一种用于结核分枝杆菌katG基因突变快速检测的引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于分子诊断和基因诊断领域，为体外诊断试剂，试剂检测对象为结核分枝杆菌dna；具体涉及一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的引物组、试剂盒及应用。

背景技术

结核病是全世界关切的公共健康问题，全球大约有三分之一人口被结核分枝杆菌感染，每年有三百余万人死于结核病。结核分枝杆菌耐药为结核病的治疗造成了极大挑战。异烟肼是结核病治疗的一线药物，结核分枝杆菌异烟肼耐药是造成结核病治疗失败的重要原因，因此对结核分枝杆菌耐药谱进行检测，不仅有利于选择有针对性的治疗方案，而且对于结核分枝杆菌耐药现状的流行病学调查也具有重要意义。

研究表明katg基因突变是异烟肼耐药的主要机制，而且突变位点不同决定了不同程度的异烟肼耐药。katg基因编码结核分枝杆菌过氧化氢-过氧化物酶，若katg基因突变，有可能导致异烟肼活化效率降低或不能活化，从而引起结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药性。其中katg基因315位点突变占结核分枝杆菌异烟肼耐药的50～95％；此外也有报道该基因463位点突变也与异烟肼耐药相关，但尚存争议；此外320和232位点的突变也有报道，但比例很低。因此katg基因315位点突变在突变导致的结核分枝杆菌异烟肼耐药中占有重要地位。

结核分枝杆菌培养周期较长(7-14d)，而且阳性率偏低，药敏试验虽然是判定细菌对不同药物敏感性的重要实验方法，但是具有一定局限性，除了检测周期长导致延误治疗时间之外，还存在检测人员的暴露风险。此外，pcr技术虽然具有快速、灵敏和特异的优点，但是需要复杂的仪器设备和专业人员操作；此外基因芯片虽然能够检测靶基因突变，具有灵敏度高、特异性强的特点，但是操作繁琐，需要经过pcr、杂交、读片等过程，无法满足实时检测的要求，也不利于在基层医院开展。此外虽然测序技术在基因突变检测方面仍是金标准，但成本较高，且耗时较长。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的引物组。

本发明第二个目的在于公开了一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的试剂盒。

本发明第三个目的在于公开了上述引物组和试剂盒的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的引物组，其中，所述引物组为：

katgf3:ggacgcgatcaccagc

katgb3:atcggatccacccgca

katgfip:agctcccactcgtagccgtacaacgaacaccccgacgaaat

katgbip:caccatcccggacccgttcggtcagtggccagcatc。

上述技术方案所述的引物组在检测katg基因315位点突变中的应用。

上述技术方案所述的引物组在检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性中的应用。

上述技术方案所述的引物组在制备检测katg基因315位点突变试剂盒中的应用。

上述技术方案所述的应用，其中，所述应用的具体过程为：

(1)、待检样本dna的提取；

(2)、按照以下配方配制反应液：反应体系为25μl：1-10mm的katgfip、1-10mm的katgbip、0.1-10mm的katgf3、0.1-10mm的katgb3、1-10mm的dntps、1-10mm的mgso4、1-10m的甜菜碱、1-5μl待检样本dna、1-8ubstdna聚合酶、加蒸馏水至25μl，温和混匀；

(3)、进行恒温扩增反应：在60-65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；

(4)、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入sybrgreeni荧光染料，混匀，静置5min，反应产物显现绿色为katg基因315位点为未突变的野生型，显橙色为katg基因315位点为突变型。

一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的试剂盒，其中，所述试剂盒的反应体系为25μl，由以下物质组成：1～10mm的katgfip、1～10mm的katgbip、0.1～10mm的katgf3、0.1～10mm的katgb3、1～10mm的dntps、1～10mm的mgso4、1～10m的甜菜碱、1～5μl待检样本dna、1～8ubstdna聚合酶、余量为蒸馏水；

所述katgf3序列如seqidno.1所示；所述katgb3序列如seqidno.2所示；所述katgfip序列如seqidno.3所示；所述katgbip序列如seqidno.4所示。

