本发明属于生物制品领域，公开了一种高活性的犬重组干扰素-λ1，同时还提供了高效表达犬重组干扰素-λ1的制备方法与应用。
背景技术：
近年来，我国的宠物业迅速发展，宠物犬、猫的数量日益增多，宠物源病毒性疫病是目前危害比较严重的疾病。最常见的犬瘟热、犬细小病毒病等通常危害严重，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害我国养犬业最为严重的传染病，严重制约了宠物业的发展。传统的治疗方案在临床上很难奏效，因此进行积极治疗和预防犬的病毒病是业内最为关注的问题。
根据氨基酸序列和特异性识别受体的不同，ifn分为i型、ii型和iii型。其中i型干扰素包括有ifn-α、ifn-β、ifn-δ、ifn-κ、ifn-ω和ifn-τ，其中ifn-α有二十余个亚型，各型结构类似，仅存在少量氨基酸的差异，ifn-α为目前应用最广的抗病毒药物之一。ifn-β仅有一个亚型。ii型ifn为ifn-γ，具有很强的免疫调节功能；干扰素-λ是2003年由美国科学家kotenko等和sheppard等共同发现的一类新型干扰素，由于其兼具i型干扰素和白细胞介素(interleukin,il)-10家族的双重特征，因此其成员的命名为ifn-λ1(il-29)、ifn-λ2(il-28a)和ifn-λ3(il-28b)，其生物学效应与i型ifn比较相似，包括抗病毒,免疫调节及抑制肿瘤增殖等生物学活性。ifn-λ通过与其特异性受体异二聚体复合物(ifn-λr1/il-10r2)结合，可介导jak-stat信号转导途径，诱导机体的抗病毒反应，从而发挥其抗病毒作用。由于iii型ifn的受体主要分布在上皮细胞表面，因此，推测iii型干扰素主要通过表皮和黏膜上皮组织来阻止病毒的入侵，在组织中，主要分布在胃部、肠道和肺部，在中枢神经系统中分布较少，这种分布可以使得其靶向性更佳，并降低临床使用中的副反应。
ifn-λ1/il-29由含22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽组成,分子质量约20ku～33ku，含有2个二硫键，在65位～67位氨基酸残基上存在1个潜在的n-连接糖基化位点。ifn-λ2/il-28a和ifn-λ3/il-28b均由含22个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟肽组成，含有3个二硫键，分子量约22ku，氨基酸同源性为81％。
毕赤酵母是一种新型的外源基因表达系统，已有多种蛋白在此系统中高效表达，不存在原核表达系统的内毒素难以去除的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并可进行类似高等真核生物的信号肽剪切和糖基化等翻译后加工。表达载体ppiczαp的醇氧化酶启动子aox1可用甲醇严格调控，表达盒的n端带有引导分泌表达的带α-factor信号肽序列，表达产物可分泌到上清，它还拥有一个特点是其具有zeocin抗性标记基因，给筛选转化子的工作带来很大的便利。再者甲醇营养型酵母表达系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌巴斯德毕赤酵母自身蛋白分泌量少，下游分离纯化操作易行，能大规模发酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种活性高的犬重组干扰素-λ1。
本发明的另一目的在于提供该犬重组干扰素-λ1的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述方法制得的犬重组干扰素-λ1的应用。
为了提高蛋白的表达量，本发明利用毕赤酵母偏爱密码子对所述核酸序列进行了密码子优化。为了避免翻译出来的mrna的gc含量过高、mrna的二级结构影响翻译的效率，本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码，前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近，氨基酸序列原序列不变，在某些很特殊的情况下，为了减少或增加酶切位点，某些位置的序列做适当的序列调整。由此，本发明优化设计了密码子优化了的犬干扰素-λ1基因，其序列如seqidno.1所示。
本发明提供一种犬重组干扰素-λ1，其氨基酸序列为：
a)seqidno.2所示的氨基酸序列；或
b)seqidno.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明提供了编码所述犬重组干扰素-λ1的基因，是如下a)或b)：a)其核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示；或
b)由seqidno.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码犬重组干扰素-λ1的核苷酸序列。
