本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种核酸的检测体系及其检测方法和应用。
背景技术：
：生物传感器(biosensor)是一种利用生物活性物质产生信号，并通过转换器将信号转换传导至物理化学检测器，显示可读信号的装置。生物传感器包括三个部分：敏感的生物元件(生物材料如生物组织、微生物、细胞器、细胞感受器、酶、抗体、核酸等，生物派生材料或者类生物材料)，这些敏感的生物元件可以通过生物工程来创造，连接二者的转换器以及检测元件(用如光学、压电、电化学、温度或者电磁等物理化学方式工作)。核酸外切酶iii作用于双链dna，沿3'→5'方向逐步催化去除单核苷酸，每次酶与底物结合催化，只有几个核苷酸被除掉，从而在dna分子群内产生渐进缺失。尽管可以作用于双链dna的切刻产生单链gap，但最适底物是平末端或3'凹陷末端dna。由于对单链dna无活性，因此3'突出末端抗该酶的切割，拮抗程度随3'突出末端的长度而不同，四碱基或更长的突出完全不能被切割。这种特性对于一端是抗性位点(3'突出端)一端是敏感位点(平端或5'突出端)的线性dna分子，可以产生单向缺失。cn106970229a公开了一种基于dna银纳米簇分子信标与核酸外切酶iii循环信号放大的转录因子检测方法，首次将dna银纳米簇分子信标这种新型纳米材料作为荧光探针应用于转录因子的检测，基于dna银纳米簇分子信标的荧光调节是由可以被酶切割的dna片段这一特征，加入了核酸外切酶iii，既参与了信号的转化，又参与了检测信号的增强。cn105651744a公开了一种au3+浓度检测方法，采用二硫化钼量子点作为荧光探针对au3+离子浓度进行测定，其原理基于三价金离子能选择性淬灭水热法合成的二硫化钼量子点(mos2qds)的荧光，而金纳米颗粒对二硫化钼量子点的荧光没有任何影响。cn104946770a涉及一种基于核酸外切酶ⅲ的汞离子检测新方法，包括(1)将两段能够对汞离子特异性识别且富含t碱基的dna片段与待测样品混合，两段dna片段在待测样品中的hg2+作用下结合成3'端闭合的双链dna；(2)核酸外切酶iii酶切双链dna；(3)对剩余的没有被酶切的dna片段进行荧光定量pcr扩增；(4)根据荧光检测结果确定hg2+浓度。cn1733934公开了一种简单、灵敏检测核酸外切酶iii活性的探针及其应用，该探针是从5'端到3'端由3～6个重复的cg碱基序列构成的dna，且3'端标记荧光基团。该发明探针能自杂交成为双链dna，g碱基与荧光基团之间发生光电子诱导转移，使探针荧光被熄灭。当检测体系中含有核酸外切酶iii时，它能沿3'→5'方向逐步催化水解双链dna生成单核苷酸，使荧光基团与dna分离而游离在溶液中，荧光基团的荧光得以恢复，通过检测体系的荧光强度即可实现核酸外切酶iii活性的定量检测，但上述现有技术步骤繁琐复杂，灵敏度不高，特异性较差，反应条件苛刻，对设别要求高，无法简洁高效的完成检测目的。综上所述，现有技术对于荧光生物传感器的研发及应用仍存在一定的局限性，因此，提供一种简洁高效的荧光生物传感器及其制备方法具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种核酸的检测体系及其检测方法和应用，通过将单层二硫化钼纳米片应用到核酸外切酶iii的荧光检测体系中，针对特定的核苷酸序列，优化反应条件和流程，最大程度发挥核酸外切酶iii的循环放大功能和二硫化钼纳米片的淬灭功能，各步骤协同增效，相互配合，牵一发而动全身，共同提升了检测体系的灵敏度和特异性，操作简便，简洁高效，具有广阔的应用前景。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种核酸的检测体系，所述检测体系包括30-50u的核酸外切酶iii、荧光探针和60-80μg/ml的单层二硫化钼纳米片。本发明中，发明人在研究核酸检测方法的过程中，综合现有技术的优缺点，发现在以荧光检测为原理的体系中，氧化石墨烯材料原料成本较高，淬灭荧光过程中生物相容性较差，因此，创造性的将二硫化钼纳米片应用到包含核酸外切酶iii的核酸检测体系中，针对特定核酸进行条件优化，证明在核酸外切酶iii和单层二硫化钼纳米片的特定浓度的搭配下，各步骤协同增效，最终建立了高效简洁的检测体系。