本发明属于两亲性聚合物材料制备及其应用领域，具体涉及一种聚酯类两亲性高分子聚合物的配位开环聚合和巯烯点击制备方法及其用途。
背景技术：
化学合成可降解脂肪族聚酯如聚己内酯(pcl)、聚乙交酯(pga)、聚丙交酯(pla)以及它们的共聚物具有低毒性、良好的生物相容性、细胞渗透性、可生物降解性以及降解产物无毒等优点，目前已广泛应用在组织工程支架、手术缝合线、骨科固定材料和药物控制释放等生物医用领域。对于两亲性聚合物而言，由于具有相反亲和性的链段(即亲水链段和疏水链段)之间的热力学不相容性，在水溶液中，疏水链段受到排斥力的驱动自发地聚集起来形成疏水的“核”，而亲水部分则以溶剂化的形式在疏水核的周围形成亲水的“壳层”，由于这种溶剂化的“壳层”的存在，疏水的“核”可以在一定浓度和时间内保持相对稳定，这种过程实际上是一种自组装过程。自组装形成的胶束、囊泡等可应用于药物传递、传感、催化以及成像等多个领域。肿瘤部位的ph值要比正常组织的ph值低，设计和合成具有ph响应性基团的药物载体可实现对肿瘤药物的定向运输和释放。对体内肿瘤有效的药物有许多是疏水性药物(如阿霉素，紫杉醇等)，这些药物易降解，同时没有特异选择性，纳米药物载体可以有效地提高药物的稳定性。本论文利用巯烯点击反应制备一种ph响应型的聚合物载药材料，在较低ph值(6.0～7.0)的pb溶液中(模拟肿瘤环境)，胶束表面质子化带正电荷，这可促进胶束的细胞摄取，可作潜在的药物载药材料。
在绿色环保和原子经济的大环境下，点击化学作为一种高效、绿色、简单的有机合成技术，它顺应绿色经济的时代发展潮流，所以备受研究者的青睐。基于点击化学反应的独特优势，许多研究者已经系统地论述了点击化学的最新研究进展及其在材料表面处理，高聚物的功能化，生物医学领域中的应用等方面。由绿色方法制备的dh响应型新材料并将其应用到载药领域基本没有专利申请。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种ph响应型维生素e载药材料及其制备方法和应用。
本发明采用如下技术方案来解决其技术问题：
本发明所述的ph响应型维生素e载药材料，该新材料具有式(i)的结构：
其中聚合度n＝20～60，聚合度m＝10～60。
本发明所述ph响应型维生素e载药材料可以进一步采取：
在弱酸性条件下其聚合物分子的端二甲氨基发生质子化作用，在ph6.2～7.0的弱酸溶液环境中，聚合物分子带一定正电荷，zeta电位在2.1～8.4mv之间；当聚合物浓度为125μg/ml时，细胞存活率仍大于85％，不具备明显的细胞毒性。
本发明提出的一种ph响应型维生素e载药材料及其制备方法和应用，首先采用开环聚合反应制备烯丙基嵌段聚合物，最后采用巯基-烯耦合反应制备ph响应型的聚合物载药材料，其反应过程如下：
其技术方案如下：
步骤(1)端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯聚合物的制备
将2～12g烯丙基聚醚apeg置于100ml圆底烧瓶中，并在80℃干燥箱中真空干燥4小时，再将5～30gε-己内酯置入所述圆底烧瓶中，然后置于磁力加热搅拌器的油浴锅中，体系加热至100℃，密封进行充氮气除氧操作30min，滴入44～110毫克辛酸亚锡，升温至120℃，密封反应12小时，反应结束，冷却至室温，用6ml二氯甲烷溶解，反应体系用50ml冰无水乙醚沉淀2次，抽滤，真空干燥，得到6～32g端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯聚合物apegn-pclm，
步骤(2)ph响应型的聚合物载药材料的制备
