本发明属于多肽药物制备技术领域，特别涉及一种来考诺肽的制备方法。
背景技术：
芋螺毒素是一类来源于芋螺毒液的生物活性多肽，能够特异性地作用于乙酰胆碱受体及其它神经递质的各种受体亚型，以及钙、钠、钾等多种离子通道。ω-芋螺毒素mviia和来考诺肽是n-型钙通道的强效、选择性阻滞剂，例如来自幻芋螺(conosmagus)的ω-芋螺毒素mviia，具有很好的镇痛效果，已被开发成治疗严重慢性疼痛的药物齐考诺肽(商品名为prialt)，具有比阿片类镇痛药物更好的疗效。
来考诺肽，英文名称为leconotide(代码名称cnsb004、am336)，是一种从猫芋螺(c.catus)毒液中分离得到的ω-芋螺毒素多肽，又称为ω-芋螺毒素cvid，可用于治疗严重的慢性疼痛。与齐考诺肽需要鞘内注射相比，来考诺肽的毒性小，没有严重的心血管副作用，可经传统的静脉注射给药。
来考诺肽由27个氨基酸残基组成的多肽，c端羧基被酰胺化，分子含有三对二硫键，cas号为247207-64-3，分子式为c107h179n35o36s7，分子量为2756.26g/mol，其结构如下：
专利cn104341496a公开了一种固相合成来考诺肽的方法，将得到的线性肽树脂在液相中通过一步氧化同时对三对二硫键进行环化。由于6个cys的侧链保护基均采用trt，会导致巯基配对错误，导致二硫键连接的准确率低，不能定向形成二硫键，易生成多种同分异构体产物，增加产物分离纯化难度，从而使产物收率低。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术的不足，依据来考诺肽的自身结构特点，提供一种可定向形成二硫键、无同分异构体产物生成、产物分离纯化简单、产物收率高的一种来考诺肽的制备方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种来考诺肽的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
1)缩合反应：在缩合体系中，以fmoc氨基树脂为固相合成的载体，树脂经脱保护、洗涤，缩合反应：从c端至n端依次缩合27个活化后的侧链保护的氨基酸，得线性全保护肽树脂，线性全保护肽树脂cys(trt)-lys(boc)-ser(tbu)-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(acm)-ser(tbu)-lys(boc)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(mob)-cys(trt)-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-cys(acm)-ser(tbu)-gly-thr(otbu)-val-gly-arg(pbf)-cys(mob)-氨基树脂；所述线性全保护肽树脂中形成三组二硫键的cys的侧链保护基分别为trt、acm以及mob；所述的依次连接保护氨基酸顺序为：fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh、fmoc-thr(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-cys(mob)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-cys(acm)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-cys(trt)-oh；
2)脱除步骤1)制得的线性全保护肽树脂上除cys(acm)和cys(mob)以外其它氨基酸的侧链保护基，并切割树脂，得线性粗肽；
3)氧化步骤2)制得的线性粗肽，环化形成第一对二硫键，得一环粗肽；
4)脱除步骤3)制得的一环粗肽上cys(acm)的acm保护基，环化形成第二对二硫键，得二环粗肽；
5)脱除步骤4)制得的二环粗肽上cys(mob)的mob保护基，环化形成第三对二硫键，得来考诺肽粗肽；
6)将步骤4)制得的来考诺肽粗肽纯化、冻干，得来考诺肽纯品。
优选的，步骤1)中氨基树脂为：rinkamideam树脂、rinkamidembha树脂或sieber树脂其中任何一种，树脂替代度为0.2～1.2mmol/g。
优选的，步骤1)中缩合体系为：a+d或a+b+c，其中a为hobt或hoat，b为hatu、hbtu、tbtu或pybop其中任何一种，c为diepa或tmp，d为dic。
优选的，步骤2)中，切割树脂方法为：在10～30℃条件下，加入裂解试剂，反应2～5h；裂解试剂体积份数比为tfa:edt:h2o:tis＝94:2:2:2。
优选的，步骤3)中，环化方法为：将步骤2)制得的线性粗肽溶于乙酸-水溶液，加入体积分数为10％～20％dmso，在10～30℃条件下反应2～6h。
优选的，步骤4)中脱除步骤3)制得的一环粗肽上cys(acm)的acm保护基、环化的方法为：10～30℃条件下加入i2-meoh溶液，反应2～5h。
优选的，步骤5)中，脱除mob保护基的环化方法为：将二环肽溶于体积分数为10％乙酸溶液，加入0.2m乙酸汞，调节ph至4，在10～30℃条件下反应2～5h后，加入体积分数20％的h2o2溶液，在10～30℃条件下反应2～5h。
优选的，步骤6)中，纯化方法为采用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化；第一步纯化：流动相a相为体积分数0.1％tfa-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％tfa-acn溶液；第二步纯化对纯品转盐：流动相a相为体积分数0.1％乙酸-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％乙酸-acn溶液；两步纯化均为梯度洗脱：洗脱时间为60min，洗脱梯度为b相体积分数10％～60％，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。
优选的，步骤1)中缩合反应具体步骤如下：
a)fmoc氨基树脂溶胀：向fmoc氨基树脂中加入dcm或dmf，将树脂溶胀0.5h，再用dmf洗涤树脂两次；
b)fmoc氨基树脂脱fmoc保护：向步骤a)中溶胀后的氨基树脂中，加入体积分数20％pip-dmf溶液，在10～30℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，再用dmf洗涤树脂至ph至7，得脱保护的氨基树脂；第一次脱fmoc保护反应时间为5min，第二次脱fmoc保护反应时间为10min；
c)氨基酸活化：在10～30℃条件下，将全保护氨基酸和缩合体系混合后活化5min后，得活化氨基酸；
