一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用的制作方法

本发明属于恶性肿瘤生物免疫药物技术领域，特别涉及一种用于肿瘤个体化生物免疫治疗的抗原肽链组及其在药物中的应用。

背景技术：

目前，全球恶性肿瘤发病率日趋上升，死亡率高，预后差。国家癌症中心全国肿瘤防治研究办公室在《国际癌症杂志》发布中国最大规模癌症生存数据汇总分析数据显示，中国癌症5年生存率为30.9％，远低于发达国家水平；同时农村患者的生存率仅为城市患者的一半。在发达国家，前列腺癌、乳腺癌占多数，在中国，肺癌、胃癌、肝癌等癌症更为常见，发病率和死亡率最高的癌症是肺癌。手术、化疗、放疗等传统治疗方法治疗效果有限，患者5年生存率仍较低；尤其是放化疗副反应大，患者生活质量差，生存率低。

生物免疫治疗通过机体免疫系统性杀伤肿瘤细胞，是未来治疗肿瘤新的治疗方法，现已逐渐成为治疗肿瘤的热点。目前生物免疫治疗肿瘤的方法较多，包括普通的cik细胞免疫治疗，dc用药治疗等，但其治疗效果并不显著，患者生存率没有得到明显提高。另有以非突变肿瘤高表达蛋白刺激的免疫细胞用药，研究有抗肿瘤免疫反应，但由于其非特异性表达，固然有副反应存在，包括视力模糊、听力下降、皮疹等。

生物免疫治疗的本质是主要通过机体免疫系统来杀伤肿瘤细胞，其中直接发挥作用的是杀伤性t细胞，而树突状细胞(dcs)是抗原提呈细胞(apcs)，主要功能是将抗原信息提呈给t细胞。人们认为，某些自身免疫应答是由于微环境组织损伤导致局部dc激活，然后与t细胞相互作用，从而引发免疫应答。因此，dcs引发t细胞应答的能力可被用于肿瘤用药中。体外用一些肿瘤相关高表达蛋白诱导产生dcs，并输回患者体内，用作为肿瘤相对特异的t细胞诱导中的apcs。动物模型已经证实，dc肿瘤用药使t细胞的无反应性逆转并导致接下来的抗肿瘤效应。然而，肿瘤相关高表达蛋白诱导产生的dcs并不具有严格的特异性，肿瘤以外的组织细胞也表达同样的蛋白，因此，其副反应是个难题。

肿瘤是细胞无限制增生的结果，而细胞的生长是由基因决定的。人体内存在肿瘤基因和肿瘤抑制基因两大功能相异的基因群。肿瘤的发生是由于肿瘤基因功能上调、肿瘤抑制基因功能受抑的结果。各种外界因素如放射线、致癌化学物、病毒等均是通过对基因的改变来诱生肿瘤的，基因的改变包括碱基突变、碱基交联、dna断裂、dna缺失等各种dna损伤。基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗，是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，直接针对疾病的根源——异常的基因本身而发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的；基因治疗产品进入细胞后再产生目的蛋白质或多肽，从而发挥特异的生物治疗作用。临床实验证明，基因治疗的疗效比单纯放、化疗疗效高出数倍；治疗非小细胞癌时，60％的患者肿瘤完全消退或部分消退；对乳腺癌的疗效更是高达90％。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于肿瘤个体化生物免疫治疗的抗原肽链组及其在药物中的应用，本发明的抗原肽链组能诱导产生肿瘤的树突状细胞，因而作为抗原呈递细胞的树突状细胞能将抗原信息呈递给t细胞，从而与t细胞相互作用，使t细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞，起到杀伤肿瘤细胞的作用。

为此，本发明技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种治疗肿瘤的抗原肽链组，所述治疗肿瘤的抗原肽链组包括seqidno：1-27中的任意一种或至少两种氨基酸序列的组合，例如可以是seqidno：1-27中的任意一条、任意两条、任意三条、任意四条、任意五条直至任意26条或全部27条的组合，由于篇幅的限制在此不再全部列举。

