提高植物耐旱性的基因及其用途的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物耐旱性的基因及其用途。

背景技术：

农作物的生长和发育往往受到干旱、高温、低温以及高盐等一些非生物胁迫，从而导致其产量降低。随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。干旱是导致农作物产量降低的最大因素，因此，各国科学界都在努力探寻与植物干旱耐受性的相关信号通路。植物脱落酸abscisic acid(ABA)能促进受胁迫的植物组织发生改变来迅速对干旱胁迫做出应答。大量实验表明，ABA能整合不同的环境胁迫信号，充当着内源信使的重要角色。在个体生长和发育的不同阶段均发挥着精细而微妙的调控作用。现有研究表明，ABA能够提高植物的抗旱和耐盐水平。

但本领域还需发现更多的耐旱基因，以提高农作物的干旱耐受力及产量。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是从基因水平提高植物的耐旱性。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种提高植物耐旱性的基因CARK1，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。所述核苷酸序列为CDS序列。

SEQ ID NO：1 CARK1基因的核苷酸序列

ATGGGCTGCTTTGGTTGTTGTGGTGGTGGTGAGGATTTCCGTAGAGTTTCTGAAACTGGACCAAAGCCAGTGCATAACACTGGAGGTTACAATGGAGGTCACCATCAAAGGGCAGATCCACCCAAAAACCTTCCAGTCATTCAGATGCAGCCTATCTCTGTTGCGGCCATTCCAGCTGATGAATTGAGGGATATAACGGATAACTATGGTTCAAAGTCCTTGATTGGTGAGGGTTCATATGGAAGAGTCTTTTATGGTATTCTTAAAAGTGGTAAAGCAGCTGCCATTAAGAAACTGGATTCTAGTAAGCAACCAGATCAAGAATTTCTCGCCCAGGTATCAATGGTTTCGAGATTGCGACAAGAAAATGTTGTTGCGCTTCTGGGCTATTGTGTTGATGGCCCACTCCGTGTTCTTGCTTATGAATATGCTCCTAATGGATCTCTTCATGATATTCTTCATGGTCGAAAAGGTGTTAAAGGGGCACAGCCAGGTCCTGTTCTGTCGTGGCACCAGAGAGTCAAAATTGCTGTTGGTGCGGCTAGAGGACTCGAGTACTTGCATGAGAAGGCAAACCCTCATGTTATCCACAGAGACATCAAATCCAGCAATGTACTTCTGTTCGATGATGATGTTGCCAAGATTGCTGATTTTGATTTGTCCAACCAAGCCCCTGACATGGCTGCTCGCCTTCACTCAACCCGTGTGCTCGGAACCTTTGGCTATCACGCTCCAGAGTATGCAATGACGGGGACGTTGAGCACAAAGAGTGATGTCTATAGTTTTGGCGTTGTTCTGCTGGAGCTCCTCACAGGTCGTAAACCAGTTGATCATACCTTACCACGTGGACAGCAGAGTGTCGTGACATGGGCAACCCCTAAATTGAGTGAAGACAAGGTGAAGCAGTGTGTTGACGCAAGACTAAACGGAGAATATCCTCCCAAAGCTGTTGCTAAGCTGGCTGCGGTAGCTGCACTGTGTGTGCAATATGAGGCAGACTTCAGGCCTAACATGAGCATAGTGGTGAAGGCTCTTCAGCCGTTGCTCAATCCTCCTCGTTCTGCTCCCCAGACTCCACACAGGAACCCGTATTGA。

其中，上述CARK1基因为植物基因。进一步的，所述的植物为拟南芥。

本发明还提供了一种上述基因编码得到的蛋白质，上述蛋白质能够提高植物的耐旱性，其氨基酸序列为SEQ ID NO：22所示。

SEQ ID NO：22CARK1基因编码的蛋白质的氨基酸序列

MGCFGCCGGGEDFRRVSETGPKPVHNTGGYNGGHHQRADPPKNLPVIQMQPISVAAIPADELRDITDNYGSKSLIGEGSYGRVFYGILKSGKAAAIKKLDSSKQPDQEFLAQVSMVSRLRQENVVALLGYCVDGPLRVLAYEYAPNGSLHDILHGRKGVKGAQPGPVLSWHQRVKIAVGAARGLEYLHEKANPHVIHRDIKSSNVLLFDDDVAKIADFDLSNQAPDMAARLHSTRVLGTFGYHAPEYAMTGTLSTKSDVYSFGVVLLELLTGRKPVDHTLPRGQQSVVTWATPKLSEDKVKQCVDARLNGEYPPKAVAKLAAVAALCVQYEADFRPNMSIVVKALQPLLNPPRSAPQTPHRNPY。

进一步的，本发明还提供了一种含有上述基因的重组载体。

其中，所述的重组载体为表达载体。

进一步的，所述的表达载体为真核表达载体。优选为pBI121载体。

本发明还提供了上述基因、蛋白、含有上述基因的重组载体在提高植物耐旱性中的用途。

本发明还提供了一种提高植物耐旱性的方法，包括以下步骤：

a、将编码耐旱蛋白质的基因CARK1可操作地连于载体上的表达调控序列后，形成可表达该基因的重组载体；

b、将35S启动子连接基因CARK1后，形成可过表达该基因的重组载体；

c、将b步骤构建的重组载体转入到农杆菌中，通过花絮浸染，获得后代，筛选出稳定的转基因植株。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一类编码耐旱蛋白质的基因CARK1，以及基因CARK1和其编码的蛋白质在提高植物或微生物的耐旱性中的用途。本发明为植物耐旱领域提供了新的能够有效提高植物的耐旱性的备选基因，具有很好的应用前景。

