一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其在环境治理中的应用的制作方法

本发明属于微生物治理污染环境的技术领域，具体涉及一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其在环境治理中的应用。

技术背景

近年来，水环境恶化问题尤为突出，湖泊普遍富营养化、蓝藻频频暴发及河道淤积、功能衰减、水体黑臭、重金属污染等一系列问题，不仅损害了百姓的人居环境，也严重影响城市形象。随着生活水平的提高，人们对环境治理改善的期待越来越高，环境保护工作正面临机遇与挑战并存的新常态，其中水环境治理也提升到了一个前所未有的高度。

微生物修复主要是利用微生物旺盛的生命活动对水体中累积的污染物进行吸收、降解和转化，补齐代谢缺环，疏通堵塞的食物链网络，调节水体生态，从根本上解决水环境污染问题。近年来，微生物修复的优势日益凸显，成为水环境治理修复的热点。但是针对重度污染的水体，尤其是黑臭水体，有益微生物的活性受到抑制，使微生物在高污染浓度的水体，尤其是黑臭水体的治理中受限。

本发明从大冶矿山的矿渣中分离出一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，与其他现有嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株相比具有繁殖速度快、耐污能力强、适应性强、应用范围广等优点，既能用于黑臭水体的脱黑除臭、底泥的生态修复等水环境的治理，还可用于生物除臭、生物浸矿、污泥沥浸、金属回收、污水处理等领域，具有见效快、成本低、安全环保、无二次污染等优势，具有推广价值。本发明将为水环境修复治理提供一种新的思路和方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对环境中的黑臭水体和底泥治理困难的问题，提供一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌，该菌已于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：嗜酸氧化亚铁硫杆菌acidithiobacillusferrooxidansdy-1，保藏编号：cctccno：m2017806，以下简称嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供一种嗜酸氧化亚铁硫杆菌在环境治理，尤其是黑臭水体治理和底泥生态修复中的应用。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的获得：

申请人从湖北大冶某矿山的矿渣中经多次富集、纯化分离，最终获得了一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌。该菌已于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：m2017806，分类命名为：嗜酸氧化亚铁硫杆菌acidithiobacillusferrooxidansdy-1，以下简称嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，地址：中国武汉武汉大学。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌为革兰氏阴性菌，适宜生长温度为28～35℃，最适生长ph为2.0～3.5，在9k培养基中培养。菌落形态为小而凸的圆形单菌落，直径1～1.5mm，菌体呈亮黄色，中心有黑色小凸起，菌落边缘规整。显微镜下观察通常以单个、两个或者几个呈链状分布，单个细菌呈为短杆菌，菌体长约1～1.5μm，直径约0.5μm，两端钝圆，有鞭毛，能活泼运动。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的生理生化特征为：葡萄糖氧化产酸阳性，葡萄糖发酵产酸产气阴性，氧化fe²⁺、fes2呈阳性，氧化s、s2o3^2-呈阳性，嗜酸性，严格好氧。

9k液体培养基的组成包括：a液：(nh4)2so43.0g/l、kcl0.1g/l、k2hpo40.5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、ca(no3)20.01g/l、二水合柠檬酸三钠8.823g/l、蒸馏水；b液：feso4·7h2o44.7g/l，蒸馏水，加入适量1:1h2so4溶液，调节ph，抑制fe²⁺氧化。a液121℃高温灭菌30min，b液105℃灭菌15min，冷却后混合，并用灭菌的的1:1h2so4溶液调节ph至2.0。

9k固体培养基的组成包括：在上述9k液体培养基的基础上添加1.5％琼脂。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在9k液体培养基中随着培养时间的延长，培养液的颜色依次经历“浅绿-浅黄-橙黄-橙红-深红-红棕”的变化过程，发酵周期短、易生产，发酵浓度高达10⁸～10¹⁰cfu/ml。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，以fe²⁺为能源物质，在生长过程中通过将fe²⁺氧化成fe³⁺来获得生长所需的能量，并以co2为碳源，吸收氮、磷等无机营养进行自身的生长繁殖。其氧化机理如式(1)、(2)所示：

在上述作用下，嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1具备了良好的生物氧化作用和生物酸化作用。在环境治理领域，嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1利用水环境中过量的fe²⁺作为能源，用于自身的生长繁殖，同时利用释放出的具有强氧化性的fe³⁺将悬浮在水体或沉积在底泥中的单质s或者s^2-、s2o3^2-、s4o6^2-等可溶性或不溶性的硫化物分解、氧化成so4^2-，减少环境中的致黑物质，促使黑臭水体和底泥脱黑。另一方面，利用嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1营造的生物氧化、酸化微环境，实现有机质的氧化、降解和转化，从而提高水体透明度，降低水环境的污染负荷。还可以氧化分解硫化氢、氨气、硫醇等致臭物质，降低环境的臭气浓度。

