本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体地，本发明涉及一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤组织由肿瘤细胞及间质构成，肿瘤细胞是由正常细胞转化来的异常增生细胞。肿瘤可发生在人体的许多器官和组织。根据肿瘤对人体危害的大小及其生长特性而分为良性肿瘤和恶性肿瘤两类。
良性肿瘤生长缓慢，呈膨胀性生长，表面常有完整包膜，除局部症状外较少全身症状，不向周围组织浸润也不向全身转移，手术切除后不易复发，对机体危害较小，如脂肪瘤、血管瘤、腺瘤、囊肿等。
恶性肿瘤生长迅速，生长时常向周围组织浸润，表面几无包膜，常有全身转移，病理检查可见不典型核分裂，除局部症状外，全身症状明显，晚期病人多出现恶病质，手术切除后复发率高，对机体危害大，如骨癌、食管癌、肝癌、肺癌、白血病、骨肉瘤、脑胶质瘤等等。
恶性肿瘤是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，在致癌因素影响下有分裂潜能的细胞，发生恶性转化和克隆增生所形成的新生物。肿瘤的发生往往是机体遗传和环境致癌因素以先后或协同的方式，引起遗传物质dna的损伤、突变，同时伴随有多个癌基因激活和肿瘤抑制基因的失活，使正常细胞不断增生，转化最终癌变。
脑胶质瘤是神经外科中最常见的神经肿瘤，由于肿瘤的恶性增殖能力和侵袭性强而导致目前所有治疗手段(比如手术、放化疗、基因治疗、免疫治疗或其组合的综合措施)均不能根治脑胶质瘤和降低该疾病的高复发率，因此成为神经外科临床治疗的难题和热点研究课题。脑胶质瘤的生物特性取决于内在的基因改变，寻找可靠的肿瘤标记性基因和对脑胶质瘤增殖性、侵袭性、分化等特性做出判断，是脑胶质瘤诊断、预后评定及确定有效治疗措施的重要前提。
鉴于肿瘤对人们身体健康具有严重的影响，本领域技术人员致力于开发新的更加有效的肿瘤治疗技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用。
本发明的第一方面，提供了一种用于治疗肿瘤的外泌体，其中，所述外泌体的外泌体膜上含有cd47分子。
在另一优选例中，所述外泌体包裹有sirna分子或其前体。
在另一优选例中，所述sirna分子为肿瘤特异性的sirna分子或其前体。
在另一优选例中，所述sirna分子靶向bptf基因。
在另一优选例中，所述sirna分子靶向bptf基因中如seqidno.:3所示的序列。
在另一优选例中，所述的肿瘤为脑胶质瘤。
本发明的第二方面，提供了一种制备外泌体的方法，所述方法包括步骤：
(1)构建慢病毒表达载体
其中，所述慢病毒表达载体包含编码cd47的多核苷酸序列；
(2)慢病毒包装
将步骤(1)构建的所述慢病毒表达载体包装为病毒颗粒；
(3)构建细胞株
实用步骤(2)中获得病毒颗粒感染宿主细胞，从而构建稳定表达cd47的细胞株；
(4)制备外泌体
培养步骤(3)中构建的细胞株，收取细胞上清液提取外泌体，从而获得所述外泌体。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(5)制备外泌体-sirna复合物。
在另一优选例中，所述sirna分子为肿瘤特异性的sirna分子。
在另一优选例中，所述sirna分子靶向bptf基因。
在另一优选例中，所述sirna分子靶向bptf基因中如seqidno.:3所示的序列。
在另一优选例中，所述的肿瘤为脑胶质瘤。
在另一优选例中，所述步骤(5)中，采用电转导的方式，将所述sirna分子包裹入所述外泌体，从而制得所述外泌体-sirna复合物。
在另一优选例中，所述步骤(5)中，电转导过程中外泌体颗粒和sirna用量比为108～1010个外泌体颗粒：0.1～10ugsirna；优选地为108～1010个外泌体颗粒：1ugsirna；最优选地为109个外泌体颗粒：1ugsirna。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述表达载体以fugw病毒载体为骨架。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，慢病毒包装过程中使用的辅助质粒为pcmv-dr8.2dvpr载体和pcmv-vsv-g载体。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，包装细胞为293t细胞。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，宿主细胞为hek293细胞。
