本发明属于生物技术领域。
背景技术：
近几年，日益突出的能源短缺、石油储量严重下降等问题引起人们对可再生生物燃料的重视。微生物油脂又称单细胞油脂，是生物柴油的前体，可由酵母、霉菌、细菌和藻类等在一定条件下以碳水化合物和碳氢化合物作为碳源，通过代谢转化为胞内油脂。其中酵母发酵时间短，可利用的原料来源丰富，能够实现微生物油脂的连续生产。
但油脂酵母积累大量微生物油脂后，需要收集其菌体细胞，提取油脂。油脂酵母的回收是获得生物柴油的关键步骤，絮凝法是目前最为提倡的菌体回收方法，絮凝处理后菌体能实现高效的重力沉降分离，成本低廉。而目前常用的无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂存在金属离子和高聚合物在产油体系中残留、难降解等问题，会污染菌体或微生物油脂。而微生物絮凝剂无毒、无害、高效、无二次污染，可以有效地回收油脂酵母。
近年来，本发明专利申请的发明人乔楠致力于利用微生物絮凝剂絮凝油脂酵母的研究，已申请的一项专利（申请号：201510414320.6；发明人：乔楠；发明名称：微生物絮凝剂协同活性炭固定絮凝沉降油脂酵母的方法）中，申请人首先利用活性炭固定化油脂酵母，然后利用菌株编号为cgmccno：3.5231的酱油曲霉发酵得到微生物絮凝剂，利用得到的絮凝剂絮凝回收活性炭固定化的油脂酵母。但该方法需要首先利用活性炭固定油脂酵母增大酵母粒径，才能使得微生物絮凝剂达到较高的絮凝效果，操作步骤略显复杂；并且，在利用微生物絮凝剂絮凝油脂酵母时，废水的cod得不到进一步去除。因此，筛选到一株能够产生微生物絮凝剂，并且该絮凝剂对油脂酵母具有高效絮凝效果，并且絮凝油脂酵母的同时能够对废水的cod进行去除的菌株至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株拟青霉菌，该拟青霉菌能够产生微生物絮凝剂，得到的微生物絮凝剂对油脂酵母具有高效的絮凝回收能力，并且对废水的cod能够进行去除的一株拟青霉菌及利用其产生的絮凝剂絮凝回收油脂酵母的方法。
本发明菌株为拟青霉菌（paecilomycessp.）菌株m2-1，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为cgmccno.15262。
本发明利用拟青霉菌（paecilomycessp.）菌株m2-1产生的絮凝剂絮凝回收油脂酵母的方法：
（1）拟青霉菌制备微生物絮凝剂
将活化培养的斜面菌种接种于液体产絮培养基中，在30℃、150r/min条件下震荡培养48h，然后按10%的接种量在30℃、150r/min条件下，于液体产絮培养基中扩大培养48h，得到含有微生物絮凝剂的发酵液；
液体产絮培养基的组分及用量为(g/l)：葡萄糖20，酵母膏0.5，k2hpo45，kh2po42，mgso40.2，nacl0.1，(nh4)2so40.2，尿素0.5，ph=8；
（2）分离提纯微生物絮凝剂
将（1）过程得到的含有微生物絮凝剂的发酵液以12000r/min，离心10min得上清液，用1mol/l的naoh调整ph值为7；加入上清液体积4倍的于4℃预冷的乙醇，静沉24h；以10000r/min离心10min后收集沉淀，将沉淀溶于100ml去离子水中；以12000r/min离心10min，再次加入400ml4℃预冷的乙醇，静沉24h，以10000r/min离心10min后收集沉淀，将收集的沉淀溶于50ml去离子水中，均匀倒入玻璃培养皿中，液体厚度0.5cm，放入-40℃冰箱冷冻2h；然后将培养皿置于冷冻干燥机中，在-50℃下真空干燥50h，然后把培养皿在40℃烘箱中烘干至恒重，得到微生物絮凝剂；
（3）斯达氏油脂酵母的培养
将保存在斜面上的菌株编号为cgmccno：2.1560的斯达氏油脂酵母接入到无菌的yepd培养基中；在30℃，150r/min条件下培养36h，得到斯达氏油脂酵母种子液，然后将种子液按6%的接种量接入2l的精炼大豆油废水中，28℃、150r/min条件下培养48h，得到经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水；
