68℃条件下持续退火40秒，72℃条件下持续40秒，第一轮循环进行10次，其中退火温度从68℃起，每个循环降低1℃；然后进入第二轮循环：94℃条件下持续40秒，58℃条件下持续40秒，72℃条件下持续40秒，第二轮循环35次；再在72℃温度下延伸30分钟，降温至4℃终止反应，扩增反应完成后，得到扩增产物。如图1所示，在电泳的多个泳道486bp出现目标条带，扩增产物符合要求。步骤b、随机片段化所述扩增产物，获得多个双链核酸片段；一实施方式中，具体实验步骤如下：1）在冰盒上向0.2ml离心管中加入以下体系：组分体积步骤a扩增产物（dna,1-5μg）1-16μl10×fragmentbuffer2μlfragmentenzyme2μlddh2o适量总体积20μl2）涡旋振荡混匀，短暂离心后，37℃孵育40min，加入5µlterminator终止酶反应；取1.5mlep管，将反应液转移至1.5mlep管中，加入1μl糖原，100μl醋酸铵，750μl冻存无水乙醇，混匀，-80℃放置60min或过夜；3）14000rpm4℃离心15min；4）弃上清，加入200μl75%乙醇，4℃14000rpm离心5min；5）重复步骤3）一次；6）弃乙醇，短暂离心，用移液器小心吸取残留乙醇，避免吸到沉淀，将ep管室温晾干（5-10min）；7）加入30μl预热的ddh2o，室温静置5min，直至沉淀溶解；8）nanodrop测浓度，4℃短暂保存或-20℃冻存。优选的，步骤b之后进一步包括提取多个双链核酸片段中长度为30-200bp的步骤。优选的，步骤b之后进一步包括对多个双链核酸片段进行末端修复的步骤，具体实验步骤如下：1）向0.2ml离心管中加入：组分体积dna（步骤b产物≥400ng）10-15μlendingrepairbuffer5μlendingrepairenzyme2μlddh2oupto25μl总体积25μl2）涡旋混匀，短暂离心后在pcr仪中运行以下程序，并设置105℃热盖。20℃加热20分钟；72℃加热10分钟；保存温度4℃。步骤c、在双链核酸片段的一端连接具有酶切识别序列的第一接头；一实施例中具体实验如下：1）末端修复完成后加入0.5µl10ng/µl第一接头和1.5µlligationenzyme，用枪吸打混合均匀；2）在pcr仪上运行20℃，10min；72℃，10min；hold4℃，并设置105℃热盖；3）将核酸纯化磁珠涡旋混匀，取45μl磁珠加至连接第一接头后的产物中，用枪吹打混匀后室温静置5min；4）磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；5）加入200µl70%无水乙醇用枪吹打混匀，磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；6）重复步骤4）两次。将离心管稍加离心使残留液体集于管底，用10µl枪头吸尽残留液体并丢弃；7）敞开管盖静置5min挥发多余无水乙醇；8）加入20µlddh2o，用枪头吹打混匀，室温静置3~5min。磁铁吸附，吸取上清液体至新的0.2ml离心管中，注意不要吸到磁珠。样品可存储于4℃，如当天不用存储于-20℃保存。步骤d、将双链核酸片段酶切至预设长度获得库片段；一实施例中，具体实验如下：1）向0.2ml离心管中加入：组分体积dna（步骤c产物）15μlcuttingbuffera2.5μlcuttingbufferb（需稀释）7μlcuttingenzyme0.5μl总体积25μl2）涡旋振荡混匀，短暂离心后，37℃孵育15min，加入1.0µlterminator终止反应。如图2所示，1泳道为含condon12、condon13以及condon61位点的kras基因片段酶切后的电泳结果；2泳道分别为含含condon12、condon13以及condon61位点的kras基因片段酶切前的电泳结果，分别在486bp出现目标条带，酶切产物符合要求。步骤e、将第一接头的一端固定在磁珠上提纯库片段，一实施例中，具体实验如下：1）将结合磁珠涡旋振荡混匀，转移2µl磁珠于0.2ml离心管中，加入10µlsolutionbuffer混匀，磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；2）取25µl2×bwbuffer以及25µl酶切产物（步骤d）加入上述0.2ml离心管中涡旋振荡混匀，短暂离心后，30℃孵育15min；3）磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；4）加入100µlsolutionbuffer用枪吹打混匀，磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；5）按照上一步骤用100µlsolutionbuffer重复洗涤3次（共4次）；6）加入10µlsolutionbuffer重悬。步骤f、在库片段连接第一接头的另一端连接第二接头，形成文库分子。