本发明属于染色技术领域，具体地说，涉及一种革兰氏染色质控片及其制作方法和应用。
背景技术：
现有技术中，临床、实验上对细菌进行革兰氏染色容易出现“假阳”和“假阴”现象，通常是由于革兰氏染色试剂的质量或者染色中时间处理不当导致，例如脱色时间过长容易出现“假阴”，脱色时间过短容易出现“假阳”。在临床上，治疗革兰氏阳性菌与治疗革兰氏阴性菌所使用的抗生素都是不一样的，所以染色结果的正确性对医生合理开药也是影响重大的。
现有方法中通常采用下列方式来确保革兰氏染色实验的正确性：(1)对样品菌进行简单染色(美蓝、结晶紫或碱性复红等染剂处理)，镜检该样品菌的形态，样品菌的形态可以是球状、或者杆状、或者螺旋状、或者其它特殊形态，但是只能是其中一种形态；(2)若镜检后发现样品菌是球状，那么在实验室里需要培养大肠杆菌；若镜检后发现样品菌是杆状或螺旋状，需要在实验室里培养金黄色葡萄球菌；(3)若样品菌是球状，那么样品菌与大肠杆菌在载玻片的同一位置进行混合涂片、干燥、固定、革兰氏染色直至镜检，镜检时，先观察混合涂片区域的大肠杆菌是否为红色，若是红色，说明本次革兰氏染色结果是正确的，再看混合涂片区域的样品菌，样品菌是红色，那就是阴性，样品菌是紫色或蓝紫色，那就是阳性；(4)若样品菌是杆状，那么样品菌需要与金黄色葡萄球菌进行混合涂片；(5)上述所说的混合涂片区域是同时含有样品菌和大肠杆菌(或者金黄色葡萄球菌)的。但上述的传统方法比较费时，需要每次对样品菌简单染色进行镜检，知道什么形态后，才能决定培养大肠杆菌或是金黄色葡萄球菌。
同时传统上的革兰氏染色多采用初染、媒染、脱色和复染的四步法，目前为止大多数学者对传统的革兰氏染色四步法进行了染色过程的优化调整，例如对染色时间和脱色时间的优化筛选，或者对染色试剂进行改进；但上述的方法都需要做大量的对比参照才能实现染色结果的准确，对于大批量未知菌的染色鉴定，这种方式效率低且错误率高，为了保证染色结果的正确性则需要每组未知菌都需要培养革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的模式菌株，增加了工作量。
技术实现要素：
1、要解决的问题
针对现有技术中临床和实验上对细菌进行革兰氏染色时由于无法准确判断染色结果的颜色致使容易出现“假阳”和“假阴”现象的问题，本发明提供一种革兰氏染色质控片及其制作方法和应用。它可以有效避免临床和实验上对细菌进行革兰氏染色时出现“假阳”和“假阴”现象，确保革兰氏染色结果的正确性。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种革兰氏染色质控片的制作方法，包括以下步骤：
(1)准备载玻片并在载玻片的一端为标记区，用于待检测样品菌种的信息；
(2)在载玻片上设置质控菌区和样品菌区，且质控菌区和样品菌区及标记区互不重叠，同时样品菌区可以设置多个，实现同一载玻片上多个样品菌的处理，从而提高了效率；
(3)准备防水胶布和双面防水胶片，并将防水胶布和双面防水胶片黏合在一起后；接着将防水胶布和双面防水胶片进行贯通打孔，再将防水胶布的一面贴合在质控菌区上并形成凸起边缘，质控菌区经紫外照射处理后，最后将防水贴纸跟双面防水胶片的一面贴合，制得保护罩；
(4)将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别进行培养；经培养后的大肠杆菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液进行混合，制得质控菌液；随后将质控菌液加入到保护罩的双面防水胶片的孔内，制得待处理的革兰氏染色质控片；采用混合制得质控菌液的方式，便于在染色后镜检时在同一显微镜视野下进行观察；
(5)将步骤(4)制得的所述待处理的革兰氏染色质控片进行干燥处理，直至所述待处理的革兰氏染色质控片看不到水迹为止，随后在所述待处理的革兰氏染色质控片中与所述质控菌区相对的背面在酒精灯火焰上方通过2次-3次进行固定，然后将质控菌区上双面防水胶片的孔置于260nm波长的紫外灯正下方25cm-30cm处紫外照射15min-25min，照射处理后准备防水贴纸并将防水贴纸贴合在双面防水胶片的另一面。将待处理的革兰氏染色质控片进行进行紫外照射，其目的是把保护罩孔内的其它杂菌全部杀死，有利于质控片的长期保藏。
优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株cctccab93154；所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌菌株cctccab91093。上述的两种菌株(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)均为中国典型培养物保藏中心的微生物模式菌株(http://www.cctcc.org/bioshow.php？newsid＝70)，并非发明人新递交的菌株。
