本发明涉及家畜胚胎工程技术领域，尤其涉及一种牛卵母细胞体外成熟培养液，以及使用该培养液培养牛卵母细胞的方法。
背景技术：
卵母细胞体外成熟培养是体外受精、体细胞核移植、动物胚胎体外生产和转基因克隆等胚胎工程技术的基础和关键环节，卵母细胞的成熟质量直接决定了在受精或核移植后胚胎的发育潜能。卵母细胞体外成熟不仅受到卵巢周期、动物品种、卵泡大小、激素、血清等多种因素影响，而且与卵母细胞体外成熟的程序和方法及培养液成分密切相关，虽然卵母细胞体外成熟技术取得较大的进步，但目前体外成熟卵母细胞在发育能力上明显低于体内成熟卵母细胞。
趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。目前体外成熟培养液往往添加多种细胞因子(FSH、LH、雌二醇、HCG)达到促进动物卵母细胞的体外成熟目的。
技术实现要素：
本发明为提高牛卵母细胞体外培养的成熟质量，提供一种牛卵母细胞体外成熟培养液及培养方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种牛卵母细胞体外成熟培养液，该体外成熟培养液包括体积分数5～20％的胎牛血清、体积分数0.5～2％的ITS-G(含5～20mg/L的胰岛素和2.8～11.0mg/L的转铁蛋白)、0.05～0.1IU/mL的HMG、0.5～1.5μg/mL的17β-雌二醇、5～10ng/mL的EGF、1.1～3.3mg/mL的bFGF和10～100ng/mL的CXCL12。
优选的，所述体外成熟培养液包括体积分数10％的胎牛血清、体积分数1％的ITS-G(含10mg/L的胰岛素和5.5mg/L的转铁蛋白)、0.075IU/mL的HMG、1μg/mL的17β-雌二醇、10ng/mL的EGF、2.2mg/mL的bFGF和50ng/mL的CXCL12。
优选的，所述体外成熟培养液由无Hepes的M199基础培养液及添加至该基础培养液中的所述胎牛血清、ITS-G、HMG、17β-雌二醇、EGF、bFGF和CXCL12组成。
一种牛卵母细胞体外成熟培养方法，包括以下步骤：
将牛卵母细胞放入卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于培养箱中培养20～22小时，即获得成熟的卵母细胞(M2期)；所述卵母细胞体外成熟培养液即上述牛卵母细胞体外成熟培养液。
优选的，所述牛卵母细胞选自GV期卵母细胞。
优选的，所述卵母细胞体外成熟培养液在放入牛卵母细胞前预热1～3小时。
优选的，所述预热和培养于38.5℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中进行。
优选的，每400～600μL的卵母细胞体外成熟培养液中放入30～50枚牛卵母细胞卵丘复合体(COCs)。
本发明的有益效果体现在：
本发明提出的牛卵母细胞体外成熟培养液，通过所添加的CXCL12、ITS(胰岛素、转铁蛋白)、EGF及bFGF等组分，可有效提高牛体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎的早期胚胎发育率和质量，达到了有效提高牛卵母细胞体外培养的成熟质量的目的。本发明提出的成熟培养方法操作简单，无需更换培养液，使得所培养获得的体外成熟卵母细胞在发育能力上显著增强。
进一步的，通过对成熟培养液于培养环境中进行预热(平衡)，可以提高成熟培养效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
经实验发现CXCL12在牛卵泡液中高丰度存在，因此推测该因子(CXCL12)可能对于卵母细胞成熟有促进作用。因此本发明通过添加CXCL12等组分来完善体外成熟培养液，以提高牛卵母细胞体外培养的成熟质量。
(一)牛卵母细胞体外成熟培养液
牛卵母细胞体外成熟培养液包括无Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)的M199基础培养液和添加至该基础培养液中的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮细胞生长因子)、17β-雌二醇、HMG(人绝经尿促性素)、胎牛血清、ITS和CXCL12。
本发明一个实施例中，按体积百分含量计，牛卵母细胞体外成熟培养液含有10％的胎牛血清和1％的ITS-G(人源)，并含有0.075IU/mL的HMG、1μg/mL的17β-雌二醇、10ng/mL的EGF(人源)、2.2mg/mL的bFGF(人源)和50ng/mL的CXCL12(人源)。
(二)试剂来源和制备