在另一优选例中，本发明第一方面所述的用于治疗肿瘤的外泌体通过本发明第二方面所述的方法制备而得。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为本发明第一方面所述的外泌体。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于预防或治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为脑胶质瘤。
本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的外泌体的用途，用于预防或治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为脑胶质瘤。
在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的用于治疗肿瘤的外泌体存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制抑制肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤为脑胶质瘤；优选地，所述肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞系(如u-87细胞系和u-251细胞系)。
在另一优选例中，所述的抑制肿瘤细胞为抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿瘤细胞成瘤。
在另一优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中bptf基因编码蛋白的活性降低10％以上，较佳地降低20％以上，更佳地降低30％以上，更佳地降低40％以上，更佳地降低50％以上，更佳地降低60％以上，更佳地降低70％以上，更佳地降低80％以上，更佳地降低90％以上，最佳地完全没有bptf基因编码蛋白的活性。
在另一优选例中，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中bptf基因的表达降低10％以上，较佳地降低20％以上，更佳地降低30％以上，更佳地降低40％以上，更佳地降低50％以上，更佳地降低60％以上，更佳地降低70％以上，更佳地降低80％以上，更佳地降低90％以上，最佳地完全没有bptf基因的表达。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1a显示了针对atm基因不同靶位的sirna的敲减效率。
图1b显示了针对bptf基因不同靶位的sirna的敲减效率。
图1c显示了分别敲除btpf和atm基因的细胞的增殖水平。
图2a显示了免疫荧光鉴定cd47-hek293细胞。
图2b显示了电镜检测的cd47-sirna-exosome。
图3显示了cd47-sirna-exosome的粒径检测结果。
图4为westernblot检测cd47-sirna-exosome标志性蛋白。
图5为外泌体与胶质瘤细胞共孵育荧光显微镜检测结果。
图6为外泌体与胶质瘤细胞共孵育mtt检测结果。
图7显示了外泌体与胶质瘤细胞共孵育克隆形成检测的结果。
图8显示了外泌体与胶质瘤细胞共孵育侵袭能力检测结果。
图9显示了外泌体注射成瘤裸鼠实验结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现bptf基因抑制剂能够显著抑制脑胶质瘤细胞株的生长、和成瘤能力。因此bptf基因在脑胶质瘤中起到非常重要的作用，是一个新型的脑胶质瘤治疗靶点。在此基础上完成了本发明。
术语
外泌体
外泌体(exosome)是一种广泛存在并分布于各种体液中可由多种细胞分泌的膜性小囊泡，具有脂质双层膜结构，直径一般介于30～120nm之间，包含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，其能够携带和传递重要的信号分子，形成一种全新的细胞间信息传递系统从而改变其他细胞的功能外，并且在很多生理病理上起着重要的作用。
bptf基因及其编码蛋白
bptf基因(ncbi序列号geneid:2186)位于17q24染色体上，是染色体重塑复合体nurf中分子量最大的亚基，可以招募nurf复合体其它亚基到基因的启动子或增强子区，通过调控核小体滑动，促进基因转录。现有的研究发现，bptf在斑马鱼神经后部化过程中发挥着非常重要的作用。bptf在功能上和结构上与smad2相互作用。bptf与smad2协同调节所结合的wnt8a启动子区的核小体滑动来调控靶基因表达，从而在神经系统发育发挥作用。
本发明对脑转移瘤相关的非小细胞肺癌样本进行了基因芯片检测，经过大规模筛选，意外发现bptf在脑转移瘤中异常表达，说明该基因与脑转移瘤的发病率有关；通过rnai技术沉默肺胚胎纤维细胞中的bptf基因后，细胞的克隆形成能力被显著抑制；在肝癌样本中发现bptf的基因存在突变；在膀胱癌中也发现bptf存在突变型，针对3株膀胱癌细胞系敲除bptf后可以显著性的降低细胞的克隆形成能力。