优选地，所述大肠杆菌菌液为将大肠杆菌培养后od值控制在0.2-0.8的培养液；所述金黄色葡萄球菌菌液为将金黄色葡萄球菌培养后od值控制在0.2-0.8的培养液。菌体浓度太大或太小，对显微观察有一定的影响，例如浓度太大会造成显微视野中菌体堆积在一起，此时在显微观察时形成一团从而无法辨别，若菌体浓度太小，可能在相应的显微视野中无法同时观察到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
优选地，所述质控菌液为所述大肠杆菌菌液与所述金黄色葡萄球菌菌液按照体积比为5:3进行混合制得的。此体积比例下进行混合，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能够达到混合比从而使得显微视野中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均匀分布，这是由于杆菌和球菌的比例大小不一样，合适的比例控制能够提高显微视野的辨别，达到在最短时间内进行识别。
优选地，所述干燥温度控制在35℃-45℃，所述干燥处理采用电热鼓风干燥箱。干燥温度处在此范围内质控菌的干燥；同时电热干燥处理避免了湿热法带来的水汽影响。
优选地，所述干燥温度控制在40℃，所述紫外照射处理时间为20min。此干燥温度选择40℃，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能够与载玻片贴合紧密度最佳；同时紫外照射处理时间控制在20min，菌体的灭活效果最佳。
优选地，步骤中所述打孔的孔径尺寸为5mm-6mm；所述双面防水胶片的厚度尺寸为3mm-6mm。这使得打孔孔径尺寸和双面防水胶片厚度控制在合适的范围内，进一步避免尺寸比值过大或过小时样品菌与质控菌发生混合的几率；
一种革兰氏染色质控片，采用上述的一种革兰氏染色质控片的制作方法进行制作而成。
一种革兰氏染色质控片的应用，包括以下步骤：
(1)将培养后的待测样品菌进行移取，制得样品菌液；所述待测样品菌可以采用样品菌的固体培养物(菌落或菌苔)，也可以采用样品菌的液体培养物；
(2)选用上述的革兰氏染色质控片，在标记区将样品菌的信息进行登记；防止待测样品菌数目较多时弄混淆；
(3)将样品菌液滴加至样品菌区，然后将样品菌液进行涂片、干燥和固定的处理，接着将革兰氏染色质控片的保护罩沿着凸起边缘撕去；将革兰氏染色质控片中质控菌区和样品菌区同时进行革兰氏染色操作，通过滴加革兰氏染色试剂，让每种染色试剂同时覆盖质控菌与样品菌，达到同时染色的目的；
(4)革兰氏染色操作后进行镜检，首先观察质控菌的染色区域，若看到红色杆菌与紫色球菌或蓝紫色球菌，说明染色过程正确，再观察样品菌的染色区域，紫色或蓝紫色表示样品菌为革兰氏阳性菌，红色表示样品菌为革兰氏阴性菌；若观察质控菌的染色区域，未看到红色杆菌与紫色球菌或蓝紫色球菌，说明染色过程失败，需要重新进行染色或更换合适革兰氏染色试剂。
优选地，步骤(1)中所述移取方式可以采用接种环进行操作。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一种革兰氏染色质控片的制作方法，采用保护罩的结构，可以保护质控菌，防止质控菌被意外损毁，实现同一载玻片上分别进行质控菌与样品菌同时观察，提高革兰氏染色结果的准确性；同时样品菌区还可以设置多个，实现同一载玻片上多个样品菌的检测；
(2)本发明提供一种革兰氏染色质控片的制作方法，将质控菌中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行混合制得质控菌液，便于在显微镜同一视野下观察并能准确判断染色结果的准确性；
(3)本发明提供一种革兰氏染色质控片的制作方法，将滴加质控菌液的革兰氏染色质控片进行紫外灭菌处理，实现了革兰氏染色质控片的长期储藏；
(4)本发明提供一种革兰氏染色质控片的制作方法，将质控菌中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌控制在特定的od值进行稀释并按照比例混合，而通用方法是先对样品菌进行简单染色，镜检确定样品菌的形态，然后再把样品菌与相应的不同形态革兰氏阳性或阴性菌进行混合涂菌，再进行革兰氏染色以便于染色后质控菌的观察；
(5)本发明提供一种革兰氏染色质控片的制作方法，干燥温度的选择能够使得质控菌更好地与载玻片贴合，提高革兰氏染色质控片的品质；
