一种白介素39特异性拮抗蛋白及其在治疗自身免疫性疾病中的应用的制作方法

文档序号：14826523发布日期：2018-06-30 08:41阅读：960来源：国知局

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种白介素39特异性拮抗蛋白及其在治疗自身免疫性疾病中的应用。

背景技术：

自身免疫性疾病（Autoimmune diseases，AID）如类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）、系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）、Sjögren氏综合症（Sjögren's disease，干燥综合症或修格林氏综合症）等是免疫系统对宿主自身抗原发生正性应答、造成其组织或器官的病理性损伤、影响其生理功能、并最终导致各种临床症状的疾病。患者女性多于男性，老年多于青少年，有遗传倾向，该类疾病还具有重叠现象，即患者可以患一种以上自身免疫病，病程一般较长，发作与缓解交替出现，仅有少数为自限性；治愈率低。因此，迫切渴求能够有效控制疾病进程的新药和临床治疗措施｡

白介素12（Interleukin 12 ，IL-12）作为效应最强的NK细胞激活因子和T淋巴细胞诱导因子，主要是由活化的单核巨噬细胞、B细胞等抗原呈递细胞产生；IL-12家族具有独特的结构，能引起Th1、Th2细胞免疫应答，在微生物感染、自身免疫性疾病和癌症中发挥作用。IL-12家族细胞因子主要以α/β异二聚体形式存在，其中α链包括p19、p28和p35，β链包括p40和EB病毒诱导基因3（Epstein-Barrvirus-inducedgene3，EBI3）。α链和β链中任意一个亚基两两结合可形成不同的异二聚体。目前已证实IL-12、IL-23、IL-27和IL-35等4种异二聚体在自然界中存在，且都具有生物活性。随着IL-12家族在常见的自身免疫性疾病研究中不断展开，也使得它在自身免疫性疾病发病机制中的作用日益成为人们研究的热点。IL-12家族及其受体可能为阐明自身免疫性疾病的发病机制及临床治疗带来新的希望。

2016年王小茜等研究发现，IL-23p19和EBI3两个亚基可结合形成新的异二聚体蛋白。由于形成此异二聚体结构的亚基来源于IL-12家族，因此它被认为是IL-12家族的新成员，且被正式命名为IL-39。IL-39的两个亚基IL-23p19和EBI3分别与IL-23和IL-27/IL-35所共有，其中IL-23p19亚基具有4个α螺旋结构，与IL-6和粒细胞集落刺激因子具有同源性。EBI3亚基基因位于人的第17号染色体，编码一个相对分子质量为34000糖蛋白，其中有27%的氨基酸序列与IL-12p40亚基同源。体外研究发现经LPS活化的B细胞（如GL7⁺B细胞）主要表达p19与Ebi3，进一步研究发现活化的B细胞可以分泌天然形式存在的IL-39；当用IFN-γ､Bcl-6抑制剂等抑制B细胞活化后，IL-39的表达量明显下降｡体内实验发现系统性红斑狼疮小鼠发病后脾脏B细胞异常活化，与体外实验结果一致，表明体内异常活化的GL7⁺B细胞是产生IL-39的主要来源。研究发现，给未发病的系统性红斑狼疮模型鼠回输GL7⁺B细胞，可诱导系统性红斑狼疮，并出现尿蛋白升高、脾脏肿大、脾重増加、脾脏B细胞异常活化；而回输敲低p19或Ebi3的GL7⁺B细胞的小鼠发病明显降低；进一步研究发现IL-39能够通过IL-39—BAFF正反馈环路途径促进系统性红斑狼疮小鼠中性粒细胞比例上升。IL-39通过结合其受体IL-23R/gp130及激活STAT1和STAT3信号分子调节生物活性。脂多糖（LPS）刺激活化的B细胞中表达IL-12家族的受体，随着LPS刺激时间増加，B细施表面受体IL-23R､gp130的表达量増多；当敲低IL-23R或gp130后，IL-39不能诱导STAT1和STAT3磷酸化｡给予系统性红斑狼疮发病鼠抗IL-39多克隆抗体治疗，阻断IL-39与其受体的结合，出现小鼠病情缓解，皮肤溃疡缓解、尿蛋白下降、脾肿大减轻、脾脏异常活化的B细胞数目减少、抗体分泌减少、肾脏病理炎症程度下降等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种白介素39特异性拮抗蛋白，其包括IL-23R受体胞外区片段肽、gp130受体胞外区片段肽以及连接所述IL-23R受体胞外区片段肽和gp130受体胞外区片段肽的Linker肽；所述IL-23R受体胞外区片段肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述gp130受体胞外区片段肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述Linker肽的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。

一种上述白介素39特异性拮抗蛋白的编码基因，其包括SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。

一种白介素39特异性拮抗剂，其为将上述白介素39特异性拮抗蛋白与免疫球蛋白的Fc片段融合后，得到的融合蛋白分子。可提高上述白介素39特异性拮抗蛋白在体内稳定性、延长半衰期。进一步的，所述免疫球蛋白为IgG1、IgG2或 IgG4。优选的，所述免疫球蛋白为IgG1。