本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的细胞壁基质中含有复杂的杂多糖，包含了氨基、酰胺基及羧基等，其结构较其它的嗜酸微生物更为完整，dy-1菌群还可分泌fe氧化酶来催化形成细胞结合的生物铁氧化物颗粒，改变微生物表面活性，加强对金属的亲和力和吸附容量。故本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1具有较强的金属耐受性和较强大的金属吸附能力，对环境中重金属的去除、回收、利用等具有积极的现实意义。

本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1能用于制备黑臭水体的净化剂，该菌剂可短时间内完成污染水体和底泥中低价硫化物、部分有机质的氧化分解，促进水体快速脱黑除臭，提高透明度。

本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1能用于制备黑臭水体中底泥的改良剂，该菌可将黑臭底泥脱臭，促使底泥金属污染物的钝化消除，实现生态恢复。

本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1能用于制备黑臭水体中硫化物去除剂，去除率达95％以上。

本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1能用于制备氧化分解硫化氢、氨气、硫醇具有恶臭气味的物质的分解剂，其中硫化氢去除率达99％以上，除臭高效、彻底、不反弹。

本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1可用于黑臭水体中的重金属的去除，可用于制备重金属去除剂；优选的，对zn、cu、cd、cr的去除率分别可达到95～99.5％、92～98％、90～99％、90～99％，对重金属的耐受性较强，对zn、cu、cd、cr的耐受浓度依次为1800mg/l、1200mg/l、800mg/l和500mg/l。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供了一种从环境中筛选到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，相比其他已发现的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，菌株dy-1是一株繁殖速度快、易生产、适应性强、安全高效、应用广泛的嗜酸氧化亚铁硫杆菌。

(2)本发明首次将嗜酸氧化亚铁硫杆菌应用于地表水环境的治理，为水环境治理提供了新思路。凭借良好的生物氧化作用、生物酸性作用以及较强的金属耐受性、金属吸附能力等，嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在黑臭水体的脱黑除臭、底泥的生态修复等方面有显著的成效，且不会对原有水系造成破坏。可作为重污染水体治理的先锋，为后续采用其他微生物、水生植物等治理方法进一步改善水体水质、恢复水体生态平衡奠定良好的水质和生态微环境基础。

(3)本发明提供的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1能够创造良好的生物氧化环境和生物酸化环境，明显消除恶臭，营造健康愉悦的生态环境。

(4)本发明提供的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在除臭、污泥生物沥浸、浸矿、金属回收、矿物材料的微生物加工及酸性废水处理等方面也具有显著的效果，所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在实际应用过程中操作简单、效果显著、适应性强、针对性强、绿色环保、无二次污染、成本低廉，可与其他的治理技术灵活配套，适合大范围推广。

附图说明

图1为嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1菌落形态示意图。

图2为嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1革兰氏染色后显微镜下的形态示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规培养与分离方法得到。

实施例1

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1菌株的获得。

从湖北大冶某矿山的矿渣中采集样品，并经多次富集、纯化，获得单菌落菌株并鉴定。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1菌株的分离纯化过程：取5g矿渣样品溶于50ml无菌水，28℃、180r/min振荡培养6h，然后静置2h。吸取10ml上层含菌种水样加入到盛有100ml已灭菌的9k液体培养基中，28℃、180r/min摇床培养，直至培养基由浅绿色变成红棕色，再进行5次富集培养，至红棕色出现的时间由原来的5d变成1d后，采用固体培养基涂布平板法分离、纯化菌种以获得纯培养单菌株。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的菌株接种到9k液体培养基中，随着培养时间的延长，培养液的颜色依次经历“浅绿-浅黄-橙黄-橙红-深红-红棕”的变化过程，这是由于细菌在生命活动中不断将fe²⁺氧化为fe³⁺，以获得生命所需的能量。继续培养，会逐渐有大量黄色沉淀生成，沉淀经鉴定为黄铵铁矾和黄钾铁矾的混合物，是溶液中高浓度的fe³⁺在酸性条件下水解生成的产物。

所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，其分类命名为：嗜酸氧化亚铁硫杆菌acidithiobacillusferroosidansdy-1，已于2017年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：m2017806，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的菌种性质：

1、形态鉴定，包括菌落形态的观察、描述和革兰氏染色后的镜检记录。特征如下：固体培养基28℃培养7d，形成小而凸的圆形单菌落，菌体呈亮黄色，中心有黑色小凸起，菌落边缘规整(图1)；革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阴性。显微镜下观察通常以单个、两个或者几个呈链状分布，单个细菌呈为短杆菌，菌体长度约1～1.5μm，直径约0.5μm，两端钝圆，有鞭毛，能活泼运动(图2)。