二硫化钼淬灭荧光dna探针的机理是：通过范德华力吸附荧光dna，在特定波长的紫外光激发下，荧光基团的能量被二硫化钼吸收，从而导致荧光强度衰减，这个过程叫荧光共振能量转移。优选地，所述单层二硫化钼纳米片的直径为0.5-2μm，例如可以是0.5μm、0.7μm、0.9μm、1μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm或2μm。优选地，所述单层二硫化钼纳米片的厚度为0.5-2nm，例如可以是0.5nm、0.8nm、1nm、1.5nm或2nm。本发明中，发明人在实验过程中发现，二硫化钼纳米片的厚度和孔径会影响检测效率，厚度在0.5-2nm、直径为0.5-2μm时，能与完整的体系内酶浓度和时间等条件相互匹配，实现对微量核酸的检测。二硫化钼是一种新兴的二维层状纳米材料，由于其具有独特的物理化学性质，而受到科研工作者的广泛关注。二硫化钼能够通过核酸碱基和二硫化钼纳米片之间的范德华力作用吸附单链dna，而较难吸附双链dna；与常用材料氧化石墨烯go相比较，二硫化钼具有以下优点：制备简单，容易大规模合成，无需表面活性剂处理可以直接分散于水中，而且具有优异的生物相容性。优选地，所述检测体系还包括缓冲液。优选地，所述缓冲液包括tris-hcl缓冲溶液和/或1×ne缓冲液1，优选为tris-hcl缓冲溶液和1×ne缓冲液1。优选地，所述荧光探针的荧光基因包括fam、hex、tamra或rox中的任意一种，优选为fam。发明人经过实验论证，在本发明提供的核酸体系中，fam荧光标记的探针被二硫化钼淬灭的效率高于rox荧光标记的探针。优选地，所述荧光探针的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述seqidno.1所示的核酸序列如下：seqidno.1：agagattttccacactgact.第二方面，本发明一种检测核酸的方法，包括如下步骤：(1)提取样品dna，与荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1中进行反应；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入核酸外切酶iii，酶切反应后将酶灭活；(3)将单层二硫化钼纳米片加入步骤(2)加热后的溶液，进行淬灭反应后检测荧光信号强度。优选地，步骤(1)所述反应的温度为20-40℃，例如可以是22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、37℃或40℃，优选为25-30℃。优选地，步骤(1)所述反应的时间为5-15min，例如可以是5min、7min、10min、12min或15min。优选地，步骤(1)所述荧光探针的浓度为5-50nm，例如可以是5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm或50nm。优选地，步骤(2)所述核酸外切酶iii的酶活力单位为30-50u，例如可以是30u、33u、35u、36u、39u、41u、43u、45u、46u、49u或50u，优选为35-45u。优选地，步骤(2)所述酶切的反应时间为20-40min，例如可以是20min、23min、25min、27min、30min、32min、35min、37min或40min，优选为25-35min。优选地，步骤(3)所述单层二硫化钼纳米片的浓度为60-80μg/ml，例如可以是69μg/ml、63μg/ml、65μg/ml、67μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、77μg/ml或80μg/ml，优选为80μg/ml。优选地，所述单层二硫化钼纳米片的直径为0.5-2μm，例如可以是0.5μm、0.7μm、0.9μm、1μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm或2μm。优选地，所述单层二硫化钼纳米片的厚度为0.5-2nm，例如可以是0.5nm、0.8nm、1nm、1.5nm或2nm。