一种上述白介素39特异性抗结剂的编码基因，其包括SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。

一种上述白介素39特异性抗结剂的编码基因的表达载体。优选的，所述的表达载体为真核质粒表达载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。

一种含有上述表达载体的宿主细胞。优选的，所述的宿主细胞为真核细胞。

一种上述的白介素39特异性抗结剂的制备方法，其通过基因工程方法进行发酵生产，包括如下步骤：（1）编码所述白介素39特异性抗结剂的核苷酸序列的5’端加上分泌信号肽的编码核苷酸序列；（2）将编码白介素39拮抗剂的基因装入表达载体，将表达载体转入宿主，宿主培养增殖后从宿主或培养上清液分离纯化得到白介素39拮抗剂。所述分泌信号肽为本领域常用的，优选的，为人 IL-2 信号肽。

进一步的，所述的分离纯化方法为将大规模培养重组工程细胞的培养上清液，通过Protein A或Protein G亲和层析进行纯化，再过阳离子交换层析精纯，即可得到白介素39拮抗剂。

一种上述白介素39特异性拮抗剂在治疗自身免疫性疾病中的应用。进一步的，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或干燥综合症。

进一步的，上述白介素39特异性抗结剂在治疗自身免疫性疾病中的应用，包括制备治疗自身免疫疾病的药物，其以上述白介素39特异性拮抗蛋白、白介素39拮抗剂、上述核苷酸序列、或基因载体作为主要活性成分。

本发明的有益效果在于：

1）本发明的新型IL-39拮抗剂——IL23R-gp130-Fc可通过与 IL-39的结合，抑制其在自身免疫疾病中的功能。实验结果显示IL23R-gp130-Fc对狼疮小鼠具有显著的治疗作用。IL23R-gp130-Fc皮下注射给药可显著降低MRL/lpr狼疮小鼠的损伤指数和脾脏指数，降低小鼠尿蛋白水平和自身抗体水平，减轻MRL/lpr小鼠肾脏和脾脏的病理变化，治疗效果明显｡

2）IL23R-gp130-Fc给药可剂量依赖性地降低MRL/lpr小鼠血清中高水平的BLyS，降低脾脏组织中转录因子Blimp-1和Bcl-6的蛋白表达水平。说明IL23R-gp130-Fc对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用是通过降低BLyS水平，抑制炎性因子产生，调控脾脏转录因子Blimp-1和Bcl-6的表达实现。

附图说明

图1 IgG1 Fc 的 RT-PCR 结果（1% Agarose 电泳）。图1中：M：DL4000 Marker；1 &2：RT-PCR 产物IgG1 Fc。

图2 ：pSelect-puro质粒图谱。图3：重组质粒 pSelect-IL23R-gp130-Fc的构建过程示意图。图4：重组质粒pSelect-IL23R-gp130-Fc图谱。图5：重组pSelect-IL23R-gp130-Fc 质粒SalⅠ/BamHⅠ双酶切和NheⅠ/BamHⅠ 双酶切鉴定。图6 ：SDS-PAGE检测纯化的IL23R-gp130-Fc融合蛋白。图7：Biacore检测IL23R-gp130-Fc蛋白与其配体IL-39的平衡解离常数KD=1.61 ×10^-10M。图8：给药8周时各组动物的损伤指数变化。图9 ：IL23R-gp130-Fc给药8周时各组动物治疗效果。图10 ：IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠肾脏组织病理学改善情况。图11 ：IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠脾脏组织病理改善。图12 ：IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠肾脏组织病理学改善情况。图13：IL23R-gp130-Fc给药后可显著降低脾脏Blimp-1和Bcl-6水平。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不在于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

一、23R-gp130蛋白编码基因的构建及表达

实施例1 23R-gp130蛋白编码基因的获得

采用全基因合成的方法得到依次编码IL-23R受体胞外结构域、Linker肽（GGGGGSS）、gp130受体胞外结构域，Linker肽（GGGGGSS）的融合 cDNA 片段，其中5’端包含人 Il-2 信号肽编码序列。将合成的DNA序列插入至重组质粒pSBS1-Cloning Vector中，得到pSBS1-23R-gp130质粒。合成序列如SEQIDNo.6所示。

实施例2 RT-PCR扩增人IgG1 Fc cDNA片段

1、人淋巴细胞总RNA提取

采集血样：使用一次性的抗凝血的真空抽血管进行采血，采血量一般为2ml。

2、分离淋巴细胞

①提取淋巴细胞。取1.5ml 无菌无酶的离心管，为管①，先加入500μl淋巴细胞分离液；另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，装有500μl血样的真空管和500ul Hank’s液，1：1混匀的混合物，共1ml。然后缓慢把混匀的血样Hank’s混合液加入到有淋巴细胞分离液的管①中。水平离心，1500rpm，15分钟，温度为室温。②离心后，管内液体分为三层，上层为血浆和Hank’s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在中上层液面处有一白色云雾状狭窄带，即为富含淋巴细胞和单核细胞的单个核细胞（PBMC）及血小板。③吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的PBMC，尽量全部吸出PBMC，移入一新的离心管中。④加入Hank’s液，混匀后离心200rpm×10分钟，弃去上清液。⑤再用同样洗涤液洗细胞2次，每次离心500rpm×10分钟，以洗去残留的淋巴细胞分离液。丢弃离心后的上层液体，离心管底的白色物质为淋巴细胞。