附图说明

图1突变体cark1及转基因株系OE-CARK1鉴定；

WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#19和#26在50uM ABA处理两小时后RNA的表达水平(以不做处理情况下作为1,野生型作为对照组)；

图2各株系中RAB18,RD29A表达量变化；

A、WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#19和#26植物中RAB18基因在50uM ABA处理两小时后RNA的表达水平(以不做处理情况下作为1，野生型作为对照组)；

B、WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#19和#26植物中RD29A基因在50uM ABA处理两小时后RNA的表达水平(以不做处理情况下作为1，野生型作为对照组)；

图3各株系在不同浓度ABA下的萌发率；

WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#26的种子在NA(不加ABA)、0.1、0.3、1和3μM ABA处理下，在第4天的萌发率；

图4各株系在不同浓度ABA下的子叶变绿率；

WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#26和#19的种子在NA(不加ABA)以及0.8μM ABA处理下，在第5天的子叶变绿率；

图5各株系在不同浓度ABA下的根长；

三日龄的WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#26和#19在NA(不加ABA)以及20μM ABA处理下生长七日后的根长。以在NA(不加ABA)条件下的根长作为对照组，为1；

图6各株系在不同浓度ABA下的气孔孔径；

4周龄的WT(野生型)、突变体cark1以及转基因株系OE-CARK1#26和#19用或不用30μM的ABA处理后，气孔的宽和长的比值。

具体实施方式

使用基因工程技术对植物进行改良是近年来的热点。使用基因工程技术以期提高植物的抗逆性，培育出耐逆性系也是一个可行之道。

本发明从拟南芥中克隆到的一个可提高植物旱胁迫抗性(耐旱性)的基因CARK1。研究发现，所述基因CAKR1表达的蛋白具有提高植物耐旱的能力；通过将CARK1基因转化拟南芥，实验结果发现转基因生物的耐旱性有所提高。该基因可用于提高植物对干旱的耐受程度，降低干旱引起的减产损失，同时降低成本，具有重要的经济意义和应用前景。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用菌株：农杆菌GV3101、大肠杆菌DH5α以及载体pBI121为来自普通市售产品。

实施例1拟南芥中耐旱基因CARK1的克隆及过量表达重组载体pBI121-35S:CARK1的构建

1、从拟南芥中筛选获得一段基因CARK1，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物，

上游引物(SEQ ID NO：2)：5’-atgggctgctttggttgttgtggtg-3’，

下游引物(SEQ ID NO：3)：5’-tcaatacgggttcctgtgtggagtc-3’。

然后经PCR从拟南芥cDNA中扩增SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。对PCR产物纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，经测序验证，得到SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

2、根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计引物

上游引物(SEQ ID NO：4)：5’-gcgtcgacatggagtacccatacgacgtac-3’，

下游引物(SEQ ID NO：5)：5’-tcccccgggtcaatacgggttcctgtgtg-3’。

采用PCR方法将步骤1从拟南芥cDNA中扩增完整的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列再次扩增出酶切位点。对PCR扩增产物进行纯化(见Qiagen公司所公开的PCR产物纯化资料)，然后用Xba1与Sma1酶切，胶回收，与载体pBI121连接(连接位点：Xba1与Sma1)，获得含SEQ ID NO：1的过量表达重组质粒，重组(同源重组位点为NcoI)，获得含有SEQ ID NO：1序列的过量表达重组质粒pBI121-35S:CARK1,并转入大肠杆菌DH5α中进行克隆。

实施例2转基因植物的获得

1)转化农杆菌(GV3101)

首先取出农杆菌(GV3101)感受态于冰上融化，加入2μL重组质粒，液氮冻2min，然后37℃水浴5min。加入1mL LB培养基，28℃振荡培养2-3h，离心收集菌体，将其涂在LB+Rif(25μg/ml)+Kan(50μg/ml)平板上，28℃继续培养2～3d。

2)阳性农杆菌转化子的鉴定

随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Rif+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养一定时间后，用菌液作模板进行PCR扩增。

根据CARK1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列设计鉴定引物：

35S：CARK1鉴定引物：

上游引物(SEQ ID NO：2)：5’-atgggctgctttggttgttgtggtg-3’，

下游引物(SEQ ID NO：3)：5’-tcaatacgggttcctgtgtggagtc-3’。

然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现(条带大小约为1100bp)，若有则代表目的基因已转入。

3)花絮浸染法介导的拟南芥稳定遗传转化

将带有目标质粒的农杆菌按1:1000体积比加入到200mL LB+Kan+Rif的培养基中，220rpm震荡培养18-20h。6000g，室温离心10min，弃上清收集菌体。将菌体溶于MS+3％蔗糖溶液中，调整OD值至0.6-0.8。加入0.02％的表面活性剂Silwet L-77，混匀。选取生长状况良好、花瓣完全开放、没有角果(约5周生长时间)的拟南芥幼苗，将花絮浸入溶解有菌体的MS溶液中约1min，取出花絮。套袋在幼苗上，黑暗处理24h后揭开袋子。5天后重复一次前面步骤。