在本发明优选地实施方式中，所述bptf基因的序列如seqidno.:1所示。
在本发明优选地实施方式中，所述bptf基因编码蛋白的序列如seqidno.:2所示。
本发明的bptf基因编码蛋白可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。
如本文所用，术语“rnai”(rnainterference,rna干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(dsrna)诱发的、高效特异性降解具有互补配对序列的rna的现象。由于使用rnai技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及肿瘤的基因治疗等领域。dsrna介导的rnai现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing，ptgs)、共抑制(cosuppression)及rna介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于rnai在不同物种的表现形式。
如本文所用，术语“sirna”(smallinterferingrna,sirna)是指一种小rna分子(约21-25个核苷酸)，可由dicer(rna酶ⅲ家族中对双链rna具有特异性的酶)从其前体(比如dsrna、shrna等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。sirna是sirisc的主要成员，激发与之序列互补的目标rna被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为rnai中的关键功能分子。在给出特定的基因靶位序列的情况下，本领域技术人员可以通过常规的方法设计并获得针对该靶位序列的sirna。
如本文所用，术语“sirna前体”是指可以在哺乳动物细胞中被加工产生sirna的rna分子，具体地说，是由dicer或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的sirna，进而实施rnai。
如本文所用，术语“构建物”是包含本发明shrna的构建物。
如本文所用，术语“表达盒”是指包含本发明shrna的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的shrna。
如本文所用，术语“mirna”(microrna)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链rna分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种mirna分子。大多数mirna基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种mirna可以调控多个靶基因，而几种mirna也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，mirna调节着人类一半以上基因的表达。mirna存在多种形式，最原始的是pri-mirna；pri-mirna经过drosha加工后，成为pre-mirna，即mirna前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-mirna再经过dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟mirna。mirna主要通过抑制翻译和加速mrna的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于sirna介导的mrna降解。
在活体中产生“小干扰rna”(sirna)的一种办法是，将sirna序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链rna”(shrna)，被细胞内的dicer蛋白所识别和加工，产生有功能的sirna。
如本文所用，术语“shrna”、“shrna”可互换使用，是以人mir-26b的前体作为骨架构建的一种特殊的shrna。所述shrna从5′端到3′端依次为：(a)5′端旁侧序列区；(b)5′端配对sirna区域；(c)顶端环区域；(d)3′端配对sirna区域，并且所述5′端配对sirna区域与3′端配对sirna区域形成双链区域；(e)3′端旁侧序列区；所述shrna产生sirna，且所述sirna的核苷酸序列对应于所述3′端配对sirna区域或5′端配对sirna区域。
