本发明属于生物医药和功能性食品领域，特别涉及一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法。
背景技术：
亚麻(linumustitatissimuml.)，又称胡麻、鸦麻，属亚麻科亚麻属一年生草本植物，广泛分布于世界50多个国家，主要产地有加拿大、中国、印度、美国、埃塞俄比亚等国家，世界范围内种植面积在260万公顷。亚麻籽是亚麻的种子，常作为一种重要的油料种籽，世界范围内年产量在230万吨左右。亚麻籽中富含脂肪、蛋白质、膳食纤维素、维生素、矿物质等营养成分以及ω-3/6不饱和脂肪酸、木酚素、植物多糖、环肽等功能因子，具有多种营养功能和保健功效。其中亚麻籽多糖是从亚麻籽中提取出来的天然高分子聚糖体，作为一种可溶性的膳食纤维，亚麻籽多糖有降低血胆固醇水平、减少冠状动脉硬化、降低糖尿病、预防结肠癌等作用，此外，亚麻籽多糖还具有良好的持水性、胶凝性、乳化性，常以亚麻籽胶的形式用做食品添加剂。研究表明亚麻籽多糖由酸性多糖和中性多糖组成，酸性多糖主要由鼠李糖、岩藻糖、半乳糖醛酸组成；中性多糖主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖组成。
多糖为来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然高分子化合物，是构成生命的四大基本物质之一。近年来，由于其重要的生理功能而引起了人们越来越大的兴趣，对植物多糖的研究己成为药物研究的热点之一。大量实验研究表明，多糖类成分是人体内重要的信息物质，参与人体的许多生理和病理过程。植物多糖来源广泛，目前已有百余种植物的多糖被分离提取出来，其最大的优点是没有细胞毒性，作为药物毒副作用小，因此，国内外有大量聚焦于植物多糖及其结构、活性的研究。但是，目前关于亚麻籽多糖的研究报道还较为少见，目前公开的与亚麻籽多糖的提取或制备相关的专利有：中国专利申请公布号cn1221771、cn1242952、cn1263139，这些专利涉及的内容都是关于传统的热水浸提亚麻籽胶工艺的改进，并未涉及到亚麻籽多糖的结构及生物活性。专利申请号cn201510391862.6研究了一种新型亚麻籽多糖fhp-1的制备及其免疫调节、抗病毒活性，但是工艺过程十分复杂，制备效率低，产品得率不高，快速、高效制备具有抗病毒和免疫调节活性的高纯度亚麻籽多糖的研究尚未见报道。
技术实现要素：
针对传统方法制备亚麻籽多糖的效率低下问题，本发明的首要目的是在于提供一种新型亚麻籽多糖fhp-2的简单、快速制备工艺，本发明的另一个目的是采用这种快速制备方法得到新型亚麻籽多糖fhp-2。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法，包括以下步骤：
1)亚麻籽壳仁分离：采用乙醇湿法过滤技术实现亚麻籽壳仁分离。亚麻籽经充分破碎后，采用乙醇洗涤脱脂，然后混合料液过筛，筛截留部分为脱脂亚麻籽壳，干燥后得到亚麻籽壳，用于亚麻籽多糖的提取；
2)亚麻籽多糖的提取：以步骤1)得到的干燥亚麻籽壳为原料，采用超声波辅助热水浸提法得到亚麻籽粗多糖提取液，过滤除去亚麻籽壳，收集滤液，离心除去不溶物，取上清液浓缩脱水并冷冻干燥后得到亚麻籽粗多糖；
3)脱蛋白和醇沉：步骤2)所得到的亚麻籽粗多糖加水溶解后采用木瓜蛋白酶脱除亚麻籽粗多糖中的游离及结合蛋白，酶处理后高温灭酶，离心除去变性酶沉淀，取上清液浓缩至适宜浓度后采用乙醇沉淀的方法除去醇溶性小分子，离心、复溶、冷冻干燥后得到初步纯化亚麻籽多糖；
4)柱层析纯化：步骤3)所得到的初步纯化亚麻籽多糖，上样于deae-sepharosefastflow柱，依次用0～2.0mol/lnacl溶液阶梯式洗脱，分管收集，用苯酚硫酸法检测多糖含量，得到洗脱曲线；收集第二个洗脱峰组分糖液，旋转蒸发浓缩，透析48h后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2mg/ml溶液，上样于sephadexg-100葡聚糖凝胶柱，用对应的洗脱液洗脱，收集多糖组分，再次透析后收集截留液，浓缩、冷冻干燥得到纯化亚麻籽多糖fhp-2。