4)转基因T1代阳性苗的筛选

收取花絮浸染后的T0代种子10000-20000颗，将其播于MS+Kan固体培养基中，pBI121载体中带有NPTⅡ基因，具有抗卡那霉素的抗性，因此阳性苗能够在卡纳抗性的培养基中正常生长。选取长出绿色真叶，根较长的幼苗移栽入泥炭土中，温室培养。待幼苗长到六片子叶后，粗提DNA，通过PCR鉴定，去除假阳性植株。

5)转基因T1代阳性苗的鉴定及获得稳定转基因株系

收取T1代种子，取50-100颗种子播于1/2MS+Kan平板中，观察卡纳抗性分离比，符合3：1的株系为单拷贝，移栽绿色幼苗入土中温室培养。T2代再播于1/2MS+Kan平板，全为绿色则为纯合子。获得稳定转基因植株T3代。

实验例3 cark1突变体，35S:CARK1转基因株系鉴定及相关基因定量分析实验cark1突变体

表示此基因在此植株内不表达。

一、拟南芥cark1突变体鉴定

同时购买突变体cark1，(购自于ABRC，Arabidopsis Biological Resource Center).

根据突变体cark1设计鉴定引物：

LP引物(SEQ ID NO：6)：5’-tttcttcaccaaccctacacg-3’,

RP引物(SEQ ID NO：7)：5’-caacagagtgacttcgtgcag-3’,

LB1.3引物(SEQ ID NO：8)：5’-attttgccgatttcggaac-3’。

LP(上游)、RP(下游)、LB1.3分别是检测此突变体的cark1基因是否沉默的引物名称。

然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现(条带大小约为1100bp)，若LP与RP引物经PCR无条带，LB1.3与RP引物经PCR,有条带，则代表是纯和突变体；若LP与RP引物经PCR有条带，LB1.3与RP引物经PCR,有条带，则代表是杂和突变体；若LP与RP引物经PCR无有条带，LB1.3与RP引物经PCR,无条带，则代表是野生型。