广义的shrna是shorthairpinrna的缩写，即，“短发夹rna”。shrna包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，通常由细胞内源的rna聚合酶iii(rnapolymeraseiii)启动子控制转录，shrna序列的末端连接5-6个t作为rna聚合酶ⅲ的转录终止子。shrna也可以由其它rna聚合酶的启动子转录产生。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：本发明第一方面所述的外泌体。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
应用
本发明提供了一种体外非治疗性的抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的外泌体存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞，所述的肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞。
在本发明的一个优选例中，所述的抑制肿瘤细胞为抑制肿瘤细胞的生长或抑制肿成瘤。
优选地，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中bptf基因编码蛋白的活性降低10％以上，较佳地降低20％以上，更佳地降低30％以上，更佳地降低40％以上，更佳地降低50％以上，更佳地降低60％以上，更佳地降低70％以上，更佳地降低80％以上，更佳地降低90％以上，最佳地完全没有bptf基因编码蛋白的活性。
或优选地，与对照肿瘤细胞相比，所述肿瘤细胞中bptf基因的表达水平降低10％以上，较佳地降低20％以上，更佳地降低30％以上，更佳地降低40％以上，更佳地降低50％以上，更佳地降低60％以上，更佳地降低70％以上，更佳地降低80％以上，更佳地降低90％以上，最佳地完全没有bptf基因的表达。
本发明的主要优点在于：
(1)首次提供了一种能够显著抑制脑胶质瘤细胞株的生长、和成瘤能力的外泌体及其制备方法。
(2)提供了一种高效制备外泌体的方法。
(3)本发明的外泌体能够显著抑制脑胶质瘤细胞株的生长、和成瘤能力，因此，可以用于脑胶质瘤的治疗。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。
实施例1基因芯片筛选检测
脑胶质瘤和对照组织总rna样品通过agilent2100分析后，采用genechip3’ivtexpresskit制备arna(amplifiedrna)。即通过一链合成得到cdna，进一步经过二链合成得到双链dna模板，然后通过体外反转获得带生物素标记的arna(amplifiedrna)。将arna进行纯化，然后将其片段化后与芯片探针杂交。杂交完成后，对芯片进行洗染，最后扫描得到图片和原始数据，原始数据在进行深度分析，获得最终报告，具体结果见表1。
表1
通过芯片检测病理组样本和正常组样本中的基因表达差异，挑选处理表达差异显著的基因信息，例如肿瘤密切相关的atm在本次检测中也同样是高表达的，此外，我们还发现bptf在胶质瘤样品中的表达与atm的表达情况相似，也是异常的高表达，是一个潜在的靶标基因。
针对atm基因(基因编号：nm_000051)和bptf基因，本发明人分别设计了多个sirna进行验证。
典型的针对atm基因的sirna的靶位信息如下：
atmsirna1#：gcgattggcttatacgcgc(seqidno.:5)
atmsirna2#：gcgcctgattcgagatcct(seqidno.:6)
atmsirna3#：ttacagtaattggagcatt(seqidno.:7)
通过化学合成针对不同靶位的sirna，然后转染至u-87胶质瘤细胞系中，通过qpcr检测目的基因atm的表达丰度，从而筛选出最有效的靶位。
筛选结果如图1a所示，结果表明，特异性靶向atm基因中靶位2(atmsirna2#，kd2)序列的sirna最有效，敲减效率可以达到60％左右。
典型的针对bptf基因的sirna的靶位信息如下：
bptfsirna1#：caggagagttctcaagtagat(seqidno.:3)
bptfsirna2#：cagcacagagaagaccatgat(seqidno.:8)
bptfsirna3#：gagactgagaatgactctaaa(seqidno.:9)
通过化学合成针对靶基因的不同sirna，然后转染至u-87胶质瘤细胞系中，通过qpcr检测目的基因btpf的表达丰度，从而筛选出最有效的靶点。