(6)本发明提供一种革兰氏染色质控片的应用，将质控菌与样品菌同时进行染色，只需镜检质控菌的染色效果即可判断染色结果的正确性。
附图说明
图1为本发明中革兰氏染色质控片的结构示意图；
图2(a)为本发明中实施例1质控菌的显微图样；
图2(b)为本发明中实施例1样品菌的显微图样；
图3(a)为本发明中实施例2质控菌的显微图样；
图3(b)为本发明中实施例2样品菌的显微图样；
图4(a)为本发明中实施例3质控菌的显微图样；
图4(b)为本发明中实施例3样品菌的显微图样。
图中：1、标记区；2、质控菌区；3、样品菌区；4、载玻片；5、防水胶布；6、双面防水胶片；7、防水贴纸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
如图1所示，一种革兰氏染色质控片的制作方法，包括以下步骤：
(1)准备载玻片4并在载玻片4的一端为标记区1，用于记录菌种的信息；
(2)在载玻片4上设置质控菌区2和样品菌区3，且质控菌区2和样品菌区3及标记区1互不重叠且设置在载玻片4的同一面上，其中质控菌区2和样品菌区3之间的距离为2mm；
(3)准备防水胶布5(防水胶布5采用电工胶布)和双面防水胶片6(双面防水胶片6采用3m双面胶片，所述双面防水胶片6的长和宽尺寸为1.2mm*1.2mm，所述双面防水胶片的厚度尺寸为3mm(具体应用时，还可以取3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4.0mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm、5.0mm、5.2mm、5.4mm、5.6mm、5.8mm或6.0mm)，并将防水胶布5和双面防水胶片6黏合在一起后；接着将防水胶布5和双面防水胶片6进行贯通打孔，所述打孔的孔径尺寸为6mm(具体应用时，还可以取5.0mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm或者5.9mm)，再将防水胶布5的一面贴合在质控菌区2上并形成凸起边缘(防水胶布5的一侧边缘处不贴合且形成凸起边缘，便于后期徒手可将保护罩整个撕下来)，质控菌区2经紫外照射处理后，最后将防水贴纸7跟双面防水胶片6的一面贴合，制得保护罩；现有技术需要每次对样品菌先简单染色进行镜检，知道什么形态后才能决定培养大肠杆菌或是金黄色葡萄球菌，但面对大批量未知菌的染色鉴定时，需要重复进行样品菌的简单染色和镜检，然后再与大肠杆菌或金黄色葡萄球菌进行混合鉴定，这个过程费时费力，且每次都需要质控菌(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)的预先培养，而本申请创新性地以载玻片为基础设计一种保护罩的结构，不仅可以实现对质控菌的保护，同时还可以实现同一载玻片上分别进行质控菌与样品菌的同时观察(省去了样品菌的简单染色和镜检步骤)，提高了工作效率(革兰氏染色质控片可以大批量提前制作)；
(4)将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别进行培养，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株cctccab93154，所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌菌株cctccab91093，培养后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中，所述大肠杆菌菌液为将大肠杆菌培养后od值控制在0.2-0.8(大肠杆菌培养后的菌液od值一般在0.2-0.8范围内，则无需进行稀释)，所述金黄色葡萄球菌菌液为将金黄色葡萄球菌培养后od值控制在0.2-0.8(金黄色葡萄球菌培养后的菌液od值一般超过0.8时，需进行稀释)；随后将所述大肠杆菌菌液与无菌生理盐水以1：19进行混合，同样将所述金黄色葡萄球菌菌液稀释2倍后与无菌生理盐水以1：49进行混合，接着将大肠杆菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液进行混合，具体为将所述大肠杆菌菌液与所述金黄色葡萄球菌菌液按照体积比为5:3进行混合制得的，制得质控菌液；随后将质控菌液加入保护罩上双面防水胶片6的孔内，制得待处理的革兰氏染色质控片；