优选地，步骤(3)所述反应的温度为20-35℃，例如可以是20℃、23℃、25℃、27℃、30℃、33℃或35℃。优选地，步骤(3)所述反应的时间为5-15min，例如可以是5min、7min、9min、11min、13min或15min。首先，单链荧光dna探针与靶标dna在缓冲溶液中互补杂交，当加入核酸外切酶iii时，该酶作用于双链dna，使3'凹陷末端的荧光dna探针沿3'→5'方向逐步切去单核苷酸，并释放出3'突出末端的靶标dna与另外的荧光dna探针杂交，形成循环的酶切过程，最后加入单层二硫化钼纳米片，进行荧光信号测试分析，原理图见图1所示。作为优选技术方案，一种检测核酸的方法，具体包括如下步骤；(1)提取样品dna，与5-50nm的核苷酸序列如seqidno.1所示的荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1中在20-40℃的温度下进行反应5-15min；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入30-50u的核酸外切酶iii，酶切反应20-40min后加热将酶灭活；(3)将浓度为60-80μg/ml、直径为0.5-2μm、厚度为0.5-2nm的单层二硫化钼纳米片加入步骤(2)加热后的溶液，20-35℃进行淬灭反应5-15min后检测荧光信号强度。第三方面，本发明提供一种荧光生物传感器，所述荧光生物传感器包含第一方面所述的检测体系。第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的检测体系和/或第三方面所述的荧光生物传感器用于检测核酸；优选地，所述核酸的核苷酸序列为seqidno.2，所述seqidno.2的核苷酸序列如下：seqidno.2:agtcagtgtggaaaatctctagc.联合国艾滋病规划署2006年的数据显示，全球估计共有4000万名hiv感染者。hiv感染的检测方法包括hivrna检测、抗体检测和hivdna检测。hivdna是最早的感染标志物，可早期快速并且准确的判断自身是否感染。更重要的是，hivdna检测在精准诊断、指导用药、疗效评估、停药标准、长期随访几个环节都具有重要的意义。人体被hiv感染后，会以rna病毒颗粒的形式进入免疫细胞，随后逆转录整合进免疫细胞的dna中。本发明的靶dna是从hiv基因组中挑选的一段特异性序列，能够用来辅助快速、早期地检测hiv感染。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的检测体系采用单层二硫化钼纳米片进行荧光淬灭，针对特定核酸序列进行优化，通过选择特定厚度和孔径的二硫化钼并调整反应酶切条件，使得二硫化钼发挥优越的荧光淬灭性能，在荧光染料标记的单链dna探针和单层二硫化钼纳米片的体系上，用核酸外切酶iii辅助循环放大检测靶标dna，最终建立的检测体系各步骤各条件协同增效，相互配合，灵敏度高，检出下限为10pm，特异性强，能区分单碱基突变，操作简便，成本较低。附图说明图1为本发明的基于核酸外切酶iii辅助循环放大的检测体系原理图；图2为本发明的聚丙烯酰氨凝胶电泳图，其中，胶孔1：20bpmarker；胶孔2：荧光探针；胶孔3：靶dna；胶孔4:荧光探针+靶dna；胶孔5:荧光探针+核酸外切酶iii；胶孔6:靶dna+核酸外切酶iii；胶孔7:荧光探针+靶dna+核酸外切酶iii；图3为本发明的不同浓度单层二硫化钼纳米片淬灭荧光dna探针，其中，图3(a)为不同浓度单层二硫化钼纳米片淬灭荧光dna探针光谱图；图3(b)为不同浓度单层二硫化钼纳米片淬灭荧光dna探针的效率图；图4为本发明的酸外切酶iii酶量和反应时间优化曲线图，其中图4(a)为外切酶iii酶量的优化曲线图，图4(b)为外切酶iii反应时间的优化曲线图；图5为本发明的单层二硫化钼纳米片的扫描电子显微镜图，其中图5(a)为放大倍数十万倍的扫描电子显微镜图，图5(b)为放大倍数四万倍的扫描电子显微镜图；图6为本发明实施例8的不同浓度靶dna的荧光光谱和荧光强度图，其中图6(a)为不同浓度靶dna的荧光光谱图，图6(b)位荧光强度与不同靶dna浓度之间的关系图；图7为本发明实施例9的结果图，其中图