yepd培养基组分及用量（g/l）：酵母提取物0.1、蛋白胨0.1、葡萄糖0.2，ph6.2；
（4）微生物絮凝剂絮凝斯达氏油脂酵母
将（2）过程制得的微生物絮凝溶于去离子水中，配制成10g/l的溶液；取100ml（3）过程经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水，装入250ml烧杯中；然后向烧杯中加入上述配制好的10g/l的微生物絮凝剂3-7ml，并加入5ml10g/l的氯化钙，调节ph值为9，然后用搅拌器在100r/min下搅拌2min后静置10min，吸取液面下1cm处溶液，测定微生物絮凝剂对精炼大豆油废水中斯达氏油脂酵母的絮凝率，以及对精炼大豆油废水cod的去除率。
本发明的技术效果是：
（1）由拟青霉菌m2-1产生的微生物絮凝剂能高效絮凝回收处理精炼大豆油废水中的斯达氏油脂酵母，该方法操作简单，酵母沉降时间短，絮凝回收效率高。
（2）斯达氏油脂酵母的絮凝率保持在92.36%-97.87%，废水的cod去除率保持在49.67%-52.91%。
具体实施方式
本发明所提供的菌株为拟青霉菌（paecilomycessp.）m2-1，它是从吉林省吉林市吉林石化污水处理厂好氧段活性污泥中分离得到的，该菌株已于2018年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为cgmccno.15262。该菌株可以用于制备微生物絮凝剂，该絮凝剂可以絮凝回收油脂酵母并对废水的cod进行降解。
利用本发明产生的絮凝剂絮凝回收油脂酵母的方法，由如下的过程和步骤组成：
（1）拟青霉菌制备微生物絮凝剂
将活化培养的斜面菌种接种于液体产絮培养基中，在30℃、150r/min条件下震荡培养48h，然后按10%的接种量在30℃、150r/min条件下，于液体产絮培养基中扩大培养48h，得到含有微生物絮凝剂的发酵液；
液体产絮培养基的组分及用量为(g/l)：葡萄糖20，酵母膏0.5，k2hpo45，kh2po42，mgso40.2，nacl0.1，(nh4)2so40.2，尿素0.5，ph=8。
（2）分离提纯微生物絮凝剂
将（1）过程得到的含有微生物絮凝剂的发酵液以12000r/min，离心10min得上清液，用1mol/l的naoh调整ph值为7；加入上清液体积4倍的于4℃预冷的乙醇，静沉24h；以10000r/min离心10min后收集沉淀，将沉淀溶于100ml去离子水中；以12000r/min离心10min，再次加入400ml4℃预冷的乙醇，静沉24h，以10000r/min离心10min后收集沉淀，将收集的沉淀溶于50ml去离子水中，均匀倒入玻璃培养皿中，液体厚度0.5cm，放入-40℃冰箱冷冻2h；然后将培养皿置于冷冻干燥机中，在-50℃下真空干燥50h，然后把培养皿在40℃烘箱中烘干至恒重，得到微生物絮凝剂。
（3）斯达氏油脂酵母的培养
将保存在斜面上的菌株编号为cgmccno：2.1560的斯达氏油脂酵母接入到无菌的yepd培养基中。在30℃，150r/min条件下培养36h，得到斯达氏油脂酵母种子液，然后将种子液按6%的接种量接入2l的精炼大豆油废水中，28℃、150r/min条件下培养48h，得到经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水。
yepd培养基组分及用量（g/l）：酵母提取物0.1、蛋白胨0.1、葡萄糖0.2，ph6.2。
（4）微生物絮凝剂絮凝斯达氏油脂酵母
将（2）过程制得的微生物絮凝溶于去离子水中，配制成10g/l的溶液。取100ml（3）过程经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水，装入250ml烧杯中；然后向烧杯中加入上述配制好的10g/l的微生物絮凝剂3-7ml，并加入5ml10g/l的氯化钙，调节ph值为9，然后用搅拌器在100r/min下搅拌2min后静置10min，吸取液面下1cm处溶液，测定微生物絮凝剂对精炼大豆油废水中斯达氏油脂酵母的絮凝率，以及对精炼大豆油废水cod的去除率。
实施例1菌株的筛选
（1）取样
