本发明涉及生物靶向功能高分子缓释材料领域，具体地指一种多糖接枝叶酸共聚物及其纳米粒制备方法。
背景技术：
癌症是当前威胁人类健康的主要疾病之一，目前化学治疗在癌症临床治疗占据重要地位。然而，目前应用的大多数化疗药物存在着水溶性差、体内循环周期短的问题。多数化疗药物尽管治疗效果显著但是由于非靶向的分布于全身，一方面降低了其生物利用度，另一方面造成了极大的毒副作用。随着科技的发展，纳米载药系统成为了解决上述问题的最有效手段之一。目前纳米载药系统的制备方法主要有乳化法，透析法，水化法，溶剂挥发法。乳化法制备纳米粒需要加入三氯甲烷等有机溶剂，通过超声的方式形成乳液，再将乳液挥干形成纳米粒。然而，三氯甲烷等有机溶剂会与水有一定比例互溶，难以完全除去。残留的有机溶剂对人体存在毒性。透析法通过将载体材料与药物共同溶解于有机溶剂中，再通过透析将有机溶剂除去，得到纳米载药系统的水溶液。然而，透析时间往往过长，需要1～3天才能得到所需的纳米载药系统。水化法是预先将载体材料与药物共同溶解于有机溶剂，将有机溶剂旋蒸干燥后得到一层载体材料和药物的贴壁薄膜，再加入水相搅拌。贴壁薄膜在水相中逐步形成纳米载药系统。这种方法需要材料与药物共同溶剂于有机溶剂，这对材料的选择有了极大限制。溶剂挥发法也需要使用大量的有机溶剂，然而有机溶剂会与水一定比例互溶而难以完全除去。残留的有机溶剂会危害人类的健康。
如何寻求一种工艺简单，同时能够避免有机溶剂的使用的方法制备能够治疗肿瘤的纳米药物载体，是亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明在于克服以上组装方法的不足和改进需求，本发明提供了一种多糖接枝叶酸共聚物及其纳米粒制备方法，该共聚物可以用于制备载药系统。其解决现有纳米载药系统制备周期长、存在有机溶剂残留容易导致毒性的问题。
为实现上述目的，本发明提供的一种多糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
其中，r为分子量为5000～500000da的多糖。
进一步，r选自葡聚糖、壳寡糖、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素和透明质酸。
再进一步地，多糖-叶酸共聚物为葡聚糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
其中，n为100～10000；作为优选方案，n为640。
再进一步地，所述叶酸在多糖上的取代度为20％～50％；为保证叶酸-多糖接枝聚合物能够组装成粒径小于100纳米的纳米粒；进一步优选为42％。
本发明还提供了一种上述多糖接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用无水二甲亚砜溶解叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，进行羧基活化反应，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在温度为50～70℃下将分子量为5000～500000da的多糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到多糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的多糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40～80℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行共透析1～5天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体在温度为-20～-25℃条件冷冻3～5h，然后放入温度为-40～-60℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的多糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为多糖接枝叶酸共聚物。
进一步地，所述步骤1)中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1～2:1～2；
所述步骤1)中，羧基活化反应中，反应温度为40～80℃，反应时间为30～60min。
再进一步地，所述步骤2)中，所述多糖选自葡聚糖、壳寡糖、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素和透明质酸。
再进一步地，所述步骤3)中，羧基活化的叶酸溶液中的叶酸与多糖的二甲亚砜溶液中的多糖质量比为1:1～4
再进一步地，所述步骤4)中，透析过程中，透析袋分子量为3500da～24000da，冷冻温度为-20℃，冷冻时间为4h；冷冻干燥温度为-50℃。
本发明还提供了多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
1)将上述多糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的多糖接枝叶酸共聚物的溶液；
2)调节多糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至8～12，在该状态下搅拌5～30min；然后在时间0～10s之内将溶液ph调节至7.2～7.4，得到了多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，所述多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的多糖接枝叶酸共聚物合成步骤简单，仅一步反应就可以得到所需的聚合物。该聚合物采用的多糖(特别是葡聚糖)与叶酸均具有良好的生物安全性，生物相容性，具备体内注射应用的价值。