7(a)为fam探针的淬灭效率图，图7(b)为rox的淬灭效率图；图8为本发明的检测体系特异性结果图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1(1)将浓度为5nm的核苷酸序列如seqidno.2的靶dna与10nm的核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1(newenglandbiolabs，exonucleaseiii的缓冲液)中，在25℃的温度下反应10min，然后向反应后的溶液中加入40u的核酸外切酶iii，酶切反应30min后加热将酶灭活；(2)与步骤(1)相比，除不加靶dna外，其他条件与步骤(1)相同；(3)与步骤(1)相比，除不加荧光探针外，其他条件与步骤(1)相同；(4)与步骤(1)相比，除不加核酸外切酶iii外，其他条件与步骤(1)相同；将步骤(1)、(2)、(3)和(4)得到的反应后溶液以及单独的靶dna、荧光探针分别上样进行聚丙烯凝胶电泳，电泳的步骤如下：a)配制5ml凝胶溶液：内含2.5ml凝胶贮存液(20％)、50μl过硫酸铵溶液(10％)和5μltemed，缓冲溶液使用1×tbe缓冲液；b)将配制好的凝胶溶液注入玻璃板间隙，确保无气泡且未漏液，室温凝固30min；c)将marker和制备好的样品注入不同的加样孔，组装好电泳装置，放入冰水中120v电泳15min；d)将电泳结束的凝胶放入配好的染料溶液中，室温振荡15min；聚丙烯酰氨凝胶电泳图如图2所示；从图2可知，核酸外切酶iii在荧光探针和靶dna同时存在的情况下，切去荧光探针而保留靶dna(胶孔7)；在荧光探针或靶dna单独存在的情况下，核酸外切酶iii不起作用(胶孔5或6)。实施例2首先，对单层二硫化钼纳米片的浓度进行优化；首先，将10nm的核苷酸序列如seqidno.1的荧光dna探针溶于tris-hcl缓冲溶液，随后采用荧光光谱仪记录其在490nm的激发波长下的505-650nm荧光光谱；向上述溶液中加入等份(10μg/ml)的单层二硫化钼纳米片九次，每加一次记录一次被测样品的荧光光谱，结果如图3(a)和图3(b)所示；由图3(a)和图3(b)可知，随着单层二硫化钼纳米片浓度的不断增加，10nm的探针的荧光逐渐被淬灭，当单层二硫化钼纳米片浓度高于80μg/ml时，荧光信号几乎不再减弱，淬灭效率达到了峰值。实施例3其次，对核酸外切酶iii酶量和反应时间进行优化；首先，设置九个实验大组，反应体系中含有0u、10u、20u、30u、40u、50u、60u、70u和80u的酶量，每个实验大组又包括两个小组，分别为实验组和对照组，实验组和对照组都含有三个反应管，对照组中不含有核苷酸序列如seqidno.2的靶nda，而实验组中含有核苷酸序列如seqidno.2的靶dna，其他条件保持不变，信噪比的数据＝反应组÷对照组；其次，设置六个实验大组，酶加入体系中的反应时间分别为0min、10min、20min、30min、40min和50min，每个实验大组包含两个小组，实验组和对照组，实验组和对照组都含有三个反应管，对照组中不含有核苷酸序列如seqidno.2的靶nda，而实验组中含有核苷酸序列如seqidno.2的靶dna，其他条件保持不变，信噪比的数据＝反应组÷对照组，结果如图4(a)和图4(b)所示；由图4(a)可知，实验体系中40u的核酸外切酶iii时，信噪比最大；由图4(b)可知，核酸外切酶iii反应30min，信噪比最大。实施例4(1)将浓度为5nm的核苷酸序列如seqidno.2的靶dna与10nm核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1中，在25℃的温度下反应10min；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入40u的核酸外切酶iii，酶切反应30min后加热将酶灭活；(3)将80μg/ml、直径为1μm、厚度为1nm的单层二硫化钼纳米片加入步骤(2)加热后的溶液，25℃进行淬灭反应10min后检测荧光信号强度，二硫化钼的扫描电子显微镜图如图5(a)和图5(b)所示；由图5(a)可以看出单层二硫化钼的结构像褶皱的纸，且厚度较薄；由图5(b)可以看出单层二硫化钼直径分布比较均匀，且互相折叠。