3、提取人淋巴细胞总RNA

①用Trizol reagent 裂解淋巴细胞，提取RNA：在离心管中加入1ml Trizol试剂，并吹打离心管底部的淋巴细胞团块，混匀后室温静置5分钟。②加入300μl氯仿，盖紧离心管，用力震荡，待充分乳化后，室温静置5分钟；随后12000rpm, 4℃, 离心15分钟。③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，吸取上清液转移至另一新的离心管中。④向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10-20分钟；随后12000rp 4℃离心10分钟。⑤RNA的沉淀的清洗：弃去上清，缓慢沿离心管壁加入75%的乙醇（用1‰的DEPC水配制）1ml，上下颠倒洗涤离心管管壁，12000rpm, 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇。⑥RNA的溶解: 室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNase free水，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

4、第一链cDNA合成：

①在1.5ml Eppendorf管中加入500ng-2μg 总RNA或25-50ng poly(A)+ mRNA。加入 DEPC－H2O使总体积为8μl。②加入1μl Oligo(dT)18 primer，小心混匀。③65℃保温5分钟。④室温放置10分钟。室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。⑤按次序分别加入下列试剂：2X First-Strand Buffer 10ul 、RT-mix 1μl、Total： 20μl；⑥ 42℃ 延伸50分钟；

⑦然后90℃处理5分钟。冰上冷却，室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。

5、PCR扩增IgG1 Fc片段

①设计如下引物扩增 IgG1 Fc 片段 cDNA ：

5’引物：5’-CGG GAT CCG ACA AAA CTC ACA CAT GCC-3’

3’引物：5’-CAT GGC TAG CTC ATT TAC CCG GAG ACA GG-3’

为了能将 PCR 产物插入克隆载体，在 5’引物中设计入 BamH I 位点，在 3’引物中设计入 Nco I 位点。

②PCR反应体系：

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③PCR 反应条件：94℃变性 30 秒；60℃退火 30 秒；68℃延伸 1 分钟。反应 25 个循环。然后 68℃再延伸 12 分钟。反应完成后，1％琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR 产物。如图1所示得到了预计大小（~700bp）的 DNA 片段。

实施例3 IL23R-gp130-Fc蛋白编码基因重组质粒的构建

如上所述，在全基因合成片段23R-gp130中的 5’端设计入 SalⅠ酶切位点，3’端设计入 BamH I 酶切位点，可将23R-gp130的 cDNA 片段直接插入真核表达载体 pSelect-Puro （购自美国Invivogen 公司，其图谱见图2）的多克隆位点 Sal I/BamH I 中，IgG1 Fc 片段插入到多克隆位点 BamH I/ Nhe I 中，即可得到IL23R-gp130-Fc融合片段。其构建过程见图3；最终获得的pSelect-IL23R-gp130-Fc表达载体如图4所示。具体步骤如下：

1）用SalⅠ/BamHⅠ 将23R-gp130序列从合成的重组质粒pSBS1-23R-gp130切下，同时对pSelect-Puro载体质粒行SalⅠ/BamHⅠ双酶切。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，随后利用琼脂糖gel DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）回收IL2-IL23R-gp130和载体pSelect DNA条带；将回收后的载体片段和目的片段分别测定DNA浓，按载体和片段摩尔比为1∶5比例，用零背景快速连接试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）将2片段连接成载体pSelect-IL23R-gp130，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将在LB培养基中活化的DH5α接种于LB平板（含100μg/ml puromycin），于37℃温箱内培养14h后挑取单菌落，扩大培养并提取质粒pSelect-23R-gp130。

2）用BamHⅠ/NheⅠ 将RT-PCR扩增得到的人IgG1 Fc cDNA片段以及重组质粒pSelect-23R-gp130分别进行双酶切。对酶切产物分别进行1%和0.8％琼脂糖凝胶电泳，随后利用琼脂糖gel DNA回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）回收IgG1 Fc cDNA和载体pSelect-23R-gp130 DNA条带；将回收后的载体片段和目的片段分别测定DNA浓，按载体和片段摩尔比为1∶5比例，用零背景快速连接试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）将2片段连接成载体pSelect-IL23R-gp130-Fc，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将在LB培养基中活化的DH5α接种于LB固体培养基平板(含100μg/ml puromycin)，于37℃温箱内培养14h后挑取单菌落，扩大培养并提取质粒pSelect-23R-gp130-Fc，分别进行SalⅠ /BamHⅠ双酶切和NheⅠ /BamHⅠ 双酶切鉴定。双酶切后经0.8%琼脂糖凝胶电泳，如图5所示，可见~4000bp和~2900bp片段，以及~700bp和~6200bp片段，说明重组pSelect-23R-gp130-Fc质粒构建正确。