无Hepes的M199基础培养液从商业化渠道购得(Thermo公司)，特级胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品，ITS-G为Thermo公司产品(ITS-G是用亚硒酸钠溶解的ITS，ITS-G包含有两种蛋白：胰岛素(Insulin)和转铁蛋白(Transferrin))，其他未标明的均为sigma公司产品。
a.牛卵母细胞体外成熟培养液
1)成熟培养液(添加CXCL12)：无Hepes的M199基础培养液中添加10％(v/v)的胎牛血清、1％(v/v)的ITS-G(Insulin：10mg/L，Transferrin：5.5mg/L)、0.075IU/mL的HMG、1μg/mL的17β-雌二醇、10ng/mL的EGF、2.2mg/mL的bFGF和50ng/mL的CXCL12。
2)成熟培养液(不添加CXCL12)：无Hepes的M199基础培养液中添加10％(v/v)的胎牛血清、1％(v/v)的ITS-G(Insulin：10mg/L，Transferrin：5.5mg/L)、0.075IU/mL的HMG、1μg/mL的17β-雌二醇、10ng/mL的EGF和2.2mg/mL的bFGF。
b.SOF溶液和mSOFaa溶液
SOF溶液制备：将0.6294g的NaCl、0.0534g的KCl、0.162g的KH2PO4、0.0172g的CaCl2·2H2O、0.00996g的MgCl2·6H2O、0.2106g的NaHCO3、0.0033g的丙酮酸钠，及28.24μL的乳酸钠加入98mL水中，1mM NaOH调pH到7.2～7.4，去离子水定容到100mL。
mSOFaa溶液：以SOF溶液作为基础液，还包含有体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、1mmol/L的谷氨酰胺、8mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)。
c.BO液
BO液是以mSOFaa溶液作为基础液，每100mL mSOFaa溶液添加0.05g肝素钠即可。
d.电融合液
电融合液包括：0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸及1mg/mL的BSA。
e.细胞消化液
称取0.02g EDTA和0.25g胰蛋白酶，加入100mL PBS，不断搅拌至充分溶解，0.22μm滤膜过滤后，4mL/管分装，-20℃保存备用。
(三)牛体细胞克隆胚胎的制备
a.牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2～5代的牛胎儿成纤维细胞(采集自杨凌科元克隆股份有限公司牛场，采集时间：2014年1月至2016年3月)于38℃解冻，加0.8mL的DMEM/F12细胞培养液，离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3mL细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰蛋白酶与EDTA混合的细胞消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，用含10％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液悬浮，按1:3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养(保证细胞在十代以内)。进行体细胞克隆胚制作的前两天，将培养液更换成含0.5％胎牛血清的DMEM/F12。
b.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场(采集时间：2014年1月至2016年3月)，将卵巢置于保温瓶内含青、链霉素的20～25℃的生理盐水中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞(GV期)，放入6cm玻璃皿中，在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含10％胎牛血清的PBS中清洗三遍。选择卵母细胞形态正常的COCs用于体外成熟培养。