筛选结果如图1b所示，结果表明，特异性靶向btpf基因中靶位1(bptfsirna1#，kd1)序列的sirna最有效，敲减效率可以达到80％左右。
进一步地，本申请人使用优选地sirna分别敲除btpf和atm基因，比较了两个基因敲除后对u87胶质瘤细胞的增殖水平。具体的，先通过针对不同基因的sirna转入胶质瘤细胞系，再通过mtt实验检测不同sirna靶点对细胞的增殖水平的影响作用。
实验结果如图1c所示，通过mtt实验的比较分析，从实验结果中可以看出，针对bptf敲除后，细胞的增殖水平明显下降，同时也显著优于atm基因敲减的效果。
实施例2cd47慢病毒载体的构建：
(1)以通过cd47cdna克隆为模板，通过扩增引物进行pcr反应，扩增获得大小～1kb左右的pcr产物。
(2)对pcr产物和fugw病毒载体(购自addgene公司)进行bamhi和agei的双酶切。
(3)过t4dna连接酶(购自takara公司)连接后进行转化反应。
(4)通过对转化子的鉴定，挑选阳性克隆送测，以测序序列和预期序列一致的作为正确克隆。
cd47cdna基因序列如seqidno.:4所示。
实施例3cd47慢病毒载体的包装：
(1)制备慢病毒包装系统中3种质粒的dna溶液(cd47慢病毒载体20μg，pcmv-dr8.2dvpr载体(购自addgene公司)15μg，pcmv-vsv-g载体(购自addgene公司)10μg，与相应体积的opti-mem混合均匀稀释，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。
(2)取100μllipofectamine2000(购自invitrogen)试剂在另一管中与2.4mlopti-mem(购自invitrogen)混合稀释，在室温下温育5分钟。
(3)把(1)中所述稀释后的dna与(2)中所述稀释后的lipofectamine2000进行混合，5分钟内轻轻地颠倒混匀。室温下温育20min。
(4)将dna与lipofectamine2000混合液转移至293t细胞(购自atcc)的培养液中，混匀，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的pbs液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
(5)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％co2培养箱内继续培养48小时。
(6)收集转染48小时后的293t细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。把病毒粗提液样品加入到过滤杯中并盖上盖子，将过滤杯插到滤过液收集管中。组合好后，做好平衡，放在转头上。在4000g离心约10-15分钟。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
(7)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。命名为lv-cd47。
实施例4稳定株构建
稳定细胞株构建，实验步骤如下：
(1)在感染前12-18小时，把hek293细胞(购自atcc)接种于6孔板中，细胞感染时融合率约为30％-50％。
(2)从-80℃冰箱取出病毒，放于冰上融化。
(3)按照moi值100，加入cd47-gfp-lv慢病毒量。
(4)混合均匀后放回37℃、5％co2培养箱培养72h。
(5)感染72小时后筛选单克隆化细胞株。
(6)通过gfp筛选完成后冻存细胞株，命名为cd47-hek293稳定细胞株。
(7)通过免疫荧光法检测cd47的表达。
图2a显示了免疫荧光鉴定cd47-hek293细胞的鉴定结果，结果表明本实施例构建的细胞株可以稳定表达目的蛋白。
实施例5外泌体制备和提取
更换无血清培养基，持续培养cd47-hek293稳定细胞株2天以上，收取细胞上清液进行外泌体提取，实验步骤如下：(参考上海宇玫博生物科技有限公司，外泌体提取试剂盒说明书方法操作)
(1)去除细胞：稳定细胞株培养上清液4℃/300g离心10分钟，取上清；
(2)去除死细胞：去除细胞的上清液4℃/2000g离心10分钟，取上清；
(3)去除细胞碎片：去除死细胞的上清液4℃/10000g离心30分钟，取上清；
(4)上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入exosomoeconcentrationsolution(ecs试剂)，每20ml上清液中加入5ml的ecs试剂；
(5)沉淀外泌体：重悬液4℃/100000g离心70分钟，沉淀即为外泌体，用适量pbs重悬，分装保存于-80℃冰箱。
