一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用与流程

文档序号：18522917发布日期：2019-08-24 09:58阅读：190来源：国知局

本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

白血病是造血系统的一种恶性疾病，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中较高。car-t(嵌合抗原受体t细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经过car改造的t细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，以达到清除恶性肿瘤细胞的目的。

虽然car-t技术在血液瘤等的治疗上取得了显著的疗效，但是在复杂的肿瘤微环境中(例如多种肿瘤抗原同时出现)，其对肿瘤细胞的识别、杀伤能力大大降低，限制了其临床应用。举例来说，对于淋巴细胞白血病，大多数患者的肿瘤细胞都表达cd19，但也存在不表达cd19的情况(即cd19阴性逃逸)。因此，有必要提供对恶性肿瘤靶向性较强的t淋巴细胞。

技术实现要素：

鉴于此，本发明提供了一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用。该t淋巴细胞可靶向b细胞恶性肿瘤(如淋巴细胞白血病)的两个肿瘤靶点，对肿瘤细胞的靶向性高、识别性较广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，扩大了该t细胞的广谱杀伤性。

第一方面，本发明提供了一种靶向性t淋巴细胞，包括靶向cd19的嵌合抗原受体car-cd19和/或靶向cd22的嵌合抗原受体car-cd22，其中，所述car-cd19包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向cd19的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述car-cd22包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向cd22的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向cd19的单链抗体的氨基酸序列包括如seqidno：1所示的氨基酸序列，所述靶向cd22的单链抗体的氨基酸序列包括如seqidno：2所示的氨基酸序列。

优选地，所述靶向性t淋巴细胞，可以为带car-cd19和car-cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞(即，靶向cd19和cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞)，也可以为带car-cd19的嵌合抗原受体t细胞和带car-cd22的嵌合抗原受体t细胞的混合，还可以为带所述car-cd19和所述car-cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞、带所述car-cd19的嵌合抗原受体t细胞，以及带所述car-cd22的嵌合抗原受体t细胞的混合。

此时，所述靶向性t淋巴细胞，既可以识别表面表达有cd19抗原蛋白的肿瘤细胞，也可以识别表面表达有cd22抗原蛋白的肿瘤细胞，当然对同时有cd19抗原蛋白和cd22抗原蛋白的肿瘤细胞的识别性也较好，能够有效避免肿瘤细胞出现cd19免疫逃逸的发生。

其中，当所述靶向性t淋巴细胞为带car-cd19和car-cd22的双靶点car-t时，嵌合抗原受体car-cd19和car-cd22的分布位置不作限定，可以是交替分布(例如abab…，aababb…)或依次分布(例如aaaa…bbb…)，但两者之间并无共价连接，此时它们相应的cd19单链抗体和cd22单链抗体之间也并无共价连接，这样可使它们保持较好的识别能力。

上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向cd19的单链抗体或所述靶向cd22的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。

上述提及的cd19是血液系统中b细胞系标志物，通过与b细胞上的b细胞受体的结合参与b细胞发育、细胞内信号传导等过程。cd19是b系恶性肿瘤(例如淋巴细胞白血病)较常用的靶点，但也有不少恶性b细胞中并不表达cd19。而cd22是一类糖结合跨膜蛋白，是血液系统中b细胞的重要靶标，主要表达在b细胞恶性肿瘤上，可以作为不表达cd19的b系恶性肿瘤细胞的替代靶标，能避免肿瘤细胞发生cd19逃逸。

可选地，所述靶向cd19的单链抗体的编码基因包括如seqidno：3所示的核苷酸序列，所述靶向cd22的单链抗体的编码基因包括如seqidno：4所示的核苷酸序列。本发明所述靶向cd19的单链抗体保留有对cd19抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有cd19抗原的肿瘤细胞。类似地，所述靶向cd22的单链抗体也保留有对cd22抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有cd22抗原的肿瘤细胞。

可选地，所述靶向cd19的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:1。所述靶向cd22的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。

本发明中，所述car-cd19中的胞外铰链区用于促进所述靶向cd19的单链抗体与肿瘤细胞上的cd19结合；类似地，所述car-cd22中的胞外铰链区用于促进所述靶向cd22的单链抗体与肿瘤细胞上的cd22结合。

