本发明属于土壤微生物学技术领域，具体涉及大田种植方式下，一种基于16srrna基因(v5-v7高变区)深度高通量测序检测不同作物根际土壤微生物的方法。
背景技术：
根际(rhizosphere)被定义为紧密围绕着有生命力植物根系的生物活性区域，其中包含大量微生物，包括细菌、真菌和放线菌，也包括一些藻类和病毒等，范围一般为距离根表面1cm以内。不同植物甚至同一植物的不同生育期，其根系分泌物会对根际微生物的生长繁殖产生影响；而根际微生物又参与土壤中有机物质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环等多种生理生化过程，尤其是其中的固氮菌群，通过生物固氮作用在常温下把氮气转化为能被植物利用于合成各种氨基酸的氨。土壤根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异等不仅受到植物根系影响，也受土壤类型、农业耕作管理、季节变化、重金属污染、杀虫剂处理等影响。另外不同的检测技术对根际微生物群落指标的准确性也有影响。因此，准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础。
传统的用于研究微生物的分离培养法主要有平板培养法和显微镜观察等方法，虽然简单方便，至今仍然是一种不可替代的研究手段，但也存在一些弊端，即上述方法无法研究土壤中大量的且不可培养的微生物。biolog微平板分析法适用于检测可培养的且生长速度较快的微生物及其代谢多样性，但是实验结果并不能完全代表原位条件下微生物代谢多样性的结果，样品的处理方法、培养条件以及biolog微平板的类型等都会对结果造成一定程度的误差。醌指纹法的优点是简单快速，因此也被广泛地应用于微生物细胞结构多样性的分析中，但是醌指纹法也存在一些不足，例如它不能具体反映到哪个属、种的微生物多样性变化等。磷脂脂肪酸(plfa)分析法是基于plfa是活体细胞膜的一个重要组成部分，含量大约占细胞干重的5％；用plfa的变化来反映土壤生态系统中微生物的种类组成和数量变化，该方法不需要进行微生物培养，可直接鉴定微生物群落多样性变化，但该方法与plfa是否完全提取以及操作过程中plfa是否稳定有着很大的关系。
土壤微生物的遗传多样性是指土壤生态系统中的微生物在基因水平上所携带的遗传物质和遗传信息的总和；与高等生物相比，微生物的遗传多样性更加突出，不同微生物种群间的遗传物质和遗传信息具有非常显著的差异。土壤微生物遗传多样性的分析方法主要包括两类：第一类是基于杂交的分析方法，第二类是基于pcr的分析方法。杂交分析方法是基于核酸分子的碱基互补配对原理，利用特异性的探针与待测样品的核酸分子进行杂交的过程；杂交技术是通过测定dna重组率或dna杂交动力相似度来研究土壤微生物的遗传多样性，用于研究微生物遗传多样性的杂交探针主要包括rrna基因探针、抗性基因探针和编码代谢酶基因探针等，其中应用比较普遍的杂交技术包括荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，fish)技术，肽核酸(peptidenucleicacids，pna)杂交技术以及限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)技术等，各有优点，但均是低通量的分析方法。
运用pcr技术扩增细菌基因组中的16srrna基因(简称16srdna)或是真菌基因组中的18srdna、its区域并测序分析，可以对微生物进行分类鉴定，该技术已经普遍应用到探讨微生物的多样性、鉴定微生物的种类以及系统发育关系等领域。基于pcr的分析方法大致分为三阶段：第一，样品的核酸提取和纯化；第二，目的基因的pcr扩增；第三，扩增片段的变性处理与分析检测，包括聚丙烯酰胺变性梯度凝胶电泳(dgge)、单链构象多态性(sscp)、末端限制性片段长度多态性分析(t-rflp)、核糖体基因间隔区分析(risa)和自动核糖体间隔区基因分析(arisa)，或者第三，扩增片段的测序与分析，例如16srdna高通量测序技术等。其中，实时荧光定量pcr具有很多优点，如高精度、高灵敏度、高特异性、具有实时性等，但同时也存在一些不足之处，例如成本比较高，操作时还要考虑同源和异源dna背景、寡核苷酸杂交特异性、荧光染料或特异性探针的浓度以及pcr产物的大小等因素，这些因素都会引起结果的偏差。dgge是一种利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳的方法将具有相同长度但不同序列组成的核酸片段分离开的技术，虽然已经普遍应用到土壤微生物群落多样性分析的研究领域中，但是该技术也存在一些不足之处，例如可重复性差，耗时耗力，而且只能检测土壤中巨量复杂微生物中的很小一部分等。16srdna高通量测序技术，也称为16srdna深度测序技术，其原理是因为16srdna是原核微生物分类学研究中最常用的系统进化“分子钟”，其序列包含9个高可变区(hypervariableregion)和8个保守区(constantregion)，可变区序列因原核微生物物种不同而异，且变异程度与原核微生物的系统进化密切相关；即提取样品中微生物的总dna，然后用16srdna的不同高可变区的通用引物进行pcr扩增，获得绝大部分微生物16srdna高可变区的扩增产物，构建扩增产物的文库，进行大规模、高通量测序，然后比较分析测序数据，对土壤微生物群落的多样性进行研究。
技术实现要素：
本发明需要解决的问题是克服现有技术检测通量低、规模小、对不可培养微生物的覆盖度低等不足，提供一种基于16srdna(v5-v7)高通量测序检测不同作物根际土壤微生物的方法，为不同基因型作物包括转基因作物及其受体品种对根际土壤微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。
本发明的技术方案：
本发明所述基于16srdna(v5-v7)高通量测序检测不同作物根际土壤原核微生物的方法，由以下步骤构成：
(1)大田试验地设计，每种基因型作物(例如：大豆、玉米、小麦等)种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m2(5m×4m)，每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株；
(2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面1-2cm的表土，然后将在盛花期或苗期或鼓粒期或成熟期的作物植株连根从土中取出，取根区外土壤或用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛，于零下20℃-零下70℃保存，再用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除断根及根毛，并于零下70℃保存；
(3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的pcr抑制因子的powersoildnaisolationkit(mobiolaboratoriesinc.，carlsbad，ca，usa)提取高质量微生物宏基因组dna；