2、16srdna分子鉴定，即采用原核生物16srdna通用引物27f和1492r(27f序列：-agagtttgatcctggctcag-，1492r序列：-ggttaccttgttacgactt-)进行pcr序列扩增。在pcr扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，对其序列进行测定。测定结果与国际ncbigenbank(www.ncbi.nih.gov)核苷酸数据库上的信息比对，该菌株与嗜酸氧化亚铁硫杆菌同源性达100％。

3、生理生化鉴定。所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的生理生化特征为：葡萄糖氧化产酸阳性，葡萄糖发酵产酸产气阴性，氧化fe²⁺、fes2呈阳性，氧化s、s2o3^2-呈阳性，嗜酸性、严格好氧。适宜生长温度为28～30℃，最适生长ph为2.0～3.5，生长对数期为18～30h。

表1嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1的生理生化特征

实施例3

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在黑臭水体脱黑除臭中的应用。

实验所用黑臭水样采自武汉某黑臭河道。实验装置为内径10cm、高35cm的圆柱形容器，装入1l黑臭水样。实验分为实验组和对照组。实验组接入10％(体积比)活化的dy-1菌悬液，对照组加入等量的灭菌蒸馏水。每组处理3个重复，均置于28℃下，曝气通氧。分别取12h、24h、48h、72h时段的水样进行fe²⁺的氧化率以及s^2-、有机质、氨氮的去除率分析，结果见表2。

fe²⁺氧化率能反映菌株dy-1菌体的活性。投菌24h以后，fe²⁺的氧化率基本维持在95％以上，说明菌株dy-1在高浓度黑臭水中能保持较高的活性。另外，菌株dy-1对黑臭水体中的硫化物、有机质有明显的去除效果，硫化物的去除率为99.7％，有机质的去除率约为61％、氨氮的去除率为59％，均比对照组只曝气增氧的去除效率高。黑臭水体的感官也有明显的改善，反应至48h，水样逐渐由黑臭转变成黄色，几乎闻不到臭味，对照组气味略有好转，但水样依然呈黑色。

表2嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1对黑臭水体的处理效果

实施例4

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1对重金属的耐受性：

实验装置为内径10cm、高35cm的圆柱形容器。向反应装置中分别加入四种(zn²⁺、cu²⁺、cd²⁺、cr⁶⁺)不同浓度梯度的金属离子与9k培养基混合溶液1l，接入10％活化好的dy-1菌悬液。每组处理3个重复，均置于28℃下，曝气通氧72h，每隔6h检测菌体的生长状况，即测定fe²⁺氧化率。

zn²⁺浓度梯度：500mg/l、1000mg/l、1500mg/l、1800mg/l、2000mg/l；cu²⁺浓度梯度：300mg/l、500mg/l、800mg/l、1000mg/l、1200mg/l、1500mg/l；cd²⁺浓度梯度：100mg/l、200mg/l、300mg/l、500mg/l、800m/l、1000mg/l；cr⁶⁺浓度梯度：100mg/l、300mg/l、500mg/l、800mg/l、1000mg/l。

以上所述重金属浓度为接入菌液后，溶液中各重金属的终浓度。

根据fe²⁺氧化率的分析结果，菌株dy-1对zn、cu、cd、cr的耐受浓度依次为1800mg/l、1200mg/l、800mg/l和500mg/l。在上述各重金属离子浓度以下，嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1对fe²⁺的氧化率维持在90％以上，反应器内菌体保持较高活性；超过上述各重金属的耐受浓度，fe²⁺的氧化率迅速降低，菌体的活性明显受到抑制。已知一般情况下，zn、cu、cd和cr元素对微生物毒害作用的最高允许浓度依次为5～13mg/l、0.5～1.0mg/l、1～5mg/l、2～5mg/l(不同最高允许浓度随不同微生物而异)，故与其他用于水环境治理的微生物相比，嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1菌株具有卓越的重金属耐受性。

实施例5

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在含zn²⁺的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果：

实验所用黑臭水样采自武汉某黑臭河道。实验装置为内径10cm、高35cm的圆柱形容器。分别向反应装置中通入1l含zn²⁺终浓度为50mg/l、500mg/l的黑臭水样。每组处理3个重复，均置于28℃下，曝气通氧。分别取12h、24h、48h、72h时段的水样进行fe²⁺的氧化率以及zn²⁺、s^2-、有机质和氨氮的去除率分析。

fe²⁺的氧化率能较好的反映菌株dy-1的活性。在12h时，dy-1菌处于适应期，在24h～48h时，dy-1菌成长为优势菌种，fe²⁺氧化效率达到高峰期，污染物的去除效率达到较高的水平；反应至72h，污染物的浓度降低，故处理效率也随之降低。在低zn²⁺(50mg/l)的条件下，fe²⁺的氧化率基本维持在90％以上，说明dy-1菌在50mg/l浓度下生长良好，zn²⁺的去除率达97％，s^2-的去除率达98％，有机质的去除率为60％，氨氮的去除率为58％。高zn²⁺条件下，受高浓度zn²⁺(500mg/l)的影响，菌株dy-1的活性略有降低，污染物的去除效率与低浓度基本一致，影响不大。