二、35S:CARK1转基因株系鉴定及cark1突变体，35S:CARK1转基因株相关基因定量分析

1、拟南芥转基因植物总RNA的提取

1)选取在MS培养基上生长良好12d左右的拟南芥幼苗，放入研钵中用液氮将其完全磨碎，称取0.08-0.1g放入EP管中。

2)EP管中加入1mL ambion TRIzol提取液，涡旋振荡1min后室温静置5min。

3)加入0.2mL氯仿，涡旋振荡15s，室温静置2-3min。

4)4℃，12000g离心10min，吸取水相至干净的EP管中。

5)加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃，静置10min。

6)4℃，12000g离心10min，弃上清。

7)将沉淀用1mL 75％乙醇轻轻洗涤，4℃，12000g离心30s，弃上清。

8)室温干燥沉淀5min，加入30μL无RNA酶的去离子水溶解沉淀。

2、单链cDNA的合成

a.基因组DNA的除去反应

10μL反应体系中加入：

5×gDNA Eraser Buffer 2μL

gDNA Eraser 1μL

Total RNA 1μg

RNase free ddH2O至10μL

室温静置5分钟。

b.反转录反应

3、qRT PCR

拟南芥中RD29A基因和RAB18基因都与ABA信号通路有关，如果能引起它们表达量的变化，就说明CARK1与ABA信号通路有关。Actin作为参照基因。

根据CARK1,RD29A,RAB18,Actin基因核苷酸序列设计定量引物：

CARK1基因(SEQ ID NO：1)：

上游引物(SEQ ID NO：9)：5’-accttccagtcattcaga-3’；

下游引物(SEQ ID NO：10)：5’-accatagttatccgttatatcc-3’；

RD29A基因(SEQ ID NO：11)：

SEQ ID NO：11RD29A基因的核苷酸序列

ATGGATCAAACAGAGGAACCACCACTCAACACACACCAGCAGCACCCAGAAGAAGTTGAACATCATGAGAATGGTGCGACTAAGATGTTTAGGAAAGTAAAGGCTAGAGCTAAGAAGTTCAAGAACAGTCTCACTAAACATGGACAAAGCAATGAGCATGAGCAAGATCATGATTTGGTTGAAGAAGATGATGATGATGACGAGCTAGAACCTGAAGTGATCGATGCACCAGGCGTAACAGGTAAACCTAGAGAAACTAATGTTCCAGCATCGGAGGAAATTATTCCACCAGGGACAAAGGTGTTTCCTGTCGTGTCTTCCGATTACACCAAACCCACTGAATCTGTACCAGTACAAGAGGCCTCTTACGGACACGATGCACCGGCTCATTCTGTAAGGACGACGTTTACATCGGACAAGGAAGAGAAAAGAGATGTACCGATTCATCATCCTCTGTCCGAATTGTCAGACAGAGAAGAGAGTAGAGAGACTCATCATGAGTCATTGAACACTCCGGTCTCTCTGCTTTCTGGAACAGAGGATGTAACGAGTACGTTTGCTCCAAGTGGTGATGATGAATATCTTGATGGTCAACGGAAGGTCAACGTCGAGACCCCGATAACGTTGGAGGAAGAGTCGGCTGTTTCAGACTATCTTAGTGGTGTATCTAATTATCAGTCCAAAGTTACTGATCCCACCAAAGAAGAAACTGGAGGAGTACCGGAGATTGCTGAGTCTTTTGGTAATATGGAAGTGACTGATGAGTCTCCTGATCAGAAGCCAGGACAATTTGAAAGAGACTTGTCGACGAGAAGCAAAGAATTCAAAGAGTTTGATCAGGACTTTGACTCTGTTCTCGGTAAGGATTCGCCGGCGAAATTTCCAGGTGAATCAGGAGTTGTTTTCCCGGTGGGCTTTGGTGACGAGTCAGGAGCTGAGCTGGAAAAAGATTTTCCGACGAGAAGTCATGATTTTGATATGAAGACTGAAACTGGAATGGACACGAATTCTCCATCAAGAAGCCATGAATTTGATCTGAAGACTGAATCTGGAAACGACAAGAATTCTCCGATGGGCTTTGGTAGTGAATCAGGAGCTGAGCTGGAAAAAGAATTTGATCAGAAGAACGATTCTGGAAGAAACGAGTATTCGCCGGAATCTGACGGCGGTTTAGGAGCTCCGTTGGGAGGAAATTTTCCGGTGAGAAGTCATGAGTTGGATCTGAAGAACGAATCTGATATCGACAAGGATGTGCCGACGGGATTTGACGGAGAACCAGATTTTCTGGCGAAGGGAAGACCTGGATACGGTGAGGCATCAGAAGAGGATAAATTTCCGGCGAGAAGTGATGATGTGGAAGTAGAGACTGAGCTGGGAAGAGACCCAAAGACGGAGACTCTTGATCAATTCTCACCGGAACTTTCTCATCCTAAAGAAAGAGATGAGTTTAAGGAGTCCAGAGATGATTTTGAGGAGACGAGAGATGAGAAAACAGAGGAGCCAAAACAGAGCACTTACACAGAGAAGTTTGCTTCAATGCTAGGTTACTCCGGAGAAATTCCGGTGGGAGATCAAACTCAAGTGGCGGGAACTGTTGATGAGAAGTTGACTCCGGTCAATGAGAAGGATCAAGAAACAGAGTCTGCCGTGACGACGAAGTTACCTATCTCCGGAGGTGGAAGTGGAGTAGAGGAGCAACGAGGGGAAGATAAAAGTGTGTCGGGTAGAGATTATGTGGCGGAGAAACTGACAACTGAAGAAGAAGACAAAGCCTTTTCTGATATGGTTGCCGAGAAACTTCAGATTGGAGGAGAAGAAGAGAAGAAGGAAACGACGACAAAGGAAGTGGAGAAGATCTCTACCGAGAAGGCAGCATCGGAGGAGGGTGAGGCGGTGGAAGAGGAAGTGAAAGGAGGAGGAGGAATGGTTGGGAGGATTAAAGGATGGTTCGGTGGTGGTGCGACTGATGAGGTGAAGCCAGAATCGCACATTCTGTTGAAGAGGCTCCAAAATCATCTGGCTGGTTTGGTGGTGGTCGACGGAGGAGGTGAAGCCAAAATCGCCTCATTCCGTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTGGCTCCACTGTTG TTCCGGTGCAGAAGGAGCTTTAA。