可选地，所述胞外铰链区包括cd8α铰链区、cd28铰链区、cd4铰链区、cd5铰链区、cd134铰链区、cd137铰链区、icos铰链区中的一种或多种的组合。

进一步可选地，所述胞外铰链区为cd8α铰链区。

可选地，所述cd8α铰链区的氨基酸序列包括如seqidno：9所示的氨基酸序列。

可选地，所述cd8α铰链区的编码基因包括如seqidno：10所示的核苷酸序列。

可选的，所述cd8α铰链区的编码基因包括如seqidno：11所示的核苷酸序列。

可选地，所述cd8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:10或如seqidno：11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:10或如seqidno：11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:9。

本发明中，所述car-cd19中的跨膜区用于固定所述靶向cd19的嵌合抗原受体car-cd19；类似地，所述car-cd22中的跨膜区用于固定所述靶向cd22的嵌合抗原受体car-cd22。

可选地，所述跨膜区包括cd3跨膜区、cd4跨膜区、cd8跨膜区、cd28跨膜区中的一种或多种的组合。

进一步可选地，所述跨膜区为cd8跨膜区。

可选地，所述cd8跨膜区的氨基酸序列包括如seqidno：12所示的氨基酸序列。

可选地，所述cd8跨膜区的编码基因包括如seqidno：13所示的核苷酸序列。

可选地，所述cd8跨膜区的编码基因包括如seqidno：14所示的核苷酸序列。

可选地，所述cd8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:13或如seqidno：14所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:13或如seqidno：14具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:12。

本发明中，所述胞内信号区用于提供t细胞活化的信号，维持t细胞的生存时间和激活t细胞增殖信号通路。

可选地，所述胞内信号区包括4-1bb信号区、cd3ζ信号区、icos信号区、cd27信号区、ox40信号区、cd28信号区、il1r1信号区、cd70信号区、tnfrsf19l信号区中的一种或多种的组合。

在本发明一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的4-1bb信号区和cd3ζ信号区。相应地，所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的4-1bb信号区的编码基因和cd3ζ信号区的编码基因。

在本发明另一实施方式中，所述胞内信号区还可以为从氨基端到羧基端顺次连接的cd27信号区和cd3ζ信号区。

可选地，所述4-1bb信号区的氨基酸序列包括如seqidno：15所示的氨基酸序列。

可选地，所述4-1bb信号区的编码基因包括如seqidno：16所示的核苷酸序列。

可选地，所述4-1bb信号区的编码基因包括如seqidno：17所示的核苷酸序列。

可选地，所述4-1bb信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:13所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:16或如seqidno：17所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:16或如seqidno：17具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:15。

可选地，所述cd3ζ信号区的氨基酸序列包括如seqidno：18所示的氨基酸序列。

可选地，所述cd3ζ信号区的编码基因包括如seqidno：19所示的核苷酸序列。

可选地，所述cd3ζ信号区的编码基因包括如seqidno：20所示的核苷酸序列。

可选地，所述cd3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:18所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:19或如seqidno：20所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:19或如seqidno：20具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:18。

需要说明的是，本发明中，所述car-cd19中的胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，与所述car-cd22中对应的胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。

在本发明一实施方式中，所述car-cd19的氨基酸序列包括如seqidno：5所示的氨基酸序列。

可选地，所述car-cd19的编码基因包括如seqidno：21所示的核苷酸序列。

可选地，所述car-cd19的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:5所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:21所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:21具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:5。

在本发明一实施方式中，所述car-cd22的氨基酸序列包括如seqidno：6所示的氨基酸序列。

可选地，所述car-cd22的编码基因包括如seqidno：22所示的核苷酸序列。

可选地，所述car-cd22的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:22所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:22具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:6。

本发明第一方面提供的靶向性t淋巴细胞，包括靶向cd19的嵌合抗原受体car-cd19和/或靶向cd22的嵌合抗原受体car-cd22，能靶向两个肿瘤靶点，增强了对肿瘤细胞的识别，避免肿瘤细胞逃逸。当car-cd19和/或car-cd22与肿瘤细胞上相应的抗原蛋白结合后，所述靶向性t淋巴细胞的胞内信号区被激活，促进t细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，尤其是表达cd19和/或cd22的肿瘤细胞，扩大了该t细胞的广谱杀伤性。此外由于所述cd19和cd22的单链抗体为人源化单链抗体，这使得该靶向性t细胞避免引起人机体的免疫反应，具有持久的在体维持能力，如活性和杀伤力。