上述技术方案所述的试剂盒在检测katg基因315位点突变中的应用。

上述技术方案所述的试剂盒在检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明是根据结核分支杆菌katg基因，设计了四条扩增目的基因片段的引物，传统的pcr方法只使用两条引物，相比较之下，本发明同时使用四条引物从而提高了检测的特异性。

2、本发明的引物组及试剂盒在使用时只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备。

3、本发明的引物组及试剂盒具有高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，假阳性率为0。

4、本发明的引物组及试剂盒能快速、高效扩增：扩增仅需1小时即可完成，且产率高。

5、本发明的引物组及试剂盒的灵敏度高：对katg基因的最低检测极限达到10个拷贝以内，标本的检出率达高到99％。

6、本发明的引物组及试剂盒的鉴定过程简便，通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。

7、本发明的引物组及试剂盒用途广，可广泛用于临床常规检测及流行病学调查。

附图说明：

1、图1为反应产物中加入sybrgreeni荧光染料后的显色照片，其中a为对照a；b为待测样品1；c为待测样品2；d为对照g；e为空白对照。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的引物组、试剂盒及应用作进一步的说明。

特殊引物的设计：原有恒温扩增的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入对于多态性位点引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善，在引物设计时，充分考虑了引物二聚体δg；3’和5’末端δg；错配概率，优化了引物间距和扩增效率，大大提高了扩增反应的特异性和灵敏度。根据katg基因的突变位点所设计的六条引物是扩增进行的关键。此外，本专利提供的引物序列，除了在设计时的优化筛选之外，还通过大量经测序验证过的标准品验证确实有效的引物组。

本发明中seqidno.1～seqidno.4所示的引物序列由上海生工公司制备。

实施例1：结核分枝杆菌katg基因315位点突变快速检测：

一、被检样品的预处理：

按照常规方法提取样本中结核分枝杆菌dna；样本来源于结核病的可疑或确诊患者的痰液或患者体内分离到的结核分支杆菌。

二、质量控制：

空白对照：用取出dnaase和rnaase的无菌双蒸水作为实际空白对照，(用以判断试剂是否被污染)；

对照wt：将经过测序验证过的，在katg基因315位点为agc的野生型结核分枝杆菌dna样本；

对照mt：将经过测序验证过的，在katg基因315位点为以下任意形式的突变型结核分枝杆菌dna样本：acc、acc、atc、cgc、aga、ggc；

三、等温扩增反应的准备：

1、反应液配置：反应体系为25μl：1.6mm的katgf3和1.6mm的katgb3；0.2mm的katgfip；0.2mm的katgbip；1.6mm的dntps；6mm的mgso4；1m的甜菜碱；2μl待检样本dna或相应对照(例如：阳性对照、阴性对照等)；8ubstdna聚合酶；加蒸馏水至25μl。

2、将上述反应液在63℃下保温1h，随后85℃加热2min后终止反应。

四、质控结果的分析与判断：

(1)、在反应产物中加入sybrgreeni荧光染料，混匀，静置5min后观察质控样本结果：

(2)、对照wt：反应产物需显现绿色，否则有可能是检测试剂失效(见图1中的a)；

(3)、对照mt：反应产物需显现橙色，否则有可能是检测试剂失效(见图1中的d)；

空白对照必须为橙色，否则有可能是核酸提取或检测试剂已造成污染，出现此种情况，应当需要在清洁检测环境和更换试剂和耗材之后进行重复试验(见图1中的e)。

五、待测样本反应产物结果观察与判断：

质控均为正常工作的条件下，才能对结果进行判断。

在反应产物中加入sybrgreeni荧光染料，混匀，静置5min，若反应产物显现绿色则说明katg基因315位点为agc的野生型，显橙色则说明katg基因315位点为突变型。本实施例中，使用两个未知待测样本(待测样品1和待测样品2)，检测结果如图1所示(a为对照a；b为待测样品1；c为待测样品2；d为对照g；e为空白对照)，待测样品1反应液成绿色，说明该样本的katg基因315位点为agc的野生型(见图1中的b)；待测样品2反应液成橙色，说明该样本的katg基因315位点为突变型(见图1中的c)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

sequencelisting

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种用于结核分枝杆菌katg基因突变快速检测的引物组、试剂盒及应用

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