实施例4 目的蛋白的稳定表达细胞株CHO-IL23R-gp130-Fc 的筛选及鉴定

1、取100μg大量制备的上述重组质粒pSelect-IL23R-gp130-Fc，利用限制性内切酶NotⅠ 酶切，得到线性化质粒pSelect-IL23R-gp130-Fc；随后将酶切体系用苯酚－氯仿抽提，抽提质粒中加1/10体积的醋酸钠，2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀，质粒沉淀用75％乙醇洗涤后，加入无菌水溶解。

2、利用脂质体 Lipofectamine2000 转染CHO-K1 细胞（购自美国 ATCC）。

1）在6孔板中接种3×10⁵细胞/孔，加入2ml/孔完全培养基（F12+10%胎牛血清），置CO2孵箱中37℃培养。

2）待细胞长到80%满时，在无菌离心管中配制如下转染溶液：

i. 溶液A：将12μg待转染的线性化pSelect-IL23R-gp130-Fc质粒稀释到600μl无血清OMEM培养基中，静置5min

ii.溶液B：将36μl Lipofectamine 2000稀释到600μl无血清OMEM培养基中，静置5min。

3）混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15min。

4）每孔用2ml无血清培养基洗涤细胞，并加入0.8ml无血清F12培养基/孔，将脂质体-质粒复合物滴加到孔中，每孔0.2ml轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37℃孵育72小时。

5）用完全培养基替换转染液，继续培养。

6）72h后加入终浓度为2μg/ml的Puromycin筛选稳定表达株。

7）筛选15天可见细胞克隆形成。选取并消化72个边缘明显分开、细胞状态良好的单克隆接种于3个24孔板培养（第一轮筛选）。

8）待单克隆细胞长满后，取细胞培养上清，用ELISA检测融合蛋白的表达情况，并从中选出表达阳性的24个克隆，接种于1个24孔板(第二轮筛选)，培养5天后，取细胞培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的4个克隆A3、B5、C1、D6进一步用有限稀释法进行筛选。

9）每个克隆均接种一个96孔板(1细胞/孔/200μl)(第三轮筛选)，待细胞长满后(大约13天)，取培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况。每个96孔板上挑取表达较高的6个克隆接种24孔板，并编号；待细胞长满后，扩大培养至6孔板，ELISA检测各克隆的融合蛋白表达情况，结果见表1。

表1 Elisa检测第三轮筛选单克隆细胞融合蛋白表达

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10）选取表达量较高的 A3-E9、A3-G3、C1-C7 克隆扩大培养，保种，并命名为CHO-IL23R-gp130-Fc（A3-E9）、CHO-IL23R-gp130-Fc（A3-G3）、CHO-IL23R-gp130-Fc（C1-C7）。选取表达量最高的CHO-IL23R-gp130-Fc（A3-E9）进行下一步表达和纯化。

实施例5 Elisa检测IL23R-gp130-Fc的方法：

1、试验材料

1.1 包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）：称取Na2CO3 0.32g，NaHCO3 0.586g，置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。

1.2 10×磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）：称取NaCl 80g、KCl 2g、Na2HPO4 14.4g、KH2PO42.4g，加水溶解并稀释至500ml，用时10倍稀释。

1.3洗涤液（PBS-T，PH7.4）：取Tween-20 0.25ml，加磷酸盐缓冲液（PBS）至500ml。

1.4终止液（1mol/L H2SO4溶液）：将20ml浓硫酸加入340ml纯化水中，混匀。

2、试验步骤：

①将鼠抗人IgG1 Fc单抗用包被液稀释至1μg/ml，每孔100μl加入酶标板中，4℃过夜包被。②用洗涤液洗板3次，加入5%BSA封闭液，200μl/孔，37℃放置1小时。③用洗涤液洗板3次，以100μl/孔加入待测细胞培养液样品，置37℃放置1小时。

④用洗涤液洗板3次后，将二抗IL-23R Antibody [HRP] （Novus Biologicals，美国）以1：3000倍稀释，并以100μl/孔加至板内，37℃放置1小时。⑤用洗涤液洗板3次。以100μl/孔加入TMB底物液(Southern Biotech, 美国)，避光显色15min。⑥以50μl/孔加入终止液终止反应。⑦将酶标板放入酶标仪中，在450nm下测定吸光度。

实施例6 融合蛋白IL23R-gp130的表达及纯化

将CHO-IL23R-gp130-Fc（A3-E9）细胞接种至细胞工厂（康宁CellS TACK 3319），采用F12完全培养基37℃培养，待细胞长满后，更换培养基为ExpiCHO™ Expression Medium（Invitrogen，美国），30℃连续培养10d后收集上清，利用MabSelect SuRe ProteinA亲和介质（GE医疗生命科学，美国）进行重组IL23R-gp130-Fc 融合蛋白的亲和纯化，随后利用SP Sepharose® Fast Flow （GE医疗生命科学，美国）进行阳离子层析纯化，最终得到IL23R-gp130-Fc纯品，具体方法如下：