本发明所述靶向性t淋巴细胞可以高效识别并杀伤表达有cd19和/或cd22的肿瘤细胞，尤其是恶性b淋巴细胞，例如淋巴细胞白血病细胞。

第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括如第一方面所述的靶向性t淋巴细胞中所述car-cd19和/或car-cd22的编码基因。

可选地，当所述重组病毒载体含有car-cd19的编码基因和car-cd22的编码基因时，在所述重组病毒载体上所述car-cd19的编码基因和所述car-cd22的编码基因之间，还包括一特殊序列，该特殊序列用于使所述car-cd19编码基因和所述car-cd22的编码基因在转录翻译后可以得到两个独立的蛋白car-cd19和car-cd22。在采用这样的重组病毒载体转染cd3阳性t淋巴细胞后，所得的靶向性t淋巴细胞为带car-cd19和car-cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞。进一步可选地，所述特殊序列可以是rbs序列、ires序列、t2a序列或其他蛋白酶序列等。

可选地，所述重组病毒载体带有所述car-cd19的编码基因，或者带有所述car-cd22的编码基因。优选采用car-cd19编码基因的重组病毒载体与带car-cd22编码基因的重组病毒载体分开或同时地共同感染t淋巴细胞，可得到如本发明第一方面所述的靶向性t淋巴细胞，且感染效率较高，所得靶向性t淋巴细胞能较充分地表达car-cd19和/或car-cd22。

可选地，所述car-cd19的编码基因包括如seqidno：21所示的核苷酸序列。

优选地，所述car-cd19的编码基因包括如seqidno：23所示的核苷酸序列。如seqidno：23所示的核苷酸序列与如seqidno：21所示的核苷酸序列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体car-cd19表达到细胞表面。

可选地，所述car-cd22的编码基因包括如seqidno：22所示的核苷酸序列。

优选地，所述car-cd22的编码基因包括如seqidno：24所示的核苷酸序列。如seqidno：24所示的核苷酸序列与如seqidno：22所示的核苷酸序列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体car-cd22达到细胞表面。

可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。本发明第四方面提供的制备方法的步骤(1)-(3)示出了所述重组病毒载体的一种制备工艺。

本发明第二方面提供的所述重组病毒载体，具有较高的感染效率以及转录效率，其中的car-cd19和/或car-cd22的编码基因片段能通过基因重组插入宿主基因组，得到上述靶向性t淋巴细胞，使其持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的重组慢病毒载体。

本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于组装如第二方面所述的重组病毒载体，使其具有感染性。

可选地，所述宿主细胞包括但不限于hek293t细胞、293细胞、293t细胞、293ft细胞、sw480细胞、u87mg细胞、hos细胞、cos1细胞和cos7细胞。

第四方面，本发明提供了一种靶向性t淋巴细胞的制备方法，包括：

(1)分别提供靶向cd19的嵌合抗原受体car-cd19的编码基因和靶向cd22的嵌合抗原受体car-cd22的编码基因；

所述car-cd19的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向cd19的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述car-cd22的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向cd22的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；

其中，所述靶向cd19的单链抗体的编码基因包括如seqidno：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向cd22的单链抗体的编码基因包括如seqidno：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

(2)将所述car-cd19的编码基因和所述car-cd22的编码基因分别插入到pwpxld载体中，得到pwpxld-car-cd19重组质粒和pwpxld-car-cd22重组质粒；

(3)分别对所述pwpxld-car-cd19重组质粒和所述pwpxld-car-cd22重组质粒进行包装，得到带car-cd19编码基因的第一重组慢病毒以及带car-cd22编码基因的第二重组慢病毒；

(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染cd3阳性t淋巴细胞，经分离获得靶向性t淋巴细胞。

以car-cd19的编码基因为例，上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因序列的3’端与所述靶向cd19的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向cd19的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。

本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体car-cd19或car-cd22表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。而car-cd19的编码基因中信号肽与所述car-cd22的编码基因中信号肽的氨基酸序列可以相同，也可以不同，也可以是它们的信号肽的氨基酸序列相同，而核苷酸序列不同。

可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如seqidno：25所示的氨基酸序列。

可选地，所述信号肽的编码基因包括如seqidno：26所示的核苷酸序列。

可选地，所述信号肽的编码基因包括如seqidno：27所示的核苷酸序列。

可选地，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如seqidno:25所示的氨基酸序列的编码基因包括如seqidno:26或如seqidno:27所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与seqidno:26或seqidno:27具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为seqidno:25。