(4)用双标签融合引物法，其一含p5illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物16srdna的799f(5‘-aacmggattagataccckg-3’)，另一引物含p7illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物16srdna的1193r(5‘-acgtcatccccaccttcc-3’)，做pcr扩增所述宏基因组dna中16srdna的v5-v7高变区片段(约400bp)以构建文库；
(5)对合格的文库用illuminamiseq平台进行双末端300个核苷酸(英语缩写为pe300)边合成边测序的高通量测序，并对边合成边测序的读段(英语为reads)进行质量控制；
(6)把纯净的成对reads拼接成tag，然后聚类成“可操作分类学单元”(英语缩写为otu)，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析；
(7)以根系抖落土壤或根区外土壤微生物群落的组成、结构及多样性作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同大豆之间的异同。
系统对照为大田种植方式下的大豆根系抖落土壤或根区外土壤，每种基因型作物的系统对照土壤样品至少3个生物学重复，每种基因型作物的根际土壤样品至少3个生物学重复。所述的高质量宏基因组dna用powersoildnaisolationkit提取。其中的土壤样品的均质化在康宁lse涡旋混合器上以最大转速2850rpm运转10分钟完成。
高通量测序是在illuminamiseq平台上进行，以pe300模式做16srdna的v5-v7高变区片段高通量测序，每个土壤样品dna至少产出4万条以上connecttag以用于聚类成otu。
本发明的有益效果是：16srdna(v5-v7)高通量测序方法具有很多优点：首先是大规模、高通量，可以检测到土壤中的绝大部分不可培养的原核微生物种类，其次相比于宏基组高通量测序方法，费用较低(500～600元/样品dna)，因而可以多方面(不同作物品种植前、苗期、花期、成熟期等多个时期；同一时期各品种多点样品)、直接、原位地研究不同作物对于土壤原核微生物群落组成、结构和遗传多样性的影响。准确检测不同基因型植物包括转基因作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微环境影响的重要基础，也是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础，本发明提供的一种基于16srdna高通量测序检测大豆根际土壤原核微生物的方法，为不同基因型作物包括转基因作物及其受体品种对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。该方法检测较全面，操作简便，成本低，结果可靠。
附图说明
图1蒙豆12(md12)和nzl06-698(n698)大豆根际土壤(rh)高质量微生物宏基因组dna的检测结果。
图2蒙豆12(md12)和nzl06-698(n698)大豆根际土壤(rh)中原核微生物alpha多样性分析结果。
图3蒙豆12(md12)和nzl06-698(n698)大豆根际土壤(rh)中原核微生物群落基于otu的主成分分析(pca)结果。
图4蒙豆12(md12)和nzl06-698(n698)大豆根际土壤(rh)中原核微生物群落的beta多样性主关联分析(pcoa)结果。
图5蒙豆12(md12)和nzl06-698(n698)大豆根际土壤(rh)中超过95％的主要细菌类别，在门(phyla)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图6蒙豆12(md12)和nzl06-698(n698)大豆根际土壤(rh)中主要细菌类别在属(genus)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p＜0.05；**，p＜0.01。
具体实施方式
1.大豆材料：蒙豆12(对照品种)；nzl06-698含epsps耐除草剂基因。
2.田间试验设计：
大田试验地点在吉林省公主岭市，每一种基因型作物(例如大豆)种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于20m2(5m×4m)。每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株。
3.样品采集
先除去地面杂草和枯枝落叶等，铲除大田土壤表面1cm左右的表土，然后将在盛花期(或苗期、鼓粒期、成熟期)的大豆植株连根从土中取出，用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛等，于零下70℃保存(至少零下20℃保存)；然后用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除根毛等，并于零下70℃保存。
4.土壤样品中微生物宏基因组dna的提取：
从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的pcr抑制因子的powersoildnaisolationkit(mobiolaboratoriesinc.，carlsbad，ca，usa)提取高质量微生物宏基因组dna(图1)。
5.用双标签融合引物法构建各样品16srdna的v5-v7高变区扩增子文库
双标签融合引物对中的一条含p5illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物799f(5‘-aacmggattagataccckg-3’)，另一条引物含p7illumina接头序列、8核苷酸的标签以及1193r(5‘-acgtcatccccaccttcc-3’)，做pcr扩增所述宏基因组dna中16srdna的v5-v7高变区片段以构建文库。
6.合格文库的高通量测序
对合格的文库用illuminamiseq平台进行双末端300个核苷酸(pe300)边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列(reads)进行质量控制。
7.生物信息学内容分析
把纯净的成对reads拼接成tag，然后聚类成“可操作分类学单元”(otu)；然后做alpha多样性、beta多样性、群落结构、组成及在不同分类水平上各物种相对丰度差异的显著性分析等。
8.数据整合与比较分析
以根系抖落土壤(so)或根区外土壤(bs)为对照，准确测定大豆根际土壤(rh)原核微生物群落的alpha多样性(图2)、结构(主成分分析，图3；beta多样性，图4)、组成及在门分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图5)、在属分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图6)，比较不同品种大豆根际土壤原核微生物群落之间的异同。