将前述获得的1～8g端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯聚合物apegn-pclm和0.02～0.16g2-甲胺乙硫醇盐酸盐作为原料，将其用10ml溶剂溶解于50ml的烧杯，所述溶剂由甲醇和二氯甲烷且体积比为1∶1，磁力搅拌下加入0.01～0.08g光引发剂dmpa反应40min，反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，水洗除去过量的2-甲胺乙硫醇盐酸盐，体系用冰无水乙醚沉淀，抽滤，真空干燥，得到0.95～7.6g产物聚合物me2n-pegn-pclm，得到具有式(i)结构的具有ph响应性的聚合物载药材料。
本发明所述的制备方法可以进一步采取：
所述步骤(2)中所述反应是在室温条件下反应，反应时间为20～60min，所述光引发剂dmpa为安息香二甲醚，安息香二甲醚是一种性能优良的新型紫外光敏剂，主要用作紫外光固化反应的引发剂。
本发明所述ph响应型维生素e载药材料应用于负载脂溶性药物ve，在水溶液中自组装形成胶束，自组装包载维生素e形成70～100nm的均匀球形颗粒，载药率82.2％。
与现有技术相比，本发明有如下优点：
(1)反应时间短，无副产物和废弃物产生
张等利用酯化反应在两亲性嵌段聚合物链端接入具有ph响应性的吗琳基团，然而存在反应时间长、有副产物等问题。本发明将具有ph响应性的2-甲胺基通过点击反应接入到嵌段聚合物链端，反应时间只需30min，且无副产物产生，具有高效、绿色、简单等优势。
(2)端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯聚合物的制备方法简单且无须溶剂，ph响应型的聚合物制备时所用溶剂甲醇、二氯甲烷均无毒无害且后处理简单。
附图说明
图1分别为原料apeg(a)、2-甲胺乙硫醇(b)、中间体apegn-pclm(c)、产物me2n-pegn-pclm(d)的1hnmr谱图以及中间体apegn-pclm(e)、产物me2n-pegn-pclm(f)的13cnmr谱图。从该产物图d的1hnmr谱图可以看到，官能团碳碳双键明显消失，说明巯烯点击反应明显进行，且由图谱可计算出巯烯点击反应转化率高达95.6％，产物的13cnmr(图f)表征得到相同的结果。
图2为原料和产物的分子量mn及其分布pd的gpc图。由图可明显看到，原料apeg的分子量在反应之后分子量明显增加，说明开环聚合成功并得到相应产物。
图3为聚合物me2n-pegn-pclm溶液在不同ph值条件下的zeta电势。由图中可知，随着缓冲溶液值ph的降低，电势的值逐渐升高，由比较明显的负电势值往正电势值偏移，说明含二甲胺基的聚合物胶束在微酸性环境下，可以实现粒子质子化而使表面带正电荷。
图4为聚合物me2n-pegn-pclm溶液临界胶束浓度cmc。由图中可知，在低浓度时，共聚物对应的荧光激发强度比随浓度的增加变化不大，当达到cmc附近时，该比值出现突变点，并一定范围内随浓度的增加而增大，随着浓度的继续增加最终保持平衡。通过图中两直线的交点可知聚合物me2n-pegn-pclm的cmc为6.9×10-4mg/ml，说明这种聚合物在较低浓度时可以发生自组装行为。
图5为聚合物me2n-pegn-pclm对人正常肝细胞(l-o2)的细胞毒性结果柱状图。用mtt法对聚合物me2n-pegn-pclm细胞毒性进行表征，结果如图5所示。胶束材料的浓度在125μg/ml的时候，细胞存活率大于85％，这说明聚合物材料本身不具备明显的细胞毒性，适合用作载药材料的载体。
图6分别为聚合物me2n-pegn-pclm在水溶液中的自组装(a)及其负载维生素e(b)的动态光散射数据。由图中可知，聚合物空白胶束可自组装成平均尺寸为51.5nm的纳米粒子，负载药物ve之后胶束尺寸明显增加，平均尺寸为87.6nm，并且胶束的粒径分布较窄。
图7聚合物me2n-pegn-pclm未载药(a)、聚合物负载维生素e(b)的透射电镜图。由图可明显看到me2n-pegn-pclm负载药物ve得到球形的纳米颗粒，且颗粒均一，透射电镜得到的胶束粒径尺寸与动态光散射测定的基本一致。