(6)溶液混合：加入ecs试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1min，再放置于2℃至8℃静置2h；
(7)沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000g离心60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；(注：尽可能吸净上清液)
(8)外泌体重悬：取100μl1×pbs均匀吹打离心沉淀物，待其均匀悬浮在pbs中后，将重悬液转移至新的1.5ml离心管中；
(9)收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5ml离心管于4℃以12000g离心2min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。
(10)纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入exosomoepuraficationfilter(epf柱)上室中，于4℃以3000g离心10min，离心后收集epf柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；
(11)外泌体的保存：纯化后的外泌体以保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。
实施例6外泌体鉴定
(1)透射电镜检测
将筛选过的外泌体样品按如下处理：
固定：2.5％戊二醛固定，2小时；用0.1m磷酸漂洗液漂洗，三次；
1％锇酸固定液固定，2小时；用0.1m磷酸漂洗液漂洗，三次；
脱水：50％乙醇，20分钟；70％乙醇，20分钟；90％乙醇，20分钟；90％乙醇：90％丙酮(1：1)，20分钟；90％丙酮，20分钟；以上在4度冰箱内进行，100％丙酮室温，20分钟；
包埋：纯丙酮+包埋液(2：1)，室温3小时；纯丙酮+包埋液(1：2)，室温过夜；纯包埋液，37℃2小时；
固化：37度烘箱内，过夜；45度烘箱内，12小时；60度烘箱内，24小时；
切片(超薄切片机切片50-60nm)：装上样品，选择刀口，使刀口与样品要平行；检查各夹具锁紧装置，打开锁定开关，通过粗细微调的调节，用手动使样品与刀面接触；加蒸馏水通过水的折光，掌握水面与刀面要平行；转换自动切片操作，拨拢水面上的切片，用氯仿熏；然后用铜网捞起切片；
染色：3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色。
检测：透射电镜观察照相，拍片。
(2)纳米激光粒度仪检测
将筛选过的外泌体样品按如下处理：(以美国zetaview粒径仪为例)
打开计算机和仪器电源，预热仪器10分钟，然后启动操作软件，设定粒径模式和参数，将筛选过的外泌体样品放入样品池，放置于仪器的嵌入式样品检测装置，合上滑盖，设置检测时间与次数，然后开始检测样品，观察面板前数值，数值在300hz左右为佳；过低或过高需停止检测，对样品进行适当稀释后，再进行测定。检测完毕后，保存资料。
(3)westernblot检测
将筛选过的外泌体样品按如下处理：
抽提蛋白：向筛选过的外泌体中加入裂解液，4℃裂解15分钟，然后4℃/12000g离心5分钟，放入100℃水浴20分钟，然后继续4℃下12000g离心2分钟，-20℃保存备用。
配置sds-page：把玻璃板冲洗干净，晾干。把晾干后的玻璃板按要求放入制具，根据蛋白的大小配制sds-page胶，先配分离胶，玻璃板中加入7ml分离胶，再加2ml无水乙醇，30min后等分离胶充分凝固后再配浓缩胶，弃去玻璃板中的无水乙醇，用滤纸把残留的无水乙醇吸干，加入2ml浓缩胶，然后插入梳齿。
上样电泳：等胶凝固后，将其放入电泳槽中，加足够的电泳液后开始准备上样。用双手抓住梳子的两端轻轻用力向上拔去梳子，用1ml的移液器吸入电泳缓冲液轻轻吹洗上样孔，将准备好的样品上样，每个样品取相同总蛋白量，用20ul的移液器垂直于上样孔把样品缓慢加入上样孔内。在电泳槽下部加入适量的电泳液
电泳：恒流30ma2小时
免疫印迹：电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400ma恒流条件下电转120分钟，将蛋白转移到pvdf膜上：在医用托盘中倒入500-800ml的电转移缓冲液，把玻璃板从电泳装置中取出来，用胶铲在玻璃板的上端轻轻地把两块玻璃板撬开，把胶的最底端用胶铲轻轻切除，然后用胶铲把胶轻轻托起来放在滤纸上，放置顺序从负极到正极依次放置：滤纸—胶—pvdf膜—滤纸，把治具放入转移电泳装置中，加入1l的电转移缓冲液进行转膜。
免疫显色：
封闭：在培养皿中倒入40-50ml的封闭液把已经转好的pvdf膜正面向上放入培养皿中，以防止蛋白脱落，pvdf膜要完全浸没在封闭液中，室温封闭1小时。