(5)将步骤(4)制得的所述待处理的革兰氏染色质控片进行干燥处理，所述干燥温度控制在40℃(具体应用时，还可以取35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃)，干燥温度范围的选择使得质控菌可以更好地与载玻片贴合，而温度过高(＞70℃)或温度过低(＜30℃)时，细菌(质控菌)与载玻片表面的黏合力不足，此时很容易造成质控菌从载玻片上脱落，进而致使质控菌无法实现染色，所述干燥处理采用电热鼓风干燥箱，直至所述待处理的革兰氏染色质控片看不到水迹为止，随后在所述待处理的革兰氏染色质控片中与所述质控菌区2相对的背面在酒精灯火焰上方通过2次进行固定，然后将质控菌区2上双面防水胶片6的孔置于260nm波长的紫外灯正下方25cm处紫外照射15min，这实现革兰氏染色质控片的长期储藏，这样面对大批量未知菌的染色鉴定时，只需取出革兰氏染色质控片即可，无需对质控菌进行预先培养；照射处理后准备防水贴纸7并将防水贴纸7贴合在双面防水胶片6的另一面。
一种革兰氏染色质控片，采用上述的一种革兰氏染色质控片的制作方法进行制作而成。
一种革兰氏染色质控片的应用，包括以下步骤
(1)将培养后的待测样品菌进行移取，制得样品菌液；其中待测样品菌还可以是菌苔或菌落，并使用接种环进行挑取；
(2)在标记区1将样品菌的信息进行登记；
(3)选用上述的一种革兰氏染色质控片，同时将样品菌液滴加至样品菌区3，然后将样品菌液进行涂片、干燥和固定的处理，接着将革兰氏染色质控片的保护罩沿着凸起边缘撕去；将革兰氏染色质控片中质控菌区2和样品菌区3同时进行革兰氏染色操作，经革兰氏染色操作后进行镜检；
(4)首先观察质控菌的染色区域，若看到红色杆菌与紫色(蓝紫色)球菌，说明染色结果正确，再观察样品菌的染色区域，紫色(蓝紫色)表示革兰氏阳性菌，红色表示革兰氏阴性菌；若观察质控菌的染色区域，未看到红色杆菌与紫色(蓝紫色)球菌，则染色失败，需要重新进行染色或更换合适革兰氏染色试剂。
综上所述，现有技术下，面对大批量未知菌的染色鉴定通常是先对样品菌染色观察形态后再根据形状培养大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌，最后还需通过混合涂片的镜检来判断样品菌的染色过程是否出现问题；本申请创造性地研制一种革兰氏染色质控片，具体通过设置保护罩实现对质控菌区2内质控菌的保护，这可以一次性制作大量的革兰氏染色质控片，然后对待测样品菌进行染色鉴定时，只需取出革兰氏染色质控片并同时对质控菌和样品菌同时染色，如质控菌染色后未观察到正确的染色结果则说明染色过程失败，由于质控菌进行了预先制作故可以加快染色结果的判断，这对于本领域技术人员而言并非显而易见。
实施例1
本实施例的革兰氏染色质控片的应用如下，
(1)将培养后的待测样品菌使用接种环进行移取，制得样品菌液；
(2)在标记区1将样品菌的信息进行登记，信息如下，枯草芽孢杆菌cctccab90008，革兰氏阳性菌；
(3)选用革兰氏染色质控片，同时将样品菌液滴加至样品菌区3，然后将样品菌液进行涂片、干燥和固定的处理，接着将革兰氏染色质控片的保护罩沿着凸起边缘撕去；将革兰氏染色质控片中质控菌区2和样品菌区3同时进行革兰氏染色操作，经革兰氏染色操作后进行镜检；
(4)首先观察质控菌的染色区域，看到红色杆菌与紫色(蓝紫色)球菌，质控菌的显微图样如图2(a)所示，这说明染色结果正确，再观察样品菌的染色区域，紫色(蓝紫色)表示革兰氏阳性菌，样品菌的显微图样如图2(b)所示。
实施例2
本实施例的革兰氏染色质控片的应用如下，
(1)将培养后的待测样品菌使用接种环进行移取，制得样品菌液；
(2)在标记区1将样品菌的信息进行登记，信息如下，变形杆菌cctccab91103，革兰氏阴性菌；
(3)选用革兰氏染色质控片，同时将样品菌液滴加至样品菌区3，然后将样品菌液进行涂片、干燥和固定的处理，接着将革兰氏染色质控片的保护罩沿着凸起边缘撕去；将革兰氏染色质控片中质控菌区2和样品菌区3同时进行革兰氏染色操作，经革兰氏染色操作后进行镜检；
(4)首先观察质控菌的染色区域，看到红色杆菌与紫色(蓝紫色)球菌，质控菌的显微图样如图3(a)所示，这说明染色结果正确，再观察样品菌的染色区域，红色表示革兰氏阴性菌，样品菌的显微图样如图3(b)所示。
实施例3
本实施例的革兰氏染色质控片的应用如下，
(1)将培养后的待测样品菌使用接种环进行移取，制得样品菌液；
(2)在标记区1将样品菌的信息进行登记，信息如下，藤黄微球菌cmcc(b)28001，革兰氏阳性菌；
(3)选用革兰氏染色质控片，同时将样品菌液滴加至样品菌区3，然后将样品菌液进行涂片、干燥和固定的处理，接着将革兰氏染色质控片的保护罩沿着凸起边缘撕去；将革兰氏染色质控片中质控菌区2和样品菌区3同时进行革兰氏染色操作，经革兰氏染色操作后进行镜检；
(4)首先观察质控菌的染色区域，看到红色杆菌与紫色(蓝紫色)球菌，质控菌的显微图样如图4(a)所示，这说明染色结果正确，再观察样品菌的染色区域，紫色(蓝紫色)表示革兰氏阳性菌，样品菌的显微图样如图4(b)所示。