具体序列如下：

seqidno：1——stvqlim

seqidno：2——tvqlimq

seqidno：3——vqlimql

seqidno：4——qlimqlm

seqidno：5——limqlmp

seqidno：6——imqlmpf

seqidno：7——mqlmpfg

seqidno：8——stvqlimq

seqidno：9——limqlmpf

seqidno：10——imqlmpfg

seqidno：11——tstvqlimq

seqidno：12——qlimqlmpf

seqidno：13——mqlmpfgcl

seqidno：14——cltstvqlim

seqidno：15——vqlimqlmpf

seqidno：16——qlimqlmpfg

seqidno：17——icltstvqlim

seqidno：18——tstvqlimqlm

seqidno：19——stvqlimqlmp

seqidno：20——tvqlimqlmpf

seqidno：21——vqlimqlmpfg

seqidno：22——qlimqlmpfgc

seqidno：23——gicltstvqlim

seqidno：24——tstvqlimqlmp

seqidno：25——tvqlimqlmpfg

seqidno：26——imqlmpfgclld

seqidno：27——mqlmpfgclldy

第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的seqidno：1-27中的任意一种或至少两种氨基酸序列。

优选地，所述药物组合物为水性悬浮、溶液或固体状态。

优选地，所述固体状态为未包衣或包衣片剂形式，例如丸剂、凝胶胶囊、胶囊或粉末等。

如果所述药物组合物处于干燥状态，则它可以与一种或多种惰性稀释剂例如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅等混合。它在干燥状态下还可以包含其他物质，例如一种或多种润滑剂如硬脂酸镁或滑石粉、着色剂、包衣(糖包衣片剂)或清漆。如果本发明的药物组合物是液体形式，则它可以包括含有惰性稀释剂例如水、乙醇、甘油、植物油或液体石蜡的可药用的溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂和酏剂。所述药物组合物还可以包含除稀释剂以外的其他液体物质，例如润湿剂、甜味剂、增稠剂、调味剂或稳定剂产品。

优选地，还包括药学上接受的辅料。

优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是赋形剂，载体和稀释剂，调味剂、粘合剂和填充剂，或者稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂的组合，由于篇幅的限制，所有组合的形式不再一一列举。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的治疗肿瘤的抗原肽链组在制备治疗癌症的药物组合物中的应用。所述癌症为任意种类的癌症(即实体性恶性肿瘤)，因为本发明的抗原肽链组能诱导产生肿瘤特异性的树突状细胞，因而作为抗原呈递细胞的树突状细胞能将抗原信息呈递给t细胞，从而与t细胞相互作用，使t细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用。

在本发明中，所述癌症优选为肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、脑瘤、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、皮肤癌、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、骨软骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、精原细胞瘤、睾丸肿瘤、子宫癌、头颈肿瘤、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、真性红细胞增多症、白血病、甲状腺肿瘤、输尿管肿瘤、膀胱肿瘤、胆囊癌、胆管癌、绒毛膜上皮癌或儿科肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。另外，所述药物组合物还可与另一种或至少两种抗癌剂联合应用，例如芳香化酶抑制剂(来曲唑和/或阿那曲唑)等。

所述药物组合物可被单独使用或在给定的治疗中与其他药物联合使用，或者与放射疗法或手术联合。具体使用方法为：

(一)体内刺激法：

将所述治疗肿瘤的抗原肽链组溶解于ph值为7.4pbs(hyclone)溶液中，浓度调至2.5mg/ml，每次上臂皮下注射200ug后覆盖5％aldaracream(inovapharmaceuticalsaustraliaptyltd.)，每周一次，12周为一个周期。