本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
其中，上述重组表达载体含有醇氧化酶启动子(aox)或甲醛脱氢酶启动子(formatedehydrogenase，fmd)。
优选地，上述载体含有醇氧化酶启动子(aox)。
在本发明的实施例中，构建的重组表达载体为ppiczαa-caifn-λ1。
本发明提供了含有所述基因或所述重组表达载体的宿主细胞。
优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。更优选地，所述毕赤酵母细胞为毕赤酵母菌株x-33。
本发明提供了上述密码子优化了的犬干扰素-λ1基因或所述重组表达载体或所述的宿主细胞在制备广谱抗病毒药物中的应用。
进一步地，所述病毒为犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、水泡性口炎病毒。
本发明提供了上述密码子优化了的犬干扰素-λ1基因或所述重组表达载体或所述的宿主细胞在制备广谱抗病毒制剂中的应用。
进一步地，所述病毒为犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、水泡性口炎病毒。
本发明提供了含有上述密码子优化了的犬重组干扰素-λ1基因或其编码蛋白的生物制剂或药物。
本发明还提供了一种制备犬干扰素-λ1的方法，是将核苷酸序列如seqidno.1所示的犬干扰素-λ1基因定向克隆至质粒中构建重组质粒，重组质粒转化至毕赤酵母感受态细胞，制备重组菌，通过确定甲醇诱导条件、诱导浓度、诱导时间，蛋白收获时间等优化酵母的发酵、表达，采用超滤浓缩后chelatingsff(ni)亲和层析的方法进行纯化，有效提高了产物的产量，从而获得高产量、高纯度的犬重组干扰素-λ1。
本发明确定重组酵母工程菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1的最佳诱导表达条件是，将克隆的重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值为2，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度1％。诱导培养96h后，收集培养上清液进行超滤浓缩后chelatingsff(ni)亲和层析的方法进行纯化。
在本发明的实施例中，是将密码子优化的犬ifn-λ1的基因定向克隆至ppiczαa中构建重组质粒ppiczαa-caifn-λ1，转化至trans5α感受态细胞中，从而获得重组菌。以含zeocin(25ug/ml)的低盐lb平板筛选转化子，并进行pcr鉴定，送公司测序。制备毕赤酵母菌株x-33的感受态细胞，将saci单酶切的线性化重组质粒经电穿孔转化至感受态细胞，涂板于md平板，30℃2-3天，挑单克隆点种至md和mm平板，筛选mut+型转化子，然后涂布于含100μg/ml、250μg/ml和500μg/mlzeocin的ypd平板，利用抗性筛选高拷贝的转化子。挑取单克隆接种于bmgy培养基中，30℃，250rpm/min培养18h左右，至菌体od600达到2～6，离心收集菌体，用bmmy培养基重悬，稀释至od600值为2.0左右，30℃，250rpm/min培养，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为0.5％、1％、1.5％、2％，并在0、24、48、72、96、120h分别取1ml菌液，以确定表达的最佳甲醇诱导浓度、最佳表达时间，实现重组酵母工程菌的诱导表达。sds-page分析及bca法对表达的目的蛋白进行定量。采用westernblot鉴定表达的目的蛋白。采用mdck-vsv系统测定犬重组干扰素-λ1的抗病毒活性。采用表达的犬重组干扰素-λ1按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天，用于预防及治疗犬的犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病。
本发明的有益效果在于：本发明应用毕赤酵母表达系统来表达犬重组干扰素-λ1，获得分泌表达的高活性犬重组干扰素-λ1，纯化后纯度达到0.86mg/ml，1l重组酵母工程菌的蛋白产量为42mg，抗病毒比活性为2.85×107iu/mg，能够有效预防和治疗犬瘟热、犬细小病毒、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等传染性疾病，具有较高的安全性，并可以大规模制备和纯化，应用前景良好。
附图说明
图1为ppiczαa-caifn-λ1载体的构建示意图。
图2为线性化的ppiczαa-caifn-λ1质粒电泳图，图中泳道1为ppiczαa-caifn-λ1质粒，泳道2为saci线性化的ppiczαa-caifn-λ1质粒，m:dl5000plusdnamarker。