取吉林省吉林市吉林石化污水处理厂好氧段活性污泥。污泥预处理：将活性污泥取100ml自然沉降2h后，将上清液倒掉；加入2倍污泥体积的3%的葡萄糖溶液进行曝气，每隔24h更换一次葡萄糖溶液，连续曝气36h。
（2）筛选
将连续曝气36h的活性污泥自然沉降一段时间，倒掉上清液，将污泥按浓度梯度进行稀释，稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌悬液。将菌悬液分别在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、查氏培养基、马丁氏培养基平板上涂布分离，在28℃培养箱中培养2-3天，然后挑取单菌落在相同培养基平板上多次划线分离，直到分离的菌种单一，几乎不出现异类菌落为止。选出生长旺盛、具有较高分泌能力、絮凝活性高的菌种，培养成熟后于4℃冰箱保存。
各培养基组分如下：
牛肉膏蛋白胨培养基组分及用量（g/l）：牛肉膏：3.0、蛋白胨10、氯化钠5、琼脂20，ph7.2。
高氏1号培养基组分及用量（g/l）：可溶性淀粉20、kno31、nacl0.5、k2hpo40.5、kh2po40.5、mgso40.5、fe2(so4)30.01、琼脂20，ph7.4。
查氏培养基组分及用量（g/l）：蔗糖30、硝酸钠2、氯化钾0.5、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、硫酸铁0.01、琼脂15-20。
马丁氏培养基组分及用量（g/l）：葡萄糖10、蛋白胨5、磷酸氢二钾1、硫酸镁0.5、琼脂15-20、1/3000孟加拉红100ml，ph自然，在临使用前加入1/3000的链霉素稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
（3）菌株鉴定
筛选菌株的培养特征为：菌落扁平，圆形或近圆形，乳白色，不透明，不粘稠、周围有丝状，直径约5mm。
筛选菌株的生理生化特性为：淀粉水解呈阳性，纤维素水解呈阳性，明胶液化呈阴性。以葡萄糖作为唯一碳源，菌株生长旺盛且速度快；以麦芽糖作为唯一碳源，生长状况一般，但生长缓慢；以纤维素作为唯一碳源，基本不生长。
该菌株的16srdna序列分析结果如下：tcttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgagggtcccacgaggcccaa
cctcccatccgtgttgaactacacctgttgcttcggcgggcccgccgtggttcacgcccggccgccggggggccttgtgctcccgggcccgcgcccgccgaagacccctcgaacgctgccctgaaggttgccgtctgagtataaaatcaatcattaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggcattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctaaccctccagcccggctggtgtgttgggtcgacgtcccccccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcgccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacgcgctctggtagggtcggccggctggccagccagcgacctcacggtcacctattttttctcttaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa。
该菌株命名为拟青霉菌（paecilomycessp.）m2-1，它已于2018年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为cgmccno.15262。
实施例2微生物絮凝剂的制备
（1）将活化培养的斜面菌种接种于液体产絮培养基中，在30℃、150r/min条件下震荡培养48h，然后按10%的接种量在30℃、150r/min条件下，于液体产絮培养基中扩大培养48h，得到含有微生物絮凝剂的发酵液；
