本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及陆地棉芳樟醇合成酶基因、其编码的蛋白及应用。
背景技术：
植物受害虫为害时虽不能通过移动逃脱，但是在长期进化过程中，其为抵御害虫的取食为害逐渐形成了一套复杂有效的防御体系。为了应对昆虫的取食，植物会增强释放由20-200个组分组成的挥发物，这些虫害诱导植物挥发物能够直接抵御害虫，包括毒杀、驱避或抑制消化的作用，又能够作为植物主动“呼救”的信号，被天敌识别和利用，在植物的间接防御中发挥着重要作用。另外，虫害诱导挥发物还可以作为向邻近未受害植株发出的“预警信号”。
萜类化合物是虫害诱导挥发物中最多的一类，分子结构多样，是以异戊二烯(c5)为基本单位重复连接而成，包括单萜(c10)、倍半萜(c15)及两种萜烯同系物dmnt(c11)和tmtt(c16)。其中，芳樟醇等单萜挥发物在植物驱避害虫或吸引天敌的防御反应过程中发挥重要作用。田间人工合成的芳樟醇标准品对烟草天蛾的产卵具有显著地驱避作用。缺失芳樟醇基因的水稻突变体植株上有更多的褐飞虱取食而且寄生性天敌稻虱缨小蜂的寄生率降低。棉花是我国重要的经济作物，常常受到棉铃虫等多种害虫的危害。因此，设计新的害虫控制途径和方法来持续有效控制棉铃虫的为害显得尤为迫切。研究表明：棉花的繁殖器官叶、蕾和铃被昆虫为害后，会诱导释放芳樟醇、柠檬烯、(e)-β-罗勒烯、(e)-β-法尼烯等为主要组分的挥发物，这些诱导萜烯挥发物在植物驱避害虫和吸引天敌的防御反应中发挥着重要功能。当前，棉花中芳樟醇的生物合成调控机制及其在棉花防御反应中的具体功能尚不清楚。
技术实现要素：
本发明的目的是提供陆地棉芳樟醇合成酶基因及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：(1)对陆地棉基因组进行生物信息学分析，筛选芳樟醇合成酶基因；(2)根据陆地棉基因组筛选的基因片段设计引物，提取目的基因全长；(3)通过农杆菌介导法将陆地棉芳樟醇合成酶基因ghtps12导入烟草中，获得转空载体对照品系、野生型对照品系和超表达棉花基因ghtps12品系。每个品系获得30株以上的t0代转基因植株，获得转ghtps12烤烟nc89，在人工培养箱内培养。植物表达载体为pbwa(v)hs，农杆菌为gv3101。进行荧光定量pcr检测，筛选目的基因ghtps12表达量高的t0代转基因阳性植株。收集并鉴定转基因烟草挥发物，筛选芳樟醇释放量高的转基因阳性植株。
具体地，本发明提供的陆地棉芳樟醇合成酶，其具有：
1)如seqidno.1所示的氨基酸序列；或
2)seqidno.1所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
本发明提供了编码所述陆地棉芳樟醇合成酶的基因，其为ghtps12其cdna序列具有：
1)seqidno.2所示的核苷酸序列；或
2)seqidno.2所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或
3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交的序列。
含有本发明所述陆地棉芳樟醇合成酶基因的表达载体、宿主细胞或重组工程菌属于本发明的保护范围。
含有本发明所述陆地棉芳樟醇合成酶的生物制剂属于本发明的保护范围。
本发明提供了所述的陆地棉芳樟醇合成酶或其编码基因在调控植物挥发物合成通路中的应用。
本发明提供了所述的陆地棉芳樟醇合成酶或其编码基因在促进植物合成芳樟醇中的应用。
本发明提供了所述的陆地棉芳樟醇合成酶或其编码基因在植物保护中的应用。
本发明提供了所述的陆地棉芳樟醇合成酶或其编码基因在培育转基因植物中的应用。
上述应用中，所述转基因植物能够驱避植食性害虫或吸引植食性害虫的天敌。
本发明的陆地棉芳樟醇合成酶基因ghtps12转入烟草中，与野生型烟草相比，获得的转基因烟草能够大量释放芳樟醇，固相微萃取法检测的叶片芳樟醇释放量为1.26～56.03μg/g鲜重/30分钟,花朵芳樟醇释放量为0.69～10.30μg/g鲜重/30分钟，说明本发明的ghtps12基因能够调控植物挥发物合成通路，并促进芳樟醇的释放，可用于培育抗虫转基因植物，在植物保护领域具有广泛的用途。
附图说明
图1为ghtps12pcr扩增电泳图。1，marker；2，开放阅读框扩增产物。
图2为野生型和转基因烟草中ghtps12基因表达量分析(a)和动态顶空法检测芳樟醇释放量分析(b)。wt-1，wt-2，wt-3，wt-4和wt-5为野生型烟草；tr-1，tr-6，tr-8，tr-13，tr-16，tr-23和tr-24为转基因烟草。从a图可以看出，ghtps12基因在野生型烟草相对表达量仅为0.08～6.42，而在转基因烟草中ghtps12基因相对表达量则高达1032.89～8784.68。从b图可以看出，采用动态顶空法在野生型烟草中未检测到芳樟醇，而转基因烟草中芳樟醇的释放量为0.16～0.72μg/株/6小时。
图3为转基因烟草品系(以tr-13为例)和野生型烟草挥发物气相色谱图比较。1，芳樟醇；is，内标癸酸乙酯；cont，柱流失。从图3可以看出转基因烟草品系(tr-13)释放大量芳樟醇，约为0.72μg/株/6小时(动态顶空法)，而野生型烟草植株未检测到芳樟醇。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1陆地棉芳樟醇合成酶ghtps12基因的获得
利用从陆地棉基因组得到的目的片段设计引物，提取目的基因全长；