如上所述的一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法，步骤1)所述的乙醇湿法过滤技术是指：加破碎后亚麻籽重量3–5倍体积的95％乙醇水溶液或无水乙醇在40–70℃条件下搅拌洗涤0.5–2.0h，然后将料液搅拌均匀后迅速过425μm筛，亚麻籽壳被截留，然后采用真空或常压干燥得到亚麻籽壳。
如上所述的一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法，步骤2)所述超声波辅助热水浸提的工艺条件为：采用超声波提取仪，将亚麻籽壳和水按质量比1：20–1：50混合，温度60–100℃,超声功率150–300w,提取时间40–100min；过滤采用425μm筛；离心速度为3000–6000r/min，离心时间5–10min；浓缩采用真空浓缩。
如上所述的一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法，步骤3)所述的酶法脱蛋白工艺条件为：亚麻籽粗多糖加水溶解至亚麻籽粗多糖质量百分含量为1％–5％后，加入相当于亚麻籽粗多糖质量0.5％–2.5％的木瓜蛋白酶，在50–70℃条件下振荡酶解0.5–2.5h，灭酶温度为100℃；醇沉是指采用粗浓缩糖溶液4倍体积的无水乙醇在4℃沉淀8–12h，醇沉期间定时搅拌沉淀物，沉淀结束后2500–5000r/min条件下离心去除乙醇。
如上所述的一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法，步骤4)所述的deae-sepharosefastflow离子交换柱层析具体条件为：上样浓度为5mg/ml,洗脱液为0～2.0mol/lnacl溶液，洗脱速度为1ml/min，30管一个梯度，每管收集5ml；所述透析为采用mw＝3500da的透析袋在去离子水中透析48h，期间每8h换一次水，浓缩为真空浓缩，冷冻干燥时间为12–24h。
如上所述制备方法获得的具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖，所述具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖为白色纤维(絮)状天然聚合物大分子植物多糖，得率为1.32％(相对于全籽)，组分均一，经凝胶渗透色谱法测得相对分子量为1182kda，经气相色谱测定fhp-2由7种单糖和1种糖醛酸组成，分别为：l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、l-岩藻糖、d-木糖、半乳糖醛酸、d-甘露糖、d-葡萄糖、d-半乳糖。
如上所述的具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖具有三螺旋结构，同时具有抗乙肝病毒和免疫调节活性。所述新型亚麻籽多糖fhp-2具有一定的抗乙肝病毒活性，添加fhp-2的药物组与空白对照组相比，明显够降低乙肝表面抗原(hbsag)、乙肝e抗原(hbeag)的表达和抑制乙肝病毒dna的表达水平，并且具有量效关系。所述的亚麻籽多糖fhp-2的m1型巨噬细胞极化试验结果显示，巨噬细胞经lps刺激后，m1/m2平衡开始向m1方向发展，raw264.7细胞主要表达m1型巨噬细胞的功能，并且在形成m1活化时，中高剂量的fp-2组一定程度上促进了raw264.7细胞诸多炎症因子il-6、il-10、tgf-β、tnf-α和inosmrna的分泌，极大的增加了细胞的免疫功能。
上述制备方法得到了一种新型具的具有抗乙肝病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖fhp-2。所述制备方法工艺简单，乙醇湿法脱壳及酶法去蛋白工艺大大减轻了工作量，缩短了工艺时间，超声波辅助萃取技术与传统热水浸提技术相比大大提高了亚麻籽多糖的提取效率。