图3为重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1的pcr鉴定结果。图中泳道1-5为克隆基因组dna的pcr扩增产物，n为毕赤酵母x33基因组dna的pcr产物(阴性对照)，p为ppiczαa-caifn-λ1质粒的pcr产物(阳性对照)，m:dl,2000dnamarker。
图4为重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1的表达产物的sds-page鉴定结果。泳道1-5为克隆株诱导72h时的培养上清(浓缩10倍)，n为阴性对照(x33诱导72h时的培养上清)，m为分子量marker。
图5为重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1的表达产物的westernblot鉴定结果。泳道1-5为克隆株诱导72h时的培养上清(浓缩10倍)，n为阴性对照(x33诱导72h时的培养上清)，p:anti-histagwesternblot阳性对照，m为分子量marker。
图6为犬重组干扰素-λ1蛋白纯化产物sds-page分析图。a:上样样品，b:穿透样品，c:50mm咪唑洗脱液1，d:50mm咪唑洗脱液2，e:500mm咪唑洗脱液1，f:500mm咪唑洗脱液2，g:500mm咪唑洗脱液3，h:500mm咪唑洗脱液2(非还原电泳)，m为分子量marker。
图7为犬重组干扰素-λ1蛋白纯化产物westernblot分析图。mk1:分子量marker(15-170kda)，mk2:分子量marker(20-120kda)1:anti-histagwesternblot阳性对照，2:westernblot阴性对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明所用生化试剂为市售可得。
实施例1编码犬干扰素-λ1的基因序列优化及引物的设计和合成
本发明根据genbank(no.ab819731.1)中犬干扰素-λ1的cdna序列，优化密码子，合成目的基因序列。编码犬干扰素-λ1的基因的密码子使用了毕赤酵母最偏爱的密码子。为了避免翻译出来的mrna的gc含量过高、mrna的二级结构影响翻译的效率，本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码，前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近，氨基酸序列原序列不变，在某些很特殊的情况下，为了减少或增加酶切位点，某些位置的序列做适当的序列调整。由此，本发明优化设计了犬干扰素-λ1基因(caifn-λ1)，其序列如seqidno.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。毕赤酵母通用引物5’aox和3’aox序列见seqidno.3和seqidno.4。
实施例2ppiczαa-caifn-λ1载体的构建
将实施例1的caifn-λ1基因片段与载体ppiczαa用xhoi和noti进行双酶切，回收双酶切片段，caifn-λ1基因片段与载体ppiczαa按3：1的摩尔比4℃连接过夜，转化至大肠杆菌感受态细胞dh5α，涂板于含zeocin(25ug/ml)的低盐lb平板上，37℃培养16-24h。挑取单菌落，提取质粒，进行pcr鉴定并送生工公司测序。ppiczαa-caifn-λ1载体的构建示意图见图1。
实施例3酵母细胞的电穿孔转化及高表达量转化子的筛选
挑取经pcr及测序正确的菌落进行扩大培养，选取碧云天的质粒中量抽提试剂盒(plasmidmidipreparationkit)，按照说明书进行质粒中抽。按invitrogenpichiaexpressionkit操作指南制备毕赤酵母x-33感受态细胞。使用saci对ppiczαa-caifn-λ1质粒进行线性化。线性化体系见表1。
表1
37℃过夜。线性化的ppiczαa-caifn-λ1质粒进行凝胶电泳，结果大小与预期一致，结果见图2。
取200μl感受态细胞与20μl(10～15μg)saci线性化的重组质粒ppiczαa-caifn-λ1混合，注入预冷的0.2cm电极杯中，冰上放置数分钟后，于bio-radgenepulser电转仪1680v，25pf，3000ω，5ms条件下电转化。电转化后，立即加入1ml预冷的1md-山梨醇，轻轻吹打数次，将电转后的酵母细胞转移至1.5ml的ep管中，冰上放置数分钟。将ep管放到30℃培养箱中孵育1h，取100μl菌液涂布于含100μg/ml、250μg/ml和500μg/mlzeocin抗性的ypd平板上，30℃倒置培养3天。