上游引物(SEQ ID NO：12)：5’-tcaacacacaccagcagcac-3’；

下游引物(SEQ ID NO：13)：5’-atcggaagacacgacaggaa-3’；

RD29B基因(SEQ ID NO：14)：

SEQ ID NO：14RD29B基因的核苷酸序列

ATGGAGTCACAGTTGACACGTCCTTATGGTCATGAGCAAGCAGAAGAACCAATCAGAATTCACCATCCAGAAGAAGAAGAGCATCATGAGAAGGGAGCATCCAAAGTGTTGAAGAAAGTAAAAGAAAAGGCTAAGAAAATCAAGAACAGTCTCACTAAACATGGAAATGGTCATGATCACGATGTGGAAGATGATGATGATGAGTATGACGAGCAAGACCCAGAAGTTCACGGCGCACCAGTGTATGAATCCTCTGCCGTGAGAGGTGGTGTAACGGGTAAACCTAAGTCTCTTAGTCATGCCGGAGAAACTAATGTTCCGGCATCGGAGGAGATTGTTCCTCCAGGGACAAAAGTTTTTCCTGTCGTGTCTTCTGACCACACCAAACCCATTGAGCCTGTATCATTACAAGATACCTCTTACGGACATGAGGCACTGGCTGATCCTGTAAGAACGACGGAAACATCGGACTGGGAAGCGAAAAGAGAGGCACCGACTCATTATCCTCTCGGAGTGTCAGAATTTTCAGACAGAGGAGAGAGCAGAGAGGCTCATCAAGAGCCATTGAACACTCCTGTGTCTCTGCTTTCAGCAACAGAGGACGTGACTAGGACGTTTGCTCCTGGTGGTGAAGATGACTATCTCGGTGGTCAACGGAAAGTCAACGTCGAGACGCCAAAACGTTTGGAGGAAGATCCGGCTGCTCCAGGAGGAGGATCGGATTATCTCAGTGGTGTATCTAATTATCAGTCCAAAGTTACTGATCCCACGCATAAAGGTGGAGAAGCTGGAGTACCAGAGATTGCTGAGTCTCTTGGTAGAATGAAAGTGACTGATGAGTCTCCTGATCAGAAATCAAGACAAGGACGCGAAGAAGACTTTCCGACGAGAAGCCATGAGTTTGATCTGAAGAAGGAATCTGATATCAACAAGAATTCTCCGGCAAGATTTGGAGGGGAATCAAAAGCTGGGATGGAGGAAGATTTTCCGACAAGAGGTGATGTGAAAGTAGAGAGTGGATTGGGAAGAGACTTACCGACGGGAACTCATGATCAGTTCTCACCAGAACTATCTCGTCCCAAAGAGAGAGATGATTCTGAGGAAACCAAAGATGAGTCGACACATGAGACAAAACCAAGCACCTACACAGAGCAGTTAGCTTCAGCTACATCAGCCATAACTAACAAAGCTATAGCCGCAAAGAACGTCGTTGCCTCAAAGCTAGGTTACACCGGAGAGAATGGCGGCGGGCAAAGCGAGAGCCCTGTAAAAGATGAAACTCCGAGATCTGTTACTGCTTACGGGCAGAAAGTGGCGGGAACTGTTGCTGAGAAGTTGACTCCGGTTTACGAAAAAGTCAAAGAAACAGGATCAACGGTGATGACAAAGCTACCTCTCTCCGGAGGTGGAAGTGGAGTGAAGGAGACGCAACAAGGGGAAGAGAAAGGTGTGACGGCTAAAAATTATATATCAGAGAAGCTGAAACCTGGAGAAGAGGACAAAGCTTTATCGGAAATGATAGCTGAGAAACTTCATTTTGGAGGAGGAGGAGAGAAGAAGACAACGGCTACAAAGGAGGTGGAAGTGACGGTTGAGAAGATACCTTCCGACCAGATAGCGGAGGGGAAAGGACATGGTGAGGCGGTTGCAGAGGAAGGAAAAGGTGGAGAAGGAATGGTGGGGAAAGTTAAAGGAGCGGTCACTTCTTGGCTCGGTGGTAAACCGAAGTCGCCACGGTCCGTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTGGCACCACCGTTGGGACTATGGGGTTTTCGGATTCCGGTGGAAGTGAGTTGGGAGGCAGTGGCGGAGGTAAGGGAGTTCAAGATTCTGGGAACTGA。

上游引物(SEQ ID NO：15)：5’-atcggaagacacgacaggaa-3’；

下游引物(SEQ ID NO：16)：5’-tctcttttcgcttcccagt-3’；

Actin基因：

上游引物(SEQ ID NO：17)：5’-ggtaacattgtgctcagtggtgg-3’；

下游引物(SEQ ID NO：18)：5’-aacgaccttaatcttcatgctgc-3’；

RAB18基因(SEQ ID NO：19)：

SEQ ID NO：19 RAB18基因的核苷酸序列

ATGGCGTCTTACCAGAACCGTCCAGGAGGTCAGGCCACTGACGAGTACGGAAACCCGATCCAGCAGCAGTATGACGAGTACGGAAATCCGATGGGAGGAGGAGGATACGGAACTGGTGGTGGTGGAGGAGCTACAGGTGGCCAAGGATACGGAACAGGTGGCCAAGGGTACGGATCAGGTGGCCAAGGGTACGGAACCGGTGGCCAAGGATACGGAACCGGGACCGGGACTGAAGGCTTTGGAACTGGCGGAGGAGCTAGGCACCACGGCCAAGAGCAACTCCACAAGGAAAGTGGTGGTGGCTTGGGAGGAATGCTTCACCGCTCCGGATCTGGATCCAGCTCTAGCTCGGAGGATGATGGACAAGGAGGGAGGAGGAAGAAGGGAATAACACAAAAGATCAAGGAGAAGTTGCCAGGTCATCATGATCAGTCTGGTCAAGCTCAAGCGATGGGCGGCATGGGATCCGGATATGATGCTGGTGGCTACGGTGGTGAGCACCACGAGAAGAAGGGGATGATGGACAAGATCAAGGAAAAGCTTCCCGGTG GTGGCCGTTAA。

上游引物(SEQ ID NO：20)：5’-aagatcaaggagaagttgccagg-3’；

下游引物(SEQ ID NO：21)：5’-gtaaacaacacacatcgcaggacg-3’；

反应体系：

程序：

结果发现，如图1所示：cark1突变体的CARK1的表达量是非常低的，同时过表达株系OE-CARK1#19和OE-CARK1#26中CARK1的表达量是远远高于野生型的，说明突变体与过表达转基因株系符合实验要求。

采用50uM ABA处理两小时前后相比较相关基因表达量的变化值，结果(图2)发现：cark1突变体在处理后RAB18,RD29A的表达量增高的值明显低于野生型，同时过表达株系OE-CARK1#19和OE-CARK1#26中RAB18,RD29A的表达量增高的值明显高于野生型。说明CAKR1基因确实能够影响干旱相关的基因RAB18,RD29A，也说明CARK1基因参与ABA信号通路，调控干旱途径。

实验例4转基因株系对ABA的响应实验

(1)种子萌发实验(ABA抑制种子的萌发过程)：不同转基因株系各100颗左右种子置于4℃春化3d，均匀播种于0，0.1，0.3，1.0，3.0μM ABA的MS培养基上，每天记录种子萌发情况，取第四天结果，如图3所示。

结果表明：在不含ABA的条件下，各株系的萌发率是一致的，且都达到100％；在不同浓度的ABA处理下，cark1突变体植株的萌发率高于野生型，过表达株系OE-CARK1#26的萌发率低于野生型。