(二)体外刺激法：

(1)第0天

使用cobespectra血液分析系统(caridianbct，inc.)进行单核细胞分离采集过滤血量2500-3500ml；准备2ml无菌样本，分1ml进行细胞计数，并进行活性检测(流式/7-add)；计算分离dc细胞样本的体积：总有核细胞7×10⁹/计算浓度；把细胞转入300ml的转移袋内，转移至gmp实验室；准备1ldc-cm培养液，500ml×2份；用60ml的注射器把样本从转移袋移出，并分装在4个200ml的离心管内；每管加入100-150mlhbss，合上盖，并轻轻混匀；降速离心，15min，800rpm(137xg)，室温；用2ml无菌枪头转移上清液，重悬细胞在100-150mlhbss，封盖，混匀；低速离心10min，1000rpm(214xg)，室温；用2ml无菌枪头转移上清液，重悬细胞于30mldc-cm培养液中；将细胞从4个离心管转移至500ml离心管内，并用10mldc-cm冲洗原离心管，并转入500ml离心管，封盖，混匀；用3ml注射器转移0.5ml至12×75mm小管内，进行计数；计算需要的培养瓶数：tnc/1.75×10⁸＝需要的培养瓶数；计算dc-cm的体积需要量：(加到稀释细胞的体积1.75×10⁷/ml)：培养瓶需要的数量×10mldc-cm＝需要的dc-cm体积；用25ml吸管，加15mldc-cm至每一个培养瓶；用10ml或25ml吸管，加10ml重悬好的样本(1.75×10⁷/ml)到每一个培养瓶，用盖封紧；摇匀培养瓶，使液体铺满整个瓶底；把培养瓶放到培养箱内(37℃，5％co2；±10℃，±0.5％co2)，2小时30min±，让细胞贴壁；把imdm放入培养箱(37℃，5％co2；±10℃，±0.5％co2)，用35mlimdm冲洗培养瓶2次；需要的imdm体积＝培养瓶数量×70mlimdm；冲洗培养瓶以后，加50ml细胞因子的dc-cm：需要的imdm＝培养瓶数量×50ml；加入il-4和gm-csf的浓度都是1000iu/ml；稀释il-4，用1％has在pbs里面至1000iu/ml；每次操作5-10个培养瓶以减少暴露于空气中的时间；把培养瓶从培养箱中拿出，轻轻摇晃培养瓶；用2ml吸管吹掉贴壁的细胞；35ml温imdm到每一个培养瓶，注意：从瓶壁的无细胞的一侧加。松一下瓶盖，轻轻瑶培养瓶，使仍贴壁的细胞下来。轻轻瑶培养瓶，避免细胞贴在壁上。放平培养瓶。用2ml吸管，转移imdm，注意倾斜培养瓶。用35mlimdm再冲洗一次。加50ml含有细胞因子的dc-cm到每一个培养瓶，封盖。轻轻放平培养瓶，使液体盖住瓶底。把培养瓶放入培养箱(37℃，5％co2；±10℃，±0.5％co2)。

(2)第6天：加成熟混合液

用1％hsa-pbs稀释il-1β、inf-α、il-6至25ug/ml；如果培养瓶数量少于50，配制50个培养瓶的细胞因子；终浓度：il-1β10ng/ml、inf-α10ng/ml、il-615ng/ml。稀释细胞因子于44mldc-cm，至最后体积50ml。用无菌吸管吸1ml含有细胞因子的dc-cm至每一个培养瓶。混匀培养瓶内的液体(加入细胞因子后)。把培养瓶放入培养箱(37℃，5％co2；±10℃，±0.5％co2)。

(3)第7-8天：准备肽链脉冲培养液(ppm)