从ypd平板上挑选单菌落做pcr鉴定，接种于含zeocin的ypd培养基中，30℃摇床中，250r/min培养24h左右后，取1ml菌液保种。另取1ml菌液至1.5mlep管中提取酵母x33基因组，具体步骤为：离心收集酵母细胞x33，用200μltebuffer重悬，加入1％(v/v)e巯基乙醇和1％(v/v)蛋白酶k，50℃水浴消化3h左右，期间不时摇晃。加入200μl氯仿和200μl苯酚，涡旋数秒。12000rpm，离心5min，小心吸取上层液体，加入2倍体积无水乙醇沉淀回收。
选用5’aox和3’aox通用引物(seqidno.3-4所示)进行鉴定。反应体系见表2：
表2
pcr反应条件：预变性，96℃5min；变性94℃20s，退火55℃20s，延伸72℃20s，共35个循环；72℃5min。
将5μlpcr产物与1μlloadingbuffer混匀后，用1.0％的琼脂糖凝胶核酸电泳，120v，35min，紫外凝胶成像仪下观察电泳结果。如图3所示，结果显示1-5克隆的pcr产物与预期大小一致。对1-5克隆的pcr产物进行测序，与目的基因同源性为100％。
实施例4酵母高拷贝筛选
用zeocine进行高拷贝筛选，将ypds平板上的酵母阳性单菌落，转移至含800μg/mlzeocine的ypd板上，30℃培养3天后进行表达和阳性鉴定。
实施例5重组酵母工程菌的诱导表达及鉴定
将5个阳性克隆的重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1和空载体转化酵母菌x-33/ppiczαa单克隆分别接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为2-6，1500～3000g，室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬，od600值为2左右，28，00℃，250rpm/min培养4～5d，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％。诱导培养结束后，收集培养上清液进行超滤浓缩，然后将样品加入等体积的2×loadingbuffer，100℃煮沸10min，取10μl样品上样，进行sds-page电泳及westernblot检测。sds-page(图4)及westernblot(图5)检测结果表明：分泌上清经超滤浓缩后，在22kd左右可见一条明显的目的条带，目的蛋白获得分泌表达。根据1-5克隆表达量，可见3号克隆具有较高的表达，因此，选定3号克隆用于后续实验。
为了确定甲醇诱导条件，将3号克隆的重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值分别为1、2，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度1％。诱导培养96h后，收集培养上清液进行超滤浓缩，然后将样品加入等体积的2×loadingbuffer，100℃煮沸10min，取10μl样品上样，进行sds-page电泳和灰度分析。
表3
为了确定甲醇诱导浓度，将3号克隆的重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值为2，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％。诱导培养96h后，收集培养上清液进行超滤浓缩，然后将样品加入等体积的2×loadingbuffer，100℃煮沸10min，取10μl样品上样，进行sds-page电泳和灰度分析。
表4
为了确定蛋白最佳收获时间，将3号克隆的重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值为2，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度为1％。诱导培养48h、72h、96h、120h后，收集培养上清液进行超滤浓缩，然后将样品加入等体积的2×loadingbuffer，100℃煮沸10min，取10μl样品上样，进行sds-page电泳和灰度分析。
表5
以上条件优化结果表明，将菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值为2时优于1因此，优选2。甲醇的诱导浓度在1％和1.5％和2％时差异不显著，优于0.5％，因此优选1％。蛋白在96h和120h收获时差异不显著，优于48h和72h，因此优选96h为蛋白的最佳收获时间。
综合所述，重组酵母工程菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1的最佳诱导表达条件是，将3号克隆的重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值为2，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度1％。诱导培养96h后，收集培养上清液进行超滤浓缩。实施例6重组ppiczαp-caifn-λ1的纯化及bca法蛋白定量
