本发明涉及一种辅助诊断多发性骨髓瘤的检测试剂盒，特别是一种基于vdr基因多态性辅助诊断多发性骨髓瘤的检测试剂盒、其用途及其制备方法。
背景技术：
多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是一种恶性克隆性浆细胞病，好发于中老年人，男性比女性多见，主要特征是单克隆恶性浆细胞瘤在骨髓内增殖、浸润，导致正常多克隆浆细胞及其功能受到抑制，引起溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾功能不全及反复感染等临床表现。该病有发病率高、不可治愈、早期易误诊、发病机制不清、预后极差的特点。流行病学研究数据表明，mm发病约占血液肿瘤的10％，仅次于淋巴瘤而高于白血病,占所有恶性肿瘤致死的2％。美国年发病率约为4.3/10万，我国低于欧美各国，约为1/10万，我国发病的平均年龄57.5岁，较欧美各国明显提前，但我国人口基数大，总发病人数更多。mm平均生存年限3-4年，随着新药(硼替佐米、沙利度胺、来那度胺等)和自体外周血干细胞移植的运用，生存时间有所增加，但大部分病人最终仍然会出现复发耐药。该病起病缓慢，临床表现复杂，无明显病因，缺乏人群筛查的标志指标，早期诊断率低，易误诊为肾病骨病等常见病、多发病，致使错失或延误治疗时机.
多发性骨髓瘤易感性的研究，对实现早诊断早治疗以及提高患者生存意义甚大。目前国内外诊断主要依据骨髓穿刺涂片或骨髓病理活检、血尿免疫固定电泳、影像学x线和ct检查等。然而骨髓穿刺是有创性的操作，若作为筛查指标，普通人群可接受性不高。血尿免疫固定电泳虽是无创性检查，但在发病前常正常，且费用较高，实验仪器及技术要求高而不易推广。
技术实现要素：
本发明研究发现，维生素d受体(vitamindreceptor，vdr)基因bsmi位点a等位基因及taqi位点c等位基因，为mm的高风险性等位基因。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)检测技术简单、成熟。鉴于上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于vdr基因多态性检测、可用于判断多发性骨髓瘤高危个体的无创基因检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒具有检测准确、迅速、使用方便、成本不高等优点，临床上可以作为检测多发性骨髓瘤患病风险的常规项目普及，弥补检测项目的空缺，实现多发性骨髓瘤的人群筛查。
本发明的一个方面，提供了一种vdr基因多态性检测试剂盒，该试剂盒可用于判断多发性骨髓瘤高危个体的无创基因检测。
优选的，该试剂盒包括超纯水、pcr缓冲液、pcr引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dntpmixture)、dna聚合酶和阳性对照品，其中的pcr引物包括vdr基因上的2个snp位点上的不同基因型的正反向扩增引物。
优选的，vdr基因上的2个snp位点包括为bsmi位点和taqi位点。
优选的，bsmi位点的上游引物(5’-3’)为caaccaagactacaagtaccgcgtcagtga(seqidno：1)；下游引物(5’-3’)为aaccagcggaagaggtcaaggg(seqidno：2)；
优选的，taqi位点的上游引物(5’-3’)为agagcatggacagggagcaag(seqidno：3)，
下游引物(5’-3’)为gcaactcctcatggctgaggtctca(seqidno：4)。
本发明的一个方面，提供了一种vdr基因多态性检测试剂盒的检测方法，该方法包括以下步骤:(1)以200μl外周血样本提取的dna为样本模板进行pcr反应(2)产物检测，进行pcr产物的纯化和测序，将检测到的测序结果导入到分析软件中进行分析(运用chromas程序分析)，获得vdr基因的snp位点的等位基因型。
优选的，pcr反应体系各成分组成如下所示：
pcr反应条件：90-100℃预变性2-8分钟；然后进行20-40个循环扩增，每个循环包括：90-100℃变性20-60秒，55-65℃退火20-60秒(bsmi、taqi分别对应55-65℃)，60-80℃延伸30-80秒；反应完成后，60-80℃延伸3-8分钟；2-8℃下收集产物。pcr产物2-8℃保存。
更为优选的，pcr反应体系各成分组成如下所示：
pcr反应条件：94℃预变性5分钟；然后进行30个循环扩增，每个循环包括：94℃变性30秒，60.8-61.5℃退火30秒(bsmi、taqi分别对应61.5℃、60.8℃)，72℃延伸60秒；反应完成后，72℃延伸5分钟；4℃下收集产物。pcr产物4℃保存。
本发明的有益效果和显著进步在于：(1)为无创检测，所需样本量少，一般人群接受度高；
(2)适用于多种样本类型：本发明不仅能检测常规的edta抗凝的全血细胞dna，还能检测口腔拭子，检测结果准确度高。(3)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。(4)安全，整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。(5)成本低，易于操作，可作为普通人群的肿瘤筛查指标而推广。
具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：一种vdr基因多态性检测试剂盒
一种vdr基因多态性检测试剂盒，包括超纯水、10xpcr缓冲液，pcr引物、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dntpmixture)、dna聚合酶和阳性对照品，其中的pcr引物包括以下vdr基因上的2个snp位点上的不同基因型的正反向扩增引物，其基因序列如:
pcr引物
bsmi位点
上游引物(5’-3’)caaccaagactacaagtaccgcgtcagtga(seqidno：1)，下游引物(5’-3’)aaccagcggaagaggtcaaggg(seqidno：2)；taqi位点
上游引物(5’-3’)agagcatggacagggagcaag(seqidno：3)，
下游引物(5’-3’)gcaactcctcatggctgaggtctca(seqidno：4)
实施例2：vdr基因多态性检测试剂盒的检测方法
vdr基因多态性检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤:(1)以200μl外周血样本提取的dna为样本模板进行pcr反应,聚合酶链反应(pcr)反应体系如下：
pcr反应体系各成分组成
pcr反应条件：94℃预变性5分钟；然后进行30个循环扩增，每个循环包括：94℃变性30秒，60.8-61.5℃退火30秒(bsmi、taqi分别对应61.5℃、60.8℃)，72℃延伸60秒；反应完成后，72℃延伸5分钟；4℃下收集产物。pcr产物4℃保存。(2)产物检测，进行pcr产物的纯化和测序，将检测到的测序结果导入到分析软件中进行分析(运用chromas程序分析)，获得vdr基因的snp位点的等位基因型。
以上所述，仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。