计算需要的ppm的量：培养瓶数量x30ml+300ml＝需要的ppm的量；将培养瓶从培养箱取出，将瓶内细胞转移至500ml无菌离心管。(用25ml吸管或直接倒入，3个培养瓶转入一个500ml离心管)。用吸管吸1ml至12×75mm管进行计数，并进行支原体、衣原体检测。降速离心1200rpm(309xg)，7min，室温(多个管的话，同时离心)。用30mlppm冲洗培养瓶，并把冲洗液转入500ml离心管。降速离心冲洗液，1200rpm(309xg)，7min，室温。用2ml吸管移走冲洗液和收获管的上清液，用10mlppm重悬细胞。转移收获管dc细胞到一个新的200ml离心管。转移冲洗管dc细胞到一个新的200ml离心管。降速离心，1200rpm(309xg)，7min，室温；用2ml吸管转移所有的上清，并用25mlppm重悬细胞，将收获的收获管dc细胞和冲洗管dc细胞合并入同一管，注明：dc细胞管。封盖，离心并混匀。取出1管冻存的一组个体化特异性突变肽链，用dc-ppm溶解肽链。加肽链至dc管，浓度为5ug/ml。松盖后放入培养箱(37℃，5％co2；±10℃，±0.5％co2)，每30min取出培养箱，混匀，总时间1.5小时。取0.2ml重悬的dc细胞，转移至12×75mm管中，进行内毒素检测评估。降速离心，1200rpm(309xg)，7min，室温。用2ml吸管去掉上清液。收获个体化特异性dc细胞，计数并溶解于1mlpbs溶液中。肿瘤引流淋巴结或其他内注射。

与现有技术相比，本发明提供的用于肿瘤个体化生物免疫治疗的抗原肽链组至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用，所述治疗肿瘤的抗原肽链组包括seqidno：1-27中的任意一种或至少两种氨基酸序列的组合。本发明的抗原肽链组能诱导产生肿瘤的树突状细胞，因而作为抗原呈递细胞的树突状细胞能将抗原信息呈递给t细胞，从而与t细胞相互作用，使t细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞，起到杀伤肿瘤细胞的作用。用药至少6周后，通过仪器能明显观察到肿瘤大量消失，密度变淡，变化明显；副作用发生率小，对患者的伤害较少。

附图说明

图1为实施例1用药前后hla*a3101—hvkitdfgrtetramer染色图；

图2为实施例1用药前后的肿瘤ct扫描图；

图3为实施例2用药前后的肿瘤ct扫描图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。

实施例1

患者a，女，47岁。肺鳞状细胞癌，肝转移，临床iv期，肺部肿瘤碘125粒子植入治疗1次，吉西他滨单药化疗3次后进展，肝转移瘤化疗栓塞治疗后进展，egfr分子靶向药耐药。肺内多发转移，肝转移，胸膜转移，骨转移，腹腔淋巴结转移。取肺部病灶组织活检，进行全外显子测序及hla分型芯片检测后，患者携带egfrp.t790m，hla分型为hla-a：a*0216a*3002；hla-b:b*1502b*5801；hla-c：c*0303c*1203；hla-dqb1：dqb1*0401dqb1*0602；hla-drb1：drb1*1101drb1*1501。

使用本发明的特异性肿瘤抗原肽链组合治疗，每周1次，共6周。检测注射抗原肽链组(以下简称“用药”)前后斑点检测特异性cd8+tetramer+t细胞分泌情况，以及通过影像学观察用药前后6周的肿瘤大小变化，结果如图1和图2所示。具体的肽链选择如下：

a)tvqlimq

b)limqlmp

c)stvqlimq

d)limqlmpf

e)tstvqlimq

f)qlimqlmpf

g)cltstvqlim

h)qlimqlmpfg

i)icltstvqlim

j)tvqlimqlmpf

k)tvqlimqlmpfg

图1为hla*a3101—hvkitdfgrtetramer染色图，其中，图1-a为用药前染色图，cd8+tetramer+t浓度为1.5％；图1-b为用药3周后染色图，cd8+tetramer+t浓度为1.7％；图1-c为用药6周后染色图，cd8+tetramer+t浓度为3.8％；从三组图中可以看出，斑点数量有明显升高的变化趋势，说明血液中肿瘤杀伤细胞cd8+tetramer+t的比例(浓度)明显提高。

图2为用药前后肺部肿瘤ct图，其中图2-a为用药前ct图，纵膈肿瘤面积为2cm×3cm；图2-b为用药6周后ct图，可以看出肿瘤基本消失。

综合以上结果表明，本发明的抗原肽链组能诱导产生肿瘤的树突状细胞，作为抗原呈递细胞的树突状细胞能将抗原信息呈递给t细胞，与t细胞相互作用，使t细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞，起到杀伤肿瘤细胞的作用，且效果明显。