所述亚麻籽fhp-2制备方法简单、高效、快速，可作为制备亚麻籽多糖的一般工艺进行推广，所述新型亚麻籽多糖fhp-2具有抗乙肝病毒和免疫调节活性，有潜力开发为新型药物和功能食品添加剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明在亚麻籽多糖的制备工艺上有以下三点优势：①首次采用乙醇湿法过滤技术实现了亚麻籽壳仁分离，相比于专利申请号cn201510391862.6报道的溶剂密度法分离，本方法具有工艺简单、快速、高效、壳得率高、溶剂残留少的特点；②超声波辅助萃取法相比于传统热水浸提法提取亚麻籽多糖(胶)，可利用超声波的物理作用，通过高频振荡，产生空化作用、机械作用和热学作用，从而使物体内部产生振荡、生长、收缩，增加分子的运动频率和速率，使植物组织和细胞变形破裂，并释放出内含物，从而促进细胞内的分子溶出，大大提高了亚麻籽多糖的提取效率，比传统热水浸提法时间节省了6–8倍。③专利申请号cn201510391862.6报道的sevage去蛋白工艺过程十分繁琐，且蛋白质去除不彻底，本发明首次利用木瓜蛋白酶脱除亚麻籽多糖中的蛋白质，条件温和，方法简单，蛋白脱除效率高(能有效脱除游离蛋白和结合蛋白)，无溶剂残留，保证了亚麻籽多糖的生物活性。
(2)本发明得到的亚麻籽多糖fhp-2相比于专利申请号cn201510391862.6报道的亚麻籽多糖fhp-1，具有分子量更小、易于人体消化吸收的特点；fhp-2是一种未见报道的新型多糖，由7种单糖分子通过特异性糖苷键连接而成，具有双螺旋结构，并首次证明了fhp-2具有抗乙肝病毒活性和免疫调节活性，能明显降低乙肝表面抗原(hbsag)、乙肝e抗原(hbeag)的表达和抑制乙肝病毒dna的表达水平，可显著提高小鼠巨噬细胞raw264.7分泌肿瘤坏死因子tnf-a、白细胞介素il-6、il-12及炎症因子no，可用于作为预防hbv的新型药物以及提高机体免疫功能的食品和保健品。
(3)本发明采用常用的油料种籽亚麻籽为原料，有方便经济的原料基础，制备方法简单可靠，绿色安全，产品具有优良的理化特性及抗乙肝病毒和免疫调节活性，可考虑作为新型药物或功能性食品配料，本发明拓宽了油料种籽亚麻籽的应用范围，丰富了多糖类物质的品种，为亚麻籽系列产品深开发提供了理论参考和现实依据。
附图说明
图1是fhp-2的deae-sepharosefastflow洗脱曲线。
图2是fhp-2的sephadexg-100洗脱曲线。
图3是fhp-2的分子量分布曲线。
图4是fhp-2的单糖组成气相色谱图，a、b分别是单糖标准品图谱和fhp-2的单糖组成气相色谱图。
图5是fhp-2的刚刚果红试验结果，即不同碱浓度下刚果红与fp-2混合液的最大吸收波长变化。
图6是亚麻籽硫酸酯多糖(fhp-2)对hepg2.2.15细胞的抗病毒活性的影响，阳性对照拉米夫定的浓度为20μg/ml，其中a是亚麻籽fhp-2对hepg2.2.15细胞存活率的影响图；b、c、d分别是亚麻籽硫酸酯多糖fhp-2对hbeag、hbsag以及dna的影响图。
图7是fhp-2对raw264.7细胞m1极化因子(a)il-6,(b)il-10,(c)tgf-β,(d)tnf-α和(e)inosmrna表达的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例1：亚麻籽多糖fhp-2的制备
一种快速制备具有抗病毒和免疫调节活性的亚麻籽多糖的方法，包括以下步骤：
1)亚麻籽壳仁分离：亚麻籽经清理除杂后充分破碎后得到亚麻籽粉，经过两次乙醇洗涤后进行湿法筛分，取筛截留部分，充分干燥后得到亚麻籽壳。乙醇洗涤的条件为：洗涤温度50℃，洗涤时间30min，料液比1:4，醇洗过程中不断搅拌；湿法筛分的具体操作为：充分搅匀醇洗体系混合物，使固体物料均匀悬浮在乙醇体系中，然后快速将混合物料过425μm筛，使醇提物与细小的亚麻籽仁颗粒通过筛孔，亚麻籽壳由于颗粒较大被截留在筛子上面。经此法处理亚麻籽壳的得率为23.12％。
2)亚麻籽多糖的提取：以干燥的亚麻籽壳为原料，采用qq-t650ct型超声波提取仪进行提取，控制料液比为1：30，温度80℃,超声功率250w,提取时间60分钟。提取液过425μm筛后离心10min，控制转速为5000r/min，离心时间10min,取上清液60℃下浓缩至合适体积，-80℃冻结后进行冷冻干燥，得到亚麻籽粗多糖。此条件下亚麻籽粗多糖得率为7.62％。