d)缩合反应：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
全保护氨基酸、缩合体系与fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1。
本发明的有益效果：
本发明一种来考诺肽的制备方法，采用固相合成法直接合成全保护线性来考诺肽肽树脂中形成三对二硫键的cys侧链采用三组不同的保护基保护，再依次脱保护可定向形成二硫键，具有效率高、副产物少、产品纯化难度低、产品得率高的优点，适合工业化规模生产制备。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。
本发明中所使用的缩写的具体含义列于下表中：
实施例1
来考诺肽线性肽树脂的制备：
1)氨基树脂的溶胀：取20g替代度为0.5mmol/g的rinkamideam树脂，加入200mldcm将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂后，再用dmf洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)fmoc保护基的脱除：向步骤1)中溶胀后的氨基树脂中，加入200ml体积分数为20％pip-dmf溶剂，在25℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，再用dmf洗涤树脂ph至7，抽干溶剂，得脱除fmoc保护基的氨基树脂；第一次脱fmoc保护时间为5min，第二次脱fmoc保护时间为10min。
3)氨基酸活化：取30mmolhobt、30mmolfmoc保护氨基酸和30mmoldic用适量的dmf溶解，在25℃条件下反应5min后，得活化的氨基酸。
4)氨基酸缩合：将步骤3)活化后的氨基酸加至步骤2)制得的脱除fmoc保护基的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得cys(trt)-lys(boc)-ser(tbu)-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(acm)-ser(tbu)-lys(boc)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(mob)-cys(trt)-ser(tbu)-gly-ser(tbu)-cys(acm)-ser(tbu)-gly-thr(otbu)-val-gly-arg(pbf)-cys(mob)-rinkamideam树脂。
茚三酮显色方法为：取少量树脂至于试管中，dmf洗涤两次；在试管中分别加入体积分数85％苯酚-乙醇溶液、吡啶和质量分数5％茚三酮-乙醇溶液各两滴，于120℃条件下加热3min后，用dmf洗涤两次，观察树脂颜色。
5)肽树脂收缩：分别用500mldcm和500mlmeoh交替洗涤肽树脂三次洗涤，洗涤时间5min/次，将肽树脂收缩后，抽干溶剂，真空干燥得来考诺肽树脂。
实施例2
线性来考诺肽粗肽的制备：
1)将实施例1制得的来考诺肽树脂置于1l圆底烧瓶中，加入10倍体积的裂解试剂在25℃条件下反应3h后，抽滤，得滤液；裂解试剂体积份数比为tfa:edt:h2o:tis＝94:2:2:2。
2)将步骤1)制得的滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次后，离心、真空干燥，得线性来考诺肽粗肽。经检测线性来考诺肽粗肽纯度为78％。
实施例3
来考诺肽一环粗肽的制备：
将实施例2制得的线性来考诺肽粗肽溶于乙酸-水溶液，配成1mm的溶液，加入体积分数10％～20％的dmso，在25℃条件下反应5h后，将反应液冻干，得来考诺肽一环粗肽。
实施例4
来考诺肽二环粗肽的制备：
将实施例3制得的考诺肽一环粗肽溶于乙酸-水溶液，配成1mm的溶液，加入质量分数10％的i2-meoh溶液，在25℃条件下反应3h，将反应液冻干，得到来考诺肽二环粗肽。
实施例5
来考诺肽三环粗肽的制备：
将实施例4制得的来考诺肽二环粗肽溶于体积分数10％乙酸，配成1mm的溶液，加入0.2m的乙酸汞，调节ph至4，在25℃条件下反应3h后，加入体积分数20％h2o2溶液，在25℃条件下反应3h后，得来考诺肽三环粗肽溶液。
实施例6
来考诺肽粗品纯化：
用反相高效液相色潽法对实施例5制得的来考诺肽三环粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化；第一步纯化：流动相a相为体积分数0.1％tfa-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％tfa-acn溶液，第二部纯化对纯品转盐：流动相a相为体积分数0.1％乙酸-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％乙酸-acn溶液；两步纯化均为梯度洗脱：c18制备柱(50×250mm，10μm)，洗脱时间为60min，洗脱梯度为b相10％～60％，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。经纯化、冻干得来考诺肽纯品。
经检测来考诺肽纯品纯度为99.4％，总收率32.7％。
上述实施例中，改变氨基树脂种类为：rinkamidembha树脂、rinkamidebha树脂或sieber树脂其中任何一种；改变氨基树脂替代度为0.2～1.2mmol/g；改变原料的投料比例为：全保护氨基酸、缩合体系与fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；改变反应溶剂、改变反应温度10～30℃、反应时间；改变缩合体系为：a+d或a+b+c，其中a为hobt或hoat，b为hatu、hbtu、tbtu或pybop其中任何一种，c为diepa或tmp，d为dic等，均可实现固相合成法直接合成全保护线性来考诺肽肽树脂中形成三对二硫键的cys侧链采用三组不同的保护基保护，再依次脱保护可定向形成二硫键，具有效率高、副产物少、产品纯化难度低、产品得率高的优点，适合工业化规模生产制备。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>润辉生物技术（威海）有限公司
<120>一种来考诺肽的制备方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>27
<212>prt
<213>猫芋螺(conoscatus)
<220>
<221>misc_feature
<400>1
cyslysserlysglyalalyscysserlysleumettyraspcyscys
151015
serglysercysserglythrvalglyargcys
2025