对于所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列，可参见本发明第一方面所述，这里不再赘述。

可选地，所述car-cd19的编码基因包括如seqidno：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。

可选地，所述car-cd19的编码基因包括如seqidno：23所示的核苷酸序列。当然，所述car-cd19的编码基因也可包括与seqidno：23所示序列具有碱基简并性质的核苷酸序列。

可选地，所述car-cd22的编码基因包括如seqidno：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。

可选地，所述car-cd22的编码基因包括如seqidno：24所示的核苷酸序列。当然，所述car-cd22的编码基因也可包括与seqidno：24所示序列具有碱基简并性质的核苷酸序列。

以car-cd19为例，seqidno：23与seqidno：21所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因，但在嵌合抗原受体car-cd19表达到t细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的嵌合抗原受体car-cd19的氨基酸序列(seqidno：5)中并未带有如seqidno：25所示的氨基酸序列。car-cd22的情况与之类似。

以car-cd19为例，所述car-cd19的编码基因序列插入到pwpxld载体中bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点之间，且位于pwpxld载体的延伸因子1α(ef1α)之后，以ef1α为启动子。所述car-cd19的编码基因序列插入到pwpxld载体时，所述car-cd19的基因序列的5’端还可加入起始密码子(如atg)与pwpxld载体中bamh1酶切位点相连，3’端还可加入终止密码子与pwpxld载体中ecor1酶切位点相连。car-cd22的情况与之相同。

可选地，步骤(3)中，所述“分别对所述pwpxld-car-cd19重组质粒和所述pwpxld-car-cd22重组质粒进行包装，得到带car-cd19编码基因的第一重组慢病毒以及带car-cd22编码基因的第二重组慢病毒”，包括：

将所述pwpxld-car-cd19重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第一重组慢病毒；将所述pwpxld-car-cd22重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到所述第二重组慢病毒。

采用本发明所述的方式制备重组质粒及包装病毒，其中，所述pwpxld-car-cd19重组质粒和pwpxld-car-cd22重组质粒上，car-cd19和car-cd22的编码基因经过了密码子优化，且分子量适宜，重组慢病毒的包装效率高，同时通过宿主细胞制得的病毒的浓度较高。相应地，采用第一重组慢病毒和第二重组慢病毒来联合转染cd3阳性t淋巴细胞时，这两种重组慢病毒的用量较低，可降低实验成本。

本发明一实施方式中，所述包膜质粒为pmd2g，所述包装质粒为pspax2，所述宿主细胞为hek293t细胞。

所述包膜质粒pmd2g编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳可以协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。

本发明所述重组慢病毒可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(mumlv)4070a株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自mumlv10al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gb、gd、gh、gp85蛋白，eb病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出b型肝炎病毒的s蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。

重组慢病毒的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293t细胞、293ft细胞、293ltv细胞、293ebna细胞及其他的从293细胞分离的克隆；sw480细胞、u87mg细胞、hos细胞、c8166细胞、mt-4细胞、molt-4细胞、hela细胞、ht1080细胞、te671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，cos1细胞、cos7细胞、cv-1细胞、bmt10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和pei转染试剂，还有一些转染试剂如lipofectamine2000、fugene和s93fectin也被经常使用。

重组慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的env糖蛋白、vsvg蛋白或hiv-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。

为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、rev基因、vsvg基因、sin转移基因分别位于四个不同的质粒)、三质粒系统(去掉了编码rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。

可选地，步骤(4)中，所述cd3阳性t淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

具体地，所述cd3阳性t淋巴细胞的获得过程如下：先将外周血单个核细胞按一定比例加入cd3/cd28免疫磁珠，并孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的cd3阳性t淋巴细胞，去除磁珠后，获得cd3阳性t淋巴细胞。

其中，步骤(4)中，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染cd3阳性t淋巴细胞，包括：

先采用所述第一重组慢病毒转染cd3阳性t淋巴细胞后，再采用所述第二重组慢病毒进行转染；或先采用所述第二重组慢病毒转染cd3阳性t淋巴细胞后，再采用所述第一重组慢病毒进行转染；或采用所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒同时地转染cd3阳性t淋巴细胞。这里“联合转染”是指针对同一组细胞进行。