处理组：将选择的COCs(30个)在成熟培养液(添加CXCL12)中洗两遍，然后移入每孔装有500μL成熟培养液(添加CXCL12)的四孔板中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养20～22h。将培养成熟的COCs用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+PBS中消化1～2min，并用1000mL移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞待用。
对照组：将选择的COCs(30个)在成熟培养液(不添加CXCL12)中洗两遍，然后移入每孔装有500μL成熟培养液(不添加CXCL12)的四孔板中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养20～22h。将培养成熟的COCs用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无Ca2+、Mg2+PBS中消化1～2min，并用1000mL移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞待用。
c.牛体细胞克隆胚的构建
去核：
去核前，处理组和对照组卵母细胞分别先在含7.5μg/mL细胞松弛素B、10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的部分卵胞质。
注核和电融合：
注核时，挑选直径为15～20μm的牛胎儿成纤维细胞分别注入去核的处理组和对照组卵母细胞透明带下。注核后的重组胚采用微电极的方法进行融合。融合前，重组胚在电融合液中预平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z”字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组胚的供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数：电压32V、脉冲时长20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。
d、牛体细胞克隆重组胚的激活
在电融合之后1～2h，挑选成功融合的处理组和对照组牛体细胞克隆重组胚通过离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP的激活处理进行激活：首先在含2～5μmol/L离子霉素的mSOFaa溶液中室温孵育4min，然后在含1～2mmol/L 6-DMAP的mSOFaa溶液中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养4h。
e、牛体细胞克隆胚胎的体外培养
四孔板每孔加入500μL的mSOFaa溶液，mSOFaa溶液上还覆盖有500μL石蜡油，石蜡油预先在CO2培养箱中平衡至少2h，处理组和对照组牛体细胞克隆重组胚在进行激活处理后，转移到上述四孔板中。每孔放置35～40枚牛体细胞克隆重组胚，在38.5℃、5％CO2、7％O2及饱和湿度条件下培养，记录发育情况。
试验结果：与对照组相比，卵母细胞成熟培养液中添加50ng/mL CXCL12，可以显著提高牛体细胞克隆胚胎的发育率和囊胚质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。具体表现为：
1)牛体细胞克隆胚胎的发育率和质量
由表1可以看出，添加50ng/mL CXCL12的卵母细胞体外成熟培养液，可显著提高卵母细胞在核移植后囊胚的发育率和质量。
表1.在含有不同浓度CXCL12的卵母细胞体外成熟培养液成熟后的卵母细胞在核移植后的发育率
注：括号内的数为发育率，括号前的数为统计的胚胎总数；2-细胞期胚胎和囊胚的发育率统计分别在重组胚培养72h和192h(第八天)；在同一列内，数据的上标字母不同表示差异显著(P<0.05，卡方检验)；囊胚(1-3)是指第八天获得的总囊胚数目和总囊胚率；囊胚(1-2)则是指达到了国际胚胎移植协会等级1和2形态标准的高质量，推荐进行进一步移植培养的囊胚
2)牛体细胞克隆囊胚的细胞数
由表2可以看出，在含50ng/mL CXCL12的卵母细胞成熟培养液中成熟的卵母细胞在核移植后获得的胚胎(囊胚)的细胞总数、内细胞团(ICM)细胞数显著提高。
表2.牛体细胞克隆囊胚的细胞数分析
注：在同一列内数据，上标字母不同表示差异显著(P<0.05)
(四)牛体外受精胚胎的制备
a.卵母细胞的成熟培养
牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场，将卵巢置于保温瓶内含青、链霉素的20～25℃的生理盐水中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中，在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含10％胎牛血清的PBS中清洗三遍。选择卵母细胞形态正常的COCs用于体外成熟培养。
处理组：将选择的COCs(30个)在成熟培养液(添加CXCL12)中洗两遍，然后移入每孔装有500μL成熟培养液(添加CXCL12)的四孔板中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养20～22h。将培养成熟的COCs用1000mL移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打至COCs周围只剩下紧密包裹的四到五层卵丘细胞时，在受精液(BO液)中洗2次，洗干净吹下的游离卵丘细胞，然后将紧密包裹四到五层卵丘细胞的卵母细胞移至提前放置到培养箱中平衡2h以上的受精液滴中。
对照组：将选择的COCs(30个)在成熟培养液(不添加CXCL12)中洗两遍，然后移入每孔装有500μL成熟培养液(不添加CXCL12)的四孔板中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养20～22h。将培养成熟的COCs用1000mL移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打至COCs周围只剩下紧密包裹的四到五层卵丘细胞时，在受精液(BO液)中洗2次，洗干净吹下的游离卵丘细胞，然后将紧密包裹四到五层卵丘细胞的卵母细胞移至提前放置到培养箱中平衡2h以上的受精液滴中。
b、精子的解冻，纯化，受精
将冻精(西安市奶牛中心，2013年10月采集)从液氮罐取出后，放置于37℃水浴解冻，离心管中做Percoll分层液。将2mL 90％Percoll液置于离心管底部，把2mL 45％Percoll液小心加到90％Percoll液面上，再将解冻后的精子置于45％Percoll液面上，1500rpm离心20min，小心吸取底部约200μL精液，分别加入处理组和对照组卵母细胞的受精液(BO液)中，放回培养箱内使精卵进行结合16～22h。
c、受精胚胎的体外培养
受精完毕后，用口吸管或者枪头吹去卵子周围的残存卵丘细胞、精子。如果无法去除干净，可以在透明质酸酶溶液中进行去除。后移入mSOFaa溶液(液面上还覆盖有500μL石蜡油，并预先在CO2培养箱中平衡至少2h)中培养(每孔放置35～40枚牛受精卵，在38.5℃、5％CO2、7％O2及饱和湿度条件下培养)，观察并记录发育情况。
试验结果：与对照组相比，卵母细胞成熟培养液中添加50ng/mL CXCL12，可以显著提高牛体外受精胚胎的发育率和囊胚质量，可高效体外生产牛受精胚胎。具体表现为：
1)牛体外受精胚胎的发育率和质量
由表3可以看出，在含50ng/mL CXCL12的卵母细胞成熟培养液中成熟的卵母细胞在受精后获得的胚胎发育潜能明显升高。
表3.在含有不同浓度CXCL12的卵母细胞体外成熟培养液成熟后的卵母细胞在受精后的发育率
注：括号内的数为发育率，括号前的数为统计的胚胎总数；2-细胞期胚胎和囊胚的发育率统计分别在体外受精胚培养72h和192h(第八天)；在同一列内，数据的上标字母不同表示差异显著(P<0.05，卡方检验)；囊胚(1-3)是指第八天获得的总囊胚数目和总囊胚率；囊胚(1-2)则是指达到了国际胚胎移植协会等级1和2形态标准的高质量，推荐进行进一步移植培养的囊胚
2)牛体外受精囊胚的细胞数
表4.牛体外受精囊胚的细胞数分析
注：在同一列内数据，上标字母不同表示差异显著(P<0.05)
由表4可以看出，在含50ng/mL CXCL12的卵母细胞成熟培养液中成熟的卵母细胞在受精后获得的胚胎(囊胚)的细胞总数显著提高。
此外，与已经报道的培养体系相比(例如，以M199为基础液，添加10％的FBS，1μg/mL的Estradiol-17β，1IU/mL的FSH，5IU/mL的LH的成熟培养液)，实验结果表明，本发明提出的牛卵母细胞体外成熟培养液，无论是否添加CXCL12，都能提高成熟后牛卵母细胞的质量。
总之，本发明提出的牛卵母细胞体外成熟培养液包括添加于基础培养液的bFGF、EGF、ITS及CXCL12等组分。将卵母细胞放入预热的卵母细胞体外成熟培养液中，然后置于CO2体积浓度为5％的环境内成熟培养20～22小时，即获得成熟的卵母细胞。实验证实，本发明的体外成熟培养液及体外成熟培养方法，能够提高牛卵母细胞体外培养的成熟质量、牛体外受精胚胎发育率和体细胞核移植胚胎(体细胞克隆胚胎)发育率及囊胚质量。