子叶变绿实验(ABA能够抑制种子的形态建成)：不同转基因株系各100颗左右种子置于4℃春化3d，均匀播于0.8μM ABA的MS培养基上，五天后记录子叶变绿情况，结果见图4所示。

结果表明：在不含ABA下，各株系的子叶的变绿率是一致的，且都达到100％；在0.8uMABA处理下，cark1突变体植株的子叶变绿率高于野生型；过表达株系OE-CARK1#26的子叶变绿低于野生型。

(3)根长实验：各转基因株系中约100颗种子，分层点在MS培养基上并垂直放置培养。三天后，各株系移5颗生长相似的苗转移到1/2MS培养基中(0,20μM ABA)，并垂直放置培养。7天后测定根长，结果见图5。

结果表明：在20uM ABA处理下，cark1突变体植株的根长比野生型的根长要长，过表达OE-CARK1#19和OE-CARK1#26转基因植株的根长比野生型的根长要短。

(4)气孔实验(ABA是通过调控气孔的张开或者关闭来响应干旱胁迫)：将4周龄的幼苗在黑暗中放置24小时以关闭气孔。然后，将来自4周龄植物的莲座叶的表皮条剥离并浸入开放缓冲液(10mM MES-KOH(pH 6.15)，10mM KCl和50μM CaCl2(含或不含30μMABA)中3小时)暴露于继续光照，为了分析抑制ABA的气孔关闭的效果，将每一株系都用或不用30μM的ABA处理。检查气孔，并用荧光显微镜(DMI6000B，Leica)拍照。用ImageJ量化法测量每条线上100多个气孔孔径的宽长比，结果见图6。

结果说明：cark1突变体植株的气孔开合比野生型的大，过表达OE-CARK1#19和OE-CARK1#26转基因植株的气孔比野生型的开合程度低。CARK1是参与ABA途径的。

当植物遇到干旱胁迫的时候，ABA会大量积累。ABA能够通过关闭气孔降低蒸腾应对受到的干旱胁迫，同时也会促进与干旱有关的基因的表达。

以上结果可以发现：在萌发、子叶变绿和根长实验中可以发现，cark1突变体植株对ABA是不敏感的，过表达OE-CARK1#19和OE-CARK1#26转基因植株对ABA是非常敏感的，在ABA信号通路中，CARK1是一个正调控因子，说明了CARK1基因可以提高植物的耐旱性。

实验例5转基因株系干旱胁迫实验

各转基因株系中约100颗种子，分层点在MS培养基上并垂直放置培养。三天后，移到花盆中，在相同的生长条件下2周后的幼苗，进行干旱胁迫处理14天。再复水4天后，记录植物的存活情况，结果如表1所示。

表1干旱胁迫存活率

1、2、3分别表示同一个实验的重复数。

结果说明：过表达OE-CARK1#19和OE-CARK1#26转基因植株的存活率是最强的，比野生型高；cark1突变体植株的存活率是最低的，比野生型低。

上述实验结果说明了：

1、CARK1基因对ABA敏感，在ABA代谢途径中，呈正调控因子。

2、OE-CARK1转基因株系与野生型和cark1突变体相比，OE-CARK1转基因株系具有最强的耐旱能力。

由此可知，CARK1基因参与ABA代谢途径，且能够提高植物的干旱耐受力。本发明提供了一种新的提高植物耐旱性的基因CARK1，对于转基因工程具有很好的应用前景。

序列表

<110> 四川大学

<120> 提高植物耐旱性的基因及其用途

<130> A180152K（序）

<141> 2018-03-09

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggctgct ttggttgttg tggtggtggt gaggatttcc gtagagtttc tgaaactgga 60

ccaaagccag tgcataacac tggaggttac aatggaggtc accatcaaag ggcagatcca 120

cccaaaaacc ttccagtcat tcagatgcag cctatctctg ttgcggccat tccagctgat 180

gaattgaggg atataacgga taactatggt tcaaagtcct tgattggtga gggttcatat 240

ggaagagtct tttatggtat tcttaaaagt ggtaaagcag ctgccattaa gaaactggat 300

tctagtaagc aaccagatca agaatttctc gcccaggtat caatggtttc gagattgcga 360

caagaaaatg ttgttgcgct tctgggctat tgtgttgatg gcccactccg tgttcttgct 420

tatgaatatg ctcctaatgg atctcttcat gatattcttc atggtcgaaa aggtgttaaa 480

ggggcacagc caggtcctgt tctgtcgtgg caccagagag tcaaaattgc tgttggtgcg 540

gctagaggac tcgagtactt gcatgagaag gcaaaccctc atgttatcca cagagacatc 600

aaatccagca atgtacttct gttcgatgat gatgttgcca agattgctga ttttgatttg 660

tccaaccaag cccctgacat ggctgctcgc cttcactcaa cccgtgtgct cggaaccttt 720

ggctatcacg ctccagagta tgcaatgacg gggacgttga gcacaaagag tgatgtctat 780

agttttggcg ttgttctgct ggagctcctc acaggtcgta aaccagttga tcatacctta 840

ccacgtggac agcagagtgt cgtgacatgg gcaaccccta aattgagtga agacaaggtg 900

aagcagtgtg ttgacgcaag actaaacgga gaatatcctc ccaaagctgt tgctaagctg 960

gctgcggtag ctgcactgtg tgtgcaatat gaggcagact tcaggcctaa catgagcata 1020

gtggtgaagg ctcttcagcc gttgctcaat cctcctcgtt ctgctcccca gactccacac 1080

aggaacccgt attga 1095

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggctgct ttggttgttg tggtg 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcaatacggg ttcctgtgtg gagtc 25