进一步地，步骤(4)中，所采用的第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。

本发明中，制备得到的所述靶向性t淋巴细胞包括带所述car-cd19和所述car-cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞、带所述car-cd19的嵌合抗原受体t细胞和带所述car-cd22的嵌合抗原受体t细胞中的至少一种。

可选地，所述靶向性t淋巴细胞包括带所述car-cd19和所述car-cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞，或者包括带所述car-cd19的嵌合抗原受体t细胞和带所述car-cd22的嵌合抗原受体t细胞的混合，或者为带所述car-cd19和所述car-cd22的双靶点嵌合抗原受体t细胞、带所述car-cd19的嵌合抗原受体t细胞，以及带所述car-cd22的嵌合抗原受体t细胞这三种的混合。

此时，靶向性t淋巴细胞的表面具有两个独立的、未共价结合的嵌合抗原受体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能同时、高效地识别肿瘤细胞上的cd19和cd22靶标。所述靶向性t淋巴细胞对表达cd19和cd22中一种或两种的肿瘤细胞均能识别和杀伤，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，提高了其靶向识别的广度和强度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。

在本发明另一实施方式中，当所需靶向性t淋巴细胞为带所述car-cd19的嵌合抗原受体t细胞和带所述car-cd22的嵌合抗原受体t细胞的混合时，也可以采用以下方式制得：采用上述第一重组慢病毒转染cd3阳性t淋巴细胞，得到带所述car-cd19的嵌合抗原受体t细胞；采用上述第二重组慢病毒转染cd3阳性t淋巴细胞，得到带所述car-cd22的嵌合抗原受体t细胞；然后将这两种嵌合抗原受体t细胞进行混合。这样也可用于b系恶性肿瘤的诊断和/或治疗。

本发明第四方面提供的靶向性t淋巴细胞的制备方法中，采用带car-cd19编码基因的第一重组慢病毒以及带car-cd22编码基因的第二重组慢病毒分别或同时地联合转染cd3阳性t淋巴细胞，可使得制得的靶向性t淋巴细胞上嵌合抗原受体car-cd19和/或car-cd22的表达效率更高，以具有较好的肿瘤识别、杀伤能力。

第五方面，本发明提供了一种如本发明第一方面所述的靶向性t淋巴细胞、如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第三方面所述的宿主细胞或如本发明第四方面所述的制备方法制得的靶向性t淋巴细胞在制备诊断和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

特别地，适用于表达cd19和/或cd22的恶性肿瘤，尤其是恶性b淋巴细胞相关的肿瘤，例如b淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤等的诊断和治疗。

所述应用可以具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向性t淋巴细胞或采用如第二方面所述的重组病毒载体转染得到的靶向性t淋巴细胞或采用如第四方面所述的制备方法所制得的靶向性t淋巴细胞，如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。

本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pwpxld-car-cd19重组质粒的质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的pwpxld-car-cd22重组质粒的质粒图谱。

图3为本发明实施例提供的靶向性t淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤效果图。

图4为本发明实施例提供的靶向性t淋巴细胞治疗肿瘤小鼠的效果图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例一一种靶向性t淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备靶向cd19的嵌合抗原受体car-cd19的基因序列

分别制备信号肽、靶向cd19的单链抗体、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb信号区和cd3ζ信号区的编码基因，所述car-cd19中，信号肽的编码基因如seqidno：26所示，靶向cd19的单链抗体的编码基因如seqidno：3所示，cd8α铰链区的编码基因如seqidno：10所示，所述cd8跨膜区的编码基因如seqidno：13所示，所述4-1bb信号区的编码基因如seqidno：16所示，所述cd3ζ信号区的编码基因如seqidno：19所示。

通过pcr的方法将上述信号肽、靶向cd19的单链抗体、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb信号区和cd3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到car-cd19的编码基因，该car-cd19的编码基因如seqidno：23所示。

(2)制备靶向cd22的嵌合抗原受体car-cd22的基因序列

分别制备信号肽、靶向cd22的单链抗体、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb信号区和cd3ζ信号区的编码基因，所述car-cd22所用的信号肽的编码基因如seqidno：27所示，靶向cd22的单链抗体的编码基因如seqidno：4所示，cd8α铰链区的编码基因如seqidno：11所示，cd8跨膜区的编码基因如seqidno：14所示，所述4-1bb信号区的编码基因如seqidno：17所示，所述cd3ζ信号区的编码基因如seqidno：20所示。