从陆地棉基因组中鉴定萜烯合成酶tpsg亚家族成员芳樟醇合成酶基因ghtps12，其序列与其它植物芳樟醇基因序列高度同源；
利用rn09-easyspin植物rna快速提取试剂盒提取棉花总rna，电泳检测rna的质量，分光光度计测定rna的浓度。采用fastquantrtkit反转录试剂盒进行cdna第一链合成。设计合成特异性引物ghtps12-fwd：5’-atggcttcattttctaaagttttctgt-3’和ghtps12-rev：5’-ttacaattttgtcggtaaaagagtt-3’，进行pcr扩增反应，获得ghtps12基因全长orf序列(电泳结果见图1)。ghtps12基因cdna全长1761bp，如seqidno.2所示，编码586个氨基酸，如seqidno.1所示。实施例2构建转棉花芳樟醇合成酶基因ghtps12的烟草
通过农杆菌介导法将实施例1获得的陆地棉芳樟醇合成酶基因ghtps12导入烟草(烤烟nc89)中。超表达棉花基因ghtps12品系，获得45株转ghtps12烟草，在人工培养箱内培养，l：d＝16：8(t：c＝29℃：25℃)。植物表达载体为pbwa(v)hs，农杆菌为gv3101。剪取叶片迅速冻于液氮，保存于-80℃冰箱用于rna提取和挥发物分析。
设计荧光定量引物ghtps12-fp：5’-gtgggattatgctgcaagtg-3’和ghtps12-rf：5’aattccctgaaccgaaccat-3’。利用rn09-easyspin植物rna快速提取试剂盒提取烟草总rna，电泳检测rna的质量，分光光度计测定rna的浓度。通过fastquantrtkit反转录试剂盒进行cdna第一链合成。然后进行实时荧光定量pcr(qrcr)检测目的基因ghtps12在转基因烟草中的相对表达量，从图2a可以看出，ghtps12基因在野生型烟草(wt-1，wt-2，wt-3，wt-4和wt-5)中相对表达量仅为0.08～6.42，而在转基因烟草(tr-1，tr-6，tr-8，tr-13，tr-16，tr-23和tr-24)中ghtps12基因相对表达量则高达1032.89～8784.68(图2的a图)。从而筛选出目的基因ghtps12表达量高的7个t0代转基因阳性品系(tr-1，tr-6，tr-8，tr-13，tr-16，tr-23和tr-24)。
采用动态顶空法分别收集野生型烟草和转基因烟草的挥发物。首先将烟草植株置于圆柱形玻璃缸(直径×高:25cm×60cm)，每缸1盆。空气由大气采样仪通过活性炭过滤后进入玻璃缸中，气流携带植物挥发物被40mg吸附剂(tenaxta60/80mesh)吸附后回流入大气采样仪。空气流速1.5l/min，收集6小时后，用300μl正己烷分2次洗脱至进样瓶中。加入8.65ng/μl癸酸乙酯作为内标。密封后置于-20℃冰箱中保存或直接吸取1μl在岛津单四极杆气质联用仪(gcms-qp2010se)上进行定性与定量检测。毛细管柱为rxi-5silms(30m×0.25mm×0.25μm,restek,usa)。载气为he，进样口温度为250℃，不分流，进样口流速和柱流速分别为10ml/min和1ml/min。进样量1μl，程序升温为:40℃(保持1min)以4℃/min升到130℃(保持5min)，以10℃/min升到250℃(保持5min)。从图2的b图可以看出，野生型烟草中未检测到芳樟醇，而转基因烟草中芳樟醇的释放量为0.16～0.72μg/株/6小时(动态顶空法)。说明tr-1，tr-6，tr-8，tr-13，tr-16，tr-23和tr-24这7个品系为芳樟醇释放量高的转基因阳性植株。图3为转基因烟草品系(以tr-13为例)和野生型烟草挥发物气相色谱图比较。可以看出转基因烟草品系(tr-13)释放大量芳樟醇，约为0.72μg/株/6小时(动态顶空法)。而且转基因烟草植株中只有芳樟醇一种挥发物特异性增强释放，没有其它挥发物增多释放。而野生型烟草植株未检测到芳樟醇。
使用固相微萃取(spme)法收集转基因烟草叶片和花朵中的挥发物。首先将200mg冻存的野生型和转基因烟草植株的叶片或花朵加入1.5ml5mcacl2迅速研磨，加94μl稀释10000倍(即10-4)的内标癸酸乙酯。将样品倒入20ml进样瓶，在摇床中50℃，200rmp放置20min，直径为100μlspem萃取30min。然后使用岛津单四极杆气质联用仪(gcms-qp2010se)对烟草挥发物进行定性与定量检测。毛细管柱为rxi-5silms(30m×0.25mm×0.25μm,restek,usa)。载气为he，进样口温度为250℃，不分流，进样口流速和柱流速分别为10ml/min和1ml/min。进样量1μl，程序升温为:40℃(保持1min)以4℃/min升到130℃(保持5min)，以10℃/min升到250℃(保持5min)。wt-1，wt-2和wt-3为野生型烟草；tr-1，tr-6，tr-8，tr-13，tr-16，tr-23和tr-24为转基因烟草，结果见表1，显示野生型烟草中叶片中未检测到芳樟醇，花朵中有微量芳樟醇0～0.05μg/g鲜重/30分钟，而在转基因烟草叶片中芳樟醇释放量为1.44～56.03μg/g鲜重/30分钟；花朵中释放量则为0.69～10.30μg/g鲜重/30分钟。
表1固相微萃取法测定野生型和转基因烟草中芳樟醇释放量
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>陆地棉芳樟醇合成酶基因及其应用
<130>khp181110259.8
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