1）MabSelect SuRe ProteinA 亲和纯化

缓冲液：

MabSelect SuRe ProteinA平衡缓冲液：pH7.4的10mM PBS；MabSelect SuRe ProteinA洗脱缓冲液：pH3.0的50mM柠檬酸缓冲液；MabSelect SuRe ProteinA中和缓冲液：pH9.0的1M Tris-HCl。

纯化设备：AKTA Pure 150 （GE医疗生命科学，美国）。

纯化步骤：①平衡：先用ddH20清洗MabSelect SuRe ProteinA层析柱，UV280nm检测值恒定不变时，转换成ProteinA平衡缓冲液进行冲洗，至UV280nm检测值稳定在基线水平。②上样：细胞培养上清液样品置于层析柜中维持低温4℃；计算并设定上样流速，使样品的柱保留时间为5min，上样。③样品洗涤：上样结束后，用ProteinA平衡缓冲液清洗，至UV280nm检测值降至基线水平。④样品洗脱：用ProteinA洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。⑤样品中和：收集的样品立即加入适量ProteinA中和缓冲液进行中和，调节至pH 5.0以维持蛋白的活性。

2）SP Sepharose^® Fast Flow 阳离子层析

SP平衡缓冲液：20mM 柠檬酸缓冲液+0.1mM NaCl pH5.0

SP洗脱缓冲液：20mM 柠檬酸缓冲液+1M NaCl pH5.0

①平衡：用先用ddH20清洗SP Sepharose® Fast Flow层析柱至UV280nm检测值恒定不变时，转换成SP平衡缓冲液进行冲洗，至280检测值稳定在基线水平。②上样：将第一步ProteinA 亲和层析纯化的样品上样，设置合适的流速，使柱保留时间为3min。③样品洗涤：上样结束后用SP平衡缓冲液清洗，至UV280nm检测值降至基线水平。④梯度洗脱：设置洗脱条件为由100% SP平衡缓冲液线性梯度转换为100% SP洗脱缓冲液，洗脱时间20min，共计洗脱10个柱体积；收集各个UV280洗脱峰。⑤置换缓冲液：利用孔径为50kD的超滤浓缩管（Millipore，美国）将层析纯化的IL23R-gp130-Fc样品缓冲液置换为PBS，pH7.4。

3）SDS-PAGE电泳检测IL23R-gp130-Fc样品纯度及分子量

①缓冲液配制：

还原SDS-PAGE供试品缓冲液（2×）：含0.12M Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚蓝，4% SDS，200mM DTT。非还原SDS-PAGE供试品缓冲液（2×）：含0.12M Tris-HCl，20%甘油，0.1%溴酚蓝，4% SDS；

加碘乙酰胺的非还原SDS-PAGE供试品缓冲液（2×）：向上述非还原SDS-PAGE供试品缓冲液中加入新鲜配制的1M碘乙酰胺母液，至终浓度200mM。

②IL23R-gp130-Fc样品N-糖基化分析：将IL23R-gp130-Fc样品稀释至2mg/ml，每毫克IL23R-gp130-Fc融合蛋白中添加275单位的PNGase F，37℃水浴条件下酶切24h，反应体系的pH保持在6～10。将酶切后的样品分别进行非还原处理和还原处理，进行SDS-PAGE电泳分析。

a,非还原 SDS-PAGE 分析：IL23R-gp130-Fc样品及PNGase F处理后样品加入含碘乙酰胺的 2 × 非还原 SDS-PAGE 供试品缓冲液，混匀后，70℃水浴 3 min。分离胶浓度 8%，上样量10 μl，150 V 恒压电泳，在室温条件下进行。电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝 R250 染色。

b,还原SDS-PAGE分析：IL23R-gp130-Fc样品及PNGase F处理后样品分别加入2×还原SDS-PAGE供试品缓冲液，混匀，沸水浴5min。分离胶浓度8%，上样量10μl，150V恒压电泳。电泳结束后，考马斯亮蓝R250染色。光密度扫描，计算样品纯度。

结果如图6所示，纯化后目的蛋白在非还原条件下分子量为~410kDa（泳道1），还原性条件下分子量为~200kDa（泳道2），以二聚体形式存在，纯化后蛋白纯度可达到95％以上。PNGase F酶切去除IL23R-gp130-Fc糖基后，在非还原条件下分子量为265kDa（泳道3），在还原性条件下分子量为132kDa（泳道4），以二聚体形式存在，与通过氨基酸序列计算的理论分子量一致。

二、融合蛋白 IL23R-gp130-Fc体外结合IL-39检测和治疗系统性红斑狼疮的功效

实施例7 IL23R-gp130-Fc与IL-39结合力检测

应用表面等离子共振技术，通过生物传感器Biacore T200生物大分子相互作用分析仪（GE Healthcare生产）进行IL23R-gp130-Fc与IL-39体外结合力的测定。