通过pcr的方法将上述信号肽、靶向cd22的单链抗体、cd8α铰链区、cd8跨膜区、4-1bb信号区和cd3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到car-cd22的编码基因，该car-cd22的编码基因如seqidno：24所示。

(3)构建pwpxld-car-cd19重组质粒和pwpxld-car-cd22重组质粒

将car-cd19的编码基因插入到pwpxld载体的bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点之间，并在pwpxld载体ef1α之后，以ef1α为启动子。所述car-cd19的编码基因插入到pwpxld载体时，所述car-cd19的编码基因的5’端可加入起始密码子(如atg)与pwpxld载体中bamhⅰ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如taa)与pwpxld载体中ecorⅰ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞dh5α，进行阳性克隆pcr鉴定和测序鉴定。经过pcr产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pwpxld-car-cd19重组质粒。

将car-cd22的编码基因插入到pwpxld载体的bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点之间，并在pwpxld载体ef1α之后，以ef1α为启动子。其中当所述car-cd22的编码基因插入到pwpxld载体时，所述car-cd22的编码基因的5’端可加入起始密码子(如atg)与pwpxld载体中bamhⅰ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如taa)与pwpxld载体中ecorⅰ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞dh5α，进行阳性克隆pcr鉴定和测序鉴定。经过pcr产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图2所示的pwpxld-car-cd22重组质粒。

(4)重组慢病毒构建

将pwpxld-car-cd22重组质粒、包装质粒pspax2、包膜质粒pmd2g三者共转染入培养好的hek293t细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并一起加入超速离心管中，逐一放入至beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，将病毒按照100μl、2×10⁸tu/ml分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带car-cd19的第一重组慢病毒。

(5)靶向性t淋巴细胞的制备

a)pbmc(外周血单个核细胞)的分离

pbmc来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，ficoll离心分离后取中间层细胞；经pbs洗涤后，得到pbmc。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性t淋巴细胞

取上述pbmc，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入cd3/cd28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；pbs洗涤，去除免疫磁珠后，得到cd3阳性t淋巴细胞。

c)病毒转染法制备抗原特异性t淋巴细胞

取上述经过免疫磁珠分离法得到的cd3阳性t淋巴细胞，同时加入与cd3阳性细胞数相应的病毒滴度的带car-cd19的第一重组慢病毒和带car-cd22的第二重组慢病毒进行共同培养，其中第一重组慢病毒与第二重组慢病毒的用量(滴度)之比是1：1。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/ml，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性t淋巴细胞，即car-cd19单阳性t淋巴细胞，car-cd22单阳性t淋巴细胞，和car-19/car-cd22双阳性t淋巴细胞细胞的混合，并将其保存在回输专用的细胞冻存液中。

效果实施例

效果实施例一：评估本发明靶向性t淋巴细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况

将经过本发明实施例一制得的靶向性t淋巴细胞(实验组)与未经制备的t淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的car–cd19的t细胞(cd19car–t单独组)以及具有单独的car–cd22的t细胞(cd22car–t单独组)进行比较，在体外将上述四组效应细胞与靶细胞(raji细胞或nalm-6细胞)按数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1的比例，在37℃、5％co2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果如图3所示。从图3中可看出，经过本发明所述的方法制备的靶向性t淋巴细胞的肿瘤杀伤力在60％以上，甚至可达99％，远远高于其他对照组，这说明经本发明方法制备的靶向性t淋巴细胞具有超强的肿瘤杀伤能力。

效果实施例二，评估本发明靶向性t淋巴细胞对小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况

将本发明实施例一制备的靶向性t淋巴细胞(实验组)与未经制备的t淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的car–cd19的t细胞(cd19car–t单独组)以及具有单独的car–cd22的t细胞(cd22car–t单独组)，在小鼠淋巴细胞白血病肿瘤模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线，结果如图4所示。从图4可以看出经过本方法制备的靶向性t淋巴细胞能在注入小鼠体内60天后，使得小鼠存活率能稳定在50％，远远超过阴性对照组和以上两个单独组。图4的结果表明提供的靶向性t淋巴细胞能较好地保护小鼠免于因淋巴细胞白血病导致的死亡。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>深圳宾德生物技术有限公司

<120>一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用

<160>27

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>242

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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100105110

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130135140

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145150155160

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<213>人工序列(artificialsequence)

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