一抗孵育：用pe手套把已封闭好的pvdf膜包起来，加入封闭液稀释的抗体，放在混合器上4度孵育12h。
洗膜：把pvdf膜从pe手套中取出来，放入培养皿中，加入40-50mltbst溶液，放在脱色摇床上轻摇，洗膜3次，每次10分钟。
二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育pvdf膜2小时。
显色：采用amersham公司ecl+plustmwesternblottingsystem试剂盒进行显色x光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片。
加ecl、曝光、显影、定影的具体步骤如下：
将pvdf膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：40的比例混合a液和b液，配成总体积为1ml，将混合液均匀滴加在pvdf膜上，避光反应5分钟。
将膜取出，沥掉多余的ecl底物反应液，不要让pvdf干掉，保持pvdf没有明显的反应液滴，就可以放入暗盒，铺上保鲜膜，关上暗盒，根据ecl的发光程度，选择曝光时间的长短在保鲜膜上做出相应的标记。取出x光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中2分钟。
戴手套用镊子把x光片从定影液中取出放入65度烘箱烘干，分析。把晾干后的x光片，放入暗盒里，根据之前所做标记用记号笔把蛋白预染marker位置和样品名称标注在x光片上，然后对结果进行分析。
图2b显示了电镜检测的cd47-sirna-exosome(外泌体)。
图3显示了cd47-sirna-exosome的粒径检测结果。
图4显示了westernblot检测cd47-sirna-exosome标志性蛋白的检测结果。
实施例7外泌体-sirna复合物制备
1.将适量sirna加到1.5ml离心管中，再加入外泌体悬液，轻轻混匀。所用比例如下，109外泌体颗粒：1ugsirna：400ul电转缓冲液)。
2.将装有3ml电解缓冲液e的neontm管插入移液器架中。
3.在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。
4.将枪头插入neontm移液器中，用10μl的枪头吸外泌体混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的neontm移液器垂直插入neontm管中。
5.选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的start(开始)键。
6.电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。
7.将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。
8.实验结束后，倒掉移液器中e液，关闭电转仪。
经过实验验证，优选地btfpsirna序列如下:
caggagagttctcaagtagat(seqidno.:3)。
实施例8外泌体-细胞共孵育实验
培养生长状态良好的目的细胞(u-87-gfp稳定株和u-251-gfp稳定株，购自中科院细胞库)，前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，共孵育当天按实验设计的组别加入外泌体颗粒进行目的细胞的共孵育实验。孵育后荧光显微镜下观察gfp表达情况。
(1)细胞增殖检测
u-87-gfp稳定株和u-251-gfp稳定株是带有绿色荧光，通过cellomics仪器可以读取带荧光的细胞并拍照，然后通过软件分析处理计算出孔板中不同组别含有的细胞数目。连续检测3-5天后，绘制出细胞生长曲线图，从而呈现出细胞生长状况。
a)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；
b)用血球计数板对细胞计数；
c)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(多数为2000cell/well)。每组3-5复孔，每孔100μl，铺板过程中要确保每孔加入细胞数目的一致；
d)铺好板后，置37℃5％co2培养箱培养；
e)从铺板后第二天开始，每天cellomics检测读板一次，连续检测读板3-5天；
f)通过调整cellomicsarrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；
g)对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
图5显示了外泌体与胶质瘤细胞共孵育荧光显微镜检测结果。