图8一系列不同浓度的维生素e溶液在294nm处的紫外吸收值绘制的标准曲线(a)和聚合物me2n-pegn-pclm负载维生素e溶液的紫外吸收值(b)，所有溶液的体系均为体积比为9∶1的四氢呋喃和蒸馏水。通过测试聚合物负载药物后的样品的ve紫外吸收值如图8(b)，并依据维标准曲线如图8(a)，据此计算出聚合物的载药率为82.2％。
图9聚合物me2n-pegn-pclm在缓冲溶液pb中(ph＝6.2、6.8、7.4)对维生素e的累积释放。78h内，聚合物me2n-pegn-pclm的释放速率和累积释放率随着ph值的降低而增加，ph＝6.2累积释放61％，而ph＝7.4的仅为21％。
具体实施方式
下面通过实施进一步说明本发明，但并不限于将发明限制在所述的实施例中。
实施例1聚合物的合成
步骤(1)端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯聚合物(apegn-pclm)的制备
将烯丙基聚醚(apeg2.37g，1.19mmol)置于100ml圆底烧瓶中，并在80℃干燥箱中真空干燥4小时，再将ε-己内酯(ε-pcl，7.0g，61.4mmol)置入所述圆底烧瓶中，然后置于磁力加热搅拌器的油浴锅中，体系加热至100℃，密封进行充氮气除氧操作30min，滴入44mg辛酸亚锡，升温至120℃，密封反应12小时，反应结束，冷却至室温，用6ml二氯甲烷溶解，反应体系用100ml冰无水乙醚沉淀2次，抽滤，25℃真空干燥，得到端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯聚合物(apegn-pclm，8.9g)，
采用核磁共振测定1hnmr氢谱和13cnmr碳谱来确定实施例中化合物的结构(如下图所示)，选用溶剂为dmso，结果如图1c和e。h化学位移为5.88ppm(-ch＝ch2)，5.2ppm(-ch＝ch2)，3.52ppm(-ch2-ch2o-)，3.99ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，2.27ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，1.55ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，1.30ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)；c化学位移为173.6ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)117.2ppm(-ch＝ch2)，134.7(-ch＝ch2)，70.4ppm(-ch2-ch2o-)，64.1ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，34.1ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，25.4ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，28.3ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)，24.7ppm(-c＝o-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-o)
步骤(2)ph响应型聚合物me2n-pegn-pclm的制备
将前述获得的端烯丙基聚氧乙烯-共-聚己内酯(apegn-pclm，3g，0.4mmol)和2-甲胺乙硫醇盐酸盐(0.062g，0.48mmol)作为原料，将其用10ml溶剂溶解于50ml的烧杯，所述溶剂由甲醇和二氯甲烷且体积比为1∶1，磁力搅拌下加入光引发剂40mg(dmpa)反应30min，反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，水洗除去过量的2-甲胺乙硫醇盐酸盐，体系用100ml冰无水乙醚沉淀2次，抽滤，25℃真空干燥，得到产物聚合物(me2n-pegn-pclm，2.87g)