3)脱蛋白和醇沉：亚麻籽粗多糖加水溶解至亚麻籽粗多糖质量百分含量为0.5％,加入相当于亚麻籽胶质量2％的木瓜蛋白酶，在60℃的条件下振荡酶解1h，酶解结束后100℃煮沸灭酶，离心除去变性酶沉淀，取上清液浓缩至适当体积后加4倍体积的无水乙醇在4℃条件下沉淀12h，离心除去乙醇，沉淀物加水溶解，-80℃冻结后进行冷冻干燥，得到初步纯化亚麻多糖。此条件下亚麻籽多糖蛋白脱除率为92.34％，紫外光谱260nm及280nm处几乎无吸收。
4)柱层析纯化：初步纯化的亚麻籽多糖溶于水配成5mg/ml溶液，上样于deae-sepharosefastflow柱，依次用0～2.0mol/lnacl溶液阶梯式洗脱，保持流速1ml/min，30管一个梯度，每管收集5ml，分管收集后，用苯酚硫酸法检测多糖含量，合并糖反应阳性收集液，50℃旋转蒸发浓缩，透析48h(3500da)后真空冷冻干燥；将干燥后的多糖配成2mg/ml溶液，上样于sephadexg-100葡聚糖凝胶柱，用对应的洗脱液洗脱，收集第二个多糖组分，再次透析后收集截留液，浓缩、冷冻干燥得纯化亚麻籽多糖fhp-2。柱层析纯化结果见附图1、2，所得到的fhp-2为第二个洗脱组分(附图1)。
实施例2：亚麻籽多糖fhp-2的表征
(1)相对分子质量的测定
用超纯水溶解fhp-2配制成2.5mg/ml的样品溶液，采用gpc对其进行纯度和分子量的测定。具体测试条件和方法如下：采用tskg-5000pwxl和tskg-3000pwxl色谱柱串联，2414型示差折光检测器，柱温为35℃，流动相为0.02mol/l的kh2po4，流速为0.6ml/min。结果表明fhp-2组分均一，相对分子量为1182kda。
(2)单糖组成分析
多糖样品水解：取10mgfhp-2样品，添加4.0ml的2mol/l三氟乙酸110℃水解8h后旋干水解液，用甲醇清洗3次，趁热用n2吹干。
单糖衍生化：向水解后的样品中加入10mg盐酸羟胺、1mg内标肌醇以及0.5ml吡啶，于90℃反应0.5h，冷却后再加0.5ml乙酸酐于90℃反应0.5h，冷却后加水和氯仿萃取3次，取氯仿层蒸干，残渣用氯仿溶解，0.22μm有机相滤膜过滤，取过滤清夜，待gc分析。
气相色谱(gc)条件：hp-5石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；载气为n2；进样量：1μl；流速为1ml/min；不分流，进样口温度：250℃；fid检测器的温度设置为250℃；程序升温：初始温度100℃，保持0.5min，以3℃/min升至160℃，改变升温速度，继续升温。以10℃/min的速度升到250℃，并保持5min。
如附图4，结果表明fhp-2由7种单糖和1种糖醛酸组成，摩尔百分含量分别为：l-鼠李糖(11.27％)、l-阿拉伯糖(4.03％)、l-岩藻糖(2.82％)、d-木糖(7.12％)、半乳糖醛酸(55.75％)、d-甘露糖(2.99％)、d-葡萄糖(4.41％)、d-半乳糖(11.61％)。
(3)甲基化分析
称取20mgfhp-2于血清瓶中，加入6ml二甲基亚砜超声溶解，加入200mg氢氧化钠，继续超声处理30min，密封过夜。
甲基化：向血清瓶中加入3.6ml碘甲烷，避光反应12h后加入2ml蒸馏水终止反应。加入三氯甲烷反复萃取5次，合并有机相，重复加蒸馏水洗涤有机相5次，收集有机相并旋干。用色谱纯甲醇进行清洗3次，得到甲基化多糖。
甲基化多糖水解：参照实施例2中单糖组成分析过程中的样品水解方法。
还原：加入4ml蒸馏水，逐渐加入氢氧化钠溶液调节ph值至10～12，加入100mg硼氢化钠，恒温低速震荡过夜。用冰醋酸调节样品溶液ph值至5.5，旋干反应液。加入色谱纯甲醇蒸干，重复进行3次。
衍生化：参照实施例2中单糖组成分析过程中的乙酰化方式进行衍生化，过0.22μm有机相滤膜后进行gc-ms分析。
气相色谱质谱(gc-ms)条件：tr-5ms弹性毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)；载气为氦气；进样量为1ul；流速为1ml/min，进样分流比10:1；进样口温度：250℃；程序升温：初始温度150℃，保持2min，以10℃/min升至180℃，保持2min，改变升温速度，继续升温。以15℃/min的速度升到260℃，并保持5min。