图6显示了外泌体与胶质瘤细胞共孵育mtt检测结果。检测结果表明，采用特异性靶向bptf基因的rnai，可以显著抑制肿瘤细胞的增殖。
(2)细胞克隆形成检测
通过感染后细胞在细胞培养板上的克隆形成能力来提示慢病毒感染后细胞的成瘤能力。
a)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液；
b)血球计数板对细胞悬液进行细胞计数；
c)细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种800个细胞/孔，每个实验组设3个复孔；
d)将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3day进行换液并观察细胞状态；
e)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；
f)实验终止时pbs洗涤细胞1次；
g)每孔加入1ml多聚甲醛，固定细胞30～60min；
h)pbs洗涤细胞1次；
i)每孔加入洁净、无杂质giemsa染液500μl，染细胞20min；
j)ddh2o洗细胞数次，直至洗净板上背景，晾干；
k)显微镜下拍照单克隆；
l)数码相机拍照整张板；
m)克隆计数。
图7显示了外泌体与胶质瘤细胞共孵育克隆形成检测的结果。检测结果表明携带有sirna的外泌体与细胞共孵育后，被细胞进行内吞后，可以有效的抑制细胞的增殖。
(3)细胞侵袭能力检测
从细胞外基质入侵是肿瘤转移的一个重要步骤,肿瘤细胞通过黏附到血管壁并沿着血管壁伸展而开始入侵,蛋白水解酶如mmp胶原酶溶解血管基底膜而允许癌细胞入侵。bdbiocoattmmatrigeltminvasionchambe为检测肿瘤细胞穿过基底膜模型提供一个有效的系统。
a)从冰箱-20℃中取出试剂盒，用70％乙醇消毒镊子取出所需数目的小室到新的24孔板中，放置室温一段时间使其恢复到室温；
b)在小室和下室中各加500μl温育(37℃温育)无血清培养基，37℃培养箱中放置2h使matrigel基质层再水化；
c)准备细胞悬液：胰酶消化处于对数生长期的各组细胞，用无血清培养基重悬，制成细胞悬液；
d)血球计数板对细胞悬液进行细胞计数；
e)在步骤3再水化后，将小室转移至另一小孔，并小心将小室中培养基去除；
f)加750μl30％fbs培养基到下室中；
g)加500μl步骤4准备好的细胞悬液(细胞密度根据细胞种类不同加以调整，一般为含5-10*104cell)到每个小室中；
h)在37℃培养箱培养24-48h(根据细胞种类不同加以调整)；
i)倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去非侵袭细胞
j)加500μl染色液到板的空孔中；
k)将小室浸泡在gimesa染色液中30min，在膜的下表面染色侵入细胞；
l)准备一个装四分之三体积水的大烧杯中，用小镊子夹取小室来回冲洗，空气中晾干小室；
m)用相机给小室整体拍照，拍照时聚焦很重要；
n)显微镜拍照膜，100x、400x各拍数张(≥5)；
o)于96孔板空中加入200ul10％醋酸，用剪刀和镊子揭下底膜，于180ul10％醋酸溶解，完全溶解后(用200ul枪头吸吹搅匀)，吸取100ul于另一孔中，od570检测。
图8显示了外泌体与胶质瘤细胞共孵育侵袭能力检测结果。检测结果表明携带有sirna的外泌体与细胞共孵育后，被细胞进行内吞后，可以有效的抑制细胞的侵袭能力。
实施例9外泌体注射成瘤裸鼠实验
肿瘤研究中，最常规的动物实验就是裸鼠成瘤实验,由于大部分肿瘤研究使用的是人类细胞，所以存在异种排除的存在，需要使用免疫缺陷型小鼠作为移植模型的载体，通过对该小鼠的注射肿瘤细胞，使其成瘤，然后再注射外泌体颗粒，观察瘤体的生长来判断其生物学变化。
a)将处于对数生长期的各实验组成瘤细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；
b)用血球计数板对细胞进行计数，并最终用一定体积的pbs重悬，使细胞悬液的浓度为1～2×107个细胞/ml；
c)用一次性注射器将一定量的细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝，注射的细胞量一般为2×106个细胞；
d)注射后饲养裸鼠至肉眼可见瘤体；(时间为2周左右)
e)每天注射外泌体pbs溶液(100ug/ml,100ul/只)继续饲养4周后，实验结束，收集数据；
f)拍照(包括处死后裸鼠荷瘤的照片和瘤体照片)；
g)对数据进行统计绘图。
图9显示了外泌体注射成瘤裸鼠实验结果。检测结果表明携带有本发明的sirna的外泌体注射裸鼠模型后，通过血液循环，可以有效的抑制肿瘤的增殖。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。