2)本发明提供的ph调节的方式制备多糖接枝叶酸共聚物纳米粒方法相对于乳化法、透析法等其他方法，操作时间更短，操作方法更为简单，无需添加有机试剂。其纳米尺寸均在100nm以下，在pbs缓冲液和胎牛血清(fbs)中均有良好的稳定性(图2)，具有广阔的应用前景；
3)本发明提供的ph调节的方式制备的多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，多糖接枝叶酸共聚物纳米粒中的叶酸可以用于负载阿霉素或其他正电性的药物。细胞摄取实验结果表明(图3)，叶酸在除了参与纳米粒的组装和负载药物，依然保留了对叶酸受体的主动靶向性。小鼠组织分布的结果表明(图4)，该纳米粒具备被动靶向和主动靶向双向靶向特性。
附图说明
图1为实施例1制备葡聚糖接枝叶酸共聚物的合成路线图；
图2为实施例1制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物的红外光谱图；
图3为实施例1制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物的核磁共振谱图；
图4为实施例1制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的dls图(图4a)及透射电镜图(图4b)；
图5为实施例2制备的壳寡糖接枝叶酸共聚物的合成路线图；
图6为实施例2制备的壳寡糖接枝叶酸共聚物的红外光谱图；
图7为实施例2制备的壳寡糖接枝叶酸共聚物的核磁共振谱图；
图8为实施例2制备的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒的dls图(图8a)及透射电镜图(图8b)；
图9为实施例3制备的普鲁蓝多糖接枝叶酸共聚物的合成路线图；
图10为实施例3制备的普鲁蓝多糖接枝叶酸共聚物的红外光谱图；
图11为实施例3制备的普鲁蓝多糖接枝叶酸共聚物的核磁共振谱图；
图12为实施例3制备的普鲁蓝多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的dls图(图12a)及透射电镜图(图12b)；
图13为实施例4制备的透明质酸接枝叶酸共聚物的合成路线图；
图14为实施例4制备的透明质酸接枝叶酸共聚物的红外光谱图；
图15为实施例4制备的透明质酸接枝叶酸共聚物的核磁共振谱图；
图16为实施例4制备的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的dls图(图16a)及透射电镜图(图16b)；
图17为实施例5制备的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物的合成路线图；
图18为实施例5制备的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物的红外光谱图；
图19为实施例5制备的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物的核磁共振谱图；
图20为实施例5制备的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒的dls图(图20a)及透射电镜图(图20b)；
图21为本发明制备的负载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒通过四甲基偶氮唑盐(mtt)微量酶反应实验结果；
图21a为阿霉素@葡聚糖-叶酸(dox@dex-fa)组与叶酸+阿霉素@葡聚糖-叶酸(fa+dox@dex-fa)组对于4t1小鼠乳腺癌细胞毒性实验；
图21b为阿霉素(dox)组与叶酸+阿霉素(fa+dox)组对于4t1小鼠乳腺癌细胞毒性实验；
图21c为阿霉素@葡聚糖-叶酸(dox@dex-fa)组与叶酸+阿霉素@葡聚糖-叶酸(fa+dox@dex-fa)组对于a549小鼠肺癌细胞毒性实验；
图21d为阿霉素(dox)组与叶酸+阿霉素(fa+dox)组对于a549小鼠肺癌细胞毒性实验；
图22为本发明制备的负载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的细胞摄取实验结果图；
图中，图22a为-4t1细胞摄取实验结果图；
图22b为a549细摄取实验结果图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
葡聚糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
n为640，葡聚糖的分子量为40kda。
如图1所示的上述葡聚糖接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1:1；
2)溶解葡聚糖：氦气保护条件下，在温度为50℃下将0.5g的分子量为40kda的葡聚糖充分溶解于5ml无水二甲亚砜中，得到葡聚糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的聚糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da共透析3天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的多糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为葡聚糖接枝叶酸共聚物dex-fa。
采用红外光谱(ftir)以及核磁共振谱(1h-nmr)确认本发明制备的葡聚糖-叶酸接枝聚合物的化学结构。由图2可知，与葡聚糖的红外光谱相比，葡聚糖接枝叶酸共聚物的红外吸收在1730cm-1出现了一个新的吸收峰，归属于反应生成的酯键的c＝o伸缩振动峰。葡聚糖接枝叶酸共聚物的红外吸收在1697cm-1和1643cm-1出现了新的吸收峰，归属于叶酸上芳香环的伸缩振动。这些新出现的吸收峰证明叶酸成果的接枝到葡聚糖上。