将3号克隆重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于20-30mlypd培养基中，30℃250rpm/min培养16～18h左右，至菌体od600值为6左右时，分别1500～3000g室温离心5min，弃去培养基，收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬至od600值为2，28℃，250rpm/min培养，且每隔24h补加甲醇，甲醇终浓度1％。诱导培养96h后，4℃12000rpm/min离心10min，收获培养上清，用3k超滤浓缩管进行浓缩约10倍，经0.45μm的滤器过滤后，用chelatingsff(ni)亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤为：
平衡凝胶介质：用10个柱体积的平衡缓冲液buffera(20mmpb,150mmnacl,ph7.4)平衡柱子；
将上清液透析至buffera后，加入纯化柱中；
调整核酸蛋白检测仪，调整流速为2mg/ml；
排净柱子中的buffer，收集流穿液；
用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗柱子；
调整流速为1mg/ml；采用不同咪唑浓度(50mm，500mm)的洗脱液(20mmpb,150mmnacl,500mmimidazole,ph7.4)进行梯度洗脱。洗脱杂蛋白，收集流分；
蛋白纯化完毕后，用平衡缓冲液buffera将柱子平衡20min，流出液体，最后用20％乙醇清洗柱子。
将纯化过程中收集的组分经过sds-page分析，显示本实施例获得的犬重组干扰素-λ1蛋白得到很好的纯化，见图6，泳道e、f、g为ni富集的犬重组干扰素-λ1蛋白。
将e500洗脱组分(泳道e、f、g)进行合并，浓缩，透析到pbs，ph7.4缓冲体系中，thermobca法蛋白定量，纯化后的犬重组干扰素-λ1蛋白浓度为0.43mg/ml。
sds-page检测结果显示：重组菌株表达的犬重组干扰素-λ1蛋白分子量在22kd左右，分子量大小与预期的目的蛋白大小一致，应用凝胶成像系统软件进行扫描分析结果表明目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的32％，具有较好的表达量。
实施例7表达产物的westernblot鉴定
将实施例6纯化后的犬重组干扰素-λ1加入等体积2×loadingbuffer，100℃煮沸10min，取10μl煮沸后样品上样，选用15％的sds-page凝胶电泳，电泳后的聚丙烯酰胺凝胶通过电湿转移系统(bio.rad)以300ma，60min的参数电转移至pvdf膜上。电转完毕，用tbst洗膜然后置于一封闭的塑料袋中，加入含5％脱脂奶粉的tbsa中37℃封闭2h；用tbst洗膜，加入anti-his单克隆抗体，4℃孵育过夜；用tbst洗膜，加入含1:5000稀释的hrp-山羊抗小鼠的单克隆抗体37℃孵育1h；用tbst洗膜，tmb单组份显色液显色，待蛋白带的颜色达到要求(约10-30min)，以自来水终止显色反应，拍照记录。如图7所示。
western-blot结果显示：表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在22kd处有较为明显的反应条带，与sds-page结果一致，说明该表达产物具有良好地免疫反应性。
实施例8犬重组干扰素-λ1的抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法，在mdck-vsv系统上测定实施例6纯化获得的犬重组干扰素-λ1的抗病毒活性。将mdck细胞以2×104cells/孔的密度铺于96孔细胞培养板中，37℃、5％co2条件下培养4-6h，待细胞贴壁后，分别加入用测定培养液(含7％fbs的dmem)倍比稀释后的犬重组干扰素-λ1和空载体表达蛋白做阴性对照，空白对照，平行三个重复，37℃、5％co2条件下培养18-24h后，弃掉上清，pbs洗涤三次，用攻毒培养液(含2％fbs的dmem)稀释vsv，将vsv以100tcid50的攻毒剂量感染mdck细胞，每孔100μl，同时设置阳性对照(只加vsv)、蛋白对照(只加犬重组干扰素-λ1后换成完全培养液，37℃、5％co2条件下培养24h，观察细胞半数病变数量，以出现50％细胞病变的最高稀释度为一个干扰素单位(iu)。按照reed-muench法计算犬重组干扰素-λ1的活性(iu/mg)。结果表明犬重组干扰素-λ1的抗病毒活性为8×106u/ml，比活性为2.85×107iu/mg。可见本发明的犬重组干扰素-λ1具有较好的体外抗病毒活性。