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtcgacat ggagtaccca tacgacgtac 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcccccgggt caatacgggt tcctgtgtg 29

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttcttcacc aaccctacac g 21

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<211> 21

<212> DNA

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caacagagtg acttcgtgca g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attttgccga tttcggaac 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accttccagt cattcaga 18

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accatagtta tccgttatat cc 22

<210> 11

<211> 2131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggatcaaa cagaggaacc accactcaac acacaccagc agcacccaga agaagttgaa 60

catcatgaga atggtgcgac taagatgttt aggaaagtaa aggctagagc taagaagttc 120

aagaacagtc tcactaaaca tggacaaagc aatgagcatg agcaagatca tgatttggtt 180

gaagaagatg atgatgatga cgagctagaa cctgaagtga tcgatgcacc aggcgtaaca 240

ggtaaaccta gagaaactaa tgttccagca tcggaggaaa ttattccacc agggacaaag 300

gtgtttcctg tcgtgtcttc cgattacacc aaacccactg aatctgtacc agtacaagag 360

gcctcttacg gacacgatgc accggctcat tctgtaagga cgacgtttac atcggacaag 420

gaagagaaaa gagatgtacc gattcatcat cctctgtccg aattgtcaga cagagaagag 480

agtagagaga ctcatcatga gtcattgaac actccggtct ctctgctttc tggaacagag 540

gatgtaacga gtacgtttgc tccaagtggt gatgatgaat atcttgatgg tcaacggaag 600

gtcaacgtcg agaccccgat aacgttggag gaagagtcgg ctgtttcaga ctatcttagt 660

ggtgtatcta attatcagtc caaagttact gatcccacca aagaagaaac tggaggagta 720

ccggagattg ctgagtcttt tggtaatatg gaagtgactg atgagtctcc tgatcagaag 780

ccaggacaat ttgaaagaga cttgtcgacg agaagcaaag aattcaaaga gtttgatcag 840

gactttgact ctgttctcgg taaggattcg ccggcgaaat ttccaggtga atcaggagtt 900

gttttcccgg tgggctttgg tgacgagtca ggagctgagc tggaaaaaga ttttccgacg 960

agaagtcatg attttgatat gaagactgaa actggaatgg acacgaattc tccatcaaga 1020

agccatgaat ttgatctgaa gactgaatct ggaaacgaca agaattctcc gatgggcttt 1080

ggtagtgaat caggagctga gctggaaaaa gaatttgatc agaagaacga ttctggaaga 1140

aacgagtatt cgccggaatc tgacggcggt ttaggagctc cgttgggagg aaattttccg 1200

gtgagaagtc atgagttgga tctgaagaac gaatctgata tcgacaagga tgtgccgacg 1260

ggatttgacg gagaaccaga ttttctggcg aagggaagac ctggatacgg tgaggcatca 1320

gaagaggata aatttccggc gagaagtgat gatgtggaag tagagactga gctgggaaga 1380

gacccaaaga cggagactct tgatcaattc tcaccggaac tttctcatcc taaagaaaga 1440

gatgagttta aggagtccag agatgatttt gaggagacga gagatgagaa aacagaggag 1500

ccaaaacaga gcacttacac agagaagttt gcttcaatgc taggttactc cggagaaatt 1560

ccggtgggag atcaaactca agtggcggga actgttgatg agaagttgac tccggtcaat 1620

gagaaggatc aagaaacaga gtctgccgtg acgacgaagt tacctatctc cggaggtgga 1680

agtggagtag aggagcaacg aggggaagat aaaagtgtgt cgggtagaga ttatgtggcg 1740

gagaaactga caactgaaga agaagacaaa gccttttctg atatggttgc cgagaaactt 1800

cagattggag gagaagaaga gaagaaggaa acgacgacaa aggaagtgga gaagatctct 1860

accgagaagg cagcatcgga ggagggtgag gcggtggaag aggaagtgaa aggaggagga 1920

ggaatggttg ggaggattaa aggatggttc ggtggtggtg cgactgatga ggtgaagcca 1980

gaatcgcaca ttctgttgaa gaggctccaa aatcatctgg ctggtttggt ggtggtcgac 2040

ggaggaggtg aagccaaaat cgcctcattc cgttgaagag tctccacaat cacttggctc 2100

cactgttgtt ccggtgcaga aggagcttta a 2131

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaacacaca ccagcagcac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcggaagac acgacaggaa 20