一实施例中，具体实验如下：1）在步骤e产物中分别加入：组分体积ddh2o32μlligationbuffer5μladapterr（10ng/µl）1μlligationenzyme1μl总体积50μl2）涡旋振荡混匀，短暂离心后，16℃孵育5min，加入2µlterminator终止反应，磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；3）加入100µlsolutionbuffer用枪吹打混匀，磁铁吸附，待磁珠吸附到管壁的一边，且溶液澄清后，小心吸取上清并丢弃，注意不要吸到磁珠；4）按照上一步骤用100µlsolutionbuffer重复洗涤3次（共4次）；5）加入20µlsolutionbuffer重悬。本实施例中，文库分子扩增与验证的实验步骤如下：1）按下表体系配制5管pcr反应液：组分体积dna（步骤6产物）2μlprimer1（10μm）1μlprimer2（10μm）1μlpcrpremix12.5μlddh2o8.5μl总体积25μl2）涡旋振荡混匀。短暂离心后，在pcr仪上运行94℃，2min；(94℃，10s；60℃，10s)循环20次；72℃，2min；保持10℃，并设置105℃热盖；3）磁铁吸附磁珠，将液体转移至新的1.5ml离心管中，加入300µlbindingbuffer和400µl异丙醇涡旋振荡混匀，短暂离心后，加入到核酸纯化柱中，8000rpm离心1min，倒掉收集管内液体；4）加入700µlwashingbuffer，8000rpm离心1min，倒掉收集管内液体；5）重复步骤3）一次；6）倒掉收集管内液体，13000rpm离心2min；离心柱敞口转移至新的1.5ml离心管中，静置3min，让酒精充分挥发；7）向柱膜中央加入30µlsolutionbuffer，静置2min，12000rpm离心2min，收集离心管内液体，qubit测定浓度；8）取5µl回收产物，12%page胶，180v电泳40min检测或取5µl回收产物，再加入5µlddh2o，用qsep100检测；验证结果：文库电泳检测目的条带单一（文库片段大小为113bp），允许10%的接头直连带（约100bp）存在。参阅图3，1泳道分别为含condon12、condon13以及condon61位点的kras基因片段文库分子的电泳结果，出现了113bp的目标条带，与理论预期文库分子大小完全相符，说明本发明的方法可以实现对待测序样本的建库。步骤e、采用第二代高通量基因测序技术对所述文库分子进行测序，确定待测位点的基因型。较佳实施例中，采用连接测序对所述文库分子进行测序，包括以下步骤：1)同一反应体系对文库分子进行普通扩增；2)同一反应体系对文库分子进行单分子扩增；3)测序引物锚定，冲洗（除去多余的未锚定的测序引物）；4)连接探针，冲洗（除去多余探针，连接酶等）；5)采图（获得探针上荧光标记所对应位置的序列信息），变性洗脱连接产物（以便下一次连接测序反应中测序引物的锚定）。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院、深圳华因康基因科技有限公司<120>kras基因检测引物组、试剂盒及检测方法<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tcttaagcgtcgatggaggag21<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acccaaggtacatttcagataac23<210>3<211>50<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cctacttgcagttgctattaccnnnncacctaactgctgaagtagtcggt50<210>4<211>53<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atcatatgaggaaccccaggcaggcagcacgagctgtccatcgatcctggaga53<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5cctacttgcagttgctattacc22<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tctccaggatcgatggacagctcg24<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ggtaatagcaactgcaagt19<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8accgactacttcagcagtta20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ggaccccaaggagtatacta20当前第1页12