由图3可知，与葡聚糖的核磁谱图相比，葡聚糖-叶酸在6.5-9.0ppm出现了一组新的峰，归属于叶酸上芳香环上质子的峰。葡聚糖-叶酸在1.5-3ppm出现了一组新峰，归属于叶酸中亚甲基上质子的峰。根据核磁共振图确认本实施例1制备的葡聚糖-叶酸接枝聚合物的化学结构的正确。核磁共振的结果进一步证实了dex-fa的结果，叶酸在葡聚糖上的取代度为46.4wt％。
葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备：包括以下步骤：
1)将葡聚糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的葡聚糖接枝叶酸共聚物的溶液；
2)加入氢氧化钠溶液，调节葡聚糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌10min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间5s之内将溶液ph调节至7.2，得到了葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm。
葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒显微镜观察：
取1mg/ml的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒，超声10min，得到备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液20μl滴于铜网上，用0.2％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用投射电子显微镜观察其形貌，用激光粒度仪测量胶束粒径和分布，测定温度为25℃，平衡时间2min,激光电源：he-ne激光，波长为633nm。
纳米粒子制剂1(包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒)的制备方法，包括以下步骤：
1)调节葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至9；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，得到超声后的溶液；
2)再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5min，随后调节ph至7.2；得到包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒；
3)将步骤2)所得的包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为10000da，超滤10次，得到包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒子制剂1。阿霉素与葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒投料质量比为1：10。
如图4中的dls结果可知，包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径在90nm，且分布均匀。tem的结果与dls结果吻合。
实施例2
壳寡糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
r为壳寡糖，其分子量为5kda。
如图5所示的上述壳寡糖接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1:1；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在温度为50℃下将0.5g分子量为5kda的壳寡糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到壳寡糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的壳寡糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为48℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da共透析35天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的壳寡糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为壳寡糖接枝叶酸共聚物(cso-fa)。
采用红外光谱(ftir)以及核磁共振谱(1h-nmr)确认制备的壳寡糖接枝叶酸共聚物的化学结构。由图6可知，与壳寡糖的红外光谱相比，壳寡糖接枝叶酸共聚物的红外吸收在1650cm-1出现了一个新的吸收峰，归属于反应生成的酰胺键的-nh-co-伸缩振动峰。壳寡糖接枝叶酸共聚物的红外吸收在1697cm-1和1643cm-1出现了新的吸收峰，归属于叶酸上芳香环的伸缩振动。这些新出现的吸收峰证明叶酸成果的接枝到壳寡糖上。
由图7可知，与壳寡糖的核磁谱图相比，葡聚糖-叶酸在6.5-9.0ppm出现了一组新的峰，归属于叶酸上芳香环上质子的峰。壳寡糖-叶酸在1.5-3ppm出现了一组新峰，归属于叶酸中亚甲基上质子的峰。根据核磁共振图确认本实施例2制备的壳寡糖接枝叶酸共聚物的化学结构的正确。核磁共振的结果进一步证实了cso-fa的结果，叶酸在壳寡糖上的取代度为36.2wt％。
壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备：包括以下步骤：
1)将壳寡糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的壳寡糖接枝叶酸共聚物的溶液；
2)加入氢氧化钠溶液，调节壳寡糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌5min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间5s之内将溶液ph调节至7.2，得到了壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm。
壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒显微镜观察：
取1mg/ml的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒，超声10min，备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液20μl滴于铜网上，用0.2％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用投射电子显微镜观察其形貌，用激光粒度仪测量胶束粒径和分布，测定温度25℃，平衡时间2min,激光电源：he-ne激光，波长为633nm。
纳米粒子制剂2(包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒)的制备方法，包括以下步骤：
1)调节壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至8～12；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，得到超声后的溶液；
2)再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2～7.4；得到包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒；
5)将步骤4)所得的包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为3000～100000da，超滤5～10次，得到包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒子制剂2。阿霉素与壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒投料质量比为1：10。
如图8中的dls结果可知，包载阿霉素的壳寡糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径在90nm，且分布均匀。tem的结果与dls结果吻合。
实施例3
普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物，其具有如下的通式：
其中，r为普鲁兰多糖；其分子量为300kda。
如图9所示的上述葡聚糖接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1:1；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在温度为50℃下将0.5g分子量为300kda的普鲁兰多糖充分溶解于无水二甲亚砜中，得到普鲁兰多糖的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的普鲁兰多糖的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为50℃条件下发生酯化反应48h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da共透析3天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至塑料培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物冻干粉；即为普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物(pullulan-fa)。
采用红外光谱(ftir)以及核磁共振谱(1h-nmr)确认制备的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物的化学结构。由图10可知，与普鲁兰多糖的红外光谱相比，普鲁兰多糖-叶酸接枝聚合物的红外吸收在1730cm-1出现了一个新的吸收峰，归属于反应生成的酯键的c＝o伸缩振动峰。普鲁兰多糖-叶酸接枝聚合物的红外吸收在1697cm-1和1643cm-1出现了新的吸收峰，归属于叶酸上芳香环的伸缩振动。这些新出现的吸收峰证明叶酸成果的接枝到普鲁兰多糖上。
由图11可知，与葡聚糖的核磁谱图相比，普鲁兰多糖-叶酸在6.5-9.0ppm出现了一组新的峰，归属于叶酸上芳香环上质子的峰。普鲁兰多糖-叶酸在1.5-3ppm出现了一组新峰，归属于叶酸中亚甲基上质子的峰。根据核磁共振图确认本实施例3制备的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物的化学结构的正确。核磁共振的结果进一步证实了pullulan-fa的结果，叶酸在普鲁兰多糖上的取代度为46.4wt％。
普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的制备：包括以下步骤：
1)将普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物的溶液；
2)加入氢氧化钠溶液，调节普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌5min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间5s之内将溶液ph调节至7.2，得到了普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm。
普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒显微镜观察：