实施例5(1)将浓度为5nm的核苷酸序列如seqidno.2的靶dna与5nm核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1中在20℃的温度下反应5min；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入30u的核酸外切酶iii，酶切反应20min后加热将酶灭活；(3)将60μg/ml、直径为0.5μm、厚度为1.5nm的单层二硫化钼纳米片加入步骤(2)加热后的溶液，20℃进行淬灭反应5min后检测荧光信号强度。实施例6(1)将浓度为5nm的核苷酸序列如seqidno.2的靶dna与50nm核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1中，在40℃的温度下反应15min；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入50u的核酸外切酶iii，酶切反应40min后加热将酶灭活；(3)将80μg/ml、直径为2μm、厚度为0.8nm的单层二硫化钼纳米片加入步骤(2)加热后的溶液，35℃进行淬灭反应15min后检测荧光信号强度。实施例7(1)将浓度为5nm的核苷酸序列如seqidno.2的靶dna与30nm核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针混合溶于1×ne缓冲液1中，在25℃的温度下进行反应12min；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入35u的核酸外切酶iii，酶切反应20min后加热将酶灭活；(3)将70μg/ml、直径为1.5μm、厚度为0.5nm的单层二硫化钼纳米片加入步骤(2)加热后的溶液，25℃进行淬灭反应12min后检测荧光信号强度。对比例1与实施例4相比，除步骤(2)中的核酸外切酶iii的酶活力单位改为20u外，其他条件与实施例4相同。对比例2与实施例4相比，除步骤(2)中的核酸外切酶iii的酶活力单位改为60u外，其他条件与实施例4相同。对比例3与实施例4相比，除了步骤(2)的反应时间改为15min外，其他条件与实施例4相同。对比例4与实施例4相比，除了步骤(2)的反应时间改为35min外，其他条件与实施例4相同。对比例5与实施例4相比，除了二硫化钼纳米片的浓度改为50μg/ml外，其他条件与实施例4相同。对比例6与实施例4相比，除了二硫化钼纳米片的浓度改为90μg/ml外，其他条件与实施例4相同。对比例7与实施例4相比，除了二硫化钼纳米片的直径改为0.3μm，厚度改为4nm外，其他条件与实施例4相同。对比例8与实施例4相比，除了二硫化钼纳米片的直径改为2.5μm，厚度改为0.3nm外，其他条件与实施例4相同。对比例9与实施例4相比，除了将靶dna更换为与核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针单碱基错配的ms1外，其他条件与实施例4相同；ms1的核苷酸序列如seqidno.3所示：seqidno.3为agtcagtgtggacaatctctagc.对比例10与实施例4相比，除了将靶dna更换为与核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针三碱基错配的ms3外，其他条件与实施例4相同；ms3的核苷酸序列如seqidno.4所示：seqidno.4为agtgagtctggacaatctctagc.对比例11与实施例4相比，除了将靶dna更换为与核苷酸序列如seqidno.1的荧光探针完全非互补的r外，其他条件与实施例4相同；r的核苷酸序列如seqinno.5所示：seqinno.5为aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa.实施例8将10nm的核苷酸序列如seqidno.1的荧光dna探针与不同浓度的核苷酸序列如seqidno.2的靶dna探针混合(浓度包括0pm、10pm、50pm、100pm、250pm、500pm、1000pm、2500pm、5000pm和10000pm)，每个浓度有三个反应管即重复三次，室温反应10min，加入40u的核酸外切酶iii，37℃反应30min，75℃失活10min，最后测荧光强度，结果如图6(a)和图6(b)所示；由图6(a)和图6(b)可知，当没有靶dna(即tdna)存在时，只有微弱的荧光信号；当加入靶dna，荧光信号明显增大，且随着靶dna浓度的增加而增加，靶dna的检出限为10pm。实施例9按照实施例4建立的体系条件，比较fam探针和rox探针被二硫化钼淬灭的效率，结果如图7(a)和图7(b)所示；由图7(a)和图7(b)可知，fam探针效率更高，达到98.4％。实验检测1、淬灭效率检测检测实施例4-7与对比例1-8中的二硫化钼的淬灭效率，结果如表1所示；表1样品效率％样品效率％实施例498.4对比例366实施例597对比例467实施例698对比例559实施例797对比例661对比例168对比例756对比例265对比例863由表1可知，实施例4-7的检测体系采用本发明提供的方案，淬灭效率在97％以上，其中，实施例4的效率最高，达到98.4％，而对比例1-8的检测体系中，酶用量、反应温度、时间、二硫化钼的孔径厚度及浓度的条件超过本发明提供的范围后，反应的淬灭效率大幅降低，说明本发明的检测体系中，各步骤各条件各浓度相互匹配，相互协同增效，牵一发而动全身，共同发挥酶活剪切及二硫化钼的淬灭功能，最终实现高效淬灭的目的。2、灵敏度检测稀释不同的靶dna浓度，分别在实施例4-7和对比例1-8建立的体系中进行检测，以得出不同体系的最低检出下限，结果如表2所示；表2样品浓度pm样品浓度pm实施例410对比例340实施例510对比例440实施例610对比例540实施例710对比例660对比例130对比例750对比例250对比例840由表2可知，实施例4-7的检测体系采用本发明提供的技术方案，检测核酸的灵敏度较高，靶dna的检出限为10pm，而对比例1-8的检测体系中，酶用量、反应温度、时间、二硫化钼的孔径厚度及浓度的条件超过本发明提供的范围后，检出下限明显升高，灵敏度降低，因此，说明本发明的检测体系中，各步骤各条件各浓度相互匹配，相互协同增效，牵一发而动全身，共同发挥酶活剪切及二硫化钼的淬灭功能，最终实现灵敏检测核酸的目的。3、特异性检测将实施例8与对比例9、10、11的荧光信号强度进行比较，结果如图8所示；由图8可知，实施例4的靶dna(即tdna)的荧光信号最强，ms1的荧光信号略高于靶dna荧光信号的三分之一，ms3和r的荧光信号不足靶dna荧光信号的五分之一，证明本发明提供的检测体系具有高度的序列特异性。综上所述，本发明提供一种核酸的检测体系及其检测方法和应用，通过将单层二硫化钼纳米片应用到核酸外切酶iii的荧光检测体系中，针对特定的核苷酸序列，优化反应条件和流程，最大程度发挥核酸外切酶iii的循环放大功能和二硫化钼纳米片的淬灭功能，各步骤协同增效，相互配合，牵一发而动全身，提升了检测体系的灵敏度和特异性，操作简便，简洁高效，具有广阔的应用前景。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表<110>上海市计量测试技术研究院<120>一种核酸的检测体系及其检测方法和应用<130>2018<141>2018-03-09<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成()<400>1agagattttccacactgact20<210>2<211>23<212>dna<213>人工合成()<400>2agtcagtgtggaaaatctctagc23<210>3<211>23<212>dna<213>人工合成()<400>3agtcagtgtggacaatctctagc23<210>4<211>23<212>dna<213>人工合成()<400>4agtgagtctggacaatctctagc23<210>5<211>23<212>dna<213>人工合成()<400>5aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa23当前第1页12