用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及II型鲤疱疹病毒的检测技术，具体涉及用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，及在检测II型鲤疱疹病毒的应用。

背景技术：

2009-2010年鲫鱼“病毒性出血病”在江苏省苏北射阳县鲫鱼养殖池塘零星发生，引起发病池塘的鲫鱼死亡，2011年8-9月份在盐城地区出现较大面积的暴发，并引起大面积死亡，2012年3月开始发现少数鲫鱼池塘发病，6月份大规模暴发，在射阳县该病发生池塘高达80％，在苏北其他鲫鱼养殖区的发病情况同样严峻，本次流行的鲫鱼“病毒性出血病”被确定为鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，其病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusII,CyHV-II)。

疱疹病毒科(Herpesviridae)属于双链DNA病毒，具囊膜、球形、形状多样化，直径为120-200nm，表面有明显的囊膜，具钉状物。核衣壳20面体对称，直径100-110nm，表面有一层由球状物组成的覆膜，球状物不对呈的分布，数量也不同。病毒衣壳内包裹大的双链DNA。该科病毒有3个亚科，分别是α型疱疹病毒(Alphaherpesvirinae)、β型疱疹病毒(Betaherpesvirinae)和γ型疱疹病毒(Gammaherpesvirinae)。在鱼类中报道的疱疹病毒科，暂被ICTV化为待分类疱疹病毒：鱼疱疹样病毒属(Ictalurid herpes-like viruses)病症，病鱼身体发红，侧线鳞以下及胸部尤为明显，鳃盖肿胀，在鳃盖张合的过程中(或鱼体跳跃的过程中)，血水会从鳃部流出；病鱼死亡后，鳃盖有明显的出血症状，剪开鳃盖观察，鳃丝肿胀并附有大量粘液。

CyHV-II的常规检测技术如LAMP技术，其反应原理复杂，引物设计繁琐，并且在引物设计时针对靶标序列所需要的保守区段较为严格，反应产物不均一，不利于后期的测序构建克隆，因此没有得到普遍应用；PCR技术耗时较长，成本较高，而且需要精密的温度循环仪器，严重限制PCR技术在现场检测中的应用。近年来，恒温核酸扩增技术的出现恰可解决PCR技术局限，更加方便，迅速，是一种快速检测CyHV-II的可行性方法。重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification，RPA)是恒温核酸扩增技术的一种，RPA利用T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs X和uvs Y、单链结合蛋白gp32及Bsu DNA聚合酶三种酶在37-42℃对目标片段进行等温扩增，可以在20-40min完成数十亿的DNA拷贝，基于该技术与凝胶电泳，侧向流动免疫层析技术(LFD)可以实现CyHV-II的快速检测。

技术实现要素：

为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针，基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification，RPA)与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合，能在15min内恒温37℃条件下可视化检测II型鲤疱疹病毒。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：

caatcagggtcagtggacgagactggcgttgtgcggtctggccaacacggccaactaccccatcgatctgtacgaccagaaggacaccaagtacagaatcatcaacaccggggccgagcctctgcactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgccatcggtggaggcttcaaaggcgcaggtggacagcatgaaaaacaacaccatcagagccgagggttccttcagaccgggtaacatggctctggg；所述RPA专用引物的正向引物序列为CAATCAGGGTCAGTGGACGAGACTGGCGTTGT；所述RPA专用引物的反向引物序列为CCTCCCAGAGCCATGTTACCCGGTCTGAAGGA。

本发明的第二方面，用于检测II型鲤疱疹病毒的探针，是根据II型鲤疱疹病毒目的基因设计的，且所述II型鲤疱疹病毒目的基因序列为：

caatcagggtcagtggacgagactggcgttgtgcggtctggccaacacggccaactaccccatcgatctgtacgaccagaaggacaccaagtacagaatcatcaacaccggggccgagcctctgcactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgccatcggtggaggcttcaaaggcgcaggtggacagcatgaaaaacaacaccatcagagccgagggttccttcagaccgggtaacatggctctggg；所述探针序列为：

(FAM)cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgccaTc(THF)gTggaggcttcaaaggc(C3spacer)。

需要说明的是，根据RPA引物设计原则，RPA对引物长度的要求是30～35bp，扩增产物在500bp之内时，扩增效率较高；由于引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，为快速、灵敏检测II型鲤疱疹病毒，需要进行多次引物筛选。在本发明的优选实施例中，委托上海生物工程公司设计针对CyHV-II目的基因的特异性引物序列和探针序列，然后通过在保守基因区域设计一系列梯度候选引物，并根据RPA凝胶检测结果从中选择最佳引物。

本发明的第三方面，用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒，包括上述RPA专用引物和探针。

优选地，用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒，还包括含有ORF72质粒的阳性对照。

优选地，用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒，还包括含有无菌ddH₂O的阴性对照。

需要进一步说明的是，本发明采用RPA与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合的方法，反应原理是羧基荧光素(FAM)标记的特异探针与生物素(Biotin)标记的核酸扩增产物特异性结合，将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物，当扩散到检测线时，三元复合物被生物素配体捕获，形成有颜色的检测线；具有判断结果肉眼可判读，检测方便，反应时间在10min内，便于携带等优点。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明针对CyHV-II病毒设计的RPA专用引物和探针能够获得需要的CyHV-II目的基因，是运用RPA技术检测II型鲤疱疹病毒的关键，目前没有针对II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物和探针，具有特异性。

