本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，特别是检测水稻千粒重QTL qTGW10.2a上特青高千粒重等位基因的10个特异性PCR标记。
二、
背景技术：
水稻是最重要的粮食作物之一，提高其产量对解决粮食安全问题具有重大意义。千粒重作为水稻产量三要素之一，备受育种家关注。常规选育过程中，千粒重的测定一般是在水稻成熟后进行，整个过程周期长，样本量大，并需要大量人力，这些因素增加了育种成本而且延缓了育种进度。分子标记辅助选择是在基因克隆或定位的基础上，借助目标基因本身或与之紧密连锁的分子标记，在群体中选择具有某些理想基因型和基因型组合的个体并结合常规育种手段以培育优良品种的方法。目前，借助该技术已经在水稻抗病和抗虫等性状的改良中取得很大进展。同样，该技术也可以在水稻品种的千粒重改良上发挥重要。
专利权人前期在水稻第10染色体上定位到1个控制水稻千粒重的QTL，命名为qTGW10.2a。在该区间，来源于水稻品种特青的等位基因具有提高千粒重，增加粒长和粒宽的作用。本发明在此基础上，根据水稻品种特青和IRBB52的重测序结果，针对qTGW10.2a所在区间进行序列比对，设计序标位(STS)标记，并从中挑选出可特异性鉴定特青等位基因的标记。随着分子生物学的快速发展，分子标记的开发已经是一种最为普遍的技术之一，借助已公布水稻品种全基因组序列，可针对目标区间设计所需分子标记。但是这类分子标记仅仅是针对序列差异开发的分子标记，所检测到的等位基因并不一定具有高千粒重等位基因的功能，因为其不依赖于表型验证。而专利权人设计的PCR标记可以鉴定出携带高千粒重的特青等位基因，这类标记可直接应用到高千粒重特青等位基因的水稻分子标记辅助选择育种中，而非仅仅只是检测出在该分子标记座位上是否存在序列差异。
本发明提供的分子标记对水稻千粒重QTL qTGW10.2a上特青增效等位基因的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于qTGW10.2a上特青增效等位基因的转育研究中。
三、
技术实现要素：
本发明解决的技术问题是提供了检测qTGW10.2a上特青高千粒重等位基因的特异性分子标记10个。
本发明采用以下技术方案：根据特青和IRBB52的重测序结果，对qTGW10.2a所在区间及其紧密连锁区间的序列进行比对，根据插入和缺失情况，在该区段设计了13个STS标记，经实验室鉴定验证，筛选出10个在两个品种中具有多态性的标记。
用于检测水稻千粒重QTL qTGW10.2a上特青高千粒重等位基因的10个特异性PCR标记名称为Te20848、Te20864、Te20873、Te20882、Te20894、Te20905、Te20927、Te20939、Te20973和Te20993，具体序列如下：
Te20848的上游引物序列为5'-TTAGCATCCATCACTCAAGCG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
Te20848的下游引物序列为5'-TCGGATTTTATGGGATATAACCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Te20864的上游引物序列为5'-CCAAGTTGATTTCTCTCGCAA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Te20864的下游引物序列为5'-CACCTAACAAATTCGGACCT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
Te20873的上游引物序列为5'-GATCTCTGCAGCATCGCAAC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
Te20873的下游引物序列为5'-ATGTACAGATCAGTCTCCACG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
Te20882的上游引物序列为5'-CAAGTGCTCGTATAAACGTGAGAC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列；
Te20882的下游引物序列为5'-CCATGCCACATCGTACTTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列；
Te20894的上游引物序列为5'-TTGACAGGCTTCCTATCGTTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；
Te20894的下游引物序列为5'-GAATAAAACGAGTGGTCAAACAAT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
Te20905的上游引物序列为5'-ACTTGAAACGAGCTGTC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:11的所示核苷酸序列；
Te20905的下游引物序列为5'-ATTGCACTATTAAAGAGAGTCA-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
Te20927的上游引物序列为5'-CGCTAAATTTTGGTTGCCCTT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:13的所示核苷酸序列；
Te20927的下游引物序列为5'-GCGGGAAATACGTACGGTATGG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
Te20939的上游引物序列为5'-ATATTTTGTTTATTGCTGTAGGT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:15的所示核苷酸序列；
Te20939的下游引物序列为5'-AGTAAAGCAGATTGTAGTCAC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