1、IL-39的制备：将重组人p19蛋白（Origene Corp，美国）和重组人Ebi3蛋白（Origene Corp，美国）溶于PBS中，混匀后4℃静置过夜；随后将含有两种蛋白的混合液，通过Superdex 75（GE医疗生命科学，美国）分子筛层析纯化，收集IL-39（p19/Ebi3）同源二聚体蛋白洗脱峰；利用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术有限公司）对纯化的IL-39蛋白进行定量。

2、用最适pH5.0的NaAc稀释IL23R-gp130-Fc蛋白，并选择CM5芯片上的一个通道用于偶联，偶联IL23R-gp130-Fc目标值为1000RU，并选择另外一个通道作为对照。试验条件为25℃、流速20μL/min，缓冲液为HBS-EP（pH7.4，Bia-Certified）。芯片偶联IL23R-gp130-Fc蛋白达到目标值后封闭芯片表面。

3、随后用HBS-EP缓冲液稀释IL-39蛋白，取不同浓度（1.5~100 nmol/L中取5个不同浓度）的蛋白样品流过检测通道和对照通道，流速20μL/min，结合时间2min，解离时间10 min，每一个循环分别以流速30μl/min注入1mM NaOH 20秒对芯片进行再生。

4、将所得传感图用Bia-evaluation分析软件进行1∶1 Langmuir结合模式拟合，计算IL23R-gp130-Fc和IL-39结合的动力学常数。如图7所示。

表面等离子共振Biacore检测IL23R-gp130-Fc蛋白与其配体IL-39的结合常数Ka= 6.45 × 10⁷（1/Ms），解离常数Kd=1.04 × 10^-2（1/s），平衡解离常数KD=1.61 ×10^-10M。

实施例8 IL23R-gp130-Fc在系统性红斑狼疮模型小鼠中的治疗作用

1、实验动物及阳性对照药：

系统性红斑狼疮模型小鼠：MRL/lpr小鼠购买于河北省实验动物中心，许可证号：SCXK（冀）2003-2-003 ，雌性，8～10 周龄，体重（25 ± 2）g，SPF级饲养；

正常小鼠：BALB/c小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，20～24g，购自河北省实验动物中心。

醋酸泼尼松片（Prednisone，Pre）：上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，每片含醋酸泼尼松5mg。

2、实验分组及给药方法

实验分组：MRL/lpr转基因小鼠50只，随机分为5组，每组10只，即模型组（MRL/lpr组）、IL23R-gp130-Fc组（给药剂量分别为5､10､20mg/kg）和阳性对照组（Pre组，5mg/kg）；另设BALB/C小鼠为正常对照组｡

给药方法：每周检测MRL/lpr小鼠的尿蛋白含量，当动物尿蛋白含量为101~300mg/100ml尿液时，IL23R-gp130-Fc给药组开始皮下注射给药，隔日一次，连续给药8周，模型组皮下注射给予等量生理盐水，阳性对照组每天灌胃给药｡给药容量均为0.2ml/10g体重。

3、小鼠一般体征及损伤指数（尿蛋白､皮肤损伤和脱发情况）的观察与测定

随疾病程度加深，MRL/lpr小鼠会表现明显的肾脏组织损伤，用尿蛋白试纸检测小鼠尿蛋白含量变化；同时观察动物皮肤脱毛､皮肤结痂或血管炎等症状｡每周对动物的尿蛋白､皮肤损伤和脱毛进行评分，并以三项之和作为损伤指数｡损伤指数=毛发脱落评分+皮肤评分+蛋白尿评分（总分<9分）。

①脱发评分标准：-（0分）：表示无脱发；+（1分）：表示小于1cm²；++（2分）：表示超过1cm²；

②皮肤评分标准：观察有无明显的皮肤结痴、血管炎情况。-（0分）：未见皮肤损伤；+（1分）：1化直径小于1cm；++（2分）：1处，直径大于1cm；+++（3分）：2处或2处以上，直径大于1cm；

③蛋白尿分级标准（采用目测尿蛋白试纸检测）。-（0分）：阴性（小于10mg/100ml尿液）；+（0.5分）：微量（11~30mg/100ml尿液）；+（1分）：30~100mg/l00ml尿液；++（2分）：101~300mg/100ml尿液；+++（3分）：301~2000mg/100ml尿液；++++（4分）：大于2000mg/l00ml尿液。

4、病理学检查：脱臼处死小鼠，取肾脏和脾脏，置于福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色，观察各组织病理学变化情况，统计评分结果｡