(2)本发明用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒可以快速且成功检测鲤疱疹病毒CyHV-II，能在15min内恒温37℃条件下可视化检测II型鲤疱疹病毒。

附图说明

图1为反应产物的琼脂糖凝胶分析结果，其中，1、2号样品为阳性样品，3号样品为阴性样品；

图2为反应产物的试纸条分析结果，其中，1、2号样品为阳性检测结果，NC为阴性样品；

图3和图4均为反应产物的特异性分析结果，其中1-10号分别为CyHV-II的DNA，IHHNV，WSSV，GCRV-jx01，GCRV-JX02，GCRV-104，KHV，SVC，YHV和水；

图5为琼脂糖胶检测的敏感性评价结果；

图6为RPA试纸条检测的灵敏性评价结果。

具体实施方式

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

实施例1用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA专用引物和探针设计与筛选

本实施例委托上海生物工程公司设计针对CyHV-II目的基因的特异性引物序列和探针序列，通过在保守基因区域设计一系列梯度候选引物，并根据RPA凝胶检测结果从中选择最佳引物。其中：

RPA专用引物的正向引物序列为

CAATCAGGGTCAGTGGACGAGACTGGCGTTGT；

RPA专用引物的反向引物序列为

CCTCCCAGAGCCATGTTACCCGGTCTGAAGGA；

探针序列为：

(FAM)cactctggcgacgcgtttgtggttgaaccgccaTc(THF)gTggaggcttcaaaggc(C3spacer)。

实施例2反应产物的琼脂糖凝胶分析

首先按照如下步骤提取CyHV-II病毒：(1)加入与加入样品PBS缓冲液混合均匀，以8000rpm离心5min，弃上清；(2)加入1ml缓冲液和20μL蛋白酶在56℃水浴中保温3h；(3)在8000rpm离心5min，取750μL上清液中于新离心管中，加入体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，以50rpm的速度混合10min后以8000rpm离心5min，再取650μL上清液于新离心管中，重复上述操作且保证不吸入蛋白层；(4)取600μL上清液于新离心管中，加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇后以50rpm的速度混合10min，再8000rpm离心5min；(5)取480μL上清液于新离心管中，加入40μL3mol/L的醋酸钠和960μL4℃乙醇，轻摇可见白色絮状物；(6)在-20℃放置20-30min后以12000rpm离心10min，弃去上清液；(7)用200ul75％的乙醇洗涤，14000rpm离心5min，弃上清；重复上述步骤一次，晾干后用50ul的超纯水洗涤，于-20℃保存备用。

再按照以下组成和配比的反应体系进行PCR扩增反应，其中，上游引物2.1μl，下游引物2.1μl，Rehydration Buffer29.5μl，病毒DNA2μl，ddH₂O 11.8μl，总量为47.5μl，37℃下反应15min进行琼脂糖凝胶分析，结果如附图1所示，其中1、2号样品均扩增到阳性产物，阴性样品无非特异性扩增。

实施例3反应产物的试纸条分析

CyHV-II病毒的提取同实施例2，按照以下组成和配比的反应体系进行PCR扩增反应，其中，上游引物2.1μl，下游引物2.1μl，荧光探针0.6μl，RehydrationBuffer29.5μl，病毒DNA2μl，ddH₂O11.2μl，总量为47.5μl。RPA试纸条检测反应步骤为：①将以上组分混合后轻微振荡后离心数秒；②将混合液加入含冻干酶粉的0.2mLTwist Amp Basic反应管中反复吸数次；③加入2.5μL280mM的醋酸镁反复吸数次；④放入38℃金属恒温箱中4min，拿出混匀后又放入38℃金属恒温箱36min；⑤反应结束后，用核酸试纸条进行检测，结果如附图2所示。当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，结果为阳性，表明样本中含有CyHV-II病毒；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，结果是阴性，表明样本中不含有CyHV-II病毒。

实施例4 RPA引物和探针的分子特异性分析

CyHV-II病毒的提取同实施例2，RPA引物和探针的分子特异性在38℃金属恒温箱中15min后用CyHV-II病毒的DNA进行检测，选取CyHV-II的DNA，IHHNV，WSSV，GCRV作为模板，所得产物用凝胶电泳进行侧向流动免疫层析技术(LFD)鉴别，结果如附图3和图4所示。

实施例5 RPA试剂盒琼脂糖凝胶电泳检测敏感性评价

CyHV-II病毒的提取同实施例2，取CyHV-II病毒的DNA进行倍数稀释，每个稀释度进行RPA扩增，37℃下扩增15min后对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如附图5所示，可以检测到10^-3拷贝。

实施例6RPA试纸条侧向流动免疫层析检测灵敏性评价

CyHV-II病毒的提取同实施例2，取CyHV-II的DNA进行倍数稀释，每个稀释度进行RPA扩增，38℃金属恒温箱中培养15min，待反应结束后对产物进行侧向流动免疫层析技术(LFD)检测，如附图6所示，可以检测出10^-4拷贝(约为5pg)。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 用于检测II型鲤疱疹病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针

<130> 20180201

<141> 2018-02-01

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 249

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>