Te20973的上游引物序列为5'-ATGAAGTAGACTAGACCAAG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:17的所示核苷酸序列；
Te20973的下游引物序列为5'-AGCTGTGGATATATTAGTCAT-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；
Te20993的上游引物序列为5'-AAAATTTAACTTCTGCATGTTG-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:19的所示核苷酸序列；
Te20993的下游引物序列为5'-TCGAGCTTGCATGTCATC-3'，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
10个STS标记的PCR扩增体系一致。扩增体系为，Tris-HCL(pH 8.8)33.5mM，(NH4)2SO48.0mM，MgCl2 1.5mM，TWEEN-20 0.05％，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/μl，Taq DNA聚合酶2.0单位，模版DNA 50ng；PCR反应条件：预变性温度94℃2分钟；变性温度94℃45秒、退火温度55℃45秒、72℃1分钟，30个循环；72℃8分钟。
四、附图说明
图1STS标记Te20864的检测结果。
M：分子量对照；P1：特青；P2：IRBB52；1～32：待测样品
图2一套在qTGW10.2a区间分离的近等基因系群体表型鉴定结果。
A.千粒重鉴定结果
B.粒长鉴定结果
C.粒宽鉴定结果
五、具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1检测水稻千粒重QTL qTGW10.2a上特青等位基因的特异性分子标记开发
利用序列比对软件DNASTAR MegAlign模块(Lasergene)对QTL定位群体的亲本特青和IRBB52在千粒重QTL qTGW10.2a所在区间的碱基序列进行比对，根据2个品种在比对中表现出的插入或缺失位点，应用引物设计软件Oligo 7.0开发了13个用于检测qTGW10.2a增效等位基因特青特异片段的STS标记。通过下述步骤鉴定这些开发的标记是否在特青和IRBB52之间存在特异性，且在分离群体中是否能准确的鉴定出携带特青等位基因。本发明以STS标记Te20864为例详细介绍检测方法：
1.DNA微量提取
(1)将特青、IRBB52以及32个在近等基因系群体中随机挑选的株系种子分别置于预先标号的培养皿，30℃发芽7天。
(2)剪取各培养皿幼苗叶片2～3cm，剪成0.5cm长的碎片，放入2.0mL离心管中。
(3)加入450μl DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。
(4)加入450μl氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。
(5)11,000rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400μl，转入新的1.5ml离心管中，弃枪头
(6)加入800μl预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。
(7)11,000rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。
(8)用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5ml离心管倒置于纸上，自然干燥。
(9)加入100μl的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。
(10)取2μl进行PCR扩增。
2.PCR扩增及检测
扩增体系为，Tris-HCL(pH 8.8)33.5mM，(NH4)2SO4 8.0mM，MgCl2 1.5mM，TWEEN-200.05％，dNTPs 0.2mM，上、下游引物各3.3ng/μl，Taq DNA聚合酶2.0单位，模版DNA 50ng；PCR反应条件：预变性温度94℃2分钟；变性温度94℃45秒、退火温度55℃45秒、72℃1分钟，30个循环；72℃8分钟。
取2μl PCR产物上样于6％非变性聚丙烯酰胺胶(PAGE)；接通电极，在100V恒定电压下电泳3小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色。
如图1所示，在Te20864座位上，特青和IRBB52表现出多态性，在近等基因系群体中，样品1、2、5、8、9、12、13、15、16、20、22、23、27、28、31和32呈特青纯合型，其余样品呈IRBB52纯合型，说明该STS标记能作为检测qTGW10.2a上特青等位基因的特异标记。通过该方法最终筛选出10个用于检测qTGW10.2a上特青高千粒重等位基因的特异标记用于分子标记辅助选择。
实施例2应用特异性分子标记鉴定特青高千粒重等位基因的验证
1近等基因系构建
采用实施例1建立的分子标记，从水稻籼籼交组合特青/IRBB52的高代自交群体中筛选仅在qTGW10.2a区间分离的个体，构建了1套包含64个株系的近等基因系群体。该群体含有qTGW10.2a区间表现为特青纯合型株系32个，IRBB52型纯合株系32个。
2表型鉴定
2016年夏季，在浙江省富阳区中国水稻研究所试验基地种植近等基因系，每个株系按随机区组设计种植，设置2个重复，每个株系种8个单株，成熟后取中间5株测定千粒重、粒长和粒宽。
3结果和分析
统计分析结果表明，在qTGW10.2a区间，与IRBB52型株系相比，携带特青型等位基因的株系平均可提高千粒重1.32g、粒长增加0.220mm以及粒宽增加0.038mm(图2)。该试验证实了特青等位基因的导入可以提高千粒重、增加粒长和粒宽。
实施例2证实了本发明提供的分子标记对检测水稻千粒重QTL qTGW10.2a上特青高千粒重等位基因具有高可靠性，可以应用于千粒重QTL qTGW10.2a中增效等位基因特青的转育研究中。