肾脏病理评分标准：1级（1分）：正常或病变轻微，肾脏正常。2级（2分）：单纯系膜病变，系膜区免疫复合物沉积，系膜增宽但绝大多数毛细血管开放。3级（3分）：局灶增生肾小球肾炎，<50%的肾小球局灶节段性毛细血管内和(或)毛细血管外增生､坏死和（或）硬化；系膜区和内皮下免疫复合物沉积。4级（4分）：弥漫增生性肾小球肾炎，>50%的肾小球呈球性増生性病变、坏死、新月体；不同程度的硬化，肾间质明显的炎症细胞浸润；系膜区及内皮下免疫复合物沉积。5级（5分）：膜性肾小球腎炎，毛细血曾壁弥漫性增厚，上皮下和系膜区免疫复合物沉积。6级（6分）：进行性硬化性肾小球肾炎进展期，肾小球破坏和节段硬化，肾小管萎缩，肾间质纤维化，免疫复合物沉积少见｡

脾脏病理评分标准：脾脏病理从动脉周围淋巴鞘的细胞密度、淋巴小结、边缘区、红髓和生发中心的总数量进行判定，按照病变从轻到重进行0~4（0=正常）级病理评分｡

小鼠脾脏指数的测定：给药8周后称小鼠体重，脱臼处死小鼠，剥离脾脏，称重，以每100g动物体重的脾脏重量（g）作为动物的脾脏指数。

血清中免疫巧蛋白和自身抗体水平的测定：实验结束时收集动物的血清，ELISA试剂盒检测免疫球蛋白IgG1、抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）和抗核抗体（ANA）水平｡

血清中细胞因子BLyS的测定：小鼠麻醉后眼眶取血｡常温静置2h后，3000rpm，4°C离心10min，收集上层血清，用ELISA试剂盒检测BLyS水平｡

蛋白免疫印进法（Western blot）检测脾脏组织Blimp-1和Bcl-6蛋白水平

（1）小鼠总蛋白的提取及定量：取小鼠脾脏组织50mg置于匀浆器中，加入500μl裂解液匀浆，随后置于冰上裂解30min；15000rpm，4℃离心15min，取上清液，BCA法进行蛋白定量。（2）电泳：每孔加样总蛋白20μg样品，同时加入marker对照，进行12% SDS-PAGE电泳。当marker染料的前端接近凝胶的底端，停止电泳。（3）转膜：PVDF膜先用甲醇浸泡后，和剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡5min；按以下顺序依次放置正极-海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵-负极，将夹具夹紧，放入电转仪，90V电压转膜90min。（4）封闭：用5%脱脂牛奶室温封闭2小时；封闭结束后，用TPBS（含有0.05% Tween-20的PBS）洗15min×3次｡（5）反应一抗：将PVDF膜放入稀释后的一抗工作液中(β-actin，1:5000； Blimp-1，1:500； Bcl-6，1:1500)，4°C过夜孵育｡随后用TPBS洗l5min×3次｡（6）反应二抗：加入1:5000稀释的相应二抗，室温孵育2h；TPBS洗15min ×3次｡（7）显影：将ECL发光液均匀的涂于PVDF膜，随后采用X光压片方式检测结果。

统计学处理：数据分析应用SSPS软件处理，计量资料的数据均数±标准差表示，ANOVA分析比较组间差异的显著性｡蛋白尿､损伤指数及病理评分统计采用Ridit分析｡组间统计P<0.05表示差异有显著性｡

实验结果

MRL/lpr小鼠在12-13周龄时尿蛋白水平较正常对照组显著升高，每100ml尿液蛋白含量大于100mg，出现明显肾脏损伤｡在15-16周龄时开始出现被毛光泽下降、毛发稀松，鼻腔和嘴部两侧局部毛发脱落，并随着饲养时间的延长而加重，背部皮肤也有脱毛现象，未见明显关节肿胀，少量模型组小鼠局部出现皮肤结痂和血管炎。MRL/lpr小鼠在12-13周龄，尿蛋白水平>100mg/ml时，各组开始给药，持续8周｡

结果显示，随着给药时间的延长，IL23R-gp130-Fc给药各组及阳性对照Pre组动物毛发脱落情况及皮肤结痂及血管炎症状与模型组相比显著减少或减轻。尿蛋白检测结果显示，模型小鼠的尿蛋白水平随治疗时间延长而持续升高，最高达2000mg/100ml，IL23R-gp130-Fc （20mg/kg）给药4周后可显著降低动物尿蛋白水平直至给药结束，且高水平尿蛋白的动物数量较模型组也有明显下降；IL23R-gp130-Fc（10mg/kg）给药6周时也可显著降低其尿蛋白水平｡Pre阳性对照组（5mg/kg）给药4周后同样可降低模型小鼠的尿蛋白含量和高水平尿蛋白动物数｡

根据以上临床评分统计结果，显示IL23R-gp130-Fc（10和20mg/kg）给药可不同程度地降低狼疮MRL/lpr模型小鼠的损伤指数。图8，图9显示给药8周时各组动物的损伤指数变化以及治疗效果。

实施例9 IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠肾脏组织病理学的影响

狼疮性肾炎是MRL/lpr小鼠的主要病理特征之一。组织病理学检查可见，模型组MRL/lpr小鼠肾小球系膜细胞增生，系膜基质增多，毛细血管基底膜增厚，肾小球纤维化，局部炎性细胞浸润，可见新月小体形成，呈明显的间质性肾炎特征。图10和表2结果显示，IL23R-gp130-Fc给药（10，20mg/kg）可有效改善小鼠肾脏病理评分。