取1mg/ml的普鲁兰多糖-叶酸纳米粒，超声10min，备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液20μl滴于铜网上，用0.2％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用投射电子显微镜观察其形貌，用激光粒度仪测量胶束粒径和分布，测定温度为25℃，平衡时间2min,激光电源：he-ne激光，波长为633nm。
纳米粒子制剂3(包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒)的制备方法，包括以下步骤：
1)调节普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至8～12；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，得到超声后的溶液；
2)再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2～7.4；得到包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒；
3)将步骤2)所得的包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为3000～100000da，超滤5～10次，得到包载阿霉素的普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒子制剂3。阿霉素与普鲁兰多糖接枝叶酸共聚物纳米粒投料质量比为1：5～100。
如图12中的dls结果可知，包载阿霉素的普鲁兰多糖-叶酸的粒径在90nm左右，且分布均匀。tem的结果与dls结果吻合。
实施例4
透明质酸接枝叶酸共聚物，其具有如下通式：
其中，r为透明质酸，其分子量为50kda。
如图13所示的上述透明质酸接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1:1；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在500℃下将0.5g的分子量为50kda的透明质酸充分溶解于无水二甲亚砜中，得到透明质酸的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的透明质酸的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40～80℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da共透析3天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的透明质酸接枝叶酸共聚物冻干粉；即为透明质酸接枝叶酸共聚物(ha-fa)。
采用红外光谱(ftir)以及核磁共振谱(1h-nmr)确认制备的透明质酸接枝叶酸共聚物的化学结构。由图11可知，与透明质酸的红外光谱相比，透明质酸接枝叶酸共聚物的红外吸收在1730cm-1出现了一个新的吸收峰，归属于反应生成的酯键的c＝o伸缩振动峰。透明质酸接枝叶酸共聚物的红外吸收在1697cm-1和1643cm-1出现了新的吸收峰，归属于叶酸上芳香环的伸缩振动。这些新出现的吸收峰证明叶酸成果的接枝到透明质酸上。
由图15可知，与葡聚糖的核磁谱图相比，透明质酸-叶酸在6.5-9.0ppm出现了一组新的峰，归属于叶酸上芳香环上质子的峰。透明质酸-叶酸在1.5-3ppm出现了一组新峰，归属于叶酸中亚甲基上质子的峰。根据核磁共振图确认本实施例4制备的透明质酸-叶酸接枝聚合物的化学结构的正确。核磁共振的结果进一步证实了ha-fa的结果，叶酸在普鲁兰多糖上的取代度为37.5wt％。
透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的制备：包括以下步骤：
1)将透明质酸接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的透明质酸接枝叶酸共聚物的溶液；
2)加入氢氧化钠溶液，调节透明质酸接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌5min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间5s之内将溶液ph调节至7.2，得到了透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm。
透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒显微镜观察：
取1mg/ml的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒，超声10min，备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液20μl滴于铜网上，用0.2％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用投射电子显微镜观察其形貌，用激光粒度仪测量胶束粒径和分布，测定温度为25℃，平衡时间2min,激光电源：he-ne激光，波长为633nm。
纳米粒子制剂4(包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒)的制备方法，包括以下步骤：
1)将透明质酸接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的透明质酸接枝叶酸共聚物的溶液；
2)加入适量的氢氧化钠溶液，调节透明质酸接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌5min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间5s之内将溶液ph调节至7.2，得到了透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm；