甲基化分析结果(见下表)表明，fp-2主要是由→4)-galp-(1→、→2,4)-galp-(1→、→2)-rhap-(1→和glup-(1→组成，其中→2)-rhap-(1→占到了28.06％，→4)-galp-(1→、→2,4)-galp-(1→分别占到31.21％和21.53％，说明fp-2多糖是以1→4连接的半乳糖为主链。
表1fp-2多糖甲基化产物分析结果
4)三螺旋结构分析
配置1mg/ml的fhp-2溶液，取2ml浓度为100μmol/l的刚果红试剂与2ml的多糖溶液混合，逐渐加入4mol/l的naoh溶液，使混合溶液中naoh浓度由0mol/l逐渐增加到0.5mol/l。以不加多糖的刚果红溶液为对照，于400～800nm波长范围内进行扫描，比较其最大吸收波长的变化。如附图4，结果表明，fhp-2可以与刚果红形成络合物的最大吸收波长同刚果红相比发生红移，表明fhp-2中存在三螺旋构象，可能有较好的生物活性。
实施例3：fhp-2的抗乙肝病毒活性
(1)mtt实验
取活化的对数生长期hepg2.2.15细胞以1×105个/ml浓度接种于96孔板，置于5％co2，37℃条件下培养，24h后，换加fhp-2的药物组150μl，以不加药物组作为空白对照，继续培养。24h后加入20μlmtt溶液，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在波长为450nm下测定其吸光度值，根据下面公式计算细胞的存活率(sr)：
存活率sr(％)＝a1/a0×100％，其中a1为样品组平行试验的吸光值，a0为对照组平行试验的吸光值。
结果表明，fhp-2对hepg2.2.15细胞存活率的影响如图6a所示，存活率都大于90％，说明fhp-2对hepg2.2.15细胞无抑制作用。
(2)fhp-2对hepg2.2.15细胞hbeag和hbsag的分泌及hbv-dna复制的影响
取活化的对数生长期hepg2.2.15细胞，用6cm培养板培养，每个培养板细胞数为5×105万。24h后加亚麻籽多糖fhp-2作为药物组，以不加药物组为空白对照，加20ug/ml的拉米夫定作为阳性对照。培养24h收集培养上清液，并加入新的细胞液培养。将上清液稀释100倍以检测hbsag，稀释10倍检测hbeag，并检测不同浓度组上清液中的hbv-dna的含量。hbeag和hbsag的检测按对应的试剂盒说明书操作，hbv-dna的检测按普通qpcr的试剂盒说明书操作。在酶标仪于450nm处测量各孔的吸光值。
结果表明(图6b、c、d)，添加了fhp-2的药物组与空白对照相比明显的抑制了hbeag、hbsag的分泌和hbv-dna的复制，对抗hbv病毒有显著作用，并且具有量效关系。
实施例4：fhp-2的免疫调节活性
(1)mtt实验
raw264.7细胞以1×106个/ml浓度接种于96孔板，于5％co2，37℃条件下培养，24h后，去除上清液换新鲜培养液，加入20μl的亚麻籽硫酸酯多糖药物，以不加药物组作为空白对照，加20μg/ml的脂多糖作为阳性对照继续培养。24h后加入20μlmtt溶液，继续培养4h后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。结果如图7a所示，表明fhp-2对raw264.7细胞存活率的影响存活率都大于95％，说明fhp-1对raw264.7细胞无抑制作用。
(2)fp-2多糖对极化m1型巨噬细胞的调节作用
取活化对数生长期的raw264.7细胞以1×106个/ml浓度接种于6孔板，于5％co2，37℃条件下培养，贴壁后，分别给与合适浓度的lps刺激一定时间，弃去上清液，用pbs洗涤细胞，提取rna后用rt-pcr检测免疫因子tgf-β、il-6、il-10、tnf-α和inos相应mrna的表达。结果如图7b、c、d、e、f所示，表明巨噬细胞经lps刺激后，m1/m2平衡开始向m1方向发展，raw264.7细胞主要表达m1型巨噬细胞的功能，并且在形成m1活化时，中高剂量的fp-2组一定程度上促进了raw264.7细胞诸多炎症因子il-6、il-10、tgf-β、tnf-α和inosmrna的分泌，极大的增加了细胞的免疫功能。