采用核磁共振测定1hnmr氢谱和13cnmr碳谱来确定实施例中化合物的结构(如下图所示)，选用溶剂为dmso，结果如图1d和f。由图d所示的h化学位移为3.14ppm((ch3)2n-ch2-ch2-)，2.81ppm((ch3)2n-ch2-ch2-)，2.7ppm((ch3)2n-ch2-ch2-)，从该图可以看到产物中2.15ppm(-sh)，5.88ppm(-ch＝ch2)，5.2ppm(-ch＝ch2)明显消失，巯烯点击反应转化率高达97.5％，同样的结构表征结果可由碳谱如图f得到。
实施例2聚合物的分子量
采用安捷伦公司的pl-gpc220型凝胶色谱仪(gpc)，测试条件为：以thf为流动相，流动相流速为1.0ml/min，聚苯乙烯为校准标样，柱温为40℃。取聚合物6mg用thf配制成2mg/ml的溶液，用gpc对原料和产物的分子量mn及其分布pd进行了表征，从图2上可明显看到，apeg的分子量明显增加，说明开环聚合成功并得到相应产物。
实施例3透析法制备聚合物胶束溶液
将100mg聚合物me2n-pegn-pclm溶解于6ml四氢呋喃中，室温磁力搅拌5h。再将12ml蒸馏水用恒压滴液漏斗缓慢滴入到溶液体系中，控制滴速为20秒/滴，滴加完成，敞口室温搅拌5h。将混合溶液转移到透析袋中(截留分子量为：mw2000da)，每四小时换一次水，透析24h(除去溶剂thf)。收集透析袋中的液体，用0.45μm水相滤膜过滤大颗粒团聚体，得到聚合物胶束溶液。
实施例4聚合物的zeta电位
zeta电势测量：取实施例3中的聚合物胶束溶液1ml加入到5ml离心管中，然后分别加入1mlph为6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8的磷酸盐pb(50mm)，37℃摇床震荡过夜，然后测量其电值。结果如图3所示，从图中可知：我们可以发现随着缓冲溶液值ph的降低，电势的值逐渐升高，由比较明显的负电势值往正电势值偏移，说明含二甲胺基的聚合物胶束在微酸性环境下，可以实现粒子质子化而使表面带正电荷，同时也从侧面印证了点击反应成功制备得到具有ph响应性的目标产物。
实施例5聚合物的临界胶束浓度
向一系列10ml容量瓶中分别加入10μl浓度为6.4×104mol/l的芘-丙酮溶液，取实施例3中的聚合物胶束溶液稀释成不同浓度的溶液，浓度从1.0×10-7到0.1mg/ml，待丙酮挥发完全，再向每个容量瓶中加入稀释得到的不同浓度的聚合物水溶液，这样得到的每个样品中的芘的浓度均为6.4×10-7mol/l。将配制的溶液超声处理30min后静置过夜，待测。荧光激发光谱使用的是horibajobinyvoninc.公司的装有氙光光源的fluorolog3-tcspc型荧光光谱仪。
采用芘荧光探针法测定所得聚合物的临界胶束浓度(cmc)，以logc(mg/ml)为横坐标，在芘发射波长373nm，发射波长336nm和333nm处的荧光强度比值(i336/i333)为纵坐标作图。结果如图4所示，曲线拐点处为聚合物的临界胶束浓度值。
实施例6聚合物的细胞毒性
以4×104/ml/0.1ml孔的处于对数生长期的人正常肝细胞(lo2)埋于96孔板中，24h后将实施例3中制备的1mg/ml的聚合物胶束溶液，以浓度8、15、31、62、125、250μg/ml加入各孔，每孔100μl，每个浓度3个平行孔，培养箱中孵育24h。孵育后，取出96孔板，加入30μl浓度为5mg/ml的mtt溶液以及120μl的完全培养基，培养箱孵育4h后，甩板并用滤纸吸干残留的溶液，每孔加入150μl的dmso的溶液，于振荡器中震荡10min，用酶标仪在570nm处测定各孔的吸光度值，计算细胞生存率。
细胞生存率(％)＝(a-k)/(d-k)×100