表2 IL23R-gp130-Fc皮下注射给药对MRL/lpr小鼠肾脏病理评分的影响（n=10，X±S）

。

实施例10 IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠脾脏组织病理学的影响

组织病理学检査结果发现（如图11所示），MRL/lpr小鼠脾脏显著肿大，动脉周围淋巴鞘的细胞密度明显加大，中央动脉管壁纤维性增厚､玻璃样变性，白髓弥漫性増生，生发中也形成数量显著増多，边缘区界限不清｡IL23R-gp130-Fc （10，20mg/kg）以及Pre（5mg/kg）给药明显缩小小鼠脾脏体积，改善MRL/lpr小鼠脾脏的白髓増生，减少生发中心形成｡下表2结果显示，IL23R-gp130-Fc给药对淋巴滤泡､动脉周围淋巴鞘密度､边缘区､生发中心数量等分项评分都有明显的降低作用，可显著改善脾脏病理学评分。

表3 IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠脾脏组织病理学评分改善情况

。

实施例11 IL23R-gp130-Fc对MRL/lpr小鼠脾脏指数的影响

脾脏肿大是MRL/lpr小鼠的典型特征｡如图12所示，处死小鼠后肉眼可见模型小鼠的脾脏体积是正常BALB/c小鼠2-3倍以上，进一步称量脾脏质量计算脏体比的结果显示，模型小鼠的脾脏指数显著升髙，IL23R-gp130-Fc （10，20mg/kg）以及Pre（5mg/kg）给药可显著缩小模型小鼠的脾脏体积，降低其异常升高的脾指数｡具体结果如表4所示。

表4 IL23R-gp130-Fc对MRL/lpr小鼠脾脏指数的影响

。

实施例12 IL23R-gp130-Fc给药MRL/lpr小鼠血清ANA､anti-dsDNA､IgC1的影响

MRL/lpr小鼠可自发产生髙水平的自身抗体，IL23R-gp130-Fc给药可剂量依赖性地降低ANA作用，降低模型小鼠的anti-dsDNA水平以及小鼠的IgG1水平｡Pre给药均可降低模型小鼠的ANA、抗dsDNA抗体和IgGl水平｡

表5 IL23R-gp130-Fc给药MRL/lpr小鼠血清ANA、anti-dsDNA、IgC1的影响

。

实施例13 IL23R-gp130-Fc对MRL/lpr小鼠血清BLyS的影响

BLyS是B淋巴细胞分化和发育成熟的重要细胞因子｡Elisa检测MRL/lpr模型小鼠血清中BLyS水平显著升高｡IL23R-gp130-Fc给药均可剂量依赖性下调MRL/lpr小鼠血清中高水平的BLyS，Pre给药也能降低BLyS水平。

表6 IL23R-gp130-Fc对MRL/lpr小鼠血清BLyS的影响

。

实施例14 IL23R-gp130-Fc给药对MRL/lpr小鼠脾脏Blimp-1和Bcl-6蛋白表达的影响

Blimp-1和Bcl-6是B淋巴细胞向浆细胞分化和生发中心形成的关键转录因子｡如图13，Western Blot检测结果显示，Blimp-1和Bcl-6蛋白表达水平在MRL/lpr小鼠脾脏组织中显著升高，IL23R-gp130-Fc给药后可显著降低脾脏Blimp-1和Bcl-6水平｡

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并作出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学

<120> 一种白介素39特异性拮抗蛋白及其在治疗自身免疫性疾病中的应用

<130> 2018

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> 人体

<400> 1

Met Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly His Ile Trp Val Glu Pro

1 5 10 15

Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile Ser Ile Tyr Cys Gln Ala

20 25 30

Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu His Phe Tyr Lys Asn Gly

35 40 45

Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile Asn Lys Thr Thr Ala Arg

50 55 60

Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His Ala Ser Met Tyr Cys Thr

65 70 75 80

Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr Leu Ile Cys Gly Lys Asp

85 90 95

Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro Asp Glu Val Thr Cys Val

100 105 110

Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys Thr Trp Asn Ala Gly Lys

115 120 125

Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val His Val Lys Ser Leu Glu

130 135 140

Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Ile Asn Ile Ser

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Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr Leu Val Trp Val Gln Ala

165 170 175

Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys Gln Leu Gln Ile His Leu

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Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val Ile Ser Arg Ala Glu Thr

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Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg Tyr Lys Ala Thr Thr Asn

225 230 235 240

Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr Asn Phe Thr Tyr Val Gln

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Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp Gln Pro Trp Ser Ser Pro

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Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro Gln Val Thr Ser Lys Ala

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Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu Thr Val Ala Ser Ile Ser

305 310 315 320

Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn Arg Gly Asp

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<210> 2

<211> 597

<212> PRT

<213> 人体

<400> 2

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1 5 10 15

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Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser

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<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

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<213> 人工合成

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<211> 3516

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5