<210> 14

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggagtcac agttgacacg tccttatggt catgagcaag cagaagaacc aatcagaatt 60

caccatccag aagaagaaga gcatcatgag aagggagcat ccaaagtgtt gaagaaagta 120

aaagaaaagg ctaagaaaat caagaacagt ctcactaaac atggaaatgg tcatgatcac 180

gatgtggaag atgatgatga tgagtatgac gagcaagacc cagaagttca cggcgcacca 240

gtgtatgaat cctctgccgt gagaggtggt gtaacgggta aacctaagtc tcttagtcat 300

gccggagaaa ctaatgttcc ggcatcggag gagattgttc ctccagggac aaaagttttt 360

cctgtcgtgt cttctgacca caccaaaccc attgagcctg tatcattaca agatacctct 420

tacggacatg aggcactggc tgatcctgta agaacgacgg aaacatcgga ctgggaagcg 480

aaaagagagg caccgactca ttatcctctc ggagtgtcag aattttcaga cagaggagag 540

agcagagagg ctcatcaaga gccattgaac actcctgtgt ctctgctttc agcaacagag 600

gacgtgacta ggacgtttgc tcctggtggt gaagatgact atctcggtgg tcaacggaaa 660

gtcaacgtcg agacgccaaa acgtttggag gaagatccgg ctgctccagg aggaggatcg 720

gattatctca gtggtgtatc taattatcag tccaaagtta ctgatcccac gcataaaggt 780

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tctcctgatc agaaatcaag acaaggacgc gaagaagact ttccgacgag aagccatgag 900

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agccctgtaa aagatgaaac tccgagatct gttactgctt acgggcagaa agtggcggga 1320

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gaggggaaag gacatggtga ggcggttgca gaggaaggaa aaggtggaga aggaatggtg 1680

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gttgaagagt ctccacaatc acttggcacc accgttggga ctatggggtt ttcggattcc 1800

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atcggaagac acgacaggaa 20

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<212> DNA

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<400> 16

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<400> 17

ggtaacattg tgctcagtgg tgg 23

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<211> 23

<212> DNA

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aacgacctta atcttcatgc tgc 23

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atggcgtctt accagaaccg tccaggaggt caggccactg acgagtacgg aaacccgatc 60

cagcagcagt atgacgagta cggaaatccg atgggaggag gaggatacgg aactggtggt 120

ggtggaggag ctacaggtgg ccaaggatac ggaacaggtg gccaagggta cggatcaggt 180

ggccaagggt acggaaccgg tggccaagga tacggaaccg ggaccgggac tgaaggcttt 240

ggaactggcg gaggagctag gcaccacggc caagagcaac tccacaagga aagtggtggt 300

ggcttgggag gaatgcttca ccgctccgga tctggatcca gctctagctc ggaggatgat 360

ggacaaggag ggaggaggaa gaagggaata acacaaaaga tcaaggagaa gttgccaggt 420

catcatgatc agtctggtca agctcaagcg atgggcggca tgggatccgg atatgatgct 480

ggtggctacg gtggtgagca ccacgagaag aaggggatga tggacaagat caaggaaaag 540

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<212> DNA

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aagatcaagg agaagttgcc agg 23

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<212> DNA

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gtaaacaaca cacatcgcag gacg 24

<210> 22

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Gly Cys Phe Gly Cys Cys Gly Gly Gly Glu Asp Phe Arg Arg Val

1 5 10 15

Ser Glu Thr Gly Pro Lys Pro Val His Asn Thr Gly Gly Tyr Asn Gly

20 25 30

Gly His His Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Asn Leu Pro Val Ile Gln

35 40 45

Met Gln Pro Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Ala Asp Glu Leu Arg Asp

50 55 60

Ile Thr Asp Asn Tyr Gly Ser Lys Ser Leu Ile Gly Glu Gly Ser Tyr

65 70 75 80

Gly Arg Val Phe Tyr Gly Ile Leu Lys Ser Gly Lys Ala Ala Ala Ile

85 90 95

Lys Lys Leu Asp Ser Ser Lys Gln Pro Asp Gln Glu Phe Leu Ala Gln

100 105 110

Val Ser Met Val Ser Arg Leu Arg Gln Glu Asn Val Val Ala Leu Leu

115 120 125

Gly Tyr Cys Val Asp Gly Pro Leu Arg Val Leu Ala Tyr Glu Tyr Ala

130 135 140

Pro Asn Gly Ser Leu His Asp Ile Leu His Gly Arg Lys Gly Val Lys

145 150 155 160

Gly Ala Gln Pro Gly Pro Val Leu Ser Trp His Gln Arg Val Lys Ile

165 170 175

Ala Val Gly Ala Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Leu His Glu Lys Ala Asn

180 185 190

Pro His Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Ser Asn Val Leu Leu Phe

195 200 205

Asp Asp Asp Val Ala Lys Ile Ala Asp Phe Asp Leu Ser Asn Gln Ala

210 215 220

Pro Asp Met Ala Ala Arg Leu His Ser Thr Arg Val Leu Gly Thr Phe

225 230 235 240

Gly Tyr His Ala Pro Glu Tyr Ala Met Thr Gly Thr Leu Ser Thr Lys

245 250 255

Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly

260 265 270

Arg Lys Pro Val Asp His Thr Leu Pro Arg Gly Gln Gln Ser Val Val

275 280 285

Thr Trp Ala Thr Pro Lys Leu Ser Glu Asp Lys Val Lys Gln Cys Val

290 295 300

Asp Ala Arg Leu Asn Gly Glu Tyr Pro Pro Lys Ala Val Ala Lys Leu

305 310 315 320

Ala Ala Val Ala Ala Leu Cys Val Gln Tyr Glu Ala Asp Phe Arg Pro

325 330 335

Asn Met Ser Ile Val Val Lys Ala Leu Gln Pro Leu Leu Asn Pro Pro

340 345 350

Arg Ser Ala Pro Gln Thr Pro His Arg Asn Pro Tyr

355 360