技术领域
本发明涉及中性蛋白酶，具体地说，涉及中性蛋白酶的新制备方法。
背景技术：
城市污泥是污水处理厂和污水处理的必然产物。未经恰当处理处置的污泥进入环境后，直接给水体和大气带来二次污染，不但降低了污水处理系统的有效处理能力，而且对生态环境和人类的活动构成了严重的威胁。目前，城市污泥的处置途径主要有：填埋、焚烧和土地利用等。但都不是最佳的处理方式。
中性蛋白酶是一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、pH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。目前用于生产中性蛋白酶的原料价格相对较为昂贵。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供一种成本低、环保的中性蛋白酶的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种中性蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）培养基调理：调节污泥含固率为3～4%，调pH为7.0～7.5，搅拌均匀，灭菌；
（2）摇瓶培养：挑取一环反硝化产碱菌接种到装有LB液体培养基中，29～30℃、100～200转/分摇瓶培养12～15小时；
（3）发酵罐发酵：按1～5%的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为3～4%的污泥的发酵罐，进行发酵培养；发酵温度30～32℃，发酵时间70～80小时；
（4）纯化：发酵完成后，调pH为6.0～7.0，浓缩制成中性蛋白酶制剂。
在上述的制备方法中，步骤（2）所述LB液体培养基配方为：酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000 mL，pH 7.2～7.6。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用城市污泥所含丰富的有机碳、氮和无机盐为营养物质，经过大量实验发现反硝化产碱菌在适宜pH、温度与通气量的条件下得以生长与增殖，并向发酵液中分泌中性蛋白酶，发酵液经一定的处理制成中性蛋白酶产品。本发明不仅可处置污泥，而且可获得附加值高、成本较低的中性蛋白酶产品，推广应用前景广阔。
具体实施方式
%是指每100份质量的培养基液体中接入接种物的质量份数。
实施例1. 反硝化产碱菌以污泥为原料发酵生产中性蛋白酶
（1）培养基调理：调节城市污泥含固率为3%，加入0.3%泡敌，并用NaOH调pH为7.0，搅拌均匀，0.1KPa压力与121℃下灭菌50分钟，冷却备用。
（2）摇瓶培养：从反硝化产碱菌斜面培养基上挑取一环菌苔接种到装有LB液体培养基的三角瓶中，30℃、100转/分进行摇瓶培养12h。
LB液体培养基配方为：酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000 mL，pH 7.4；
（3）发酵：以3%的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为3%的污泥的发酵罐，进行发酵培养。条件为：罐温30℃、罐压0.005MPa、通气量1:1.0(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间75小时。
（4）蛋白酶纯化：发酵完成后，调pH为7.0，浓缩制成中性蛋白酶制剂。
（5）中性蛋白酶的检测：发酵完成后，取样，测定中性蛋白酶酶活，酶活力达到100%。