实施例2

患者b，男，70岁，右肺腺癌，多发淋巴结转移，无手术适应症，培美曲塞+顺铂静脉化疗6个周，培美曲塞化疗1个周期后进展，碘125粒子植入术后进展。进行全外显子测序及hla分型芯片检测后，结果显示患者携带egfrp.t790m突变，hla分型为hla-a：a*0202a*0212；hla-b:b*0702b*0808；hla-c：c*0401c*0701；hla-dqb1：dqb1*030302dqb1*0601；hla-drb1：drb1*0401drb1*1002。

使用本发明的治疗肿瘤的抗原肽链组进行组合治疗，每周1次，共12周。具体选择的肽链如下：

a)mqlmpfgclldy

b)tstvqlimqlmp

c)gicltstvqlim

d)tstvqlimqlm

e)qlimqlmpfgc

f)vqlimqlmpf

g)qlimqlmpf

h)imqlmpfg

i)mqlmpfg

j)mqlmpfgcl

治疗前后肺部肿瘤大小变化情况如图3所示，由图3可见，用药治疗前，右肺肿瘤大小4×6cm(图3-a)；用药治疗后3周，右肺肿瘤基本消失(图3-b)，肿瘤较用药前明显缩小，密度变淡。本实施例说明本发明的抗原肽链组能诱导产生肿瘤的树突状细胞，作为抗原呈递细胞的树突状细胞能将抗原信息呈递给t细胞，与t细胞相互作用，使t细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞，起到杀伤肿瘤细胞的作用，且效果明显。

实施例3-50

实施例3-50取不同种类，不同程度的癌症患者，分别使用不同的抗原肽链组的组合形式进行治疗，每周一次，共12周。实施例3-50的hla*a3101—hvkitdfgrtetramer染色结果和治疗前后肺部肿瘤大小变化情况与实施例1-2类似，由于篇幅的限制，在此不再重复赘述。以上结果均可说明本发明的抗原肽链组能诱导产生肿瘤的树突状细胞，作为抗原呈递细胞的树突状细胞能将抗原信息呈递给t细胞，与t细胞相互作用，使t细胞产生特异性杀伤肿瘤细胞，起到杀伤肿瘤细胞的作用，且效果明显。

在对实施例1-50进行治疗期间，用elisa检测用抗原肽链前、用药3周、7周、11周的特异性ifn-γ分泌情况，具体结果如表1所示。

对比例1-10

在对对比例1-10进行治疗期间，用elisa检测用药前、用药3周、7周、11周的特异性ifn-γ分泌情况，具体结果如表1所示，用药量与实施例1-50相同；其中，对比例1-5不加入肽链。

从表1可以看出，实施例1-50在用药后11周，t细胞分泌的特异性ifn-γ水平具有明显升高的趋势，说明使用了本发明的抗原肽链组中的任意一条或其任意组合都能增加癌症患者外周血的肿瘤杀伤能力，进一步证明了本发明的效果。而对比例1-10中，ifn-γ水平在用药前后也有所增加，可能是加入的营养成分作用的结果，但总体来看浓度的增量远低于实施例1-50，说明其并未增加患者外周血的肿瘤杀伤能力或血液杀伤肿瘤的能力远低于实施例1-50，进一步证明了本发明的效果。

表1ifn-γ分泌统计列表

随后，对实施例1-50的副反应发生率进行了统计，结果如表2所示，从表2可以看出，在使用了本发明的抗原肽链组后，副反应的发生率(即阳性比率)较低，说明其副作用较小，对患者的影响和伤害较低。

表2副反应发生率统计结果

应该注意到并理解，在不脱离后附的权利要求所要求的本发明的精神和范围的情况下，能够对上述详细描述的本发明做出各种修改和改进。因此，要求保护的技术方案的范围不受所给出的任何特定示范教导的限制。

申请人声明，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。