3)调节透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至8～12；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的阿霉素的二甲亚砜溶液，得到超声后的溶液；
4)再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2～7.4；得到包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒；
5)将步骤4)所得的包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为3000～100000da，超滤5～10次，得到包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒溶液，即为纳米粒子制剂4，其中，阿霉素与透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒投料质量比为1：10。
如图16中的dls结果可知，包载阿霉素的透明质酸接枝叶酸共聚物纳米粒在90nm左右，且分布均匀。tem的结果与dls结果吻合。
实施例5
羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物，其具有如下通式：
其中，r为羟乙基纤维素，其分子量为50kda。
如图17所示的上述葡聚糖接枝叶酸共聚物的制备方法，包括以下步骤：
1)溶解叶酸并活化其羧基：用5ml无水二甲亚砜溶解0.5g叶酸，随后加入1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺，在温度为60℃条件下羧基活化反应30min，在室温下搅拌2-4小时后得到端羧基活化的叶酸溶液；其中，叶酸、1-羟基苯并三氮唑和n-n’-二环己基碳二亚胺的投料摩尔比为1:1:1；
2)溶解多糖：氦气保护条件下，在温度为500℃下将分子量为50kda的羟乙基纤维素充分溶解于无水二甲亚砜中，得到羟乙基纤维素的二甲亚砜溶液：
3)酯化反应：将步骤1)得到的羧基活化的叶酸溶液与步骤2)得到的羟乙基纤维素的二甲亚砜溶液混合，在氮气保护和温度为40～80℃条件下发生酯化反应24～72h，纯化后得到共聚物混合物；
4)纯化：将上述共聚物混合物使用pbs溶液进行透析，透析袋分子量为3500da共透析3天，除去未反应的1-羟基苯并三氮唑、n-n’-二环己基碳二亚胺、叶酸以及dmso溶剂，透析完毕后将透析袋中的液体转移至培养皿中，先在温度为-20℃条件冷冻4h，然后放入温度为-50℃条件下冷冻干燥，将冷冻干燥后得到所述的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物冻干粉；即为羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物(ha-fa)。
采用红外光谱(ftir)以及核磁共振谱(1h-nmr)确认制备的羟乙基纤维素-叶酸接枝聚合物的化学结构。由图19可知，与羟乙基纤维素的红外光谱相比，羟乙基纤维素-叶酸接枝聚合物的红外吸收在1730cm-1出现了一个新的吸收峰，归属于反应生成的酯键的c＝o伸缩振动峰。羟乙基纤维素-叶酸接枝聚合物的红外吸收在1697cm-1和1643cm-1出现了新的吸收峰，归属于叶酸上芳香环的伸缩振动。这些新出现的吸收峰证明叶酸成果的接枝到羟乙基纤维素上。
由图20可知，与透明质酸的核磁谱图相比，羟乙基纤维素-叶酸在6.5-9.0ppm出现了一组新的峰，归属于叶酸上芳香环上质子的峰。羟乙基纤维素-叶酸在1.5-3ppm出现了一组新峰，归属于叶酸中亚甲基上质子的峰。根据核磁共振图确认本实施例6制备的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物的化学结构的正确。核磁共振的结果进一步证实了hec-fa的结果，叶酸在羟乙基纤维素上的取代度为46.4wt％。
羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒的制备：包括以下步骤：
1)将羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物溶解于水中，得到浓度为0.1～100mg/ml的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物的溶液；
2)加入氢氧化钠溶液，调节羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物的溶液ph值至9，在该状态下搅拌5min；然后快速加入盐酸溶液，控制时间5s之内将溶液ph调节至7.2，得到了羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒，其中，上述溶液中羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒的粒径小于100nm。
羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒显微镜观察：
取1mg/ml的羟乙基纤维素-叶酸纳米粒，超声10min，备用。将铜网放在覆有滤纸的表面皿中，将1mg/ml的纳米粒分散液20μl滴于铜网上，用0.2％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用投射电子显微镜观察其形貌，用激光粒度仪测量胶束粒径和分布，测定温度为25℃，平衡时间2min,激光电源：he-ne激光，波长为633nm。
纳米粒子制剂5(包载阿霉素的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒)的制备方法，包括以下步骤：