实施例9重组酵母工程菌的放大表达
将3号克隆重组菌x-33/ppiczαa-caifn-λ1接种于25ml的bmgy培养基中，30℃，250rpm/min培养16-18h左右，至菌体od600值为2-6，1500-3000g，室温离心5min收集菌体。菌体沉淀用20mlbmmy培养基重悬，od600值为2左右，28-30℃，250rpm/min培养16～18h。1500-3000g室温离心5min，收集菌体。菌体沉淀用1lbmmy培养基重悬，od600值为2左右，28-30℃，250rpm/min培养4～5d，每隔24h补加甲醇至终浓度为1％。培养96h后4℃12000rpm/min离心10min收获培养上清，采用3k超滤浓缩杯进行浓缩后，经0.45um的滤器过滤后，用akta蛋白纯化仪进行亲和层析，纯化后的蛋白经过sds-page纯度分析，thermobca法蛋白定量，纯化后的犬重组干扰素-λ1为0.86mg/ml，1l重组酵母工程菌的蛋白产量为42mg。
实施例10犬重组干扰素-λ1预防及治疗效果评价
采用实施例9表达、纯化的犬重组干扰素-λ1进行按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天为一个疗程，通过症状观察、临床检测等评价其用于预防及治疗犬的犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病的效果，结果显示犬重组干扰素-λ1可以有效预防及治疗犬的犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病，注射犬明显出现症状减轻、食欲恢复，死亡率降低，排毒减少。
表6为对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病临床病例采用犬重组干扰素-λ1按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天进行治疗后，观察病犬的症状、食欲，排毒情况，死亡率。
表6犬重组干扰素-λ1治疗效果评价表
表7为采用犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒人工感染60-70日龄实验犬，在感染前24h开始，采用犬重组干扰素-λ1按照20万iu/kg剂量皮下注射病犬，连续注射6天进行预防后，观察攻毒犬的症状、食欲，排毒情况，死亡率。
表7犬重组干扰素-λ1预防效果评价表
犬瘟热症状打分：体温升高/起伏不定，双相热，精神沉郁，食欲差，眼结膜发红、眼睑肿胀，分泌出水样分泌物，鼻头发干，流出水样分泌物。少数病例可见足掌皮肤角化过渡性病变。出现咳嗽，肠胃型感染的出现呕吐、腹泻，约有10～30％的病犬出现神经症状(痉挛、癫痫、抽搐等)。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
肠炎型犬细小病毒病症状打分：肠炎病犬初期精神沉郁，厌食，偶见发热，软便或轻微呕吐，随后发展成为频繁呕吐和剧烈腹泻。起初粪便呈灰色，黄色或乳白色，带果冻状粘液，其后排出恶臭的酱油样或番茄汁样血便。病犬迅速脱水，消瘦，眼窝深陷，被毛凌乱，皮肤无弹性，耳鼻，四肢发凉，精神高度沉郁，休克，死亡。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
犬副流感病毒病症状打分：发热、咳嗽、流涕，病犬疲软无力，体温升高至40℃以上，病犬后肢可支撑躯体，但不能行走。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
犬传染性肝炎症状打分：病犬精神沉郁，流水样或脓性鼻液，结膜发炎，羞明流泪。口腔及齿龈出血或见出血点，体温升高，呼吸加快，心跳快，节律不齐。咳嗽。有的病犬呕吐或排稀便。根据症状从重到轻依次打分为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0。
食欲打分标准：食欲正常5分，食欲稍差4分，食欲较差3，食欲较少2，基本无食欲1分，食欲废绝0分。
综合以上犬重组干扰素-λ1对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病临床预防/治疗情况，犬重组干扰素-λ1注射犬明显出现症状减轻、食欲恢复，死亡率降低，排毒减少。表明犬重组干扰素-λ1对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎等疫病具有较好的预防/治疗作用，可进行临床使用。
虽然，上述文字已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120>犬重组干扰素-λ1及其制备方法与应用
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