a为实验组的od值、d为对照组od的值、k为空白组的od值(空白组只加培养液、mtt、dmso)
由图5所示可知，当聚合物浓度为125μg/ml时，细胞存活率仍大于85％，这说明本实验所制备的聚合物载药材料不具备明显的细胞毒性，适用于包载药物。
实施例7透析法制备载药胶束
室温避光下，分别将100mg聚合物me2n-pegn-pclm溶解于5ml四氢呋喃中，20mg维生素e溶解于2ml四氢呋喃中，磁力搅拌下，将维生素e的四氢呋喃溶液缓慢滴入聚合物的四氢呋喃溶液中，并室温避光混合搅拌5h。再将14ml蒸馏水用恒压滴液漏斗缓慢滴入到溶液体系中，控制滴速为20秒/滴，滴加结束后，敞口室温搅拌5h。将混合溶液转移到透析袋中(截留分子量为：mw2000da)，每四小时换一次水，透析24h。收集透析袋中的液体，用0.45μm水相滤膜过滤除去未被包载的药物以及大颗粒团聚体，得到聚合物载药胶束溶液。实施例8聚合物载药胶束的动态光散射
动态光散射的测试采用的是装有4mw氦-氖光源(波长为532nm)的brookhavenbi-200sm型激光广角散射仪，入射光角度为90°。测试样品为1mgml-1的共聚物胶束以及载药胶束的超纯水溶液，在测试之前的24h用0.45μmptfe的微滤膜对样品溶液进行过滤处理，除去大颗粒灰尘杂质等对测试的干扰。样品池装在充满十氢萘的折光率匹配池中并保持恒温25℃。每个样品平行测定三次，取平均值作为结果。粒径采用强度相关分布来表征，结果如图6所示。
实施例9聚合物的透射电镜
透射电镜的测试采用的是jeol公司的jem2100高分辨tem，测试条件：加速电压为200kv，样品滴于400目的铜网上，用2％的磷钨酸水溶液对样品进行负染色，测试样品为浓度是2mg/ml的聚合物胶束以及载药胶束的水溶液，待溶剂蒸干进行测试，测试结果如图7所示。由透射电镜图7可看到me2n-pegn-pclm负载药物ve得到的形貌，均一的球形颗粒，透射电镜得到的胶束粒径尺寸与动态光散射测定的基本一致。
实施例10聚合物的载药率(dle)
采用紫外分光光度的方法测定聚合物me2n-pegn-pclm对维生素e的载药率。测试仪器采用的是日本岛津公司的uv-2450。具体做法：准确量取1ml载药胶束溶液，另取9ml四氢呋喃稀释，紫外光谱记录范围200-500nm。标准曲线由一系列不同浓度的维生素e的溶液，在294nm处ve的紫外吸收强度建立，其中溶解ve的溶剂由体积比为9∶1的四氢呋喃和蒸馏水组成，然后由标准曲线计算出载药率。计算公式如下所示：
由图8(a)维生素e在不同浓度的紫外吸收强度可知，在294nm处ve的紫外浓度c和吸收值a的对应关系为：a＝4140.47619c-0.03501(r2＝0.99804)，据此由图8(b)ve的紫外吸收值可计算出聚合物的载药率为82.2％。
实施例11聚合物对维生素e体外释放性能
我们模拟了生理环境(ph＝7.4)和肿瘤环境(ph＝6.0～7.0)下聚合物对维生素e的体外释放行为。实验在磷酸盐pbs缓冲溶液(ph＝6.2、6.8、7.4)中进行。具体步骤为：室温避光下，分别取实施例7中载药胶束溶液10ml，装入截留分子量为2000da的透析袋中，将透析袋分别放在装有120mlpbs缓冲溶液的烧杯中，37℃下恒温透析。分别在3、6、9、12、24、30、36、48、54、60、72、78h时取出5ml透析外液并补充5ml新缓冲溶液。用紫外分光光度计测量每次取出的外液在294nm处的吸光度，根据维生素e的标准曲线计算不同时间段的释放量，并根据载药量计算累积释放率。
从图9中可以看出，维生素e释放曲线呈现出先快后慢的趋势，原因可能是释放初期吸附在胶束表面的药物可以快速地释放出来，而后期则是被包裹的药物逐渐从体系中释放。78h内，聚合物me2n-pegn-pclm的释放速率和累积释放率随着ph值的降低而增加，ph＝6.2累积释放61％，而ph＝7.4的仅为21％，这可能是因为疏水链端pcl的结构在低ph值下断裂导致药物释放，因此释放的比例更大。