表3菌株dy-1在不同含zn²⁺量的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果

实施例6

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在含cu²⁺的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果：

实验所用黑臭水样采自武汉某黑臭河道。实验装置为内径10cm、高35cm的圆柱形容器。分别向反应装置中通入cu²⁺终浓度为10mg/l和100mg/l的黑臭水样。每组处理3个重复，均置于28℃下，曝气通氧。分别取12h、24h、48h、72h时段的水样进行fe²⁺的氧化率以及cu²⁺、s^2-、有机质和氨氮的去除率分析。

在低cu(10mg/l)的条件下，fe²⁺的氧化率基本维持在85％以上，说明dy-1菌在10mg/l浓度下生长良好，cu²⁺的去除率达95％，s^2-的去除率达98％，有机质的去除率为63％、氨氮去除率为55％。高cu(100mg/l)条件下，受高浓度cu²⁺的影响，菌株dy-1的活性略有降低，但污染物的去除效率基本维持在较高水平。

表4菌株dy-1在不同含cu²⁺量的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果

实施例7

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在含cd²⁺的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果：

实验所用黑臭水样采自武汉某黑臭河道。实验装置为内径10cm、高35cm的圆柱形容器。分别向反应装置中通入cd²⁺终浓度为10mg/l和100mg/l的黑臭水样。每组处理3个重复，均置于28℃下，曝气通氧。分别取12h、24h、48h、72h时段的水样进行fe²⁺的氧化率以及cd²⁺、s^2-、有机质和氨氮的去除率分析。

在低cd²⁺(10mg/l)的条件下，fe²⁺的氧化率基本维持在85％以上，说明dy-1菌在10mg/l浓度下生长良好。此浓度下，cd²⁺的去除率达96％，s^2-的去除率达95％，有机质的去除率为56％，氨氮去除率为51％。高cd²⁺(100mg/l)条件下，受高浓度cd²⁺的影响，菌株dy-1的活性略有降低，但污染物的去除效率基本维持在较高水平。

表5菌株dy-1在不同含cd²⁺的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果

实施例8

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在含cr⁶⁺的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果：

实验所用黑臭水样采自武汉某黑臭河道。实验装置为内径10cm、高35cm的圆柱形容器。分别向反应装置中通入cr⁶⁺浓度为10mg/l和100mg/l的黑臭水样。每组处理3个重复，均置于28℃下，曝气通氧。分别取12h、24h、48h、72h时段的水样进行fe²⁺的氧化率以及cr⁶⁺、s^2-、有机质和氨氮的去除率分析。

在低cr⁶⁺(10mg/l)的条件下，fe²⁺的氧化率基本维持在90％以上，说明dy-1菌在10mg/l浓度下生长良好。此浓度下，cr⁶⁺的去除率达95％，s^2-的去除率达97％，有机质的去除率为56％，氨氮去除率为51％。高cr⁶⁺(100mg/l)条件下，受高浓度cr⁶⁺的影响，菌株dy-1的活性略有降低，但污染物的去除效率基本维持在较高水平。

表6菌株dy-1在不同含cr量的黑臭水体中的活性及对污染物的去除效果

实施例9

嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1在黑臭河道治理中的应用：

将本发明提供的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1应用于徐州某河道黑臭治理示范工程。该河道底泥淤积严重，黏腻黑臭，并含有大量有害有机质和重金属，水体表面漂浮大量废油。由于水质状况恶劣，前期采用投加本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1与人工增氧相结合的方式，对黑臭水体和底泥进行解毒、调理。连续投加本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌dy-1，5～8d左右示范区内水体黑臭现象有了明显的改善。水体恶臭消散，臭气浓度低至10，水体透明度由原来的不足20cm提高至50～60cm，水中开始出现藻类和原生动物；黑臭的底泥逐渐变成无臭的黄泥，底泥厚度削减15～20cm。为后续采用其他微生物、水生植物等治理方法进一步改善河道水质、恢复水体生态平衡奠定了良好的水质和生态微环境基础。

表7投加菌株dy-1前后黑臭河道底泥的各项指标的情况

本发明创造并不局限于上述实施方式，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变化和修改，都应涵盖在本发明范围内。