1)调节羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒的ph至8～12；在冰浴条件下超声破碎，同时加入脱去盐酸的抗肿瘤药物的二甲亚砜溶液，得到超声后的溶液；
2)再超声后的溶液在冰浴条件下超声破碎5～15min，随后调节ph至7.2～7.4；得到包载阿霉素的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒；
3)将步骤4)所得的包载阿霉素的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒离心超滤，超滤管截留分子量为3000～100000da，超滤5～10次，得到包载阿霉素的羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒，即为纳米粒子制剂5。阿霉素与羟乙基纤维素接枝叶酸共聚物纳米粒投料质量比为1:10
如图20中的dls结果可知，包载阿霉素的羟乙基纤维素-叶酸的粒径在90nm左右，且分布均匀。tem的结果与dls结果吻合。
实施例6
本实验通过四甲基偶氮唑盐(mtt)微量酶反应实验，考察了本发明提供的多糖接枝接枝叶酸共聚物纳米粒中叶酸的主动靶向性。考察了按照实施实例1方法制备的葡聚糖接枝接枝叶酸共聚物纳米粒。
首先考察材料对叶酸受体高表达细胞-4t1组与叶酸受体低表达的细胞-a549组的mtt毒性。mtt细胞毒性实验步骤具体如下，4t1细胞与a549细胞均用含10％胎牛血清(fbs)，100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液(prmi1640)，在37℃饱和湿度和5％co2进行培养。取对数生长期的4t1细胞与a549细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并捶打成细胞悬浮液，以4000cells/well的密度接种于96孔培养板，于37℃和5％co2培养24h至细胞达80～90％融合度后，吸出原有培养液。
在不同条件下(2mg/ml的叶酸的prmi1640培养液预先饱和2小时与不饱和)，向培育后的细胞中分别加入配制的负载浓度为0.0625μg/ml，0.125μg/ml，0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml的阿霉素(dox)的包载阿霉素的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒(阿霉素@葡聚糖-叶酸(dox@dex-fa))和游离的阿霉素(dox)溶液，培养24h后，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，继续在37℃、5％co2培养箱中培养4h，小心吸取板孔中的液体，每孔加入150μldmso，摇床震荡15min，使其充分溶解残留的mtt-甲簪结晶。同时设立空白组(background,即不加细胞及药液)和对照组(control,即无药物处理的细胞)。以空白组调零，以酶标仪上测定波长490nm处的吸光度值od。细胞存活率用以下公式计算，其中odtest,odcontrol,odbackground分别指的是加药组，对照组和空白组的吸光度。
由图21可知，mtt的细胞毒性实验结果表明在叶酸受体高表达的4t1细胞中，不同阿霉素(dox)浓度下，阿霉素@葡聚糖-叶酸(dox@dex-fa)比叶酸+阿霉素@葡聚糖-叶酸(fa+dox@dex-fa)组均具有更高的毒性，对于叶酸受体低表达的a549细胞，不同阿霉素(dox)浓度下，阿霉素@葡聚糖-叶酸dox@dex-fa与叶酸+阿霉素@葡聚糖-叶酸fa+dox@dex-fa的毒性相近。说明在叶酸受体高表达的4t1细胞中，阿霉素@葡聚糖-叶酸dox@dex-fa纳米粒中的叶酸表现出了主动靶向性，而在叶酸受体低表达的a549细胞中，阿霉素@葡聚糖-叶酸dox@dex-fa中的叶酸没有表现出主动靶向性。两个结果均证明了阿霉素@葡聚糖-叶酸dox@dex-fa中的叶酸依然具备主动靶向性。
实施例7
本实验通过细胞对材料的摄取实验，进一步考察了多糖接枝叶酸共聚物纳米粒中叶酸的主动靶向性。考察了按照实施实例1方法制备的葡聚糖接枝叶酸共聚物纳米粒。首先考察材料对叶酸受体高表达细胞-4t1组的细胞摄取。
细胞摄取实验步骤具体如下：
4t1细胞培养含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的prmi1640培养基中，ecv304细胞培养于含10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640完全培养基中，均置于37℃、5％co2饱和湿度培养箱培养。细胞经过消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。
将对数生长期的4t1细胞和a549细胞分别接种于6孔培养板(2×106/孔)，平行3孔，在37℃、5％co2饱和湿度条件下过夜，自不同条件(2mg/ml的叶酸的prmi1640培养液预先饱和2小时与不饱和)下分别加入dox浓度为10μg/ml的dox与dox@dex-fa纳米粒，至于37℃培养箱中共孵育1h，收集细胞，pbs洗涤3次，对细胞进行计数。用细胞破碎仪破碎细胞，破碎细胞后加入甲醇萃取细胞中dox，离心，去上清的dox的甲醇溶液，采用荧光分光光度计测定上清中的dox含量。由图22可知，对于fa高表达的细4t1细胞，dox@dex-fa相对于fa+dox@dex-fa有着更高的细胞摄取，而对于fa低表达的are49细胞，dox@dex-fa相对于fa+dox@dex-fa没有显著性差异。阿霉素(dox)和叶酸+阿霉素@葡聚糖-叶酸(fa+dox@dex-fa)对两种细胞的摄取均无太大差异。这些结果说明了阿霉素@葡聚糖-叶酸(dox＠dex－fa)中的叶酸依然保留了主动靶向性。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。