液体产絮培养基的组分及用量为(g/l)：葡萄糖20，酵母膏0.5，k2hpo45，kh2po42，mgso40.2，nacl0.1，(nh4)2so40.2，尿素0.5，ph=8。
（2）分离提纯微生物絮凝剂
将（1）过程得到的含有微生物絮凝剂的发酵液以12000r/min，离心10min得上清液，用1mol/l的naoh调整ph值为7；加入上清液体积4倍的于4℃预冷的乙醇，静沉24h；以10000r/min离心10min后收集沉淀，将沉淀溶于100ml去离子水中；以12000r/min离心10min，再次加入400ml4℃预冷的乙醇，静沉24h，以10000r/min离心10min后收集沉淀，将收集的沉淀溶于50ml去离子水中，均匀倒入玻璃培养皿中，液体厚度0.5cm，放入-40℃冰箱冷冻2h；然后将培养皿置于冷冻干燥机中，在-50℃下真空干燥50h，然后把培养皿在40℃烘箱中烘干至恒重，得到微生物絮凝剂。经测定，微生物絮凝剂产量为4g/l。
微生物絮凝剂产量的计算方法为：产量=絮凝剂干重g/培养基的体积l
实施例3油脂酵母的培养
将保存在斜面上的菌株编号为cgmccno：2.1560的斯达氏油脂酵母接入到无菌的yepd培养基中。在30℃，150r/min条件下培养36h，得到斯达氏油脂酵母种子液，然后将种子液按6%的接种量接入2l的精炼大豆油废水中，28℃、150r/min条件下培养48h，得到经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水。
yepd培养基组分及用量（g/l）：酵母提取物0.1、蛋白胨0.1、葡萄糖0.2，ph6.2。
实施例4利用微生物絮凝剂絮凝油脂酵母
将实施例2制备的微生物絮凝剂应用于实施例3中经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水，絮凝回收油脂酵母，降低废水的cod。
（1）将实施例2得到的微生物絮凝剂溶于去离子水中，配制成10g/l的溶液。
（2）取100ml经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水，装入250ml烧杯中；然后向烧杯中加入配制好的10g/l的微生物絮凝剂3ml，并加入5ml10g/l的氯化钙，调节ph值为9，然后用搅拌器在100r/min下搅拌2min，静置10min，吸取液面下1cm处溶液，测定微生物絮凝剂对精炼大豆油废水中斯达氏油脂酵母的絮凝率92.36%，精炼大豆油废水cod的去除率为49.67%。
油脂酵母絮凝率的测定方法：将上述过程中取得的液面下1cm处的溶液用分光光度计于600nm处测其吸光度。（测定过程以培养基作为参比）
絮凝率计算式：絮凝率（%）=（a0－a）/a0×100%
a0——空白对照在600nm处的吸光度值
a——样品在600nm处的吸光度值
按照上述步骤计算发酵液对斯达氏油脂酵母的絮凝率。
实施例5
包括与实施例4相同的步骤（1），其区别步骤为：
（2）取100ml经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水，装入250ml烧杯中；然后向烧杯中加入配制好的10g/l的微生物絮凝剂5ml，并加入5ml10g/l的氯化钙，调节ph值为9，然后用搅拌器在100r/min下搅拌2min，静置10min，吸取液面下1cm处溶液，测定微生物絮凝剂对精炼大豆油废水中斯达氏油脂酵母的絮凝率97.87%，精炼大豆油废水cod的去除率为52.91%。
实施例6
包括与实施例5相同的步骤是（1），其区别步骤为：
（2）取100ml经斯达氏油脂酵母处理后的精炼大豆油废水，装入250ml烧杯中；然后向烧杯中加入配制好的10g/l的微生物絮凝剂7ml，并加入5ml10g/l的氯化钙，调节ph值为9，然后用搅拌器在100r/min下搅拌2min，静置10min，吸取液面下1cm处溶液，测定微生物絮凝剂对精炼大豆油废水中斯达氏油脂酵母的絮凝率95.55%，精炼大豆油废水cod的去除率为50.32%。